免疫学及免疫学检验免疫电泳技术毛旭虎
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室
二 OO二年四月免疫学及免疫学检验第一节 概述免疫电泳技术实质上是 直流电场作用下的凝胶扩散试验 。
Grabar和 Williams于 1953年首先将凝胶扩散置于直流电场中进行，让电流加速抗原和抗体的扩散，并规定其运动方向，从而使这种沉淀反应时间大缩短，敏感度显著提高。随着现代生物学医学科学技术的发展，免疫电泳技术有了新的发展，应用范围日益扩大，不仅用于人与动物血清蛋白、各组织器官抗原成分及抗体的分析，
也用于细菌、植物性抗原、酶与激素的检测。
免疫学及免疫学检验
一、电泳的原理
带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这种现象称为电泳 。 抗体及大多数抗原是蛋白质,具有许多可解离的酸性和碱性基团如
COO— 及 NH3+等,在一定 pH条件下,这种两性电解质解离成为带正电或负电的质点,其泳动方向和泳动速度与本身净电荷量,颗粒大小,
形状等有关 。 所带净电荷量越多,颗粒越小,
泳动速度越快 。
免疫学及免疫学检验二、影响因素
1,电场强度 是指每厘米的电位降,以 V/cm表示 。 电泳时,可采用恒定电流,变动电压；
也可恒定电压,变动电流 。 I=V/R,恒定电压时,因 R不断下降,所以电流增高,颗粒移动速度和热效应也增大 。 通常采用电压在
2~10V/cm；当恒定电流时,由于 R不断下降,
因此,V也随之下降,从而蒸发较少,热效应也小,移动率接近恒定 。 因此恒定电流要比恒定电压好 。 常用电流为 2~4mA/cm。
免疫学及免疫学检验
2,溶液 pH值 溶液 pH值决定蛋白质带电荷种类和数量 。 pH离等电点越远,离子解离越多,泳动速度越快,反之则越慢 。
为了使电泳速度恒定,必须采用缓冲溶液 。 由于大多数蛋白质的等电点较低,
一般电泳所采用的缓冲溶液均偏碱性,
因而使大部分的分子带负电荷 。
免疫学及免疫学检验
3,离子强度 溶液的离子强越高,电导率越高,则带电质点泳动速度越慢并有较高的热效应；反之,离子强度低,质点泳动快,热效应较小 。
免疫学及免疫学检验
4,电渗 在电场中液体相对于固体的移动称为电渗 。 在琼脂凝胶电泳中,由于琼脂是带负电荷的极性基团 (如 SO42—,COO— ),使琼脂成为负电的固相,静电感应作用使琼脂网格附近的水带正电,因此,液体向负极流动,
形成电渗力 。 带电质点泳动时受电泳力和电渗力的共同作用 。 如电泳力低于电渗力,则向负极移动 。 如抗体,在碱性环境带负电,
应向正极移动,但由于其等电点较高,电荷少,抵不过电渗力而泳向负极 。
免疫学及免疫学检验第二节 对流免疫电泳对流免疫电泳 (counter immunoelectrophoresis,
CIEP) 又 称 免 疫 电 渗 电 泳 (immuno-
osmophoresis,IEOP)。 是在直流电场中进行的免疫双扩散技术 。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理在 pH8.6的琼脂凝胶中,抗体球蛋白因等电点高,只带有微弱的负电荷,而且分子又较大,
因此电泳力小,小于电渗力,泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷,分子较小,
电泳力大,大于电渗力,泳向正极,电泳时抗原放负极侧,抗体放正极侧,抗原抗体相对泳动,一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇,
在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线 。
免疫学及免疫学检验
(二 ) 操作步骤
1,制备 1.2%巴比妥琼脂凝胶板 。
2.在琼脂板上成对打孔,孔径 3mm,孔距 6mm。
3.于阴极侧孔内加入待检血清或阳性对照血清,
阳极侧孔内加抗血清 。
4,电泳 电泳条件 3~4mAcm宽,电泳 30min。
5,观察结果或在室温放置数小时后观察沉淀线，
见图。
免疫学及免疫学检验
1为阳性
2为弱阳性
3/4为强阳性免疫学及免疫学检验
(三 ) 方法评价对流电泳简便,快速,敏感度较双相琼脂扩散试验高 8~10倍,但分辨力低于双向琼脂扩散试验 。
免疫学及免疫学检验第三节 火箭免疫电泳火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis,RIE)
技术是把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀形似火箭，故称为火箭电泳。也有人称其为电免疫扩散 (electro-immunodiffusion,EID)。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理将待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，
在抗原与抗体达到适当比例时形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭峰状沉淀 (见图 )。峰形高低与抗原量成正比。
