组织培养：组织培养电子书籍

电子讲义具体内容如下第一章 绪 论目的要求：
(1)掌握组织培养的概念和类型；
(2)掌握组织培养的特点；
(3)一般掌握组织培养发展史；
(4)初步掌握组织培养在农业实践上的应用。
第一节 植物组织培养的意义高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。
组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、
细胞培养和原生质体培养等：
(1)植株培养(plant culture)是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。
(2)器官培养(organculture)即离体器官的培养，根据作物和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。
(3)组织或愈伤组织培养(tissue。rcallusculture)为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。
(4)细胞培养(cellculture)是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。
(5)原生质体培养(proplastculture)是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。
组织培养是本世纪发展起来的一门新技术，由于科学技术的进步，尤其是外源激素的应用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上越来越得到广泛的应用。植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之广泛，是由于具备以下几个特点,
①培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
②生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
第二节 植物组织培养的发展组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。
20世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理论，即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1912年，Habefiandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1，45-3．75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。
自Haberlandt的实验之后，直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。这之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。与此同时，Gautherer(1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织,Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来，White于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。
40年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(1AA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中，Miller等人于1956年发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。
1952年；Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。1935-1945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，，使单细胞培养获得初步成功。
1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。
1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究。
以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。
1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。
1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。
在整个植物组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的研究成效以外，还有1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。
第三节 植物组织培养与农业的关系植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。
一、快速繁殖种苗(rapidpropagation)
用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。
快速繁殖可用下列手段进行：通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系 等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。
由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是"快"，通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量，以一个茎尖或一小块叶片为基数，经组织培养一年内可增殖到10 000-100 000株。
二、无病毒苗(virus free)的培养植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。自从Morell952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。
组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。
三、在育种上的应用(breeding)
植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工
作在新的条件下更有效的进行。如用花药培养单倍体植株；用原生质体进行个体细胞杂交和基因转移；用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精，以及种质资源的保存等等。
胚培养技术很早就有利用，在种属间远缘杂交的情况下，由于生理代谢等方面的原因，杂种胚常常停止发育，因此不能得到杂种植物，所以通过胚培养就可保证远缘杂交的顺利进行。到50年代在实践上的应用就更多了，如在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鸢尾等等许多园艺植物远缘杂交育种上都得到了应用。大白菜X甘蓝的远缘杂交种"白兰"，就是通过杂种胚的培养而得到的。对早期发育幼胚因太小难以培养的种类，还可采用胚珠和子房培养来获得成功。利用胚珠和子房培养也可进行试管受精，以克服柱头或花柱对受精的障碍，使花粉管直接进入胚珠而受精。
花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交，而单倍体育种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。
利用组织培养可以进行突变体的筛选。突变的产生因部位而异，茎尖遗传性比较稳定，根、茎、叶乃至愈伤组织和细胞的培养则变异率就较大。培养基的激素也会诱导变异，因浓度而不同。此外还可采用紫外线、x射线、Y射线对材料进行照射，来诱发突变的产生。在组织培养中产生多倍体、混倍体现象的比较多，产生的变异为育种提供的材料，可以根据需要进行筛选。利用组织培养，采用与微生物筛选相似的技术，在细胞水平上进行突变体的筛选更加富有成效。
原生质体培养和体细胞杂交技术的开发，在育种上展现了一幅崭新的前景。已有多种植物经原生质体培养得到再生植物，有些植物得到体细胞杂种，无论在理论和实践上都有重要价值。随着这方面工作的深入和水平的提高，原生质体培养一定会在育种上产生深远的影响。
四、工厂化育苗(industrializing propagation)
近年来，组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。
组织培养育苗工厂化生产，是以植物组织培养为基础，在含有植物生长发育必需物质的人工合成培养基上，并附加一定量的生长调节物质，把脱离于完整植株的本来已经分化的植物器官或细胞，接种在不同的培养基上。在一定的温度、光照、湿度及pH值条件下，利用细胞的全能性以及原有的遗传基础，促使细胞重新分裂、分化长成新的组织、器官或不定芽，最后长成和母株同样的小植物体。例如非洲紫罗兰组织培养育苗的工厂化生产，就是取样品株一定部位的叶片为材料，消毒后切成一定大小的块，接种在适宜的培养基上，在培养室内培养，两个月左右在切口处产生不定芽，这些不定芽再切割后又形成新的不定芽，如此继续，即可获得批量的幼小植株，按需要量生产与样品株完全相同的苗子。
工厂化生产组织培养育苗，是按一定工艺流程和规范化程序生产的，不但具有繁殖速度快、整齐、一致、无虫少病、生长周期短、遗传性稳定的特点，而且还可以加速产品的发展，获得繁殖无性系。特别是对一些繁殖系数低、杂合的材料有性繁殖优良性状易分离、或从杂合的遗传群体中筛选出表现型优异的植株，需要保持其优良遗传性，有更重要的作用。另外，组织培养育苗的无毒化生产，还可减少病害传播，更符合国际植物检疫标准的要求，扩大产品的流通渠道，增加产品市场的销售能力，同时可以减少气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和淡、旺季的供需矛盾。
世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就已经开始，并随着生长、分化规律性探索的逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产，到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达20亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为6亿多美元，日本三友种苗公司有60％的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在1亿美元以上。由于组织培养技术的应用，加快了花卉新品种的推广。以前靠常规方法推广一个新品种要几年甚至十多年，而现在快的只要1-2年就可在世界范围内达到普及和应用。
