第三章 分子发光分析法
2007/09/05
第一节 分子发光法概述
分子荧光分析法 （光致发光）
分子磷光分析法 （光致发光）
化学发光分析法 化学发光分析
（利用化学反应） 生物发光分析分子发光分析法属于分子发射光谱法的范畴，具有较高的检测灵敏度，在有机大分子和生物大分子分析中有重要应用。特别是 激光诱导荧光分析法 因具有超高灵敏度而倍受关注。
几个基本概念
反磁性分子：
分子电子自旋成对的结果为 S=0。
单重态若一个分子所有的电子自旋是成对的 S=0,
那么这个分子所处的电子能态称 ~。
三重态
有机分子中的电子多为偶数，则分子中的总自旋量子数 S=0,即基态分子内的电子是自旋成对的。根据谱线多重度的定义 M=2S+1=0,此时这个分子所处的电子能态称为 单重态 。
若电子在激发态与在基态的自旋方向相同，则激发态仍是单重态，此为 激发单重态 。
若在激发过程中电子自旋方向改变，即与基态时的自旋方向相反，变为平行状态，则
S=1/2+1/2=1,M=2S+1=3，这样的激发态为 三重态 。
由于自旋平行比自旋相反的状态稳定，故三重态的能级比相应单重态的能级低。
分子在光照射时吸收特定波长的能量，由基态跃迁到激发态的各振动能级上。
分子由激发态去激发回到基态时能够产生发光现象。但去激发既可以辐射方式、也可以非辐射方式（振动弛豫、内转换、外转换、系间跨越）回到基态，所以去激发过程并不一定产生光或产生与吸收光波长相同的光。
荧光与磷光的产生过程
荧光发射,由于电子发生振动弛豫和内转换的过程远比由第一激发单重态的最低振动能级到基态的跃迁快，因此荧光发射多为由第一激发单重态的最低振动能级回到基态的各振动能级间的跃迁所产生的辐射。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。
荧光与磷光的产生过程
磷光发射,电子由第一激发三重态的最低振动能级回到基态各振动能级的跃迁产生磷光。
三重激发态能量低于单重激发态，故产生磷光的波长要比产生荧光的波长长。
荧光与磷光的产生过程第二节 分子荧光分析法一,荧光光谱
1,荧光光谱的产生
2,荧光光谱的基本特征
3,荧光效率和荧光物质
4,影响荧光强度的环境因素
5,化合物的结构与荧光
1,荧光光谱的产生分子吸收辐射后可能激发为第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，这种激发态分子以热的形式损失其振动能后下降为第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）；然后再以辐射的形式跃迁为电子基态的任一振动能级，即产生荧光，并进一步以无辐射跃迁形式回到基态的最低振动能级。
2,荧光光谱的基本特征
a,Stokes位移在溶液中，分子的荧光发射光谱的波长总比激发波谱的长，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长处，称为 ~。
原因：激发与发射之间产生了能量损耗
2,荧光光谱的基本特征
b,发射光谱的形状与激发波长无关所发射的荧光光谱由第一激发单重态和基态之间的能量差决定，与激发波长无关。
c,镜像规则通常荧光发射光谱与它的激发光谱形状呈镜像对照关系。
3,荧光效率和荧光物质物质发荧光的能力，通常用 荧光效率 （或称 荧光量子产率 ）来描述荧光辐射跃迁几率的大小。荧光效率定义为发荧光的分子数与激发态分子数目的比值。
荧光效率（ φf ） =发荧光分子数 /激发态分子数
φf 决定于物质的分子结构，也受化学环境的严重影响
（温度、溶剂、酸度）。
荧光分子：能产生荧光的分子称为荧光分子。
荧光物质通常为含有苯环或稠环的刚性结构有机分子，典型的如荧光素的分子结构。
3,荧光效率和荧光物质分子产生荧光的必备条件
分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；
