Chapter 3 Enzyme
第三章 酶
Ⅰ,酶的一般性质
1.酶的化学本质
⑴ 化学本质
①水解产物是 AA，酶能被蛋白酶水解；
②使蛋白质变性的因素可使酶变性失活；
③两性电解质；
④胶体性质，如不能通过半透膜等；
⑤呈色反应：酶和蛋白质具有。
⑥其他：活性中心、空间结构等；
依据除核酶外！
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⑵ 单体酶、寡聚酶、多酶体系 和 多功能酶
① 单体酶 monomeric enzyme
一条肽链,无 四级结构多条肽链,共价 连接分子量种类组成
（ 13~35）× 103
少,多催化 水解 反应；
牛胰核糖核酸酶、溶菌酶、羧肽酶 A等胰凝乳蛋白酶：肽链组成，链间 二硫键
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② 寡聚酶 oligomeric enzyme
两个或两个以上亚基亚基结构连接亚基数量组成非共价键的次级键，易分开！
可相同，也可不同。
绝大部分含偶数亚基个别含奇数亚基：如荧光素酶、嘌呤核苷磷酸化酶均含 3亚基
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③ 多酶复合体 multienzyme complex
催化一系列反应几乎同时同地进行反应的一组酶，它们以 非共价键 相互嵌合。
丙酮酸脱氢酶复合体脂肪酸合成酶系概念名称,脂肪酸合成酶复合体
fatty acid synthase complex
脂肪酸合成酶系
fatty acid synthase system
组成,7个酶和 1个酰基转移蛋白组成分子量,2.2× 106。
名称,pyruvate dehydrogenase complex
组成,E,coli,3个酶 60个亚基组成分子量,4.6~5.0× 106；
牛肾,7.8× 106。
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④ 多酶融合体 （ 多功能酶 ）
一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶,多是基因融合的产物 。
分支酸变位酶双功能酶概念名称,Asp激酶 Ⅰ - homoserine脱氢酶 Ⅰ 融合体组成,四聚体 α4
功能,N-端区域 → Asp激酶，
C-端区域 → homoserine脱氢酶。
P蛋白,分支酸变位酶 P-预莽酸脱水酶；
合成苯丙氨酸
T蛋白,分支酸变位酶 T-预莽酸脱氢酶；
合成酪氨酸
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2.酶促反应的 特点
⑴ 易失活常温、常压、近中性水中工业固氮失活因素反应条件固氮酶变性因素,高温、强碱、强酸、重金属盐等条件,27℃,中性 pH
产量,1亿吨氮 /年
500℃,几百个大气压
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⑵ 高 催化效率在一定条件下，
每秒钟每个酶分子转换底物的分子数 ；
或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数实际定义酶转换数 turnover number,TN=催化常数 kcat
大多数酶对天然底物的转换数为每秒 1到 104。
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⑶ 酶的 专一性 specificity
酶对催化的反应和反应物的选择性。
高度专一性专一性酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。
①结构 专一性只作用于一种底物，不作用于任何其他物质的酶的催化特性。
A.绝对专一性
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严格,α-糖苷键，一端有葡萄糖宽松,另一端 R基团可多种糖键专一性
α-D-葡萄糖苷酶作用于底物 特定化学键 的酶催化特性。
如 酯酶 催化酯键的水解。
B.相对 专一性 作用 结构相近 的底物的酶催化特性酶对底物链两端的基团要求不同，
对其中一个基团要求严格，对另一个要求不严格的催化特性。
族专一性 或基团专一性
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② 立体异构专一性 stereospecificity
只催化一种 几何异构体 的酶催化特性。
琥珀酸 脱氢酶 催化琥珀酸脱氢 → 延胡索酸不 能生成 顺 丁烯二酸（马来酸）。
只催化底物的一种 立体异构体 的酶催化特性。
B几何异构专一性
C.对称基团专一性特点只催化一种 对映异构体 的酶催化特性。
L-AA氧化酶 催化 L-AA氧化，不作用 D-AA
酶只催化 对称分子 中的两个等同基团的一个,不 催化另一个。
甘油 一端 14C标记,甘油激酶 催化只产生一种 甘油 -1-磷酸 标记物。
A.旋光异构专一性
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3.酶的化学组成简单酶 =简单蛋白质 simple protein
如 脲酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶 等 水解酶 ；
全酶 holoenzyme
=结合蛋白 conjugated protein
=酶蛋白 +辅酶 or 辅基
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名称,脱 辅 蛋白质 （ apoprotein）
或 脱 辅 酶 （ apoenzyme cofactor）
组成,酶的氨基酸组成部分辅酶辅基酶蛋白
coenzyme,与酶蛋白结合 不紧密,可用 透析法 与酶蛋白分开，多是维生素及其衍生物成。
prosthetic group,与酶蛋白结合 紧密,不能用 透析法 与酶蛋白分离，多为金属离子。
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4.酶的分类与命名
⑴ 习惯命名法
1961年以前酶的名称，称习惯名。
⑵ 国际系统命名法原则命名原则渊源
①根据 酶作用的底物 命名
②根据 酶催化反应的性质规定,以整体反应为基础的酶命名规则。
内容,底物、反应的性质。
特点,名称冗长！
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⑶ 国际系统分类法及酶编号乙醇脱氢酶,EC1.1.1.1
乳酸脱氢酶,EC1.1.1.27
苹果酸脱氢酶,EC1.1.1.37
大类,氧化还原酶氧化基团,CHOH；
受氢体,NAD+；
编号,1,27,37；
转 水 裂 异 合氧
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⑷ 国际系统分类的 盲区忽略酶的物种差异和组织差异。
种类催化反应盲区超氧化物歧化酶,superoxide dismutase,SOD
EC1.15.1.1
方案编号 一个名称和编号
2O2-+2H+→H 2O2+O2
CuZn-SOD,真核生物细胞质中
Mn-SOD,真核生物线粒体中
Fe-SOD,广泛存在
CuZn-SOD,牛 红细胞与 猪 红细胞中一级结构差异大名称注明酶的来源与名称！
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Ⅱ,酶促反应的 作用机理
1.与化学催化剂的比较
⑴反应前后催化剂的 数量 和 性质 不发生改变
⑵ 不改变 反应的平衡点，加快达到平衡的时间
⑶降低反应的 活化能,反应易进行能量较高，处于活化态的分子。
结果活化能
activation
energy
活化分子
activation molecule
活化分子比一般分子高出的能量 。
单位,一定温度下 1摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能,kJ/mol。
活化能愈高，活化分子数少，反应速率慢。
催化剂能瞬时与反应物结合成过渡态，降低反应所需的活化能。
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2.过渡态和活化能
⑴ 过渡态 transition state
A+B→→→A……B→→→C+D
初态 过渡态 终态过渡态反应特征 反应的全过程含一个或多个过渡态（中间产物）
极不稳定的 中间产物,寿命极短。
其结构不同于反应物和产物。
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⑵ 活化能 activation energy
反应物（初态）转化成中间产物（过渡态）所需要的能量。活化能
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3.中间产物学说
S+E→→→ES→→→ES ≠→→→EP→→→P+E
中间产物与 过渡态反应中间产物
ES,合成酶 -底物复合物
ES≠：酶 -过渡态中间物复合物
EP,酶 -产物复合物稳定,稳定可分离！
寿命,短而难于分离酶,总结果中不参与反应证据观察,电子显微镜可直接观察 核酸聚合酶与 核酸 结合而成的复合物！
产物,已分离并结晶 D-氨基酸氧化酶 与
D-氨基酸 结合的复合物。
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4.诱导契合 induced fit假说
1958年,Koshland提出内容酶分子的活性部位有一定的 可变性,当底物分子与酶分子相遇时，可诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性部位上各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与 定向,使酶与底物 互补结合,产生 酶 -
底物复合物,使底物发生反应。
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5.酸碱 催化 acid-base catalysis