我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。如广东切花菊"黄秀风"的应用，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使30多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活，并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。
植物组织培养也存在一定的困难，首先是繁殖效率与商品需 要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要，其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。
总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。
本章小结
(1)植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。
(2)按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、胚胎培养、
器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。
(3)组织培养具有：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。
(4)组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。
复习思考题
(1)什么是广义的植物组织培养?什么是狭义的植物组织培养?
(2)什么是"外植体"?
(3)按照外植体的不同，植物组织培养可以分成几类?比较常用的是哪些?
(4)植物组织培养有哪些特点?
(5)你认为植物组织培养技术在当前的农业生产上有什么价值?为什么?
第二章 实验设备及培养条件目的要求：
(1)掌握组织培养实验室的设计；
(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；
(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。
在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
第一节 实验室一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。
一、洗涤室(cleaning room)
洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。
二、准备室(repairing room)
准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。
为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：
(1)大型工作台 其高度应方便配制工作。
(2)药品柜 用于放置常用药品。
(3)普通冰箱 主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。
(4)电子分析天平和托盘天平 电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0．0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0．1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。
(5)电蒸馏水器 电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配制培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。
(6)磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。
(7)恒温水浴锅 恒温水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。
(8)电炉或电饭锅 电炉的功率为1500或2000W，并配有铝锅。电饭锅的功率1000W，用于琼脂的溶化。
(9)酸度计 组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。
首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。
(10)培养基分装设备 小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用"下口杯"作为分装工具，在"下口杯"的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。
(11)高压灭菌锅 用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。
(12)恒温培养箱 用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。生化培养箱还配有光照装置。
(13)烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80-100℃；进行干热灭菌需保持
150℃，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80℃烘干至完全干燥为止。
三、接种室(transfering room)
接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。
在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。
接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。
接种室应设有缓冲间，面积2m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带人接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。
接种室的主要设备及用具有：
(1)接种箱 在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。
(2)超净台cleaning table优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0．3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。超净台分水平式和垂直式二种型号。
(3)解剖镜 种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。
(4)无菌操作用的器具 按单人超净台上用量有：酒精灯1个；20-25cm长的医用镊子1把；4号解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm医用剪1把；250ml广口瓶1只，内放酒精，用于浸泡镊子、
刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架。
四、培养室(culturing room)
培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般 设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1．7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，
如采用40W日光灯，则长1．3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。
培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。
室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。
控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照 植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。
第二节 设备和器材一,玻璃器皿在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放人培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。
最常使用的是三角瓶，规格有lOOml，250ml，500ml等，一般使用lOOml三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。
培养皿常用9、12cm直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。
试管常用18mmXl80mm或20mmX200mm规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不易污染。
培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。
目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培养空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。
瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。
在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括100ml、250ml、500mi、1000ml烧杯；lOml、lOOml、1000ml量筒；lOOml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。
二、器械用具
1．镊子类(forceps)
