第三章 饲料卫生检验常用分析方法
对饲料中的有毒有害物质进行定性定量分析是饲料卫生检验的内容之一。由于检验的目的、被检测物质的性质以及它们在饲料中的含量不同，所选用的方法也各不相同。在饲料卫生检验中，应用最多的是薄层层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法以及荧光分析法等。
第一节 饲料卫生检验常用分析方法气相色谱法气相色谱法（Gas chromatography，GC）是以气体作为流动相对混合组分进行分离分析的一种色谱方法。
此法特别适用于分子量小于300，加热有一定挥发性物质的分析。目前，多种真菌毒素、有机磷农药、有机氯农药的气相色谱分析已有报道。
二、高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是利用高压输送的液体作为流动相的一种色谱方法。
高效液相色谱仪由于采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具有高压、高速、高效和高灵敏度等优点。HPLC是将样品制成溶液进样，不经过气化，所以不受样品挥发性的约束。故尤其适用于一些挥发性低、热稳定性差、分子量较大的高分子化合物及离子型化合物的分离分析。在饲料卫生检验中，此法已用于苯并（a）芘、黄曲霉毒素、有机磷农药以及有机氯农药等分析。
三、薄层色谱法薄层层析法（Thin Layer Chromatography,TLC）是将固定相均匀地涂布于玻板上制成薄层，以液体作为流动相，对混合组分进行分离、定性、定量的一种方法。薄层层析法是一种经典色谱方法，由于它具有不需要任何仪器设备，操作简便、快速、灵敏度高、分离效果好等优点，因而在饲料毒物分析中应用十分广泛。
四、原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法（Atomic Absorptive Spectrometer,AAS）利用待测元素的基态原子蒸汽对特定波长的谱线光有吸收作用，根据特征性谱线光被吸收的程度来测定试样中待测元素含量的方法。
AAS是测定进素元素含量的重要手段之一。本法具有选择性好（通常情况下共存元素不产生干扰，试样不需纯化）、灵敏度高（可达ppm,甚至ppb）、重现性好、分析速度快等优点。因而被作为饲料卫生检验的标准方法之一。
缺点：对不同的分析项目，其测定条件不同，特别是要求具有不同的光源灯。另外，仪器昂贵，因此，其应用面和程度受到限制。
五、紫外—可见分光光度法
（Visible and Ultraviolet Absorption Spectrum）
根据朗——比耳定律，当一束平行的单色光通过某一种均匀透明的稀溶液时，溶液的吸光度（或称光密度）等于吸光系数乘以溶液的厚度乘以溶液的浓度，即A=K×C×L，K表示某种物质溶液对某特定波长光的吸收能力,与溶液的浓度及厚度无关。紫外—可见光光度仪即根据这一原理，用棱镜或光栅将光源的光线分成单色光，用一定厚度的液槽（或称比色杯，常是0.5cm、1cm、2cm、5cm），通过比较待测液与标准溶液的吸光度，求出待测溶液的浓度。
紫外光源用于测定具有共轭双键结构的无色物质；可见光源用于测定一般的有色物质。
本法灵敏度高，操作简便，快速，廉价，因而在饲料卫生检验上应用很广。
近年来又出现了双波长分光光度法（Dualwavelength Spectrophotometry）。这是一种新技术，不用参比液，而是选用两种不同的波长，λ1与λ2的光束通过一个样品,测定在这两种波长下的吸收度差值,其中λ1下的吸收度为参比吸收度,λ2下的吸收度为测量吸收度。此法最突出的优越性是不仅对吸收光谱互相重叠的混合样品可以不经分离直接测定，而且可以测定混浊样品。
六、荧光分析法荧光分析法（Fluorescence analysis）是利用某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和强度，对物质进行定性或定量的方法。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样用量少、方法简便和能提供较多的理论参数等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量，其检出限可达ppb乃至ppt级。在饲料卫生检验中，常用于黄曲霉素、苯并（a）芘、铅等物质的测定。但从总的来说，由于能产生荧光的物质不是很多，故应用范围不如分光光度法。
七、离子选择电极法根据电化学原理，在一个由参比电极和某种特定电极（离子选择性电极如氟电极等）组成原电池中，原电池的电位与溶液中该离子的活度之对数成正比：即
E=E0±lgα(
式中：E为原电池的电极电位；
E0为常数项,取决于参比电极和溶液的离子活度；
R为气体常数,即8.315焦耳/度；
T为绝对温度,即273+t℃；
F为法拉第常数,96500库仑；
n为待测离子的价数；
为该直线在一定温度下的理论斜率
α(为待测溶液中某离子的活度,在稀溶液中,离子浓度就是该离子的活度。
离子选择电极法就是根据以上原理，通过测定原电池电位的变化，来对被测定溶液中某离子的浓度进行定量的一种分析方法。本法操作极为简便，灵敏度较高，且样品不需作复杂的处理。但本法尚有一些缺点，主要是精度差，重现性不好，需进一步完善。目前离子选择电极的品种很多，有K、Na、Ca、F、NO、SO等。在食品卫生检验中作为标准的分析方法是氟离子选择电极法。
八、放射免疫测定法放射免疫测定法（Radio Immuno Assay RIA）是一种将放射性同位素测量和免疫反应原理相结合的同位素体外检测法。
RIA的基本原理是利用标记抗原（Ag*）与未知抗原（Ag）和特异性抗体（Ab）间发生竞争作用来测定抗原（毒物或药物）的浓度。
因免疫反应的本质是抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物。放射性同位素与抗原相结合形成标记抗原，与其相应的特异性抗体产生抗原抗体反应。
Ag（未标记抗原） AgAb（未标记抗原抗体复合物）
+Ab +
Ag*（标记抗原） Ag*Ab（标记抗原抗体复合物）
“未结合状态”,结合状态”
（Free） （Bound）