吸收了与其本身特征频率相同的能量后，
还必须具有一定的荧光效率 (荧光量子产率 ) 。
4,影响荧光强度的环境因素
a,溶剂的影响除对光的折射、散射外，溶剂的影响主要表现在溶剂的极性、氢键及配位键的形成等。
溶剂极性增大，通常使荧光光谱红移；
氢键和配位键的形成，改变荧光强度和形状。
4,影响荧光强度的环境因素
b,温度的影响温度增加，溶剂分子与荧光分子激发态的碰撞频率增加，外转换去激发的几率增加，荧光量子产率下降。低温荧光分析可提高分析的灵敏度。
c,溶液 pH
对含有酸碱基团的荧光分子，荧光发射受
pH影响较大，需严格控制溶液 pH。
4,影响荧光强度的环境因素
d,内滤效应是指分子发射的荧光通过溶液时，被未激发的荧光物质分子所吸收（自吸收）而引起的荧光强度下降的现象。
被测物浓度越高，则内滤效应越严重。
4,影响荧光强度的环境因素
e,荧光猝灭是指荧光分子与溶剂分子或其它分子之间相互作用，从而使荧光强度减弱的现象。
与荧光物质分子相互作用而引起荧光强度下降的物质称为 荧光猝灭剂 。
跃迁类型：分子存在 π* π,π* n跃迁，荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。
共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。
5,化合物的结构与荧光
刚性平面结构：
分子具有刚性平面结构可以降低分子振动，
减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。
取代基效应：
芳环上有供电子基团（如 -NH2,-OH）可增强荧光；有吸电子基团（如 -X,-NO2,-COOH）
则荧光减弱。
5,化合物的结构与荧光二、荧光分析法的应用
1,荧光分析法的特点
2,定量分析的原理
3,荧光分析法的应用第二节 分子荧光分析法
1,荧光分析法的特点
灵敏度高，检出限比吸收光度法低 2~4
个数量级
选择性较强（对有机物而言）
试样量少：与光度分析相比，荧光物质较少，应用受限制
2,定量分析的原理荧光强度正比于吸收的光量和荧光量子产率,
If =? Ia
据 Beer定律,Ia = I0 - It = I0(1- e -? l C)
代入上式整理得,If = 23? I0?lc
在一定条件下,If = K c
故：荧光强度与荧光物质的浓度成之正比 。
2,定量分析的原理定量分析的基础：
If = K c
定量分析的方法：
标准曲线法比较法
3,荧光分析法的应用
a,具荧光特性的有机化合物,生物及药物化合物可直接测定。
如：肾上腺素、青霉素、普鲁卡因等药物
b,不产生荧光的甾族化合物,经浓硫酸处理后测定（使环状醇类结构变成产生荧光的分类结构）
3,荧光分析法的应用
c,本身 不具荧光的 无机化合物,可与有机荧光试剂配位构成发光体系后进行测量。
大约可测 60余种元素；常用的荧光试剂：
8-羟基喹啉,2-羟基 -3-萘甲酸,2,2’-二羟基偶氮苯及安息香等。
3,荧光分析法的应用
d,生物和基因检测
DNA因自身荧光效率低而不易检测，但用某些荧光分子作探针进行标记后，可通过探针分子的荧光变化来研究 DNA。
常用荧光探针：溴化乙锭、吖啶类荧光染料、钌的配合物等。
基因检测领域，荧光染料正逐步取代同位素标记物。
一、荧光光谱二、荧光分析法的应用三、荧光分析仪器的结构第二节 分子荧光分析法荧光分析仪器的基本结构激发光源 激发单色器发射单色器样品池检测器
激发光源 —
作用：提供连续辐射，激发样品要求：光源强度足够，强度与波长无关种类：汞弧灯、氢灯或氙灯
激发单色器 —
作用：选择激发光的波长荧光分析仪器的基本结构
样品池 —
石英制成，正方形、长方形或圆形
发射单色器 —
用于选择投射到检测器的荧光波长
检测器 —
荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高荧光分析仪器的基本结构第三节 分子磷光分析法一、磷光分析法概述二、磷光分析法的原理三、磷光分析仪器四、磷光分析法的应用一、磷光分析法概述