常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，若用lOOml的三角瓶作为培养瓶，可用20em长的镊子。镊子过短．容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。如在分离茎尖幼叶时，则用钟表镊子。
2．剪刀类(scissors)
可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。
3．解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。
4．解剖针解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。
第三节 培养条件在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。,
一、温度(temperature)
因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养 都是在23-27、之间进行，一般采用25土2℃。低于15t时培养，植物组织会表现生长停止，高于35、时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月季是25-
27℃番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度,也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以928℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30~C以下再的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25t以下的高。桃胚在2-5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3-5d，可得到无病毒苗。
二、光照(1ight)
组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面：
1．光照强度(1ight intensity)
光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。
2．光质(light wave)
光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。
3．光周期(1igh period)
试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。
三、湿度(humidity)
湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基于硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。
环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70％-80％的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
四、渗透压(penetrating pressure)
培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。
五、pH值不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表2-
1)，大多在5-6．5左右，一般培养基皆要求5．8，这基本能适应大多植物培养的需要。
表2-1 不同植物的最适PH值最适pu值 种 类 最适PH值杜 鹃 4．0 月 季 5．8
越 桔 4．5 胡萝,石刁柏 6．0
蚕 豆 5．5 桃 7．0
番茄、葡萄 5．7
pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说当
pH值高于6．5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值(约0．2-0．3个pH值)因此在配制时常提高pH值0．2-0．3单位。pH值大小调整可用0．1M的NaOH和0．1M的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2
单位，lml的HCI可使pH值降低0．2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。
六、气体(gas)
氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。·培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。
复习思考题
(1)因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些分实验室?各分室的作用是什么?
(2)常规组织培养时，需要什么设备和器械?怎样使用?
(3)组织培养中，pH值起什么作用?如果pH值过高或过低会有什么后果?
(4)如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度?
第三章 培养基目的要求：
(1)一般掌握培养基的种类、特点；
(2)掌握基本培养基的配方；
(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；
(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；
(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；
(6)一般掌握培养基的筛选办法。
培养基culture medium是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。
第一节 培养基的种类和成分一、培养基的种类培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。
培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基，
目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：
(1)MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。
(2)B5培养基 是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B，培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
(3)White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4：的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。
(4)N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KN03和(NH4)：S04含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。
(5)KM-8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。常用培养配方见表3-1。
表3-1 MS和White培养基配方表物质名称 MS(rog／L) White(rog／L)
NH4N03 1650
KN03 1900 80
CaCI2·2H20 440
MsSO4·7H20 370 720
KH：P04 170
Feso47H 28．7
Na2EDTA 37．3
Mn04·H20 22．3 7
ZnS04·7H：0 8．6
CoCl：·6H：O 0．025
Cuso4 5H2o 0．025 0．03
Na2M004·2H：O 0．25
H3B03 6．2
KI 0．83 0．75
烟酸(vDD) 0．5 0．5
盐酸吡哆醇(VB6） 0．5 0．1
盐酸硫胺素(v81) 0．1 0．1
肌醇 100
甘氨酸 2 3
二、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
1．水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质'大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2、无机元素(inorganicelement)
大量元素，指浓度大于0．5mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。其作用是：
(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以N03-N和NH4-N两种形式供应。大多数培养基既含有NO，-N又含NH4-N。NH4-N对植物生长较为有利。供应的物质有KN03、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。
(2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。
(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mg／L为好。制备培养基时，常以KCl、KNO，等盐类提供。
(4)Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgS04·7H20提供。用量为1-3mg／L较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2·2H20提供。
(5)微量元素 指小于0．5mmol／L的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用FeS04·7H20和Na2-EDTA结合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。
总之，植物必需营养元素可组成结构物质，也可是具有生理活性的物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。
3．有机化合物(organic compound)
培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：
(1)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2％-3％，常用3％，即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2．5％，但在胚培养时采用4％-15％的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。