在上述免疫反疫中Ab对Ag*与Ag之间没有选择性，具的相同的亲和力，结合的机会相等。这就是说未标记抗原遇到特异抗体要发生抗原抗体反应，生成抗原抗体复物。标记抗原遇到特异性抗体也会发生抗原抗体反应，形成标记抗原抗体复合物。所以说标记抗原（Ag*）及未标记抗原（Ag）与特异性抗体间发生竞争作用（Compefitive reaction）。因此，如果我们将要测定的抗原先进行标记，然后将一定量的标记抗原（Ag*），一定量的抗体（Ab）与未标记的抗原（Ag，待测毒物）相混合，则无论是Ag*或Ag都要与Ab发生竞争作用而形成竞争结合。如未标记抗原浓度增大，则Ag*Ab复合物浓度就减少。因Ag*对Ab的结合被Ag的竞争所抑制；反之如未标记的抗原浓度减少，则Ag*Ab复合物的浓度就增大。因而在一定量标记抗原，一定稀释度的抗体与待测的未知量抗原作用一定时间后，用放射性同位素的方法来测量标记抗菌素原抗体复合物的放射性，即可测出毒物的含量。测定时，先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原与抗体作用，测定各种标准浓度抗原的标记抗原抗体复合物的放射性结合率（B%），即可绘成标准曲线。即标准竞争抑制曲线。然后取一定量样品按同法进行测定，再根据被测抗原的放射性结合率（B%），就可从标准竞争抑制曲线中查出相应的该抗原的含量，即预测定的毒物之含量。
RIA由于具有灵敏度高（可检测10-9~10-12g）、特异性强、用样量少（0.1~1ml）等特点，所以应用越来越广，发展也更加迅速。其突出特点是样品可不必纯化处理，所以应用其进行的药物与毒物的种类越来越多。目前已将RIA商品化，标准化，成套出售RIA试剂盒以及自动化测录的同位素计数仪的配备，使RIA的应用更加方便。
第二节 薄层色谱法薄层色谱法是色谱法的一个重要分支。由于该法具有设备简单、操作方便、对混合组分的分离效果好等优点，故广泛应用于饲料中农药、真菌毒素等的分离和分析。
薄层色谱根据分离的机理不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和凝胶过滤薄层色谱等四种。考虑在饲料卫生检验中的实际应用情况，这里只介绍吸附薄层色谱。
吸附薄层色谱的原理吸附薄层色谱主要是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的不同，及展开剂对它们的解吸附能力不同，使各成分达到分离的目的。
凡具有吸附能力，能将溶液中的一些成分吸附到它表面的固体物称为吸附剂，吸附剂的吸附活性主要由物质的表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附剂对各种有机化合物能表现出不同的吸附活性。用一定的溶剂系统展开时，由于溶剂与样品组分争夺吸附剂表面，产生竞争吸附作用，因此，产生了吸附与解吸附的过程。可见，薄层分离过程实际上是一个吸附、解吸附、再吸附、再解吸附……的连续不断的循环过程。各种化合物，由于结构和性质上差异，表现出在吸附上所受吸附力就不同，一定展开剂对它们的解吸附难易程度也就不同，因此，各种化合物组分展开时彼此程度不同地被分离，性质差异越大，分离效果越好。
二、薄层色谱条件的选择要想得到理想的薄层色谱结果，首先要处理好吸附剂、展开剂和被分离成分三者之间的关系。
㈠ 吸附剂
1、吸附剂的条件薄层吸附色谱要求吸附剂有较大的表面积及适当的吸附能力，与被分离物质、溶剂、展开剂不发生化学反应，在所用的溶剂及展开剂中不溶解，颗粒均匀。
吸附剂的种类薄层色谱所用吸附剂种类很多，在饲料卫生检验中最常用的吸附剂有硅胶和氧化铝。
⑴ 硅胶 硅胶是一种微酸性的无机吸附剂，由硅胶酸脱水而成。具有多孔性硅氧环的交链结构，由于其骨架表面有很多硅醇基（—Si—OH），能和许多化合物形成氢键而具有吸附能力，同时也可通过氢键吸附多量的水分。硅胶吸附的水越多，则吸附的活性也越低。若吸附水量超过17%，则硅胶的吸附能力很弱，一般就不作为吸附剂应用，而只能作为分配色谱的支持剂（载体）。当将硅胶加热至100~110℃时,可除去硅胶所吸附的水,重新显出吸附活性。但加热温度不能太高，若超过500℃，硅胶结构中彼此邻近的硅醇基将会互相脱水成硅氧环结构，将使硅胶形成不可逆的失水，而失去吸附活性，一般到170℃时，即有少量硅醇基相互脱水。
│硅氧环│
—Si—O—Si—OH
硅胶上的硅醇基能一定程度的解离，显弱酸性(pH3~5)。所以硅胶适用于中性或酸性物质的分离。相对地说，更适于分离疏水性物质，所以常用于有机磷、黄曲霉素等物质的分离分析，是目前应用很广的薄层吸附剂。
目前常用的商品硅胶有以下几种：
硅胶H 不加粘合剂的硅胶。
硅胶G 加粘合剂的硅胶，一般加10~13%的石膏粉。
硅胶HF254 含荧光物质但不含粘合剂的硅胶。它可以在短波紫外线光照下显出荧光。
⑵ 氧化铝 是微碱性的吸附剂，其吸附能力较硅胶强，适用于中性或碱性的亲脂性化合物的分离。它不像硅胶那样含有较多的氯化物，因而常用于有机氯及氨基甲酸酯类农药的分析。
市场上氧化铝常见的有氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF和氧化铝 等。粒度一般为40um。
硅胶和氧化铝的吸附能力与自身的含水量有关，含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。按含水多少通常将它们的活性分为五级，I级吸附力最强，V级吸附力最弱。薄层色谱通常要求活性为II~III级，故必须通过活化或减活进行调整。活化是将吸附剂在一定温度下加热，除去吸附剂中所含的水分使其吸附活性提高，吸附能力加强的过程。相反在吸附剂中加入一定量的水分，使其吸附活性降低的过程称为减活。
（二）展开剂
薄层的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。展开剂的选择正确与否对于成功地进行薄层分离是非常重要的。
在吸附薄层色谱条件选择时，必须从吸附剂、展开剂,被分离物质三者综合考虑。这三者的相互关系可由图1—1简明表示。
薄层色谱条件选择的基本原则：当用亲水性吸附剂进行色谱时，如果被分离物质极性较大，应采用吸附性较弱（活度低）的吸附和极性较大的展开剂；如果被分离物质亲脂性较强，应选用吸附性较强（高活度）的吸附剂和极性较小的展开剂。
在实际工作中，由于吸附剂,被分离物质及展开剂三者之间，前两者的性质在一定条件下是固定的，因此，选择合适的展开剂是提高薄层分离效率的关键。为了达到良好的分离效果，消除斑点的拖尾现象，并使斑点轮廓清晰，展开剂通常采用两种或两种以上有机溶剂组成的混合溶剂系统。这种混合溶剂系统由“基础溶剂”（即底剂）和“洗脱溶剂”（即推进剂）组成。底剂通常用极性小的溶剂，如丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等。由于展开系统极性过强或过弱，均会影响色谱分离效果，展开剂极性过强，绝大多数组分被推至前沿重叠；而过弱则绝大多数组分留在原点附近而不能分离。因此。使用时，需通过调节底剂和推进剂的比例来改变展开剂的极性，使被分离物质得到更好的分离效果。通常希望展开后，被测组分的比移值（即试样斑点中心至原点距离与溶剂前沿至原点的距离的比值，Rate of flow，简写Rf）在0.2~0.8分离。