磷光是分子从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射。
磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。
1975年以前，大多磷光分析工作在低温下进行，之后才相继出现室温分析方法，使得其在药物分析、临床分析等领域的应用日益广泛。
二、磷光分析法的原理
1,磷光的产生和磷光强度
2,低温磷光的测量
3,重原子效应
4,室温磷光测量
1,磷光的产生和磷光强度
磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。
由于分子的第一电子激发三重态（ T1）的能量低于其第一电子激发单重态，因此磷光辐射的波长比荧光长。
1,磷光的产生和磷光强度
由第一电子激发三重态（ T1 ）向基态（ S0）的跃迁属禁阻跃迁，跃迁速率小，使得 T1态稳定性强，所以磷光的寿命长于荧光。
同样由于 T1态的稳定性强、寿命长，所以以非辐射跃迁方式损失的能量多，因而磷光物质在室温溶液中产生的磷光一般比较弱。
1,磷光的产生和磷光强度
当磷光物质浓度很小时，磷光强度和磷光物质浓度之间的关系为：
Ip = 2.3?pI0kbc
p为磷光效率,I0为激发光强度,k为磷光物质的摩尔吸收系数，
b为试样池的光程。
在一定条件下,?p,I0,k,b均为常数，
因此可据上式制作磷光强度对磷光物质浓度的标准曲线，进而用于定量分析。
2,低温磷光的测量
由于三重激发态的寿命长，激发态分子与溶剂分子发生碰撞去激发的几率增大，使磷光强度减弱甚至完全消失。为减少这些影响，
就需要在低温下测量以保持较大的荧光强度。
2,低温磷光的测量
低温测量一般在液氮温度（ 77K）下进行。
溶剂应具有低的磷光背景，且在低温下具有足够的黏度以便能形成透明的刚性玻璃体，
以减少磷光的碰撞猝灭。
常用溶剂 EPA的组成乙醇：异戊烷：二乙醚 = 2,5,5（ v）
3,重原子效应
使用含有重原子的溶剂（如碘乙烷、溴乙烷）或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，
这种效应称为重原子效应。前者称为外部 ~，后者称为内部 ~。
3,重原子效应
机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而增大了
S1 T1的体系间跨越跃迁概率，有利于增大磷光效率。
4,室温磷光测量低温测量在实际操作和溶剂选择上有诸多不便，因此促进了室温磷光测量方法的建立，当前主要有：
固体基质法溶剂胶束增稳法敏化溶液法固体基质法
固体基质法是将磷光物质吸附在固体载体上直接进行测量。
磷光物质吸附固化后，分子的刚性增加，三重态的碰撞去活化概率大大将小，因而增加了室温下的磷光强度。
常用载体：滤纸、硅胶、氧化铝、乙酸钠、纤维素膜等。
溶剂胶束增稳法向溶液加入适当的表面活性剂，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，
增强了定向约束力，使其昂性增强，减小了内转换和碰撞能量损失等非辐射去激发过程的发生几率，明显增强了三重态的稳定性，从而导致磷光强度显著增大，实现室温下磷光测量。
敏化溶液法
向溶液中加入能量受体组分，分析组分作为能量给予体将能量转移给能量受体，引发受体在室温下发射磷光。
磷光不是分析组分而是能量受体发射。
需要选择合适的能量受体。
三、磷光分析仪器激发光源 激发单色器发射单色器样品池检测器与荧光分析仪器类似三、磷光分析仪器特殊部件：
试样室：低温磷光测量时需将试样池放在盛液氮的杜瓦瓶内；固体表面室温分析则需要特制的试样室。
磷光镜：在既有磷光又有荧光的体系中，使用叫磷光镜的一种机械切光装置，利用荧光和磷光寿命的差异消除荧光干扰，达到测定磷光的目的。