酸碱催化狭义 酸碱催化广义 酸碱催化向反应体系 瞬时 提供 H+或从反应物 接受 H+以稳定过渡态,加速 反应达到平衡的催化机制。
总 酸碱催化：通过 H+和 OH-以及能提供
H+及 OH-的 供体 进行的催化。
专一 酸碱催化：在水溶液中通过 高反应性 的 H+和 OH-进行的催化。
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6.共价催化 covalent catalysis
亲核催化 nucleophilic catalysis
或 亲电子催化 electrophilic catalysis名称效应结果放出 电子或 汲取 电子！
形成 不稳定 的共价 中间复合物,
降低 反应 活化能,加速 反应
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Ⅲ,酶活力 测定及调节
1.酶活力 enzyme activity
⑴ 概念酶催化某一化学反应的 能力 。
一定条件 下催化的某一化学反应的 速率
（ reaction velocity或 reaction rate）
速率越 大,酶的活力越 高 。
酶活力
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⑵ 酶的 活力单位 （ U,activity unit）
在 一定 条件下，一定时间内将 一定量 底物转化为产物所需的酶量。
表示,每 克 或每 毫升 酶制剂含的酶单位（ U/g或 U/m1）
最适条件酶单位国际单位 IU
最适条件下,1min催化 1μmol底物 转化为 产物 所需的 酶量 为一个 酶活力 单位，即 IU=1μmol /min。
温度（ 25℃ 或 37 ℃ ）,pH
缓冲液离子强度、底物浓度最适条件下，每 秒 钟能催化 lmol底物 转化为产物所需的 酶量,1Kat=1mol/s
Kat
单位
1Kat=60× 106IU
1IU=1μKat/60= 16.7nKat
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⑶ 酶的 比活力 specific activity
比活力每 mg蛋白质所含的酶活力单位。
同一种酶的比活力愈 大,酶的 纯度 愈高。
比活力 = 活力 U/mg蛋白 = 总活力 U/总蛋白 mg
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⑷ 酶活力的 实际使用酶单位,30℃,1分钟,使底物 DNA
溶液的 比粘度 下降 25%的 酶量 。
淀粉酶凝胶电泳法
① 1g可溶性 starch,1h内 液化 所需的 酶量 。
② lml 2%可溶性 starch,1h内 液化 所需的 酶量 。
酶单位,37℃ 1小时使 1ugλDNA
完全 水解 的 酶量 。
酶单位,5分钟使 1ugDNA活性 残留 37%所需的 酶量 。
限制性核酸内切酶粘度法转化率法
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⑸ 酶活力的测定方法
① 分光光度法 spectrophotometry
底物或产物在紫外或可见光部分的光吸收变化，选择波长测定酶活力。
原理酶偶联分析法
enzyme coupling
assay
原理
② 荧光法 fluorometry
范围,无光吸收变化的酶反应方法,第一个酶反应的产物，与能引起光吸收变化的酶反应偶联，转变为有光吸收变化的产物来测量酶活。
底物或产物的荧光差别来测定酶活。
特点 灵敏度比分光光度法高。
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③ 同位素测定法 isotope method
用 放射性同位素 标记底物，酶作用后测产物的脉冲数，换算出酶活力。
④ 电化学法 electrochemical method
特点原理灵敏度 极高 ！
A.测定 pH的变化计算酶的反应速率。
B.恒定 pH,由加入酸或碱的速率计算酶活！原理特点 应用广泛！多测定酯酶活力。
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2.酶原激活
⑴ 酶活性中心 active center
名称,活性部位 active site或活性中心概念,酶分子中能直接与底物结合，并催化底物化学反应的部位。
结合部位概念结合基团活性部位 或 活性中心 ==结合部位 + 催化部位由不少于三个以上的结合基团组成结合部位，决定底物 专一性。
binding group,直接与底物结合的基团。
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一般由 2~3个 催化基团 组成催化部位，决定酶的 催化效率 。
催化基团催化部位活性部位特征
catalytic group,直接催化底物反应的基团 。
一级结构,或近或远，甚至不在同一肽链上空间位置,靠近！
直接参与对底物分子结合和催化的基团及参与维持酶分子构象的基团。酶分子中基团很多，但仅 必需基团 才与酶活性有关。
必需基团 =结合基团 +催化基团 +维持构象基团必需基团
essential group
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⑵ 酶原激活刚合成 的 无活性 的酶前体。酶原酶原激活
⑶ 酶活性部位的特点酶原经适当的肽键切割，成为有活性的酶的过程。
结果,无活性的酶原 →→ 有 活性的酶
① 空间 比例小体积,约占 1~2％
氨基酸,催化部位,仅 2~3个结合部位,少则 1个，多则数个。
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③ 底物结合过程
② 活性部位是 三维实体 结构诱导契合（ induced-fit）假说内容形状,酶的活性部位和底物的形状 不互补变化,酶和底物结合过程中，
底物或酶，或两者同时发生构象变化结果,形状互补催化基团位置,在底物反应键和即将生成键处
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⑤ 底物与酶结合
④ 活性部位位置酶表面的一个 裂缝 （ crevice） 内。 圆形？
⑥ 酶活性部位具有 柔性 或 可运动 性。
次级键,非共价键,noncovalent，
如氢键、疏水键、盐键、范德华力结合键结合力 弱！
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3.变构酶 allosteric enzyme
⑴ 概念对代谢 途径 的反应起调节作用的酶变构酶、共价调节酶、同功酶变构酶调节酶含 2个或 2个以上亚基的调节酶！
同促变构酶、异促变构酶、同促异促变构酶
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名称,catalytic center
功能,结合和催化底物分子！
调节亚基调节中心名称,catalytic subunit
结构,含催化中心的 亚基 ！
名称,regulatory center
作用,结合调节物，调节催化中心！
催化亚基催化中心名称,regulatory subunit
结构,含调节中心的 亚基 ！
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⑵ 变构酶的意义终产物过 多 时,降低 代谢途径的总反应速度,减少 原始底物的消耗,避免 终产物的过多产生！
别构激活变构抑制异促别构酶以 底物 作激活剂，结合到酶分子的调节部位，避免过多 底物 的积累！
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4.共价调节酶 covalent modification enzyme
酶促共价修饰对酶活力的调节酶 修 饰 机 理 活力变化糖原磷酸化酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大磷酸化酶 b激酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大糖原合成酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大丙酮酸脱氢酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大谷酰胺合成酶 腺苷酰化 /脱腺苷酰 减小 /增大酶的基团与化合物 共价 结合或解离后，使酶的 活性 发生改变的酶！概念共价修饰调节 共价调节酶的修饰作用！
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5.同工酶 isoenzyme or isozyme
催化 相同 或 相似 化学反应，但酶分 子结构、
性质 存在明显差异的一组酶！
原因概念组织或细胞器特异性！
细胞分化（胚胎发育）！
疾病诊断！应用分布编码基因的差异！
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Ⅳ,影响酶促反应速度的因素
1.动力学基础单位时间内 底物 或 产物 浓度 的变化。
含义速率定义注意数学形式
v=-dc/dt； 或 v=+dc/dt；
v=-d[S]/dt=d[P]/dt
负号,底物浓度的减少正号,产物浓度的增多若有水参与反应，则：
V= =-dS/dt=dP/dt
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2.底物浓度 对酶反应速度的影响
⑴ 底物浓度与酶反应速度的 关系产物不断被下一步反应 消耗,产物与酶形成 ES的反应基本不会发生。
在酶浓度、温度,pH等不变的情况，酶和底物结合形成中间复合物，反应如下：
特点没有反应常数 k4！结果
E+S ES E+Pk
2
k3
k4
k1
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⑵ 米氏常数推导
][
][
][
]][[][ m a x3
3
SK
SV
SKm
SEKESKV
m?