三、薄层色谱操作步骤薄层色谱操作一般包括制板、点样、展开、显色、定性、定量等几个步骤。
㈠ 薄层板的制备常用玻璃板作为载板，预先必须清洗干净，并且晾干。制备时根据玻板的大小和所需薄层的厚度，按每100cm称取1.0~1.5g置研钵中，加2~3倍量水，适当研磨，调成匀浆，迅速倒于干洁的玻板上，用玻棒将吸附剂铺平，振动玻板，使吸附剂均匀分布，然后先自然晾干再根据需要进行活化。
薄层制备时的注意事项：
1、吸附剂的加液量必须适宜，加液量过多，吸附剂不易形成凝胶，固化时间延长，且容易留下波纹状痕印或斑迹。加液量过少，凝胶化过速容易堆积过厚，不仅涂布不匀，而且易造成薄层龟裂或皱褶。
2、研磨时，不宜过于剧烈，以免产生气泡，造成薄层上有麻点。
3、调制匀浆时间应适宜，一般研磨时间以1~2min为宜。时间过长会使凝胶水分溢出，结构破坏，并在研钵上自行固化，以致无法涂布。
4、具体调浆时所需的量要视薄板的面积和厚度来定，一般用作定量分析的薄层，其厚度以0.25~0.30mm为宜。若过厚，其灵敏度太低。过薄，虽然灵敏度高，但经展开后，被测物质的比移值规律性差，且展开速度较慢。在实际工作中，用于测定有机氯的板要薄一些（0.25mm），用于测定有机磷的板可稍厚些（0.4~0.5mm）。至于每块板所需称取多少吸附剂，这要根据试验确定，例如涂一块5×15cm的硅胶G板，需0.8g左右；如果是氧化铝板，须1.8g左右。当然，由于涂布方法不同，所需的量也会有所差异。
5、涂好吸附剂的薄层板，应先晾干再活化。即先放在水平的桌面上让其自然干燥。如果未干燥就加热活化，会因水分蒸发过快，而在薄层上出现气泡或龟裂。晾干后再根据需要进行活化，对于硅胶板来说，于105~110℃活化半小时便符合要求。活化好的薄层板应放在干燥器中，一般可保存二周，如果超过时间，应重新进行活化。
㈡ 点样在薄层定量分析中，要求点样的原点大小一致，并且要求尽可能小，一般直径不超过3mm。目前常用的点样方法有直接点样法和间接点样法两种。
1、直接点样法先在已准备好的薄层板上作记号，距底边2cm为基线，距基线10cm或15cm处作为展开溶剂的前沿线。然后用微量点样器直接将样品液点在基线上，每点的间距为1.5cm。边点样边用热风缓缓吹原点，使溶剂迅速挥发，以免原点面积过大。点样既要细心，不要截破薄层板上的固定相，以免形成不规则的斑点而影响比移值的正确测量；又不能过慢，一般不应超过10min。否则薄层板在空气中暴露时间过长，会吸收水分而改变其活度，从而影响分离效果。
直接点样法操作简便，是最常用的点样方法。但很难使原点面积大小一致，也很难控制直径在3mm之内，而且又容易损伤薄层的表面，特别是在薄层板上进行测定面积时，这些缺点会影响结果。
2、间接点样法（滤纸移样法）
先将样品液分次缓缓样于直径为2~3mm的色谱滤纸上。另用打孔器在薄层上打一相同直径的小孔，然后将点好样的滤纸片放入小孔内。此法优点是可点较多的样液，而且斑点很集中。这样用斑点面积法进行定量比较准确，但操作较麻烦。
㈢ 展开展开（亦称展层）就是将薄层板点有样液的一端浸入展开槽中的展开剂（其深度必须低于点样原点。一般以1cm为宜），由于溶剂推动样点中物质自下而上的移动，并使之达到彼此分离的操作过程。根据展开的次数和方向，可分为一次展开、多次展开、双向展开。
1、一次展开用一种或一种以上的溶剂组成的展开系统一次展开至前沿，然后挥干、显色。
2、多次展开使用一种展开剂展开至前沿后再用同样展开剂或另换别种展开剂进行第二次或更多次的展开，这样可以使比移值接近的不同组分得到较好的分离。
3、双向展开是同一块薄层板沿两个不同方向，用两类性质不同的溶剂进行展开的方法。适用于多组分混合物的分离。同时，此法刀可用于纯化处理，即将薄层板用弱极性的溶剂先横向展开一次，将色素、脂肪等干扰杂质推到薄层边缘，然后将薄层板转90度，再用极性较强的溶剂纵展一次。这样可以排除杂质的干扰，获得清晰的样品斑点。
展开过程中，有时会出现前沿线弯曲，经显色后，并列点加样品的斑点却不在同一条线上，而出现斑点形状、大小不规则、比例值改变的现象，这种现象称为边缘效应。
产生边缘效应的原因是由于展开槽中溶液不饱和状态和展开剂在薄层板不同部位分配不同的缘故。即当混合溶剂在薄层上展开时，极性弱的低沸点溶剂在薄层边缘挥发得快，在边缘部分比中心部分含有更多的极性较大溶剂，从而使边缘斑点的比移值高于中部斑点的比移值。
消除边缘效应的方法，可在展开前取一大小适宜的洁净滤纸，折成圆筒形垫在展开槽的内壁，浸在展开剂中充分润湿，通过滤纸上的溶剂分子的扩散，使溶剂蒸汽在展开槽内达到饱和，再将薄层板放入槽内展开。当前后二次展开后，同一组分的比移值差异大于±0.02%时，一般应更换新的展开剂。
㈣ 显色显色是薄层色谱的重要步骤。当薄层经展开后，除组分本身有色者可直接观察斑点外，通常都需通过显色来观察被分离化合物的比移值及斑点面积，这是薄层定性和定量的基础。常用的显色方法有以下几类：
1、物理显色法薄层的物理显色法主要是运用紫外光作为光源。常用的紫外光的短波（254nm）和长波（365nm）两种。物理显色法又可分为以下三种：
⑴ 观察荧光斑点 这种方法适用于在特定的波长条件下产生荧光的物质。将展开后的薄层板直接放在紫外灯下照射，此时某些被分离化合物在黑色背景下显示出荧光斑点。
⑵ 荧光猝灭法 这种方法主要用于对短波紫外线有一定吸收能力的物质。即含有荧光物质的薄层板在紫外线光照射下显示出荧光背景，而那些对短波紫外光有一定吸收能力的化合物由于吸收作用而形成荧光猝灭，其斑点显黑色。所用含荧光物质的吸附剂有硅胶GF254、氧化铝GF254等。
⑶ 被分离的化合物在紫外光的照射下，与化学显色剂进行反应而产生色斑。如有机氯农药在喷洒硝酸银显色剂后，在254nm紫外光照射下可产生黑色斑点。
mAgClAgCl2·AgCl·nAgCl2+Ag+AgclO·AgCl·AgO
2、化学显色剂借助于被分离的化合物，在薄层板上与化学显色剂进行化学反应，产生有色化合物，从而显示出色斑的位置。常用的显色剂进行有碘—碘化钾溶液（对许多物质都显黄棕色）；磷钼酸乙醇溶液（对还原性物质显蓝色）；硝酸银溶液（对还原性物质显黑色），还有用浓硫酸使有机物产生黑色的碳化斑点等。
化学显色法通常用喷雾器将显色剂喷洒在薄板上。喷雾时，喷雾器距薄层板的距离要适当，压力大小也要合适，使喷出的液滴均匀分布在薄层上。以喷至板面湿润或呈半透明为止。
用化学显色剂是薄层显色中最常用的方法，但很多显色剂有毒或有强烈的腐蚀性，所以喷洒操作应在通风柜中进行。另外，薄层板背后以玻璃板为衬底，以免腐蚀其它物品。