四、磷光分析法的应用
稠环芳烃和石油产物的分析
农药和生物碱的分析如 DDT、萘乙酸等
药物分析和临床分析如阿司匹林、普鲁卡因等第四节 化学发光分析法一、化学发光法概述二、基本原理三、化学发光反应的类型四、化学发光分析仪器五、化学发光法的应用一、化学发光法概述
化学发光是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。在化学发光中，发光物质所需的激发能不是光能、热能或电能，而是化学反应过程所提供的化学能。
一、化学发光法概述化学发光分析的突出特点在于：
灵敏度很高
测定的线性范围宽，一般有 5~6个数量级
仪器设备简单（无需激发光源和单色器）
分析速度快（流动注射化学发光分析每小时可测定 100多个试样）
二、基本原理
1,化学发光的产生
在化学反应中，某一反应产物的分子接受反应能被激发，形成电子激发态，当它们由激发态返回到基态时，以辐射的形式将能量释放出来。
A+B C*+D C* C+hv
二、基本原理
某些化学发光反应需加入,能量受体,,该物质不参与反应，但可接受化学能跃迁到激发态，
返回基态时发射出一定波长的光。此为间接发光的过程。
A+B C*+D,C*+X F+X*
X X+hv
X为能量受体,C*为能量给予体。
二、基本原理产生化学发光必备条件：
能快速地释放出足够能量（可见光区的化学发光需能 170~300kJ/mol）；
反应途径有利于激发态产物的形成；
激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，
或者能够将能量转移给可发生辐射跃迁的其它分子。
二、基本原理
2,化学发光效率 φCL
等于生成激发态分子的效率 φr 与激发态分子的发光效率 φf 的乘积,
φCL=φr * φf
化学效率 φr主要取决于化学反应本身；发光效率 φf
的影响因素与荧光效率相似，与发光体本身的结构和性质以及环境影响都有关系。
二、基本原理
3,定量分析依据：
发光总强度与分析物浓度成正比；
因此，可根据已知时间内的发光总强度来进行化学发光的定量分析。
三、化学发光反应的类型
1,按反应过程
直接化学发光：指被测物质作为发光反应物之一参与了化学反应。
间接化学发光：指被测物质不参与化学反应，但参与发光过程。
三、化学发光反应的类型
2,按反应体系状态：
气相发光反应：多涉及 O3
如,NO+O3 NO2*+O2
NO2* NO2+hv（ ≧ 600nm）
液相发光反应：常用 H2O2
生物发光反应：涉及生物或酶反应四、化学发光分析仪器
1,分立取样式仪器一种静态下测量化学发光信号的装置。先将试剂与试样加入贮液管，然后开阀门使溶液流入反应池，混合后化学发光反应立即发生。发光信号通过光电倍增管检测，再经放大后记录下来。
仪器简单，灵敏度高；但手动进样重复性差，
测量精密度不够。
四、化学发光分析仪器
2,流动注射式仪器流动注射分析是一种自动化溶液分析技术。
把一定体积的试液注射到一个连续流动着的载流中，试样在流动过程中分散、反应，并被检测。
主要由蠕动泵、进样阀、反应盘管和化学发光检测器组成。
五、化学发光法的应用
1,环境监测方面
a,大气中有毒气体的监测：
O3,NO,NO2,H2S,SO2,CO等；气相发光分析法，
方便快捷，灵敏度可达 1ng/g。
b,废水中金属离子分析：液相发光分析法例：溶液中 Cr (Ⅲ ) 和 Cr (Ⅵ )共存时，可在碱性条件下采用 Cr (Ⅲ )-鲁米诺 -H2O2发光体系测定，而 Cr (Ⅵ )在酸性条件下可被 H2O2还原为 Cr (Ⅲ )，因此可分别测定 Cr
(Ⅲ ) 和 Cr (Ⅵ )的含量。
五、化学发光法的应用
2,生物分析方面鲁米诺 - H2O2体系也可用于化学发光法测定许多生化物质，如甘氨酸、血红蛋白、肌红蛋白等。特别是与酶反应结合，可以分析葡萄糖、
乳酸、氨基酸等。