稳态法快速平衡法应用,早期！
内容,酶与底物形成 ES的速度 极快,
ES形成产物的速度 极慢 。
结果,[ES] 的动态平衡与 ES? P+E无关应用,现在内容,ES的形成速度与分解速度相等，
ES的浓度保持不变。
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E+S ES E+Pk
2
k3
k4
k1
ES的 形成 速度,d[ES]/dt=k1*[E现在 ]*[S]
= k1*（ [E]-[ES]） *[S]
ES的 分解 速度,-d[ES]/dt=k2*[ES]+k3*[ES]
在反应达到 平衡 时,ES的形成和分解的速率相等，得下面的公式（ 1）
设
1
32
k
kkk
m
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当 [S]较大时当 [S] >> km时关键点
A反应平衡时,ES生成速度 v1等于 ES分解速度 v2
B.Km的定义！
C.酶促反应的总反应速度是 ES的 k3解离速度
D.底物浓度 [S]无穷大时,[E]=[ES]
mS k
Svv ][m a x
0][
lim
m a x
][
lim vv
S
0])[( )][][][ 2m a x?Sk kSSkvSd dv
m
mm
（
当 [S] << km时
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米氏常数的 意义当 [S]= km时
2][
][ m a xm a x V
SK
SVV
m
A,km是反应速度为 vmax一半时的底物浓度
B.km单位是浓度的单位,mol/L。 为什么？
⑶ 米氏常数的 意义
① km是酶的 特征常数 之一因素,底物种类、反应温度,pH及离子强度等性质,km与 酶性质 有关，与 酶浓度 无关！
鉴别酶影响因素不同来源或 相同来源但不同发育阶段、不同生理状况下 催化相同反应的酶 是否 属同一种酶。
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② 判断酶的 专一性 和 天然底物名称,最适底物概念,在不止一种底物的酶的底物中，
km值最小的底物。
天然底物原因 1/km可近似表示酶对底物亲和力大小！1/k
m愈大，亲合力越大！
Km为达到 vmax一半所需底物浓度小。
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当 k3<<k2时,km=k2/k1,即 km=ks
ES的分解是反应的 限制 速率,km等于 ES复合物的解离常数（底物常数）。
③ 底物常数 的情况原因应用
km可表示酶和底物结合的 亲和力 大小。
当 k3极小时,1/km来近似地说明酶与底物结合的难易程度。
④已知酶的 km，可计算在某 [S]时，其反应速率相当于 vmax的百分率。
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⑤ km值可推断代谢反应的 方向 和 途径
A.推测可逆反应谷氨酸脱氢酶催化下列反应：
L-谷氨酸 +NAD 亚氨基戊酸 +NADH2
km=1.8× 10-5 mol/Lkm=2.5× 10-5 mol/L
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B.推测 限速反应
B C DA
10-2 mol/L 10-4 mol/Lkm=10-3 mol/L
C.推测 代谢途径乳酸：乳酸脱氢酶 km=1.7× 10-5 mol/L
乙酰 CoA,丙酮酸脱氢酶 系,1.3× 10-3
乙醛,丙酮酸脱羧酶 1.0× 10-3 mol/L
丙酮酸
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⑥ vmax和 k3（ kcat） 的 意义酶浓度 一定时,vmax对特定底物为常数。
与 km相似，随底物种类,pH,温度和离子强度等因素而变化。
vmax
k3 = TN = kcat
k3和 [E] [S]→∞ 时,vmax=k3[ES]=k3[E]，v
max和 [E]成正比关系。
k3,当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数,又称 转换数 （简称 TN）,催化常数
（ catalytic constant,kcat） 。
kcat值越大，酶催化效率越高（但不一定常用）。
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⑦ kcat/km的意义
][][)(][][)(
32
13 SE
k
kSE
kk
kkv
m
c a t
E+S→→ P
在生理条件下,[S]很小酶并不被底物饱和，体内 [S]/ km的比值通常介于 0.01~1.0之间。
另称,表观二级速率常数概念,酶促反应的可测定速率常数。
专一性常数
Chapter 3 Enzyme
⑷ 米氏常数的求法
① Lineweaver-Burk双倒数作图法（ 常用 ）
将米氏方程式改写为下列倒数形式：
baxy
vSv
k
v
m 类似于,1
][
11
m a xm a x
② Eadie-Hofstee作图改写米氏方程为：
axby
S
vkVv
m,类似于][m a x
Chapter 3 Enzyme
③ Hanes-Woolf作图将米氏方程变形为：
baxyv kSvvS m,类似方程
m a xm a x
][1][
④ Eisenthal和 Cornish-Bowden作图改写米氏方程为：
mkS
v
vv
][m a x
直线簇交点是 km和 vmax的值，可识别实验中不正确的观察结果。
Chapter 3 Enzyme
3.酶浓度 对酶反应速度的影响根据米氏方程可得,
][
]][[
3
Sk
SE
kv
m?
反应速度与酶浓度成 正比 ！
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4.抑制剂 对酶反应速度的影响
inhibition
概念,酶分子必需基团结合一些物质后，改变酶性质，使酶活降低，甚至完全丧失的作用。
本质,酶未变性！
抑制剂 inhibitor
种类抑制作用有机磷杀虫剂、磺胺类药物等产生抑制作用的物质 。
Chapter 3 Enzyme
⑴ 抑制作用的 鉴别 和 种类
① 不可逆抑制作用 irreversible inhibition
本质,酶被化学修饰，又称 修饰抑制特点,不能用 透析,超过滤 等方法除去抑制剂结合,抑制剂与酶的必需基团以 共价键 结合。
② 可逆抑制作用 reversible inhibition
特点,可透析、超过滤除去抑制剂恢复酶活。
结合,抑制剂与酶以 非共价键 结合！
Chapter 3 Enzyme
③ 抑制作用的动力学特点不可逆抑制,酶失活,酶量减少,原点右移；
可逆抑制,酶与底物结合存在竞争，酶 活性下降
Chapter 3 Enzyme
⑵ 可逆抑制作用
① 竞争性抑制作用 competitive inhibiton
抑制剂和底物相互 竞争 和 排斥 对酶的结合的抑制作用。
概念
EI<==>I+E+S<==>ES→→→E+P
酶不能同时与 S和 I结合，因此只有 EI和 ES，
没有 ESI，故酶的总浓度 [E]为
[E]=[Ef]+[ES]+[EI]
反应特征
Chapter 3 Enzyme
A.竞争性抑制作用的 动力学特征
][)][1(
][m a x
S
k
Ik
SVv
i
m
baxyVSkIV kv
i
m,类似
m a xm a x
1
][
1)][1(1
数学分析
m a x][
'
m a x lim vvv s
变大！
'
m a x2
1 vv?
当 [S]→∞ 时，表观最大反应速度为：
当
m a x
'
m a x 2
1
2
1 vvv
mm
i
m kkk
IkS?')][1(][
时，
Chapter 3 Enzyme
B.常见的 竞争性抑制剂药物,酶的竞争性抑制剂！
氨基喋呤,FH2还原酶的竞争性抑制剂，
抑制 FH4的合成,FH4是核酸合成的辅酶结果,能抑制癌细胞，治疗白血病。
叶酸合成注意磺胺结构,与 对氨基苯甲酸 的结构相似，竞争性抑制叶酸合成酶。
结果,人和畜禽能利用食物中的叶酸，
细菌不能利用外源叶酸，须自己合成。
结构,抑制剂与底物结构相似 不是 竞争性抑制的必要条件。
关键,抑制剂与酶活性部位之外的 必需基团 结合后，产生了不利于与底物结合的酶分子构象变化。
Chapter 3 Enzyme
② 非竞争性抑制作用 noncompetitive inhibition
酶与底物和抑制剂可形成三元复合物 ESI,但酶分子不能催化底物反应，导致酶活性丧失的抑制作用。
动力学概念
））（（
i
m k
I
Sk
SV
v