(2)维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有Vsl(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0．1-1．Omg／L。有时用量较高。Vm对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。
(3)肌醇 (myo-inosit0l)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为lOOmg／L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。
(4)氨基酸(aminoacide) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。
(5)天然复合物 其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用o
1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10％-20％，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1mm时，椰乳就不发生作用。
2)香蕉 用量为150-200ml/l。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。
3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150-200g／L。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。
4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100-200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。
5)其他 酵母提取液(YE)(0．01％-0．05％)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0．01％-0．5％)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。·遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。
4．植物激素(hormone)
是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。
(1)生长素类(auxin) 在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对·生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5-10-8mg／L)就可促进生长，其次是茎和芽。
天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。
IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。
NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。
IBA(indolebutyric acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。
2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。
生长素配制时可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mgdml的溶液贮于冰箱中备用。
(2)GA(gibberellicacid赤霉素) 有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70％-100％失效，应当采用过滤灭菌法加入。
(3)细胞分裂素类(cytokinin) 这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、n(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素／生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、是长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。
生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0．05-5mg／L，细胞分裂素0．05-10mg／L。
5，培养材料的支持物
(1)琼脂(agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。
琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的"煮化"培养基，就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂的用量在6-10g／L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。
加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。
(2)其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
6．抗生物质(antibiotic)
抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mg／L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5％-10％的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。
7、抗氧化物(antioxide)
植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。目前还没有彻底完善的办法，只能按不同的实际情况，加用一些药物，并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然像严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。
抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用50-200mg／L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。
8、活性炭(active carbon)
活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0．5-108／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阀值，一般为0.1％-0．2％，不能超过0．2％。
活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性碳减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。
此外，在培养基中加入0．3％活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。
活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入o．1％的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。
但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性碳放入培养基，会带来不良的后果。因此，在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。
第二节 培养基的制备一、母液(stocks01ution)的配制和保存在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素 氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。
下面以MS培养基制备为例，概述其制备方法见表3-2。
表3-2 MS培养基母液的配制化合物 名称 原配方量／mg 扩大倍数 称取量 ／mg 母液体积／mL 配制1L培养基应移取量／mL 母液名称
NH4N03 1650 10 16500
KN03 1900 10 19000 大量
CaCl·2H，O 440 10 4400 1000 100 元素
MgS04·7H20 370 10 3700 母液
KH2P04 170 10 1700
MnS04，H20 22．3 100 2230
ZnS04·7H20 8．6 100 860
CoCI·6H2O 0．025 100 2．5 微量
CuS04·5H20 0．02 100 25 1000 10 元素
H3B03 6．2 100 620 母液
Na2M04·2H20 0．25 100 25
K1 0．83 100 83
FeS04·7H20 28．7 100 2870 1000 10 铁盐
Na,-EDTA 37．3 100 3730 母液烟酸(Vpp) 0．5 50 25
盐酸吡哆醇(VB6) 0．5 50 25 有机盐酸硫胺素(VB2) 0．1 50 5 500 10 物肌醇 100 50 5000 母液甘氨酸 2 50 100
(1)大量元素母液可配成浓度10倍母液。用分析天平按表3-2称取药品，分别加100ml左右蒸馏水溶解后，再用磁力搅拌器搅拌，促进溶解。注意Ca2+和阳Po43-易发生沉淀。然后倒人1000ml定容瓶中，再加水定容至刻度，成为10倍母液。
(2)微量元素母液 可配成浓度配成比100倍的母液。用分析天平按表准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000ml。
(3)铁盐母液 可配成100倍的母液，按表称取药品，可加热溶解，混合后加水定容至1000ml。
(4)有机物母液 可配成500倍的母液。按表分别称取药品，溶解，混合后加水定容至500ml。
(5)激素母液的配制每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成1mg／ml。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成50ml或100ml。另外，多数激素难溶于水，要先溶于可溶物质，然后才能加水定容。