具有很高的灵敏度。
2007/09/05
第一节 分子发光法概述
分子荧光分析法 （光致发光）
分子磷光分析法 （光致发光）
化学发光分析法 化学发光分析
（利用化学反应） 生物发光分析分子发光分析法属于分子发射光谱法的范畴，具有较高的检测灵敏度，在有机大分子和生物大分子分析中有重要应用。特别是 激光诱导荧光分析法 因具有超高灵敏度而倍受关注。
几个基本概念
反磁性分子：
分子电子自旋成对的结果为 S=0。
单重态若一个分子所有的电子自旋是成对的 S=0,
那么这个分子所处的电子能态称 ~。
三重态
有机分子中的电子多为偶数，则分子中的总自旋量子数 S=0,即基态分子内的电子是自旋成对的。根据谱线多重度的定义 M=2S+1=0,此时这个分子所处的电子能态称为 单重态 。
若电子在激发态与在基态的自旋方向相同，则激发态仍是单重态，此为 激发单重态 。
若在激发过程中电子自旋方向改变，即与基态时的自旋方向相反，变为平行状态，则
S=1/2+1/2=1,M=2S+1=3，这样的激发态为 三重态 。
由于自旋平行比自旋相反的状态稳定，故三重态的能级比相应单重态的能级低。
分子在光照射时吸收特定波长的能量，由基态跃迁到激发态的各振动能级上。
分子由激发态去激发回到基态时能够产生发光现象。但去激发既可以辐射方式、也可以非辐射方式（振动弛豫、内转换、外转换、系间跨越）回到基态，所以去激发过程并不一定产生光或产生与吸收光波长相同的光。
荧光与磷光的产生过程
荧光发射,由于电子发生振动弛豫和内转换的过程远比由第一激发单重态的最低振动能级到基态的跃迁快，因此荧光发射多为由第一激发单重态的最低振动能级回到基态的各振动能级间的跃迁所产生的辐射。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。
荧光与磷光的产生过程
磷光发射,电子由第一激发三重态的最低振动能级回到基态各振动能级的跃迁产生磷光。
三重激发态能量低于单重激发态，故产生磷光的波长要比产生荧光的波长长。
荧光与磷光的产生过程第二节 分子荧光分析法一,荧光光谱
1,荧光光谱的产生
2,荧光光谱的基本特征
3,荧光效率和荧光物质
4,影响荧光强度的环境因素
5,化合物的结构与荧光
1,荧光光谱的产生分子吸收辐射后可能激发为第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，这种激发态分子以热的形式损失其振动能后下降为第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）；然后再以辐射的形式跃迁为电子基态的任一振动能级，即产生荧光，并进一步以无辐射跃迁形式回到基态的最低振动能级。
2,荧光光谱的基本特征
a,Stokes位移在溶液中，分子的荧光发射光谱的波长总比激发波谱的长，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长处，称为 ~。
原因：激发与发射之间产生了能量损耗
2,荧光光谱的基本特征
b,发射光谱的形状与激发波长无关所发射的荧光光谱由第一激发单重态和基态之间的能量差决定，与激发波长无关。
c,镜像规则通常荧光发射光谱与它的激发光谱形状呈镜像对照关系。
3,荧光效率和荧光物质物质发荧光的能力，通常用 荧光效率 （或称 荧光量子产率 ）来描述荧光辐射跃迁几率的大小。荧光效率定义为发荧光的分子数与激发态分子数目的比值。
荧光效率（ φf ） =发荧光分子数 /激发态分子数
φf 决定于物质的分子结构，也受化学环境的严重影响
（温度、溶剂、酸度）。
荧光分子：能产生荧光的分子称为荧光分子。
荧光物质通常为含有苯环或稠环的刚性结构有机分子，典型的如荧光素的分子结构。
3,荧光效率和荧光物质分子产生荧光的必备条件
分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；