][
1][
][m a x
)][1(1][ 1)][1(1
m a xm a x ii
m
k
I
VSk
I
V
k
v
双倒数方程
Chapter 3 Enzyme
③ 反非竞争性抑制 uncompetitive inhibition
概念动力学酶先与底物结合后才与抑制剂结合的抑制现象。
i
m k
I
Sk
SV
v
][
1]([
][m a x
双倒数方程
)][1(1
][
11
m a xm a x i
m
k
I
VSV
k
v
Chapter 3 Enzyme
⑶ 不可逆抑制作用 irreversible inhibition
酶的活性不能恢复的抑制现象。概念
① 有机磷化合物与酶活性部位的 Ser共价结合，强烈抑制胆碱酯酶，
使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱，阻止了神经的信号传递，引起 神经中毒,又称 神经毒剂缓解原理种类
DFP（ or DIFP,二异丙基磷酰氟），
敌敌畏,敌百虫,对硫磷,
萨林（甲基异丙基磷酰氟）等。
解磷定 （ pralidoxime,吡啶 -2-甲醛肟碘甲烷
Pyridine-2-aldoxime methyliodide,PAM）
氯磷定 （ Pralidoxime Chloride） 能把酶上的磷酸根去掉，使酶部分恢复活性。
Chapter 3 Enzyme
② 有机汞、有机砷抑制含巯基酶！
③ 重金属盐种类,Ag+,Cu2+,Hg2+,Pb2+,Fe3+等机制,高浓度时使酶变性而失活，
低浓度时沉淀抑制酶活。
缓解,金属螯合剂如 EDTA,半胱氨酸等去掉重金属，恢复酶部分活性。
机制解除 物质,含巯基化合物！种类,牛奶，水果等！
Chapter 3 Enzyme
④ 烷化试剂种类,含卤素，如碘乙酸、碘乙酰胺,2,4-二硝基氟苯作用,巯基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等。
⑤ 氰化物、硫化物 和 CO
与金属离子形成稳定的络合物使酶失活。
氰化物与铁卟啉中的 Fe2+结合，如 cyt c，
阻止细胞呼吸，尸表有 青紫斑 。
机制
⑥ 青霉素 Penicillin
机制,共价结合糖肽转肽酶活性部位的 ser，酶失活！
结果,细菌细胞壁的合成受阻而抗菌。
Chapter 3 Enzyme
5.激活剂 activator对酶反应速度的影响凡提高酶活性的物质。
6.温度 对酶反应速度的影响最适温度温度系数金属,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+,K+,Na+等阴离子,Cl-,Br-,I-,CN-,PO43-等。
optimum temperature
使酶反应速度最大的温度。
概念种类概念,提高 10℃ 时速率与原反应速率之比。
符号,Q10
实际,在达到最适温度前,Q10=1~2。
问题？
Chapter 3 Enzyme
7.pH对酶反应速度的影响
optimum pH,酶活力最高时的溶液 pH值，
酶的特性之一，但非常数，受许多因素的影响，如底物浓度、缓冲液种类等。
原因最适
pH
A.影响酶的 空间结构 。
B,影响底物和酶 活性部位 基团的解离状态。
C.影响酶与空间结构的有关基团的解离。
Chapter 3 Enzyme
Ⅴ,酶工程 enzyme engineering
研究 酶 的生产、纯化、固定化技术、
分子的 修饰 和 改造理论研究、生产、医药卫生等的 应用 研究！
1.化学酶工程 （ 初级酶工程 ）
primary enzyme engineering
内容,对 天然酶、化学修饰酶、
固定化酶、人工模拟酶 的研究和应用！
Chapter 3 Enzyme
⑵ 化学修饰酶化学修饰酶,化学修饰酶后改善 性能 的酶。
① 化学修饰酶的功能基亲核氨基酸,Ser,Cys,Thr,Lys,His
亲电氨基酸,Tyr,Trp
可氧化氨基酸,Tyr,Trp,Met
⑴ 天然酶方法,分离纯化微生物发酵产生的酶供工业应用！
特点,价格低，方法简便！
缺点,种类少，使用范围窄！
Chapter 3 Enzyme
α-胰凝乳蛋白酶修饰,酶表面的 -NH2→ -NHCH2COOH
性质,增强亲水性结果,60℃ 时稳定性提高 l000倍应用,高温环境！
修饰,酰化修饰氨基结果,血浆中酶的稳定性提高应用,抗白血病药物！
天冬酰胺酶
Chapter 3 Enzyme
② 交联反应材料,双功能试剂作用,酶 分子间 或 分子内 发生交联！
实例,α-半乳糖苷酶 A（人）交联后稳定好前景,交联两种功能不同的药，用酶 同时 输送到同一部位，提高药效！
③ 大分子修饰作用材料,可溶高分子（如肝素,葡聚糖,聚乙二醇）
作用,修饰酶的侧链，提高稳定性！
Chapter 3 Enzyme
⑶ 固定化酶 immobilized enzyme
概念,将水溶性酶用物理或化学方法处理，
成为不溶于水、但仍有酶活的酶。
方法,物理法（吸附和包埋）
化学法（共价偶联和交联）固定！
稳定性提高！
使用寿命延长；
易与产物分离；
抗震动和搅拌；
易清洗！
优点
Chapter 3 Enzyme
酶的专一性、灵敏性和电位测定的简单性
80多种固定化酶电极！
将完成一组反应的酶固定！
生产酒精、啤酒、有机溶剂、有机酸、
氨基酸、抗菌素、单克隆抗体和酶等。
酶电极应用生物传感器模拟生物多酶体系生物反应器在活细胞上固定酶应用前景非常广阔！
Chapter 3 Enzyme
⑷ 人工模拟酶 artificial enzyme
人工模拟酶,用化学 半合成法 或化学 全合成法合成的人工酶！
全合成酶,并入酶 必需基团 有酶活性的有机物！
必需基团 =结合基团 +催化基团 +维持构象基团进展,实际应用还有很长的距离！
Chapter 3 Enzyme
2.生物酶工程（ 高级酶工程 ）
advanced enzyme engineering
酶学和以 DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的技术！
突变酶内容基因工程技术大量生产酶！
概念新酶克隆酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶！
设计新酶基因，合成自然界不存在的 新酶 ！
Chapter 3 Enzyme
3.抗体酶 abzyme） 催化性抗体 catalytic antibody）
有催化能力的免疫球蛋白，易变区有酶属性！
特征意义概念抗体的多样性（但结合底物专一性）和酶的催化能力的结合！
制造专一性破坏病毒蛋白质的酶！
清除血管壁上的血液凝块！
降解可卡因以治疗毒瘾！
固定化抗体酶可作生物传感器！
Chapter 3 Enzyme
4.核酶 ribozyme
⑴ 概念
1982年 Thomas R,Cech等；
材料核酶发现原生动物 嗜热四膜虫 ；
转录产物 rRNA前体（约 6400个 nt）,在鸟苷和 Mg2+存在下切除自身的 413个核苷酸的 内含子 （ intron,又称为间接插入序列 intervening
sequence,IVS）,使两个外显子（ exon） 拼接起来形成成熟的 rRNA分子。
Chapter 3 Enzyme
⑵ 核酶的 种类
① 催化分子内反应 （ in cis）
A.自我剪 接 （ self-splicing） 核酶反应可逆！
催化 IVS移位和 RNA重组。
a.Ⅰ 型,IVS催化自我剪接，需鸟苷和 Mg+2
参与，得到剪接产物 G-IVS。
特点
b.Ⅱ 型,IVS催化自我剪接，不需鸟苷参与。
B.自我剪 切 （ self-cleavage） 核酶适用,转录后加工方式之一，基因复制和表达所需。
例证,丁型肝炎病毒（ HDV） RNA,烟草环斑病毒（ sTRSV）
Chapter 3 Enzyme
② 催化分子间 （ in trans）
RNase P
来源,四膜虫 rRNA前体（ 6400nt）的
3'部分（ 413nt被切除 5'部分 18nt）
结构,395nt的线状 RNA分子酶活,寡聚核糖核苷酸底物的切割和连接作用,tRNA前体 5'端成熟的内切核酸酶组成,RNA：称 MIRNA,377个 nt
催化 tRNA 5'端成熟占酶总重的 77％
蛋白质,称 C5蛋白,119AA
占酶总重的 23％！
L19RNA
或 L19IVS
Chapter 3 Enzyme
⑶ 核酶的研究意义及应用前景
① 进入细胞核问题,蛋白酶进入细胞核 难,核酶可进入，
但易被 RNase破坏。
前景,设计核酶基因，已成功在细胞内表达。
② 抗病毒问题,人类对病毒的办法很少！
核酶,可清除或阻断已经整合到细胞染色体上的病毒基因表达！
前景,抗病毒感染，抗肿瘤！
Chapter 3 Enzyme
③ 蛋白质合成问题,核酶催化氨酰酯水解的可逆和转移反应，
可能有氨酰 tRNA合成酶 和 肽基转移酶 活性意义,蛋白质合成的氨基酸活化机理的研究。