酶化学显色法利用酶抑制技术，在薄层板上进行酶化学反应，从而显示出斑点的方法。有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，对各种酯酶有抑制作用，使酶的活力降低而不能分解基质，通过检查是否有基质的分解产物，便可确定是否有这类农药存在。如测定有机磷农药，常用乙酸—β—萘酯作基质，以鼠肝作酶源，当不存在有机磷农药时，酶能促使乙酸—β—萘酯水解成β—萘酚和乙酸。加牢固蓝B盐作显色剂，使β—萘酚生成红色化合物。而在有机磷农药斑点处，由于抑制了酶的活性，就无水解产物，不产生红色，便与背景颜色不同而显出农药斑点。
㈤ 定性分析从理论上讲，在特定的条件下，被分离化合物的Rf值是该物质的特性常数，故可作为物质定性的依据。但事实上由于影响比移值的因素很多，如吸附剂的质量和活度、薄层厚度、展开剂的质量和配比误差、展开槽内溶剂蒸汽的饱和程度、空气的相对湿度、展开时的温度、展开方式以及点样量等都会影响比移值，故薄层色谱的比移值往往不很稳定，重现性不好，所以在实际工作中，多采用以下几种方法综合进行定性。
1、与已知标准品比较即将待测样品液和标准液点于同一块板上,根据展开后两者的Rf值是否一至来决定是否是同一物质。此法由于在相同的条件下进行展开、显色、比较，可以排除多种因素的干扰，因此结果较准确可靠。
2、采用两种以上展开系统化合物的比移值是一种物理常数，结构相似的同类物质，比移值可能非常接近。因此，为了鉴定工作准确无误，至少要用两种以上的展开剂系统，当在各种展开剂系统中，样品与标准品的RF值都相同时，才能确定是同一物。
3、使用专属显色剂或多种显色剂专属显色剂是通过和某些基团起一定化学反应而显色的。因此，定性检验时应当用专属性显色剂，这样可以排除一些杂质的干扰。因此在实际工作中，为了使结果准确无误，还可选用几种显色剂并用。
4、加大展开距离，使样品与标准品的差异显示出来，再观察其RF值是否一致。
5、将样品和标准品均转变成衍生物，观察RF值改变是否一致。如在黄曲霉毒素的定性检验时，为了排除其它可能产生荧光的杂质的干扰，常在标准样点上和试样点上滴加三氯乙酸，使黄曲霉毒素的三氯乙酸反应，形成一种衍生物，然后再展开，观察衍生物的RF值是否仍然一致。
㈥ 定量分析薄层的定量分析方法基本上可分为两大类，一类是在薄层板上直接进行测定。即用肉眼或仪器比较待测样品与标准样品色斑的大小和颜色深浅或荧光的强弱进行定量。另一类是将薄层板上被分离化合物的斑点区的吸附剂剥离下来，在用适当的溶剂提取被分离的化合物，然后用其它的含量测定方法进行测定。在饲料卫生检验中主要是用第一类方法。这类定量测定方法又可分为目视直接比较法、最低检出量法、限量法、薄层扫描法、斑点面积测定法等五种。
1、目视直接比较法（标准系列法）
在同一块薄层板上，分别点上待测样品液及一系列不同含量的标准溶液，进行展开显色后，观察比较样品斑点和标准斑点的面积大小和颜色深浅，找出与样品斑点相当的标准斑点，按标准点的组分含量，不致于斑点颜色过深。
最低检出量法（稀释定量法）
先将不同浓度的标准溶液进行点样、展开、显色，以确定在特定的实验条件下标准物质的最低检出量（即刚能显示出斑点）。
然后在相同条件下，将样品液的标准液（最低检出量）点样、展开、显色、比较。如果可以找出和标准溶液最低检出量的斑点相同者，就可认为此点的样品液含有与最低检出量相同的待测物质。如果斑点大小、颜色深浅（或荧光强度）不同，则需进行稀释或浓缩，也可减少点样量或增加点样量，直至样品斑点与标准物质最低检出量斑点相同为止。最后求出样品中待测物质的含量。此法常用于测定黄曲霉毒素。
限量法该法是根据国家卫生标准设计出点样量，将该点样量的标准液点在薄层板上，然后将待测的样品液按卫生标准算出的点样量点在同一薄层板上，经展开后，显色，分别观测各样点是否超过标准。
本法不需分析每个样品的具体含量，这样可以大大减少分析工件量，既省时又节省药品，对搞普查时作大批量样本的筛选很方便。但此法缺点是只能粗略地作限量检查。
薄层扫描法本法是用薄层扫描测定仪直接在薄层板上测定斑点的颜色深浅或荧光强度的一种方法。
作法是在制好的薄层板上点加样品液的标准液，经展开、显色后，置薄层扫描仪上扫描，扫描时，组分斑点吸收待征波长的单色光，剩余的单色光经透射或反射或发出荧光，由检测器检测，从而获得该点面积的待测物质含量。
本法准确度高，重现性好，分析迅速，大大提高了薄层分析的精度。
斑点面积测定法斑点面积测定法是用一定的测量工具测出斑点面积，然后再根据经验公式计算待测物质的定量方法。
根据S.J.Purdy原理，在展开的薄层上，物质含量（W）的对数和斑点面积（A）的平方根成线性关系，即=mlogW+C。根据此原理，在测量时，准备一个待测试样、一个标准溶液和一个标准溶液的稀释液，按等体积量点在同一薄板上展开、显色后，测量各斑点的面积：
=mlogWs+C
=mlogWd+C
=mlogW+C
由以上三式可得：logW=logWs-logd′
式中：W为样品检测量；
Ws为标准样量；
Wd为稀释标准样量；
d′为标准品稀释倍数的倒数；
A为样品斑点面积；
Ad为稀释后的标准斑点面积；
As为标准斑点面积。
第二节 薄层色谱法吸附薄层色谱的原理是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力，以及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使之各成分达到分离的目的。
二、薄层色谱条件的选择
㈠ 吸附剂吸附剂的条件吸附剂的种类
⑴ 硅胶
⑵ 氧化铝
㈡ 展开剂色谱分析的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。展开剂的选择正确与否对于能否成功地进行薄层分离至关重要。
薄层色谱条件选择的基本原则：当用亲水性吸附剂进行色谱时，如果被分离物质极性较大，应采用吸附性较弱的吸附剂和极性较大的展开剂；如果被分离物质亲脂性较强，应采用吸附性较强的吸附剂和极性较小的展开剂。
三、薄层色谱操作步骤制薄层、点样、展开、显色、定性、定量
㈠ 薄层制备吸附剂的加液量必须适宜；
研磨不宜过于剧烈；
调制匀浆时间宜适宜；
调制匀浆的量要根据薄层板的面积和薄层的厚度而定。
涂好吸附剂的薄层板，应先晾干再活化。
㈡ 点样直接点样法间接点样法
㈢ 展开
㈣ 显色物理显色法
⑴ 观察显色斑点
⑵ 荧光猝灭法
⑶ 促使被分离化合物在紫外光照射下，与化学显色剂进行反应而产生色斑。
化学显色法酶化学显色法
㈤ 定性分析法与已知标准品比较采用两种以上展开剂使用专属显色剂加大展开距离制备衍生物
㈥ 定量分析目视直接比较法（标准系列法）
最低检出量法（稀释定量法）