吸收了与其本身特征频率相同的能量后，
还必须具有一定的荧光效率 (荧光量子产率 ) 。
4,影响荧光强度的环境因素
a,溶剂的影响除对光的折射、散射外，溶剂的影响主要表现在溶剂的极性、氢键及配位键的形成等。
溶剂极性增大，通常使荧光光谱红移；
氢键和配位键的形成，改变荧光强度和形状。
4,影响荧光强度的环境因素
b,温度的影响温度增加，溶剂分子与荧光分子激发态的碰撞频率增加，外转换去激发的几率增加，荧光量子产率下降。低温荧光分析可提高分析的灵敏度。
c,溶液 pH
对含有酸碱基团的荧光分子，荧光发射受
pH影响较大，需严格控制溶液 pH。
4,影响荧光强度的环境因素
d,内滤效应是指分子发射的荧光通过溶液时，被未激发的荧光物质分子所吸收（自吸收）而引起的荧光强度下降的现象。
被测物浓度越高，则内滤效应越严重。
4,影响荧光强度的环境因素
e,荧光猝灭是指荧光分子与溶剂分子或其它分子之间相互作用，从而使荧光强度减弱的现象。
与荧光物质分子相互作用而引起荧光强度下降的物质称为 荧光猝灭剂 。
跃迁类型：分子存在 π* π,π* n跃迁，荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。
共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。
5,化合物的结构与荧光
刚性平面结构：
分子具有刚性平面结构可以降低分子振动，
减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。
取代基效应：
芳环上有供电子基团（如 -NH2,-OH）可增强荧光；有吸电子基团（如 -X,-NO2,-COOH）
则荧光减弱。
5,化合物的结构与荧光二、荧光分析法的应用
1,荧光分析法的特点
2,定量分析的原理
3,荧光分析法的应用第二节 分子荧光分析法
1,荧光分析法的特点
灵敏度高，检出限比吸收光度法低 2~4
个数量级
选择性较强（对有机物而言）
试样量少：与光度分析相比，荧光物质较少，应用受限制
2,定量分析的原理荧光强度正比于吸收的光量和荧光量子产率,
If =? Ia
据 Beer定律,Ia = I0 - It = I0(1- e -? l C)
代入上式整理得,If = 23? I0?lc
在一定条件下,If = K c
故：荧光强度与荧光物质的浓度成之正比 。
2,定量分析的原理定量分析的基础：
If = K c
定量分析的方法：
标准曲线法比较法
3,荧光分析法的应用
a,具荧光特性的有机化合物,生物及药物化合物可直接测定。
如：肾上腺素、青霉素、普鲁卡因等药物
b,不产生荧光的甾族化合物,经浓硫酸处理后测定（使环状醇类结构变成产生荧光的分类结构）
3,荧光分析法的应用
c,本身 不具荧光的 无机化合物,可与有机荧光试剂配位构成发光体系后进行测量。
大约可测 60余种元素；常用的荧光试剂：
8-羟基喹啉,2-羟基 -3-萘甲酸,2,2’-二羟基偶氮苯及安息香等。
3,荧光分析法的应用
d,生物和基因检测
DNA因自身荧光效率低而不易检测，但用某些荧光分子作探针进行标记后，可通过探针分子的荧光变化来研究 DNA。
常用荧光探针：溴化乙锭、吖啶类荧光染料、钌的配合物等。
基因检测领域，荧光染料正逐步取代同位素标记物。
一、荧光光谱二、荧光分析法的应用三、荧光分析仪器的结构第二节 分子荧光分析法荧光分析仪器的基本结构激发光源 激发单色器发射单色器样品池检测器
激发光源 —
作用：提供连续辐射，激发样品要求：光源强度足够，强度与波长无关种类：汞弧灯、氢灯或氙灯
激发单色器 —
作用：选择激发光的波长荧光分析仪器的基本结构
样品池 —
石英制成，正方形、长方形或圆形
发射单色器 —
用于选择投射到检测器的荧光波长
检测器 —
荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高荧光分析仪器的基本结构第三节 分子磷光分析法一、磷光分析法概述二、磷光分析法的原理三、磷光分析仪器四、磷光分析法的应用一、磷光分析法概述