④ 我国已在 体外 用核酶成功剪切乙肝、甲肝病毒、
蚕核多角体病毒及 MTV（ mammary tumor virus
乳腺瘤病毒）等核酸片段。
Chapter 3 Enzyme
⑤ 研究进化活性,转换数为 0.1~5，比蛋白酶低几个数量级 ！
进化,也许正是生物代谢高效率和生命现象复杂化的证据！
RNA→RNA→ 蛋白质 → 蛋白质 -RNA→
蛋白质 -辅酶（辅基） → 蛋白质内含子,有酶活性！
可能是生物进化残存的分子,化石,！
第三章 酶
Ⅰ,酶的一般性质
1.酶的化学本质
⑴ 化学本质
①水解产物是 AA，酶能被蛋白酶水解；
②使蛋白质变性的因素可使酶变性失活；
③两性电解质；
④胶体性质，如不能通过半透膜等；
⑤呈色反应：酶和蛋白质具有。
⑥其他：活性中心、空间结构等；
依据除核酶外！
Chapter 3 Enzyme
⑵ 单体酶、寡聚酶、多酶体系 和 多功能酶
① 单体酶 monomeric enzyme
一条肽链,无 四级结构多条肽链,共价 连接分子量种类组成
（ 13~35）× 103
少,多催化 水解 反应；
牛胰核糖核酸酶、溶菌酶、羧肽酶 A等胰凝乳蛋白酶：肽链组成，链间 二硫键
Chapter 3 Enzyme
② 寡聚酶 oligomeric enzyme
两个或两个以上亚基亚基结构连接亚基数量组成非共价键的次级键，易分开！
可相同，也可不同。
绝大部分含偶数亚基个别含奇数亚基：如荧光素酶、嘌呤核苷磷酸化酶均含 3亚基
Chapter 3 Enzyme
③ 多酶复合体 multienzyme complex
催化一系列反应几乎同时同地进行反应的一组酶，它们以 非共价键 相互嵌合。
丙酮酸脱氢酶复合体脂肪酸合成酶系概念名称,脂肪酸合成酶复合体
fatty acid synthase complex
脂肪酸合成酶系
fatty acid synthase system
组成,7个酶和 1个酰基转移蛋白组成分子量,2.2× 106。
名称,pyruvate dehydrogenase complex
组成,E,coli,3个酶 60个亚基组成分子量,4.6~5.0× 106；
牛肾,7.8× 106。
Chapter 3 Enzyme
④ 多酶融合体 （ 多功能酶 ）
一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶,多是基因融合的产物 。
分支酸变位酶双功能酶概念名称,Asp激酶 Ⅰ - homoserine脱氢酶 Ⅰ 融合体组成,四聚体 α4
功能,N-端区域 → Asp激酶，
C-端区域 → homoserine脱氢酶。
P蛋白,分支酸变位酶 P-预莽酸脱水酶；
合成苯丙氨酸
T蛋白,分支酸变位酶 T-预莽酸脱氢酶；
合成酪氨酸
Chapter 3 Enzyme
2.酶促反应的 特点
⑴ 易失活常温、常压、近中性水中工业固氮失活因素反应条件固氮酶变性因素,高温、强碱、强酸、重金属盐等条件,27℃,中性 pH
产量,1亿吨氮 /年
500℃,几百个大气压
Chapter 3 Enzyme
⑵ 高 催化效率在一定条件下，
每秒钟每个酶分子转换底物的分子数 ；
或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数实际定义酶转换数 turnover number,TN=催化常数 kcat
大多数酶对天然底物的转换数为每秒 1到 104。
Chapter 3 Enzyme
⑶ 酶的 专一性 specificity
酶对催化的反应和反应物的选择性。
高度专一性专一性酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。
①结构 专一性只作用于一种底物，不作用于任何其他物质的酶的催化特性。
A.绝对专一性
Chapter 3 Enzyme
严格,α-糖苷键，一端有葡萄糖宽松,另一端 R基团可多种糖键专一性
α-D-葡萄糖苷酶作用于底物 特定化学键 的酶催化特性。
如 酯酶 催化酯键的水解。
B.相对 专一性 作用 结构相近 的底物的酶催化特性酶对底物链两端的基团要求不同，
对其中一个基团要求严格，对另一个要求不严格的催化特性。
族专一性 或基团专一性
Chapter 3 Enzyme
② 立体异构专一性 stereospecificity
只催化一种 几何异构体 的酶催化特性。
琥珀酸 脱氢酶 催化琥珀酸脱氢 → 延胡索酸不 能生成 顺 丁烯二酸（马来酸）。
只催化底物的一种 立体异构体 的酶催化特性。
B几何异构专一性
C.对称基团专一性特点只催化一种 对映异构体 的酶催化特性。
L-AA氧化酶 催化 L-AA氧化，不作用 D-AA
酶只催化 对称分子 中的两个等同基团的一个,不 催化另一个。
甘油 一端 14C标记,甘油激酶 催化只产生一种 甘油 -1-磷酸 标记物。
A.旋光异构专一性
Chapter 3 Enzyme
3.酶的化学组成简单酶 =简单蛋白质 simple protein
如 脲酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶 等 水解酶 ；
全酶 holoenzyme
=结合蛋白 conjugated protein
=酶蛋白 +辅酶 or 辅基
Chapter 3 Enzyme
名称,脱 辅 蛋白质 （ apoprotein）
或 脱 辅 酶 （ apoenzyme cofactor）
组成,酶的氨基酸组成部分辅酶辅基酶蛋白
coenzyme,与酶蛋白结合 不紧密,可用 透析法 与酶蛋白分开，多是维生素及其衍生物成。
prosthetic group,与酶蛋白结合 紧密,不能用 透析法 与酶蛋白分离，多为金属离子。
Chapter 3 Enzyme
4.酶的分类与命名
⑴ 习惯命名法
1961年以前酶的名称，称习惯名。
⑵ 国际系统命名法原则命名原则渊源
①根据 酶作用的底物 命名
②根据 酶催化反应的性质规定,以整体反应为基础的酶命名规则。
内容,底物、反应的性质。
特点,名称冗长！
Chapter 3 Enzyme
⑶ 国际系统分类法及酶编号乙醇脱氢酶,EC1.1.1.1
乳酸脱氢酶,EC1.1.1.27
苹果酸脱氢酶,EC1.1.1.37
大类,氧化还原酶氧化基团,CHOH；
受氢体,NAD+；
编号,1,27,37；
转 水 裂 异 合氧
Chapter 3 Enzyme
⑷ 国际系统分类的 盲区忽略酶的物种差异和组织差异。
种类催化反应盲区超氧化物歧化酶,superoxide dismutase,SOD
EC1.15.1.1
方案编号 一个名称和编号
2O2-+2H+→H 2O2+O2
CuZn-SOD,真核生物细胞质中
Mn-SOD,真核生物线粒体中
Fe-SOD,广泛存在
CuZn-SOD,牛 红细胞与 猪 红细胞中一级结构差异大名称注明酶的来源与名称！
Chapter 3 Enzyme
Ⅱ,酶促反应的 作用机理
1.与化学催化剂的比较
⑴反应前后催化剂的 数量 和 性质 不发生改变
⑵ 不改变 反应的平衡点，加快达到平衡的时间
⑶降低反应的 活化能,反应易进行能量较高，处于活化态的分子。
结果活化能
activation
energy
活化分子
activation molecule
活化分子比一般分子高出的能量 。
单位,一定温度下 1摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能,kJ/mol。
活化能愈高，活化分子数少，反应速率慢。
催化剂能瞬时与反应物结合成过渡态，降低反应所需的活化能。
Chapter 3 Enzyme
2.过渡态和活化能
⑴ 过渡态 transition state
A+B→→→A……B→→→C+D
初态 过渡态 终态过渡态反应特征 反应的全过程含一个或多个过渡态（中间产物）
极不稳定的 中间产物,寿命极短。
其结构不同于反应物和产物。
Chapter 3 Enzyme
⑵ 活化能 activation energy
反应物（初态）转化成中间产物（过渡态）所需要的能量。活化能
Chapter 3 Enzyme
3.中间产物学说
S+E→→→ES→→→ES ≠→→→EP→→→P+E
中间产物与 过渡态反应中间产物
ES,合成酶 -底物复合物
ES≠：酶 -过渡态中间物复合物
EP,酶 -产物复合物稳定,稳定可分离！
寿命,短而难于分离酶,总结果中不参与反应证据观察,电子显微镜可直接观察 核酸聚合酶与 核酸 结合而成的复合物！
产物,已分离并结晶 D-氨基酸氧化酶 与
D-氨基酸 结合的复合物。
Chapter 3 Enzyme
4.诱导契合 induced fit假说
1958年,Koshland提出内容酶分子的活性部位有一定的 可变性,当底物分子与酶分子相遇时，可诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性部位上各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与 定向,使酶与底物 互补结合,产生 酶 -