限量法薄层扫描法斑点面积测定法
对饲料中的有毒有害物质进行定性定量分析是饲料卫生检验的内容之一。由于检验的目的、被检测物质的性质以及它们在饲料中的含量不同，所选用的方法也各不相同。在饲料卫生检验中，应用最多的是薄层层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法以及荧光分析法等。
第一节 饲料卫生检验常用分析方法气相色谱法气相色谱法（Gas chromatography，GC）是以气体作为流动相对混合组分进行分离分析的一种色谱方法。
此法特别适用于分子量小于300，加热有一定挥发性物质的分析。目前，多种真菌毒素、有机磷农药、有机氯农药的气相色谱分析已有报道。
二、高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是利用高压输送的液体作为流动相的一种色谱方法。
高效液相色谱仪由于采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具有高压、高速、高效和高灵敏度等优点。HPLC是将样品制成溶液进样，不经过气化，所以不受样品挥发性的约束。故尤其适用于一些挥发性低、热稳定性差、分子量较大的高分子化合物及离子型化合物的分离分析。在饲料卫生检验中，此法已用于苯并（a）芘、黄曲霉毒素、有机磷农药以及有机氯农药等分析。
三、薄层色谱法薄层层析法（Thin Layer Chromatography,TLC）是将固定相均匀地涂布于玻板上制成薄层，以液体作为流动相，对混合组分进行分离、定性、定量的一种方法。薄层层析法是一种经典色谱方法，由于它具有不需要任何仪器设备，操作简便、快速、灵敏度高、分离效果好等优点，因而在饲料毒物分析中应用十分广泛。
四、原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法（Atomic Absorptive Spectrometer,AAS）利用待测元素的基态原子蒸汽对特定波长的谱线光有吸收作用，根据特征性谱线光被吸收的程度来测定试样中待测元素含量的方法。
AAS是测定进素元素含量的重要手段之一。本法具有选择性好（通常情况下共存元素不产生干扰，试样不需纯化）、灵敏度高（可达ppm,甚至ppb）、重现性好、分析速度快等优点。因而被作为饲料卫生检验的标准方法之一。
缺点：对不同的分析项目，其测定条件不同，特别是要求具有不同的光源灯。另外，仪器昂贵，因此，其应用面和程度受到限制。
五、紫外—可见分光光度法
（Visible and Ultraviolet Absorption Spectrum）
根据朗——比耳定律，当一束平行的单色光通过某一种均匀透明的稀溶液时，溶液的吸光度（或称光密度）等于吸光系数乘以溶液的厚度乘以溶液的浓度，即A=K×C×L，K表示某种物质溶液对某特定波长光的吸收能力,与溶液的浓度及厚度无关。紫外—可见光光度仪即根据这一原理，用棱镜或光栅将光源的光线分成单色光，用一定厚度的液槽（或称比色杯，常是0.5cm、1cm、2cm、5cm），通过比较待测液与标准溶液的吸光度，求出待测溶液的浓度。
紫外光源用于测定具有共轭双键结构的无色物质；可见光源用于测定一般的有色物质。
本法灵敏度高，操作简便，快速，廉价，因而在饲料卫生检验上应用很广。
近年来又出现了双波长分光光度法（Dualwavelength Spectrophotometry）。这是一种新技术，不用参比液，而是选用两种不同的波长，λ1与λ2的光束通过一个样品,测定在这两种波长下的吸收度差值,其中λ1下的吸收度为参比吸收度,λ2下的吸收度为测量吸收度。此法最突出的优越性是不仅对吸收光谱互相重叠的混合样品可以不经分离直接测定，而且可以测定混浊样品。
六、荧光分析法荧光分析法（Fluorescence analysis）是利用某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和强度，对物质进行定性或定量的方法。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样用量少、方法简便和能提供较多的理论参数等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量，其检出限可达ppb乃至ppt级。在饲料卫生检验中，常用于黄曲霉素、苯并（a）芘、铅等物质的测定。但从总的来说，由于能产生荧光的物质不是很多，故应用范围不如分光光度法。
七、离子选择电极法根据电化学原理，在一个由参比电极和某种特定电极（离子选择性电极如氟电极等）组成原电池中，原电池的电位与溶液中该离子的活度之对数成正比：即
E=E0±lgα(
式中：E为原电池的电极电位；
E0为常数项,取决于参比电极和溶液的离子活度；
R为气体常数,即8.315焦耳/度；
T为绝对温度,即273+t℃；
F为法拉第常数,96500库仑；
n为待测离子的价数；
为该直线在一定温度下的理论斜率
α(为待测溶液中某离子的活度,在稀溶液中,离子浓度就是该离子的活度。
离子选择电极法就是根据以上原理，通过测定原电池电位的变化，来对被测定溶液中某离子的浓度进行定量的一种分析方法。本法操作极为简便，灵敏度较高，且样品不需作复杂的处理。但本法尚有一些缺点，主要是精度差，重现性不好，需进一步完善。目前离子选择电极的品种很多，有K、Na、Ca、F、NO、SO等。在食品卫生检验中作为标准的分析方法是氟离子选择电极法。
八、放射免疫测定法放射免疫测定法（Radio Immuno Assay RIA）是一种将放射性同位素测量和免疫反应原理相结合的同位素体外检测法。
RIA的基本原理是利用标记抗原（Ag*）与未知抗原（Ag）和特异性抗体（Ab）间发生竞争作用来测定抗原（毒物或药物）的浓度。
因免疫反应的本质是抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物。放射性同位素与抗原相结合形成标记抗原，与其相应的特异性抗体产生抗原抗体反应。
Ag（未标记抗原） AgAb（未标记抗原抗体复合物）
+Ab +
Ag*（标记抗原） Ag*Ab（标记抗原抗体复合物）
“未结合状态”,结合状态”
（Free） （Bound）