磷光是分子从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射。
磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。
1975年以前，大多磷光分析工作在低温下进行，之后才相继出现室温分析方法，使得其在药物分析、临床分析等领域的应用日益广泛。
二、磷光分析法的原理
1,磷光的产生和磷光强度
2,低温磷光的测量
3,重原子效应
4,室温磷光测量
1,磷光的产生和磷光强度
磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。
由于分子的第一电子激发三重态（ T1）的能量低于其第一电子激发单重态，因此磷光辐射的波长比荧光长。
1,磷光的产生和磷光强度
由第一电子激发三重态（ T1 ）向基态（ S0）的跃迁属禁阻跃迁，跃迁速率小，使得 T1态稳定性强，所以磷光的寿命长于荧光。
同样由于 T1态的稳定性强、寿命长，所以以非辐射跃迁方式损失的能量多，因而磷光物质在室温溶液中产生的磷光一般比较弱。
1,磷光的产生和磷光强度
当磷光物质浓度很小时，磷光强度和磷光物质浓度之间的关系为：
Ip = 2.3?pI0kbc
p为磷光效率,I0为激发光强度,k为磷光物质的摩尔吸收系数，
b为试样池的光程。
在一定条件下,?p,I0,k,b均为常数，
因此可据上式制作磷光强度对磷光物质浓度的标准曲线，进而用于定量分析。
2,低温磷光的测量
由于三重激发态的寿命长，激发态分子与溶剂分子发生碰撞去激发的几率增大，使磷光强度减弱甚至完全消失。为减少这些影响，
就需要在低温下测量以保持较大的荧光强度。
2,低温磷光的测量
低温测量一般在液氮温度（ 77K）下进行。
溶剂应具有低的磷光背景，且在低温下具有足够的黏度以便能形成透明的刚性玻璃体，
以减少磷光的碰撞猝灭。
常用溶剂 EPA的组成乙醇：异戊烷：二乙醚 = 2,5,5（ v）
3,重原子效应
使用含有重原子的溶剂（如碘乙烷、溴乙烷）或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，
这种效应称为重原子效应。前者称为外部 ~，后者称为内部 ~。
3,重原子效应
机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而增大了
S1 T1的体系间跨越跃迁概率，有利于增大磷光效率。
4,室温磷光测量低温测量在实际操作和溶剂选择上有诸多不便，因此促进了室温磷光测量方法的建立，当前主要有：
固体基质法溶剂胶束增稳法敏化溶液法固体基质法
固体基质法是将磷光物质吸附在固体载体上直接进行测量。
磷光物质吸附固化后，分子的刚性增加，三重态的碰撞去活化概率大大将小，因而增加了室温下的磷光强度。
常用载体：滤纸、硅胶、氧化铝、乙酸钠、纤维素膜等。
溶剂胶束增稳法向溶液加入适当的表面活性剂，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，
增强了定向约束力，使其昂性增强，减小了内转换和碰撞能量损失等非辐射去激发过程的发生几率，明显增强了三重态的稳定性，从而导致磷光强度显著增大，实现室温下磷光测量。
敏化溶液法
向溶液中加入能量受体组分，分析组分作为能量给予体将能量转移给能量受体，引发受体在室温下发射磷光。
磷光不是分析组分而是能量受体发射。
需要选择合适的能量受体。
三、磷光分析仪器激发光源 激发单色器发射单色器样品池检测器与荧光分析仪器类似三、磷光分析仪器特殊部件：
试样室：低温磷光测量时需将试样池放在盛液氮的杜瓦瓶内；固体表面室温分析则需要特制的试样室。
磷光镜：在既有磷光又有荧光的体系中，使用叫磷光镜的一种机械切光装置，利用荧光和磷光寿命的差异消除荧光干扰，达到测定磷光的目的。