底物复合物,使底物发生反应。
Chapter 3 Enzyme
5.酸碱 催化 acid-base catalysis
酸碱催化狭义 酸碱催化广义 酸碱催化向反应体系 瞬时 提供 H+或从反应物 接受 H+以稳定过渡态,加速 反应达到平衡的催化机制。
总 酸碱催化：通过 H+和 OH-以及能提供
H+及 OH-的 供体 进行的催化。
专一 酸碱催化：在水溶液中通过 高反应性 的 H+和 OH-进行的催化。
Chapter 3 Enzyme
6.共价催化 covalent catalysis
亲核催化 nucleophilic catalysis
或 亲电子催化 electrophilic catalysis名称效应结果放出 电子或 汲取 电子！
形成 不稳定 的共价 中间复合物,
降低 反应 活化能,加速 反应
Chapter 3 Enzyme
Ⅲ,酶活力 测定及调节
1.酶活力 enzyme activity
⑴ 概念酶催化某一化学反应的 能力 。
一定条件 下催化的某一化学反应的 速率
（ reaction velocity或 reaction rate）
速率越 大,酶的活力越 高 。
酶活力
Chapter 3 Enzyme
⑵ 酶的 活力单位 （ U,activity unit）
在 一定 条件下，一定时间内将 一定量 底物转化为产物所需的酶量。
表示,每 克 或每 毫升 酶制剂含的酶单位（ U/g或 U/m1）
最适条件酶单位国际单位 IU
最适条件下,1min催化 1μmol底物 转化为 产物 所需的 酶量 为一个 酶活力 单位，即 IU=1μmol /min。
温度（ 25℃ 或 37 ℃ ）,pH
缓冲液离子强度、底物浓度最适条件下，每 秒 钟能催化 lmol底物 转化为产物所需的 酶量,1Kat=1mol/s
Kat
单位
1Kat=60× 106IU
1IU=1μKat/60= 16.7nKat
Chapter 3 Enzyme
⑶ 酶的 比活力 specific activity
比活力每 mg蛋白质所含的酶活力单位。
同一种酶的比活力愈 大,酶的 纯度 愈高。
比活力 = 活力 U/mg蛋白 = 总活力 U/总蛋白 mg
Chapter 3 Enzyme
⑷ 酶活力的 实际使用酶单位,30℃,1分钟,使底物 DNA
溶液的 比粘度 下降 25%的 酶量 。
淀粉酶凝胶电泳法
① 1g可溶性 starch,1h内 液化 所需的 酶量 。
② lml 2%可溶性 starch,1h内 液化 所需的 酶量 。
酶单位,37℃ 1小时使 1ugλDNA
完全 水解 的 酶量 。
酶单位,5分钟使 1ugDNA活性 残留 37%所需的 酶量 。
限制性核酸内切酶粘度法转化率法
Chapter 3 Enzyme
⑸ 酶活力的测定方法
① 分光光度法 spectrophotometry
底物或产物在紫外或可见光部分的光吸收变化，选择波长测定酶活力。
原理酶偶联分析法
enzyme coupling
assay
原理
② 荧光法 fluorometry
范围,无光吸收变化的酶反应方法,第一个酶反应的产物，与能引起光吸收变化的酶反应偶联，转变为有光吸收变化的产物来测量酶活。
底物或产物的荧光差别来测定酶活。
特点 灵敏度比分光光度法高。
Chapter 3 Enzyme
③ 同位素测定法 isotope method
用 放射性同位素 标记底物，酶作用后测产物的脉冲数，换算出酶活力。
④ 电化学法 electrochemical method
特点原理灵敏度 极高 ！
A.测定 pH的变化计算酶的反应速率。
B.恒定 pH,由加入酸或碱的速率计算酶活！原理特点 应用广泛！多测定酯酶活力。
Chapter 3 Enzyme
2.酶原激活
⑴ 酶活性中心 active center
名称,活性部位 active site或活性中心概念,酶分子中能直接与底物结合，并催化底物化学反应的部位。
结合部位概念结合基团活性部位 或 活性中心 ==结合部位 + 催化部位由不少于三个以上的结合基团组成结合部位，决定底物 专一性。
binding group,直接与底物结合的基团。
Chapter 3 Enzyme
一般由 2~3个 催化基团 组成催化部位，决定酶的 催化效率 。
催化基团催化部位活性部位特征
catalytic group,直接催化底物反应的基团 。
一级结构,或近或远，甚至不在同一肽链上空间位置,靠近！
直接参与对底物分子结合和催化的基团及参与维持酶分子构象的基团。酶分子中基团很多，但仅 必需基团 才与酶活性有关。
必需基团 =结合基团 +催化基团 +维持构象基团必需基团
essential group
Chapter 3 Enzyme
⑵ 酶原激活刚合成 的 无活性 的酶前体。酶原酶原激活
⑶ 酶活性部位的特点酶原经适当的肽键切割，成为有活性的酶的过程。
结果,无活性的酶原 →→ 有 活性的酶
① 空间 比例小体积,约占 1~2％
氨基酸,催化部位,仅 2~3个结合部位,少则 1个，多则数个。
Chapter 3 Enzyme
③ 底物结合过程
② 活性部位是 三维实体 结构诱导契合（ induced-fit）假说内容形状,酶的活性部位和底物的形状 不互补变化,酶和底物结合过程中，
底物或酶，或两者同时发生构象变化结果,形状互补催化基团位置,在底物反应键和即将生成键处
Chapter 3 Enzyme
⑤ 底物与酶结合
④ 活性部位位置酶表面的一个 裂缝 （ crevice） 内。 圆形？
⑥ 酶活性部位具有 柔性 或 可运动 性。
次级键,非共价键,noncovalent，
如氢键、疏水键、盐键、范德华力结合键结合力 弱！
Chapter 3 Enzyme
3.变构酶 allosteric enzyme
⑴ 概念对代谢 途径 的反应起调节作用的酶变构酶、共价调节酶、同功酶变构酶调节酶含 2个或 2个以上亚基的调节酶！
同促变构酶、异促变构酶、同促异促变构酶
Chapter 3 Enzyme
名称,catalytic center
功能,结合和催化底物分子！
调节亚基调节中心名称,catalytic subunit
结构,含催化中心的 亚基 ！
名称,regulatory center
作用,结合调节物，调节催化中心！
催化亚基催化中心名称,regulatory subunit
结构,含调节中心的 亚基 ！
Chapter 3 Enzyme
⑵ 变构酶的意义终产物过 多 时,降低 代谢途径的总反应速度,减少 原始底物的消耗,避免 终产物的过多产生！
别构激活变构抑制异促别构酶以 底物 作激活剂，结合到酶分子的调节部位，避免过多 底物 的积累！
Chapter 3 Enzyme
4.共价调节酶 covalent modification enzyme
酶促共价修饰对酶活力的调节酶 修 饰 机 理 活力变化糖原磷酸化酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大磷酸化酶 b激酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大糖原合成酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大丙酮酸脱氢酶 磷酸化 /脱磷酸 减小 /增大谷酰胺合成酶 腺苷酰化 /脱腺苷酰 减小 /增大酶的基团与化合物 共价 结合或解离后，使酶的 活性 发生改变的酶！概念共价修饰调节 共价调节酶的修饰作用！
Chapter 3 Enzyme
5.同工酶 isoenzyme or isozyme
催化 相同 或 相似 化学反应，但酶分 子结构、
性质 存在明显差异的一组酶！
原因概念组织或细胞器特异性！
细胞分化（胚胎发育）！
疾病诊断！应用分布编码基因的差异！
Chapter 3 Enzyme
Ⅳ,影响酶促反应速度的因素
1.动力学基础单位时间内 底物 或 产物 浓度 的变化。
含义速率定义注意数学形式
v=-dc/dt； 或 v=+dc/dt；
v=-d[S]/dt=d[P]/dt
负号,底物浓度的减少正号,产物浓度的增多若有水参与反应，则：
V= =-dS/dt=dP/dt
Chapter 3 Enzyme
2.底物浓度 对酶反应速度的影响
⑴ 底物浓度与酶反应速度的 关系产物不断被下一步反应 消耗,产物与酶形成 ES的反应基本不会发生。
在酶浓度、温度,pH等不变的情况，酶和底物结合形成中间复合物，反应如下：
特点没有反应常数 k4！结果
E+S ES E+Pk
2
k3
k4
k1
Chapter 3 Enzyme
⑵ 米氏常数推导
][
][
][
]][[][ m a x3
3
SK
SV
SKm
SEKESKV
m?