在上述免疫反疫中Ab对Ag*与Ag之间没有选择性，具的相同的亲和力，结合的机会相等。这就是说未标记抗原遇到特异抗体要发生抗原抗体反应，生成抗原抗体复物。标记抗原遇到特异性抗体也会发生抗原抗体反应，形成标记抗原抗体复合物。所以说标记抗原（Ag*）及未标记抗原（Ag）与特异性抗体间发生竞争作用（Compefitive reaction）。因此，如果我们将要测定的抗原先进行标记，然后将一定量的标记抗原（Ag*），一定量的抗体（Ab）与未标记的抗原（Ag，待测毒物）相混合，则无论是Ag*或Ag都要与Ab发生竞争作用而形成竞争结合。如未标记抗原浓度增大，则Ag*Ab复合物浓度就减少。因Ag*对Ab的结合被Ag的竞争所抑制；反之如未标记的抗原浓度减少，则Ag*Ab复合物的浓度就增大。因而在一定量标记抗原，一定稀释度的抗体与待测的未知量抗原作用一定时间后，用放射性同位素的方法来测量标记抗菌素原抗体复合物的放射性，即可测出毒物的含量。测定时，先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原与抗体作用，测定各种标准浓度抗原的标记抗原抗体复合物的放射性结合率（B%），即可绘成标准曲线。即标准竞争抑制曲线。然后取一定量样品按同法进行测定，再根据被测抗原的放射性结合率（B%），就可从标准竞争抑制曲线中查出相应的该抗原的含量，即预测定的毒物之含量。
RIA由于具有灵敏度高（可检测10-9~10-12g）、特异性强、用样量少（0.1~1ml）等特点，所以应用越来越广，发展也更加迅速。其突出特点是样品可不必纯化处理，所以应用其进行的药物与毒物的种类越来越多。目前已将RIA商品化，标准化，成套出售RIA试剂盒以及自动化测录的同位素计数仪的配备，使RIA的应用更加方便。
第二节 薄层色谱法薄层色谱法是色谱法的一个重要分支。由于该法具有设备简单、操作方便、对混合组分的分离效果好等优点，故广泛应用于饲料中农药、真菌毒素等的分离和分析。
薄层色谱根据分离的机理不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和凝胶过滤薄层色谱等四种。考虑在饲料卫生检验中的实际应用情况，这里只介绍吸附薄层色谱。
吸附薄层色谱的原理吸附薄层色谱主要是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的不同，及展开剂对它们的解吸附能力不同，使各成分达到分离的目的。
凡具有吸附能力，能将溶液中的一些成分吸附到它表面的固体物称为吸附剂，吸附剂的吸附活性主要由物质的表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附剂对各种有机化合物能表现出不同的吸附活性。用一定的溶剂系统展开时，由于溶剂与样品组分争夺吸附剂表面，产生竞争吸附作用，因此，产生了吸附与解吸附的过程。可见，薄层分离过程实际上是一个吸附、解吸附、再吸附、再解吸附……的连续不断的循环过程。各种化合物，由于结构和性质上差异，表现出在吸附上所受吸附力就不同，一定展开剂对它们的解吸附难易程度也就不同，因此，各种化合物组分展开时彼此程度不同地被分离，性质差异越大，分离效果越好。
二、薄层色谱条件的选择要想得到理想的薄层色谱结果，首先要处理好吸附剂、展开剂和被分离成分三者之间的关系。
㈠ 吸附剂
1、吸附剂的条件薄层吸附色谱要求吸附剂有较大的表面积及适当的吸附能力，与被分离物质、溶剂、展开剂不发生化学反应，在所用的溶剂及展开剂中不溶解，颗粒均匀。
吸附剂的种类薄层色谱所用吸附剂种类很多，在饲料卫生检验中最常用的吸附剂有硅胶和氧化铝。
⑴ 硅胶 硅胶是一种微酸性的无机吸附剂，由硅胶酸脱水而成。具有多孔性硅氧环的交链结构，由于其骨架表面有很多硅醇基（—Si—OH），能和许多化合物形成氢键而具有吸附能力，同时也可通过氢键吸附多量的水分。硅胶吸附的水越多，则吸附的活性也越低。若吸附水量超过17%，则硅胶的吸附能力很弱，一般就不作为吸附剂应用，而只能作为分配色谱的支持剂（载体）。当将硅胶加热至100~110℃时,可除去硅胶所吸附的水,重新显出吸附活性。但加热温度不能太高，若超过500℃，硅胶结构中彼此邻近的硅醇基将会互相脱水成硅氧环结构，将使硅胶形成不可逆的失水，而失去吸附活性，一般到170℃时，即有少量硅醇基相互脱水。
│硅氧环│
—Si—O—Si—OH
硅胶上的硅醇基能一定程度的解离，显弱酸性(pH3~5)。所以硅胶适用于中性或酸性物质的分离。相对地说，更适于分离疏水性物质，所以常用于有机磷、黄曲霉素等物质的分离分析，是目前应用很广的薄层吸附剂。
目前常用的商品硅胶有以下几种：
硅胶H 不加粘合剂的硅胶。
硅胶G 加粘合剂的硅胶，一般加10~13%的石膏粉。
硅胶HF254 含荧光物质但不含粘合剂的硅胶。它可以在短波紫外线光照下显出荧光。
⑵ 氧化铝 是微碱性的吸附剂，其吸附能力较硅胶强，适用于中性或碱性的亲脂性化合物的分离。它不像硅胶那样含有较多的氯化物，因而常用于有机氯及氨基甲酸酯类农药的分析。
市场上氧化铝常见的有氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF和氧化铝 等。粒度一般为40um。
硅胶和氧化铝的吸附能力与自身的含水量有关，含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。按含水多少通常将它们的活性分为五级，I级吸附力最强，V级吸附力最弱。薄层色谱通常要求活性为II~III级，故必须通过活化或减活进行调整。活化是将吸附剂在一定温度下加热，除去吸附剂中所含的水分使其吸附活性提高，吸附能力加强的过程。相反在吸附剂中加入一定量的水分，使其吸附活性降低的过程称为减活。
（二）展开剂
薄层的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。展开剂的选择正确与否对于成功地进行薄层分离是非常重要的。
在吸附薄层色谱条件选择时，必须从吸附剂、展开剂,被分离物质三者综合考虑。这三者的相互关系可由图1—1简明表示。
薄层色谱条件选择的基本原则：当用亲水性吸附剂进行色谱时，如果被分离物质极性较大，应采用吸附性较弱（活度低）的吸附和极性较大的展开剂；如果被分离物质亲脂性较强，应选用吸附性较强（高活度）的吸附剂和极性较小的展开剂。
在实际工作中，由于吸附剂,被分离物质及展开剂三者之间，前两者的性质在一定条件下是固定的，因此，选择合适的展开剂是提高薄层分离效率的关键。为了达到良好的分离效果，消除斑点的拖尾现象，并使斑点轮廓清晰，展开剂通常采用两种或两种以上有机溶剂组成的混合溶剂系统。这种混合溶剂系统由“基础溶剂”（即底剂）和“洗脱溶剂”（即推进剂）组成。底剂通常用极性小的溶剂，如丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等。由于展开系统极性过强或过弱，均会影响色谱分离效果，展开剂极性过强，绝大多数组分被推至前沿重叠；而过弱则绝大多数组分留在原点附近而不能分离。因此。使用时，需通过调节底剂和推进剂的比例来改变展开剂的极性，使被分离物质得到更好的分离效果。通常希望展开后，被测组分的比移值（即试样斑点中心至原点距离与溶剂前沿至原点的距离的比值，Rate of flow，简写Rf）在0.2~0.8分离。