免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验
(二 )操作步骤
1,制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的 1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷却至 55℃ 左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。
2,打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径 3mm，孔距 2mm。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样 10μl。
3,电泳 样品孔放负极侧，电压 8~10V/cm或电流 3~5mA/cm，电泳
6h。
4,观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。
5,绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标 (对数坐标 )，
绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度。
免疫学及免疫学检验火箭电泳图
①②③为标本；④⑤⑥为标准抗原免疫学及免疫学检验
(三 ) 方法评价火箭电泳是一种操作简便,省时,结果重复性好的定量检测方法 。 其敏感度可测 0.3mg/L抗原含量,若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰 。 如加入少量 125I标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳,形成的不可见火箭峰,经洗涤干燥后,用 X线胶片感光,经显影和定影,
可呈现同位素显影,这就是放射自显影技术,
可用于微量抗原含量测定,如测定血清 AFP或
IgE含量,可测至 μg/L水平 。
免疫学及免疫学检验
(四 ) 注意事项
1,所用琼脂应是无电渗或电渗很小,否则火箭峰形状不规则 。
2,观察峰形可判断电泳终点,如电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形,表示抗原未达到终点,
应继续电泳 。
3,待检标本数多时,应将琼脂板置于电泳槽上,
搭桥并开启电源后加样,否则易出现宽底峰形,影响正确判断结果 。
免疫学及免疫学检验第四节 免疫电泳免疫电泳 (immunoelectrophoresis,IEP)是将区带电泳和双相琼脂扩散相结合的一种免疫化学分析技术 。 1953年 Grabar首先应用该方法进行抗原抗体分析 。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理先将待检标本在琼脂凝胶中进行电泳,不同的抗原成分由于所带电荷、分子量及分子构型的差异，在电场作用下的泳动速度不同而被分成不同区带。然后与电泳方向平行，挖一小槽，加入含相应抗体的免疫血清，与已分离的各抗原成分在琼脂内作双相免疫扩散，
各区带在相应位置与抗体形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。
免疫学及免疫学检验
(二 ) 操作步骤
1,取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。
2,用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。
3,电泳条件以电压 4~6V/cm或电流 2~3mA/cm为宜，电泳 1.5~2h。
4,电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原，
孵育，使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。
5,观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、
染色、脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免疫电泳。
免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验
(三 ) 方法评价免疫电泳分辨率高,可分出人血清中
20~30种抗原成分,可鉴定混合抗原中各组分 。
免疫学及免疫学检验由于免疫电泳的影响因素较多,对异常结果的分析增加了复杂性 。 如沉淀弧数目不总是与混合物中应有的成分相符 。 原因有,① 抗原抗体比例不恰当,使一些成分未出现沉淀线；
② 相邻两抗原迁移率非常接近而致沉淀线重叠； ③ 一条沉淀线分离成多条 。 因此用免疫电泳技术检测多种混合物时,至少要用 3种不同的浓度,2种或 2种以上的抗体 (免疫不同动物而得 ),而且要及时观察并记录沉淀弧出现的情况 。