四、磷光分析法的应用
稠环芳烃和石油产物的分析
农药和生物碱的分析如 DDT、萘乙酸等
药物分析和临床分析如阿司匹林、普鲁卡因等第四节 化学发光分析法一、化学发光法概述二、基本原理三、化学发光反应的类型四、化学发光分析仪器五、化学发光法的应用一、化学发光法概述
化学发光是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。在化学发光中，发光物质所需的激发能不是光能、热能或电能，而是化学反应过程所提供的化学能。
一、化学发光法概述化学发光分析的突出特点在于：
灵敏度很高
测定的线性范围宽，一般有 5~6个数量级
仪器设备简单（无需激发光源和单色器）
分析速度快（流动注射化学发光分析每小时可测定 100多个试样）
二、基本原理
1,化学发光的产生
在化学反应中，某一反应产物的分子接受反应能被激发，形成电子激发态，当它们由激发态返回到基态时，以辐射的形式将能量释放出来。
A+B C*+D C* C+hv
二、基本原理
某些化学发光反应需加入,能量受体,,该物质不参与反应，但可接受化学能跃迁到激发态，
返回基态时发射出一定波长的光。此为间接发光的过程。
A+B C*+D,C*+X F+X*
X X+hv
X为能量受体,C*为能量给予体。
二、基本原理产生化学发光必备条件：
能快速地释放出足够能量（可见光区的化学发光需能 170~300kJ/mol）；
反应途径有利于激发态产物的形成；
激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，
或者能够将能量转移给可发生辐射跃迁的其它分子。
二、基本原理
2,化学发光效率 φCL
等于生成激发态分子的效率 φr 与激发态分子的发光效率 φf 的乘积,
φCL=φr * φf
化学效率 φr主要取决于化学反应本身；发光效率 φf
的影响因素与荧光效率相似，与发光体本身的结构和性质以及环境影响都有关系。
二、基本原理
3,定量分析依据：
发光总强度与分析物浓度成正比；
因此，可根据已知时间内的发光总强度来进行化学发光的定量分析。
三、化学发光反应的类型
1,按反应过程
直接化学发光：指被测物质作为发光反应物之一参与了化学反应。
间接化学发光：指被测物质不参与化学反应，但参与发光过程。
三、化学发光反应的类型
2,按反应体系状态：
气相发光反应：多涉及 O3
如,NO+O3 NO2*+O2
NO2* NO2+hv（ ≧ 600nm）
液相发光反应：常用 H2O2
生物发光反应：涉及生物或酶反应四、化学发光分析仪器
1,分立取样式仪器一种静态下测量化学发光信号的装置。先将试剂与试样加入贮液管，然后开阀门使溶液流入反应池，混合后化学发光反应立即发生。发光信号通过光电倍增管检测，再经放大后记录下来。
仪器简单，灵敏度高；但手动进样重复性差，
测量精密度不够。
四、化学发光分析仪器
2,流动注射式仪器流动注射分析是一种自动化溶液分析技术。
把一定体积的试液注射到一个连续流动着的载流中，试样在流动过程中分散、反应，并被检测。
主要由蠕动泵、进样阀、反应盘管和化学发光检测器组成。
五、化学发光法的应用
1,环境监测方面
a,大气中有毒气体的监测：
O3,NO,NO2,H2S,SO2,CO等；气相发光分析法，
方便快捷，灵敏度可达 1ng/g。
b,废水中金属离子分析：液相发光分析法例：溶液中 Cr (Ⅲ ) 和 Cr (Ⅵ )共存时，可在碱性条件下采用 Cr (Ⅲ )-鲁米诺 -H2O2发光体系测定，而 Cr (Ⅵ )在酸性条件下可被 H2O2还原为 Cr (Ⅲ )，因此可分别测定 Cr
(Ⅲ ) 和 Cr (Ⅵ )的含量。
五、化学发光法的应用
2,生物分析方面鲁米诺 - H2O2体系也可用于化学发光法测定许多生化物质，如甘氨酸、血红蛋白、肌红蛋白等。特别是与酶反应结合，可以分析葡萄糖、
乳酸、氨基酸等。
具有很高的灵敏度。