三、薄层色谱操作步骤薄层色谱操作一般包括制板、点样、展开、显色、定性、定量等几个步骤。
㈠ 薄层板的制备常用玻璃板作为载板，预先必须清洗干净，并且晾干。制备时根据玻板的大小和所需薄层的厚度，按每100cm称取1.0~1.5g置研钵中，加2~3倍量水，适当研磨，调成匀浆，迅速倒于干洁的玻板上，用玻棒将吸附剂铺平，振动玻板，使吸附剂均匀分布，然后先自然晾干再根据需要进行活化。
薄层制备时的注意事项：
1、吸附剂的加液量必须适宜，加液量过多，吸附剂不易形成凝胶，固化时间延长，且容易留下波纹状痕印或斑迹。加液量过少，凝胶化过速容易堆积过厚，不仅涂布不匀，而且易造成薄层龟裂或皱褶。
2、研磨时，不宜过于剧烈，以免产生气泡，造成薄层上有麻点。
3、调制匀浆时间应适宜，一般研磨时间以1~2min为宜。时间过长会使凝胶水分溢出，结构破坏，并在研钵上自行固化，以致无法涂布。
4、具体调浆时所需的量要视薄板的面积和厚度来定，一般用作定量分析的薄层，其厚度以0.25~0.30mm为宜。若过厚，其灵敏度太低。过薄，虽然灵敏度高，但经展开后，被测物质的比移值规律性差，且展开速度较慢。在实际工作中，用于测定有机氯的板要薄一些（0.25mm），用于测定有机磷的板可稍厚些（0.4~0.5mm）。至于每块板所需称取多少吸附剂，这要根据试验确定，例如涂一块5×15cm的硅胶G板，需0.8g左右；如果是氧化铝板，须1.8g左右。当然，由于涂布方法不同，所需的量也会有所差异。
5、涂好吸附剂的薄层板，应先晾干再活化。即先放在水平的桌面上让其自然干燥。如果未干燥就加热活化，会因水分蒸发过快，而在薄层上出现气泡或龟裂。晾干后再根据需要进行活化，对于硅胶板来说，于105~110℃活化半小时便符合要求。活化好的薄层板应放在干燥器中，一般可保存二周，如果超过时间，应重新进行活化。
㈡ 点样在薄层定量分析中，要求点样的原点大小一致，并且要求尽可能小，一般直径不超过3mm。目前常用的点样方法有直接点样法和间接点样法两种。
1、直接点样法先在已准备好的薄层板上作记号，距底边2cm为基线，距基线10cm或15cm处作为展开溶剂的前沿线。然后用微量点样器直接将样品液点在基线上，每点的间距为1.5cm。边点样边用热风缓缓吹原点，使溶剂迅速挥发，以免原点面积过大。点样既要细心，不要截破薄层板上的固定相，以免形成不规则的斑点而影响比移值的正确测量；又不能过慢，一般不应超过10min。否则薄层板在空气中暴露时间过长，会吸收水分而改变其活度，从而影响分离效果。
直接点样法操作简便，是最常用的点样方法。但很难使原点面积大小一致，也很难控制直径在3mm之内，而且又容易损伤薄层的表面，特别是在薄层板上进行测定面积时，这些缺点会影响结果。
2、间接点样法（滤纸移样法）
先将样品液分次缓缓样于直径为2~3mm的色谱滤纸上。另用打孔器在薄层上打一相同直径的小孔，然后将点好样的滤纸片放入小孔内。此法优点是可点较多的样液，而且斑点很集中。这样用斑点面积法进行定量比较准确，但操作较麻烦。
㈢ 展开展开（亦称展层）就是将薄层板点有样液的一端浸入展开槽中的展开剂（其深度必须低于点样原点。一般以1cm为宜），由于溶剂推动样点中物质自下而上的移动，并使之达到彼此分离的操作过程。根据展开的次数和方向，可分为一次展开、多次展开、双向展开。
1、一次展开用一种或一种以上的溶剂组成的展开系统一次展开至前沿，然后挥干、显色。
2、多次展开使用一种展开剂展开至前沿后再用同样展开剂或另换别种展开剂进行第二次或更多次的展开，这样可以使比移值接近的不同组分得到较好的分离。
3、双向展开是同一块薄层板沿两个不同方向，用两类性质不同的溶剂进行展开的方法。适用于多组分混合物的分离。同时，此法刀可用于纯化处理，即将薄层板用弱极性的溶剂先横向展开一次，将色素、脂肪等干扰杂质推到薄层边缘，然后将薄层板转90度，再用极性较强的溶剂纵展一次。这样可以排除杂质的干扰，获得清晰的样品斑点。
展开过程中，有时会出现前沿线弯曲，经显色后，并列点加样品的斑点却不在同一条线上，而出现斑点形状、大小不规则、比例值改变的现象，这种现象称为边缘效应。
产生边缘效应的原因是由于展开槽中溶液不饱和状态和展开剂在薄层板不同部位分配不同的缘故。即当混合溶剂在薄层上展开时，极性弱的低沸点溶剂在薄层边缘挥发得快，在边缘部分比中心部分含有更多的极性较大溶剂，从而使边缘斑点的比移值高于中部斑点的比移值。
消除边缘效应的方法，可在展开前取一大小适宜的洁净滤纸，折成圆筒形垫在展开槽的内壁，浸在展开剂中充分润湿，通过滤纸上的溶剂分子的扩散，使溶剂蒸汽在展开槽内达到饱和，再将薄层板放入槽内展开。当前后二次展开后，同一组分的比移值差异大于±0.02%时，一般应更换新的展开剂。
㈣ 显色显色是薄层色谱的重要步骤。当薄层经展开后，除组分本身有色者可直接观察斑点外，通常都需通过显色来观察被分离化合物的比移值及斑点面积，这是薄层定性和定量的基础。常用的显色方法有以下几类：
1、物理显色法薄层的物理显色法主要是运用紫外光作为光源。常用的紫外光的短波（254nm）和长波（365nm）两种。物理显色法又可分为以下三种：
⑴ 观察荧光斑点 这种方法适用于在特定的波长条件下产生荧光的物质。将展开后的薄层板直接放在紫外灯下照射，此时某些被分离化合物在黑色背景下显示出荧光斑点。
⑵ 荧光猝灭法 这种方法主要用于对短波紫外线有一定吸收能力的物质。即含有荧光物质的薄层板在紫外线光照射下显示出荧光背景，而那些对短波紫外光有一定吸收能力的化合物由于吸收作用而形成荧光猝灭，其斑点显黑色。所用含荧光物质的吸附剂有硅胶GF254、氧化铝GF254等。
⑶ 被分离的化合物在紫外光的照射下，与化学显色剂进行反应而产生色斑。如有机氯农药在喷洒硝酸银显色剂后，在254nm紫外光照射下可产生黑色斑点。
mAgClAgCl2·AgCl·nAgCl2+Ag+AgclO·AgCl·AgO
2、化学显色剂借助于被分离的化合物，在薄层板上与化学显色剂进行化学反应，产生有色化合物，从而显示出色斑的位置。常用的显色剂进行有碘—碘化钾溶液（对许多物质都显黄棕色）；磷钼酸乙醇溶液（对还原性物质显蓝色）；硝酸银溶液（对还原性物质显黑色），还有用浓硫酸使有机物产生黑色的碳化斑点等。
化学显色法通常用喷雾器将显色剂喷洒在薄板上。喷雾时，喷雾器距薄层板的距离要适当，压力大小也要合适，使喷出的液滴均匀分布在薄层上。以喷至板面湿润或呈半透明为止。
用化学显色剂是薄层显色中最常用的方法，但很多显色剂有毒或有强烈的腐蚀性，所以喷洒操作应在通风柜中进行。另外，薄层板背后以玻璃板为衬底，以免腐蚀其它物品。