免疫学及免疫学检验免疫电泳可用于正常情况,免疫后以及在病理过程中血清蛋白的分析 。 在许多疾病如骨髓瘤,γ球蛋白缺乏症,肝病,白血病,弥漫性红斑狼疮等,可用该方法观察某种 Ig的超常增加或减少 。
免疫学及免疫学检验第五节 免疫转印技术
1979年,Towbin将核酸转印技术应用于蛋白质的研究,建立了蛋白质转印技术,
称 Western blot。 由于蛋白质转印技术主要用于研究抗原或抗体,所以称其为免疫转印技术 (immuno-blot)。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理免疫转印技术的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫测定结合起来,将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜 (NC膜 ),并保持其原有的生物活性,
再经荧光免疫,酶免疫,放射免疫技术等进行测定,可得以定位,定性和定量结果 。 实质上分 3步骤即蛋白质组分分离,各组分转印及免疫检测 。
免疫学及免疫学检验
(二 ) 操作步骤
1,蛋白质分离 采用聚丙稀酰胺凝胶电泳
(polyacryamide gel electrophoresis,PAGE)进行分离。
2,蛋白质转印 从凝胶上将蛋白质转移至 NC膜等固相载体的过程即为蛋白质转印。
3,蛋白质的免疫检测 将已转印 NC膜封闭,用酶免疫组化技术,免疫金组化技术等检测 。
免疫学及免疫学检验三 )方法评价免疫转印技术综合了 PAGE的高分辨力和免疫标记技术的高度特异性和敏感性。
PAGE具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应，使之具有高度的分辨力，在同一固相载体上可作多项成分的分析。随着这种固相反应基质商品化，该技术会越来越广泛地应用到医学检验工作中。
免疫学及免疫学检验应用举例：用免疫印迹法检查患者血清中的 HIV病毒抗体免疫学及免疫学检验第一步：经电泳将 HIV混合抗合抗原按分子量大小分离免疫学及免疫学检验第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上免疫学及免疫学检验第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上免疫学及免疫学检验第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上免疫学及免疫学检验第五步：加入显色底物（或放射自显影）显现第二抗体免疫学及免疫学检验
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室
二 OO二年四月免疫学及免疫学检验第一节 概述免疫电泳技术实质上是 直流电场作用下的凝胶扩散试验 。
Grabar和 Williams于 1953年首先将凝胶扩散置于直流电场中进行，让电流加速抗原和抗体的扩散，并规定其运动方向，从而使这种沉淀反应时间大缩短，敏感度显著提高。随着现代生物学医学科学技术的发展，免疫电泳技术有了新的发展，应用范围日益扩大，不仅用于人与动物血清蛋白、各组织器官抗原成分及抗体的分析，
也用于细菌、植物性抗原、酶与激素的检测。
免疫学及免疫学检验
一、电泳的原理
带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这种现象称为电泳 。 抗体及大多数抗原是蛋白质,具有许多可解离的酸性和碱性基团如
COO— 及 NH3+等,在一定 pH条件下,这种两性电解质解离成为带正电或负电的质点,其泳动方向和泳动速度与本身净电荷量,颗粒大小,
形状等有关 。 所带净电荷量越多,颗粒越小,
泳动速度越快 。
免疫学及免疫学检验二、影响因素
1,电场强度 是指每厘米的电位降,以 V/cm表示 。 电泳时,可采用恒定电流,变动电压；
也可恒定电压,变动电流 。 I=V/R,恒定电压时,因 R不断下降,所以电流增高,颗粒移动速度和热效应也增大 。 通常采用电压在
2~10V/cm；当恒定电流时,由于 R不断下降,
因此,V也随之下降,从而蒸发较少,热效应也小,移动率接近恒定 。 因此恒定电流要比恒定电压好 。 常用电流为 2~4mA/cm。
免疫学及免疫学检验
2,溶液 pH值 溶液 pH值决定蛋白质带电荷种类和数量 。 pH离等电点越远,离子解离越多,泳动速度越快,反之则越慢 。
为了使电泳速度恒定,必须采用缓冲溶液 。 由于大多数蛋白质的等电点较低,
一般电泳所采用的缓冲溶液均偏碱性,
因而使大部分的分子带负电荷 。
免疫学及免疫学检验
3,离子强度 溶液的离子强越高,电导率越高,则带电质点泳动速度越慢并有较高的热效应；反之,离子强度低,质点泳动快,热效应较小 。
免疫学及免疫学检验
4,电渗 在电场中液体相对于固体的移动称为电渗 。 在琼脂凝胶电泳中,由于琼脂是带负电荷的极性基团 (如 SO42—,COO— ),使琼脂成为负电的固相,静电感应作用使琼脂网格附近的水带正电,因此,液体向负极流动,
形成电渗力 。 带电质点泳动时受电泳力和电渗力的共同作用 。 如电泳力低于电渗力,则向负极移动 。 如抗体,在碱性环境带负电,