稳态法快速平衡法应用,早期！
内容,酶与底物形成 ES的速度 极快,
ES形成产物的速度 极慢 。
结果,[ES] 的动态平衡与 ES? P+E无关应用,现在内容,ES的形成速度与分解速度相等，
ES的浓度保持不变。
Chapter 3 Enzyme
E+S ES E+Pk
2
k3
k4
k1
ES的 形成 速度,d[ES]/dt=k1*[E现在 ]*[S]
= k1*（ [E]-[ES]） *[S]
ES的 分解 速度,-d[ES]/dt=k2*[ES]+k3*[ES]
在反应达到 平衡 时,ES的形成和分解的速率相等，得下面的公式（ 1）
设
1
32
k
kkk
m
Chapter 3 Enzyme
当 [S]较大时当 [S] >> km时关键点
A反应平衡时,ES生成速度 v1等于 ES分解速度 v2
B.Km的定义！
C.酶促反应的总反应速度是 ES的 k3解离速度
D.底物浓度 [S]无穷大时,[E]=[ES]
mS k
Svv ][m a x
0][
lim
m a x
][
lim vv
S
0])[( )][][][ 2m a x?Sk kSSkvSd dv
m
mm
（
当 [S] << km时
Chapter 3 Enzyme
米氏常数的 意义当 [S]= km时
2][
][ m a xm a x V
SK
SVV
m
A,km是反应速度为 vmax一半时的底物浓度
B.km单位是浓度的单位,mol/L。 为什么？
⑶ 米氏常数的 意义
① km是酶的 特征常数 之一因素,底物种类、反应温度,pH及离子强度等性质,km与 酶性质 有关，与 酶浓度 无关！
鉴别酶影响因素不同来源或 相同来源但不同发育阶段、不同生理状况下 催化相同反应的酶 是否 属同一种酶。
Chapter 3 Enzyme
② 判断酶的 专一性 和 天然底物名称,最适底物概念,在不止一种底物的酶的底物中，
km值最小的底物。
天然底物原因 1/km可近似表示酶对底物亲和力大小！1/k
m愈大，亲合力越大！
Km为达到 vmax一半所需底物浓度小。
Chapter 3 Enzyme
当 k3<<k2时,km=k2/k1,即 km=ks
ES的分解是反应的 限制 速率,km等于 ES复合物的解离常数（底物常数）。
③ 底物常数 的情况原因应用
km可表示酶和底物结合的 亲和力 大小。
当 k3极小时,1/km来近似地说明酶与底物结合的难易程度。
④已知酶的 km，可计算在某 [S]时，其反应速率相当于 vmax的百分率。
Chapter 3 Enzyme
⑤ km值可推断代谢反应的 方向 和 途径
A.推测可逆反应谷氨酸脱氢酶催化下列反应：
L-谷氨酸 +NAD 亚氨基戊酸 +NADH2
km=1.8× 10-5 mol/Lkm=2.5× 10-5 mol/L
Chapter 3 Enzyme
B.推测 限速反应
B C DA
10-2 mol/L 10-4 mol/Lkm=10-3 mol/L
C.推测 代谢途径乳酸：乳酸脱氢酶 km=1.7× 10-5 mol/L
乙酰 CoA,丙酮酸脱氢酶 系,1.3× 10-3
乙醛,丙酮酸脱羧酶 1.0× 10-3 mol/L
丙酮酸
Chapter 3 Enzyme
⑥ vmax和 k3（ kcat） 的 意义酶浓度 一定时,vmax对特定底物为常数。
与 km相似，随底物种类,pH,温度和离子强度等因素而变化。
vmax
k3 = TN = kcat
k3和 [E] [S]→∞ 时,vmax=k3[ES]=k3[E]，v
max和 [E]成正比关系。
k3,当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数,又称 转换数 （简称 TN）,催化常数
（ catalytic constant,kcat） 。
kcat值越大，酶催化效率越高（但不一定常用）。
Chapter 3 Enzyme
⑦ kcat/km的意义
][][)(][][)(
32
13 SE
k
kSE
kk
kkv
m
c a t
E+S→→ P
在生理条件下,[S]很小酶并不被底物饱和，体内 [S]/ km的比值通常介于 0.01~1.0之间。
另称,表观二级速率常数概念,酶促反应的可测定速率常数。
专一性常数
Chapter 3 Enzyme
⑷ 米氏常数的求法
① Lineweaver-Burk双倒数作图法（ 常用 ）
将米氏方程式改写为下列倒数形式：
baxy
vSv
k
v
m 类似于,1
][
11
m a xm a x
② Eadie-Hofstee作图改写米氏方程为：
axby
S
vkVv
m,类似于][m a x
Chapter 3 Enzyme
③ Hanes-Woolf作图将米氏方程变形为：
baxyv kSvvS m,类似方程
m a xm a x
][1][
④ Eisenthal和 Cornish-Bowden作图改写米氏方程为：
mkS
v
vv
][m a x
直线簇交点是 km和 vmax的值，可识别实验中不正确的观察结果。
Chapter 3 Enzyme
3.酶浓度 对酶反应速度的影响根据米氏方程可得,
][
]][[
3
Sk
SE
kv
m?
反应速度与酶浓度成 正比 ！
Chapter 3 Enzyme
4.抑制剂 对酶反应速度的影响
inhibition
概念,酶分子必需基团结合一些物质后，改变酶性质，使酶活降低，甚至完全丧失的作用。
本质,酶未变性！
抑制剂 inhibitor
种类抑制作用有机磷杀虫剂、磺胺类药物等产生抑制作用的物质 。
Chapter 3 Enzyme
⑴ 抑制作用的 鉴别 和 种类
① 不可逆抑制作用 irreversible inhibition
本质,酶被化学修饰，又称 修饰抑制特点,不能用 透析,超过滤 等方法除去抑制剂结合,抑制剂与酶的必需基团以 共价键 结合。
② 可逆抑制作用 reversible inhibition
特点,可透析、超过滤除去抑制剂恢复酶活。
结合,抑制剂与酶以 非共价键 结合！
Chapter 3 Enzyme
③ 抑制作用的动力学特点不可逆抑制,酶失活,酶量减少,原点右移；
可逆抑制,酶与底物结合存在竞争，酶 活性下降
Chapter 3 Enzyme
⑵ 可逆抑制作用
① 竞争性抑制作用 competitive inhibiton
抑制剂和底物相互 竞争 和 排斥 对酶的结合的抑制作用。
概念
EI<==>I+E+S<==>ES→→→E+P
酶不能同时与 S和 I结合，因此只有 EI和 ES，
没有 ESI，故酶的总浓度 [E]为
[E]=[Ef]+[ES]+[EI]
反应特征
Chapter 3 Enzyme
A.竞争性抑制作用的 动力学特征
][)][1(
][m a x
S
k
Ik
SVv
i
m
baxyVSkIV kv
i
m,类似
m a xm a x
1
][
1)][1(1
数学分析
m a x][
'
m a x lim vvv s
变大！
'
m a x2
1 vv?