酶化学显色法利用酶抑制技术，在薄层板上进行酶化学反应，从而显示出斑点的方法。有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，对各种酯酶有抑制作用，使酶的活力降低而不能分解基质，通过检查是否有基质的分解产物，便可确定是否有这类农药存在。如测定有机磷农药，常用乙酸—β—萘酯作基质，以鼠肝作酶源，当不存在有机磷农药时，酶能促使乙酸—β—萘酯水解成β—萘酚和乙酸。加牢固蓝B盐作显色剂，使β—萘酚生成红色化合物。而在有机磷农药斑点处，由于抑制了酶的活性，就无水解产物，不产生红色，便与背景颜色不同而显出农药斑点。
㈤ 定性分析从理论上讲，在特定的条件下，被分离化合物的Rf值是该物质的特性常数，故可作为物质定性的依据。但事实上由于影响比移值的因素很多，如吸附剂的质量和活度、薄层厚度、展开剂的质量和配比误差、展开槽内溶剂蒸汽的饱和程度、空气的相对湿度、展开时的温度、展开方式以及点样量等都会影响比移值，故薄层色谱的比移值往往不很稳定，重现性不好，所以在实际工作中，多采用以下几种方法综合进行定性。
1、与已知标准品比较即将待测样品液和标准液点于同一块板上,根据展开后两者的Rf值是否一至来决定是否是同一物质。此法由于在相同的条件下进行展开、显色、比较，可以排除多种因素的干扰，因此结果较准确可靠。
2、采用两种以上展开系统化合物的比移值是一种物理常数，结构相似的同类物质，比移值可能非常接近。因此，为了鉴定工作准确无误，至少要用两种以上的展开剂系统，当在各种展开剂系统中，样品与标准品的RF值都相同时，才能确定是同一物。
3、使用专属显色剂或多种显色剂专属显色剂是通过和某些基团起一定化学反应而显色的。因此，定性检验时应当用专属性显色剂，这样可以排除一些杂质的干扰。因此在实际工作中，为了使结果准确无误，还可选用几种显色剂并用。
4、加大展开距离，使样品与标准品的差异显示出来，再观察其RF值是否一致。
5、将样品和标准品均转变成衍生物，观察RF值改变是否一致。如在黄曲霉毒素的定性检验时，为了排除其它可能产生荧光的杂质的干扰，常在标准样点上和试样点上滴加三氯乙酸，使黄曲霉毒素的三氯乙酸反应，形成一种衍生物，然后再展开，观察衍生物的RF值是否仍然一致。
㈥ 定量分析薄层的定量分析方法基本上可分为两大类，一类是在薄层板上直接进行测定。即用肉眼或仪器比较待测样品与标准样品色斑的大小和颜色深浅或荧光的强弱进行定量。另一类是将薄层板上被分离化合物的斑点区的吸附剂剥离下来，在用适当的溶剂提取被分离的化合物，然后用其它的含量测定方法进行测定。在饲料卫生检验中主要是用第一类方法。这类定量测定方法又可分为目视直接比较法、最低检出量法、限量法、薄层扫描法、斑点面积测定法等五种。
1、目视直接比较法（标准系列法）
在同一块薄层板上，分别点上待测样品液及一系列不同含量的标准溶液，进行展开显色后，观察比较样品斑点和标准斑点的面积大小和颜色深浅，找出与样品斑点相当的标准斑点，按标准点的组分含量，不致于斑点颜色过深。
最低检出量法（稀释定量法）
先将不同浓度的标准溶液进行点样、展开、显色，以确定在特定的实验条件下标准物质的最低检出量（即刚能显示出斑点）。
然后在相同条件下，将样品液的标准液（最低检出量）点样、展开、显色、比较。如果可以找出和标准溶液最低检出量的斑点相同者，就可认为此点的样品液含有与最低检出量相同的待测物质。如果斑点大小、颜色深浅（或荧光强度）不同，则需进行稀释或浓缩，也可减少点样量或增加点样量，直至样品斑点与标准物质最低检出量斑点相同为止。最后求出样品中待测物质的含量。此法常用于测定黄曲霉毒素。
限量法该法是根据国家卫生标准设计出点样量，将该点样量的标准液点在薄层板上，然后将待测的样品液按卫生标准算出的点样量点在同一薄层板上，经展开后，显色，分别观测各样点是否超过标准。
本法不需分析每个样品的具体含量，这样可以大大减少分析工件量，既省时又节省药品，对搞普查时作大批量样本的筛选很方便。但此法缺点是只能粗略地作限量检查。
薄层扫描法本法是用薄层扫描测定仪直接在薄层板上测定斑点的颜色深浅或荧光强度的一种方法。
作法是在制好的薄层板上点加样品液的标准液，经展开、显色后，置薄层扫描仪上扫描，扫描时，组分斑点吸收待征波长的单色光，剩余的单色光经透射或反射或发出荧光，由检测器检测，从而获得该点面积的待测物质含量。
本法准确度高，重现性好，分析迅速，大大提高了薄层分析的精度。
斑点面积测定法斑点面积测定法是用一定的测量工具测出斑点面积，然后再根据经验公式计算待测物质的定量方法。
根据S.J.Purdy原理，在展开的薄层上，物质含量（W）的对数和斑点面积（A）的平方根成线性关系，即=mlogW+C。根据此原理，在测量时，准备一个待测试样、一个标准溶液和一个标准溶液的稀释液，按等体积量点在同一薄板上展开、显色后，测量各斑点的面积：
=mlogWs+C
=mlogWd+C
=mlogW+C
由以上三式可得：logW=logWs-logd′
式中：W为样品检测量；
Ws为标准样量；
Wd为稀释标准样量；
d′为标准品稀释倍数的倒数；
A为样品斑点面积；
Ad为稀释后的标准斑点面积；
As为标准斑点面积。
第二节 薄层色谱法吸附薄层色谱的原理是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力，以及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使之各成分达到分离的目的。
二、薄层色谱条件的选择
㈠ 吸附剂吸附剂的条件吸附剂的种类
⑴ 硅胶
⑵ 氧化铝
㈡ 展开剂色谱分析的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。展开剂的选择正确与否对于能否成功地进行薄层分离至关重要。
薄层色谱条件选择的基本原则：当用亲水性吸附剂进行色谱时，如果被分离物质极性较大，应采用吸附性较弱的吸附剂和极性较大的展开剂；如果被分离物质亲脂性较强，应采用吸附性较强的吸附剂和极性较小的展开剂。
三、薄层色谱操作步骤制薄层、点样、展开、显色、定性、定量
㈠ 薄层制备吸附剂的加液量必须适宜；
研磨不宜过于剧烈；
调制匀浆时间宜适宜；
调制匀浆的量要根据薄层板的面积和薄层的厚度而定。
涂好吸附剂的薄层板，应先晾干再活化。
㈡ 点样直接点样法间接点样法
㈢ 展开
㈣ 显色物理显色法
⑴ 观察显色斑点
⑵ 荧光猝灭法
⑶ 促使被分离化合物在紫外光照射下，与化学显色剂进行反应而产生色斑。
化学显色法酶化学显色法
㈤ 定性分析法与已知标准品比较采用两种以上展开剂使用专属显色剂加大展开距离制备衍生物
㈥ 定量分析目视直接比较法（标准系列法）
最低检出量法（稀释定量法）
限量法薄层扫描法斑点面积测定法