应向正极移动,但由于其等电点较高,电荷少,抵不过电渗力而泳向负极 。
免疫学及免疫学检验第二节 对流免疫电泳对流免疫电泳 (counter immunoelectrophoresis,
CIEP) 又 称 免 疫 电 渗 电 泳 (immuno-
osmophoresis,IEOP)。 是在直流电场中进行的免疫双扩散技术 。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理在 pH8.6的琼脂凝胶中,抗体球蛋白因等电点高,只带有微弱的负电荷,而且分子又较大,
因此电泳力小,小于电渗力,泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷,分子较小,
电泳力大,大于电渗力,泳向正极,电泳时抗原放负极侧,抗体放正极侧,抗原抗体相对泳动,一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇,
在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线 。
免疫学及免疫学检验
(二 ) 操作步骤
1,制备 1.2%巴比妥琼脂凝胶板 。
2.在琼脂板上成对打孔,孔径 3mm,孔距 6mm。
3.于阴极侧孔内加入待检血清或阳性对照血清,
阳极侧孔内加抗血清 。
4,电泳 电泳条件 3~4mAcm宽,电泳 30min。
5,观察结果或在室温放置数小时后观察沉淀线，
见图。
免疫学及免疫学检验
1为阳性
2为弱阳性
3/4为强阳性免疫学及免疫学检验
(三 ) 方法评价对流电泳简便,快速,敏感度较双相琼脂扩散试验高 8~10倍,但分辨力低于双向琼脂扩散试验 。
免疫学及免疫学检验第三节 火箭免疫电泳火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis,RIE)
技术是把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀形似火箭，故称为火箭电泳。也有人称其为电免疫扩散 (electro-immunodiffusion,EID)。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理将待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，
在抗原与抗体达到适当比例时形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭峰状沉淀 (见图 )。峰形高低与抗原量成正比。
免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验
(二 )操作步骤
1,制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的 1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷却至 55℃ 左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。
2,打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径 3mm，孔距 2mm。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样 10μl。
3,电泳 样品孔放负极侧，电压 8~10V/cm或电流 3~5mA/cm，电泳
6h。
4,观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。
5,绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标 (对数坐标 )，
绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度。
免疫学及免疫学检验火箭电泳图
①②③为标本；④⑤⑥为标准抗原免疫学及免疫学检验
(三 ) 方法评价火箭电泳是一种操作简便,省时,结果重复性好的定量检测方法 。 其敏感度可测 0.3mg/L抗原含量,若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰 。 如加入少量 125I标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳,形成的不可见火箭峰,经洗涤干燥后,用 X线胶片感光,经显影和定影,
可呈现同位素显影,这就是放射自显影技术,
可用于微量抗原含量测定,如测定血清 AFP或
IgE含量,可测至 μg/L水平 。
免疫学及免疫学检验
(四 ) 注意事项
1,所用琼脂应是无电渗或电渗很小,否则火箭峰形状不规则 。
2,观察峰形可判断电泳终点,如电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形,表示抗原未达到终点,
应继续电泳 。