当 [S]→∞ 时，表观最大反应速度为：
当
m a x
'
m a x 2
1
2
1 vvv
mm
i
m kkk
IkS?')][1(][
时，
Chapter 3 Enzyme
B.常见的 竞争性抑制剂药物,酶的竞争性抑制剂！
氨基喋呤,FH2还原酶的竞争性抑制剂，
抑制 FH4的合成,FH4是核酸合成的辅酶结果,能抑制癌细胞，治疗白血病。
叶酸合成注意磺胺结构,与 对氨基苯甲酸 的结构相似，竞争性抑制叶酸合成酶。
结果,人和畜禽能利用食物中的叶酸，
细菌不能利用外源叶酸，须自己合成。
结构,抑制剂与底物结构相似 不是 竞争性抑制的必要条件。
关键,抑制剂与酶活性部位之外的 必需基团 结合后，产生了不利于与底物结合的酶分子构象变化。
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② 非竞争性抑制作用 noncompetitive inhibition
酶与底物和抑制剂可形成三元复合物 ESI,但酶分子不能催化底物反应，导致酶活性丧失的抑制作用。
动力学概念
））（（
i
m k
I
Sk
SV
v
][
1][
][m a x
)][1(1][ 1)][1(1
m a xm a x ii
m
k
I
VSk
I
V
k
v
双倒数方程
Chapter 3 Enzyme
③ 反非竞争性抑制 uncompetitive inhibition
概念动力学酶先与底物结合后才与抑制剂结合的抑制现象。
i
m k
I
Sk
SV
v
][
1]([
][m a x
双倒数方程
)][1(1
][
11
m a xm a x i
m
k
I
VSV
k
v
Chapter 3 Enzyme
⑶ 不可逆抑制作用 irreversible inhibition
酶的活性不能恢复的抑制现象。概念
① 有机磷化合物与酶活性部位的 Ser共价结合，强烈抑制胆碱酯酶，
使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱，阻止了神经的信号传递，引起 神经中毒,又称 神经毒剂缓解原理种类
DFP（ or DIFP,二异丙基磷酰氟），
敌敌畏,敌百虫,对硫磷,
萨林（甲基异丙基磷酰氟）等。
解磷定 （ pralidoxime,吡啶 -2-甲醛肟碘甲烷
Pyridine-2-aldoxime methyliodide,PAM）
氯磷定 （ Pralidoxime Chloride） 能把酶上的磷酸根去掉，使酶部分恢复活性。
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② 有机汞、有机砷抑制含巯基酶！
③ 重金属盐种类,Ag+,Cu2+,Hg2+,Pb2+,Fe3+等机制,高浓度时使酶变性而失活，
低浓度时沉淀抑制酶活。
缓解,金属螯合剂如 EDTA,半胱氨酸等去掉重金属，恢复酶部分活性。
机制解除 物质,含巯基化合物！种类,牛奶，水果等！
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④ 烷化试剂种类,含卤素，如碘乙酸、碘乙酰胺,2,4-二硝基氟苯作用,巯基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等。
⑤ 氰化物、硫化物 和 CO
与金属离子形成稳定的络合物使酶失活。
氰化物与铁卟啉中的 Fe2+结合，如 cyt c，
阻止细胞呼吸，尸表有 青紫斑 。
机制
⑥ 青霉素 Penicillin
机制,共价结合糖肽转肽酶活性部位的 ser，酶失活！
结果,细菌细胞壁的合成受阻而抗菌。
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5.激活剂 activator对酶反应速度的影响凡提高酶活性的物质。
6.温度 对酶反应速度的影响最适温度温度系数金属,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+,K+,Na+等阴离子,Cl-,Br-,I-,CN-,PO43-等。
optimum temperature
使酶反应速度最大的温度。
概念种类概念,提高 10℃ 时速率与原反应速率之比。
符号,Q10
实际,在达到最适温度前,Q10=1~2。
问题？
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7.pH对酶反应速度的影响
optimum pH,酶活力最高时的溶液 pH值，
酶的特性之一，但非常数，受许多因素的影响，如底物浓度、缓冲液种类等。
原因最适
pH
A.影响酶的 空间结构 。
B,影响底物和酶 活性部位 基团的解离状态。
C.影响酶与空间结构的有关基团的解离。
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Ⅴ,酶工程 enzyme engineering
研究 酶 的生产、纯化、固定化技术、
分子的 修饰 和 改造理论研究、生产、医药卫生等的 应用 研究！
1.化学酶工程 （ 初级酶工程 ）
primary enzyme engineering
内容,对 天然酶、化学修饰酶、
固定化酶、人工模拟酶 的研究和应用！
Chapter 3 Enzyme
⑵ 化学修饰酶化学修饰酶,化学修饰酶后改善 性能 的酶。
① 化学修饰酶的功能基亲核氨基酸,Ser,Cys,Thr,Lys,His
亲电氨基酸,Tyr,Trp
可氧化氨基酸,Tyr,Trp,Met
⑴ 天然酶方法,分离纯化微生物发酵产生的酶供工业应用！
特点,价格低，方法简便！
缺点,种类少，使用范围窄！
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α-胰凝乳蛋白酶修饰,酶表面的 -NH2→ -NHCH2COOH
性质,增强亲水性结果,60℃ 时稳定性提高 l000倍应用,高温环境！
修饰,酰化修饰氨基结果,血浆中酶的稳定性提高应用,抗白血病药物！
天冬酰胺酶
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② 交联反应材料,双功能试剂作用,酶 分子间 或 分子内 发生交联！
实例,α-半乳糖苷酶 A（人）交联后稳定好前景,交联两种功能不同的药，用酶 同时 输送到同一部位，提高药效！
③ 大分子修饰作用材料,可溶高分子（如肝素,葡聚糖,聚乙二醇）
作用,修饰酶的侧链，提高稳定性！
Chapter 3 Enzyme
⑶ 固定化酶 immobilized enzyme
概念,将水溶性酶用物理或化学方法处理，
成为不溶于水、但仍有酶活的酶。
方法,物理法（吸附和包埋）
化学法（共价偶联和交联）固定！
稳定性提高！
使用寿命延长；
易与产物分离；
抗震动和搅拌；
易清洗！
优点
Chapter 3 Enzyme
酶的专一性、灵敏性和电位测定的简单性
80多种固定化酶电极！
将完成一组反应的酶固定！
生产酒精、啤酒、有机溶剂、有机酸、
氨基酸、抗菌素、单克隆抗体和酶等。
酶电极应用生物传感器模拟生物多酶体系生物反应器在活细胞上固定酶应用前景非常广阔！
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⑷ 人工模拟酶 artificial enzyme
人工模拟酶,用化学 半合成法 或化学 全合成法合成的人工酶！
全合成酶,并入酶 必需基团 有酶活性的有机物！
必需基团 =结合基团 +催化基团 +维持构象基团进展,实际应用还有很长的距离！
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2.生物酶工程（ 高级酶工程 ）
advanced enzyme engineering
酶学和以 DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的技术！
突变酶内容基因工程技术大量生产酶！
概念新酶克隆酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶！
设计新酶基因，合成自然界不存在的 新酶 ！
Chapter 3 Enzyme
3.抗体酶 abzyme） 催化性抗体 catalytic antibody）
有催化能力的免疫球蛋白，易变区有酶属性！
特征意义概念抗体的多样性（但结合底物专一性）和酶的催化能力的结合！
制造专一性破坏病毒蛋白质的酶！
清除血管壁上的血液凝块！
降解可卡因以治疗毒瘾！
固定化抗体酶可作生物传感器！
Chapter 3 Enzyme
4.核酶 ribozyme
⑴ 概念
1982年 Thomas R,Cech等；
材料核酶发现原生动物 嗜热四膜虫 ；
转录产物 rRNA前体（约 6400个 nt）,在鸟苷和 Mg2+存在下切除自身的 413个核苷酸的 内含子 （ intron,又称为间接插入序列 intervening
sequence,IVS）,使两个外显子（ exon） 拼接起来形成成熟的 rRNA分子。
Chapter 3 Enzyme
⑵ 核酶的 种类
① 催化分子内反应 （ in cis）
A.自我剪 接 （ self-splicing） 核酶反应可逆！
催化 IVS移位和 RNA重组。
a.Ⅰ 型,IVS催化自我剪接，需鸟苷和 Mg+2
参与，得到剪接产物 G-IVS。
特点
b.Ⅱ 型,IVS催化自我剪接，不需鸟苷参与。
B.自我剪 切 （ self-cleavage） 核酶适用,转录后加工方式之一，基因复制和表达所需。
例证,丁型肝炎病毒（ HDV） RNA,烟草环斑病毒（ sTRSV）
Chapter 3 Enzyme
② 催化分子间 （ in trans）
RNase P
来源,四膜虫 rRNA前体（ 6400nt）的
3'部分（ 413nt被切除 5'部分 18nt）
结构,395nt的线状 RNA分子酶活,寡聚核糖核苷酸底物的切割和连接作用,tRNA前体 5'端成熟的内切核酸酶组成,RNA：称 MIRNA,377个 nt
催化 tRNA 5'端成熟占酶总重的 77％
蛋白质,称 C5蛋白,119AA
占酶总重的 23％！
L19RNA
或 L19IVS
Chapter 3 Enzyme
⑶ 核酶的研究意义及应用前景
① 进入细胞核问题,蛋白酶进入细胞核 难,核酶可进入，
但易被 RNase破坏。
前景,设计核酶基因，已成功在细胞内表达。
② 抗病毒问题,人类对病毒的办法很少！
核酶,可清除或阻断已经整合到细胞染色体上的病毒基因表达！
前景,抗病毒感染，抗肿瘤！
Chapter 3 Enzyme
③ 蛋白质合成问题,核酶催化氨酰酯水解的可逆和转移反应，
可能有氨酰 tRNA合成酶 和 肽基转移酶 活性意义,蛋白质合成的氨基酸活化机理的研究。
④ 我国已在 体外 用核酶成功剪切乙肝、甲肝病毒、
蚕核多角体病毒及 MTV（ mammary tumor virus
乳腺瘤病毒）等核酸片段。
Chapter 3 Enzyme
⑤ 研究进化活性,转换数为 0.1~5，比蛋白酶低几个数量级 ！
进化,也许正是生物代谢高效率和生命现象复杂化的证据！
RNA→RNA→ 蛋白质 → 蛋白质 -RNA→
蛋白质 -辅酶（辅基） → 蛋白质内含子,有酶活性！
可能是生物进化残存的分子,化石,！