3,待检标本数多时,应将琼脂板置于电泳槽上,
搭桥并开启电源后加样,否则易出现宽底峰形,影响正确判断结果 。
免疫学及免疫学检验第四节 免疫电泳免疫电泳 (immunoelectrophoresis,IEP)是将区带电泳和双相琼脂扩散相结合的一种免疫化学分析技术 。 1953年 Grabar首先应用该方法进行抗原抗体分析 。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理先将待检标本在琼脂凝胶中进行电泳,不同的抗原成分由于所带电荷、分子量及分子构型的差异，在电场作用下的泳动速度不同而被分成不同区带。然后与电泳方向平行，挖一小槽，加入含相应抗体的免疫血清，与已分离的各抗原成分在琼脂内作双相免疫扩散，
各区带在相应位置与抗体形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。
免疫学及免疫学检验
(二 ) 操作步骤
1,取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。
2,用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。
3,电泳条件以电压 4~6V/cm或电流 2~3mA/cm为宜，电泳 1.5~2h。
4,电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原，
孵育，使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。
5,观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、
染色、脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免疫电泳。
免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验
(三 ) 方法评价免疫电泳分辨率高,可分出人血清中
20~30种抗原成分,可鉴定混合抗原中各组分 。
免疫学及免疫学检验由于免疫电泳的影响因素较多,对异常结果的分析增加了复杂性 。 如沉淀弧数目不总是与混合物中应有的成分相符 。 原因有,① 抗原抗体比例不恰当,使一些成分未出现沉淀线；
② 相邻两抗原迁移率非常接近而致沉淀线重叠； ③ 一条沉淀线分离成多条 。 因此用免疫电泳技术检测多种混合物时,至少要用 3种不同的浓度,2种或 2种以上的抗体 (免疫不同动物而得 ),而且要及时观察并记录沉淀弧出现的情况 。
免疫学及免疫学检验免疫电泳可用于正常情况,免疫后以及在病理过程中血清蛋白的分析 。 在许多疾病如骨髓瘤,γ球蛋白缺乏症,肝病,白血病,弥漫性红斑狼疮等,可用该方法观察某种 Ig的超常增加或减少 。
免疫学及免疫学检验第五节 免疫转印技术
1979年,Towbin将核酸转印技术应用于蛋白质的研究,建立了蛋白质转印技术,
称 Western blot。 由于蛋白质转印技术主要用于研究抗原或抗体,所以称其为免疫转印技术 (immuno-blot)。
免疫学及免疫学检验
(一 ) 原理免疫转印技术的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫测定结合起来,将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜 (NC膜 ),并保持其原有的生物活性,
再经荧光免疫,酶免疫,放射免疫技术等进行测定,可得以定位,定性和定量结果 。 实质上分 3步骤即蛋白质组分分离,各组分转印及免疫检测 。
免疫学及免疫学检验
(二 ) 操作步骤
1,蛋白质分离 采用聚丙稀酰胺凝胶电泳
(polyacryamide gel electrophoresis,PAGE)进行分离。
2,蛋白质转印 从凝胶上将蛋白质转移至 NC膜等固相载体的过程即为蛋白质转印。
3,蛋白质的免疫检测 将已转印 NC膜封闭,用酶免疫组化技术,免疫金组化技术等检测 。
免疫学及免疫学检验三 )方法评价免疫转印技术综合了 PAGE的高分辨力和免疫标记技术的高度特异性和敏感性。
PAGE具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应，使之具有高度的分辨力，在同一固相载体上可作多项成分的分析。随着这种固相反应基质商品化，该技术会越来越广泛地应用到医学检验工作中。
免疫学及免疫学检验应用举例：用免疫印迹法检查患者血清中的 HIV病毒抗体免疫学及免疫学检验第一步：经电泳将 HIV混合抗合抗原按分子量大小分离免疫学及免疫学检验第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上免疫学及免疫学检验第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上免疫学及免疫学检验第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上免疫学及免疫学检验第五步：加入显色底物（或放射自显影）显现第二抗体免疫学及免疫学检验