它们的的配法如下：
将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95％的酒精中。再加水定容-定浓度。
NAA可先溶于热水或少量95％的酒精中，再加水定容到一定浓度。
2，4-D可用少量1mol NaOH溶解后，再加水定容到一定浓度。
将Kt和BA先溶于少量1mol的HCI中再加水定容。
将玉米素先溶于少量95％的酒精中，再加热水到一定浓度。
配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。
二、培养基的配制按表用量筒移取大量元素母液100ml，用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液10mi、铁盐母液10ml、有机物母液10ml，均置人1000ml定容瓶中，若不加任何激素，则为MSo培养基；若需加激素按配方移取激素母液即可。
将已装母液的定容瓶用蒸馏水或自来水定容到1000ml，取1／3左右倒人小铝锅中加热。同时，称好30g蔗糖，称琼脂丝7g(或琼脂粉)，也倾人小铝锅中，边加热边搅拌，防止糊底。旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化即清澈见底为度。(若用琼脂粉，应加入100ml左右的液体培养基，并搅拌均匀)。然后再倾人定容瓶余下的液体培养基，摇晃均匀即可。
培养基配好后，要调整pH值。用0．1M的NaOH或HCl液调成5．8pH值左右。在培养基配方不大变动的情况下可用经验法。可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量值。调后注意一定要摇动均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。
三、培养基的分装与灭菌培养基合成后要趁热分装，100ml的容器约装入30-40ml培养基，即1L培养基约装35瓶左右。太多则浪费培养基，太少不易接种和影响生长。但要根据培养对象来决定。如果培养时间较长时，应适当多装培养基，生根等短期培养时，可适当少加培养基。分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。装后用封口材料包上瓶口，扎口后，写上培养基种类，准备灭菌。注意不能放置时间过长，以免产生污染。
培养基用高压灭菌。打开锅盖，加水至水位线。把已装好培养基的三角瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出。然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝，接通电源加热，当升至0．05MPa时，打开放气阀放气，回"0'，后关闭放气阀。当气压上升到0．10MPa时，保压灭菌20min，到时停止加热。当气压回"0"后打开锅盖，取出培养基，放于平台上冷凝。灭好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过1周。
第三节 培养基的选择在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如MS培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。
一、单因子试验在单因子试验中，由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这宁因子对试验的影响和影响的程度。例如MS基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。
生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。
试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4-10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。
二、多因子试验对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6-BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0．5，2．5，5，10mg／L)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验见表3-3。
表3-3 2种激素5种浓度的实验组合
6-BA（μmol/l）0 0.5 2.5 5 10
NAA（μmol/l） 0 1 2 3 4 5
0.5 6 7 8 9 10
2.5 11 12 13 14 15
5 16 17 18 19 20
10 21 22 23 24 25
完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。
三、逐步添加和逐步排除的试验方法在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。
四、广谱实验法在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。
本章小结
(1)常用的培养基有：①MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；②B5培养基，其特点是含有较低的铵；③White培养基，其特点是无机盐低，适于生根；④N6培养基，其特点是KN03和(NH4)：SO：含量较高，适于花药培养；⑤KM-8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。
(2)水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。
(3)配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素10倍液；微量元素100倍液；铁盐100倍液；有机物500倍液；激素1mg／l倍液。
(4)培养基常分装到160ml的三角瓶，含量一般为每瓶30-40ml；高压灭菌时，压力通常为0．1MPa以上，持续20min。
(5)筛选合适的培养基一般有四种方法，即单因子试验法、多因子试验法、逐步添加和排除法以及广谱实验法。其中，第一种方法比较简单，第二种方法比较准确，而后两种方法则比较复杂。
复习思考题
(1)目前，常用的培养基种类有哪些?各有什么特点?
(2)培养基包括哪些成分?各有什么作用?
(3)简要说明MS培养基的基本组成?
(4)配制培养基时，为什么要先配母液?如何配制母液?
(5)怎样利用母液配制培养基?
(6)培养基内加入活性炭的目的是什么?应注意什么问题?
(7)配制培养基时，为什么要加入一定量的植物生长物质?
(8)怎样进行培养基的高压湿热灭菌?
(9)试比较选择培养基时几种方法的优劣?
第四章 操作技术目的要求：
(1)一般掌握灭菌和消毒的区别；
(2)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；
(3)掌握无菌接种的步骤；
(4)掌握外植体的培养方法和步骤；
(5)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；
(6)掌握试管苗驯化的基本程序；
(7)一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算法。
有了设计良好的实验室和基本设备以后，应当学习组织培养的操作技术。包括灭菌、接种、培养、驯化等。
第一节 灭菌和接种一、灭菌(sterilization)
灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。
植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。
1．培养基用湿热灭菌培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa时，开始计时，维持压力0，1~0．15MPa，20min。
按容器大小不同，保压时间有所不同见表4-1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。
容器的体积／mL 在121℃灭菌所需最少时间／min
20-50 15
75-150 20
250-500 25
1000 30
表4-1 培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间到达保压时间后，即可切断电源，在压力降到0．5MPa，可缓慢放出蒸气，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易开了。
对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。,
对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。
高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0．2-0．3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化大于0．5单位就有可能产生明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8％-20％蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15％-25％的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5．5，其水解量更多，培养基中添加0．1％活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1％活性炭，蔗糖水解率可达5％。
为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：
(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。
(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0．1％以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5．80升高至6．48。而96h后又回降至5．8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
2．用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放人95％的酒精，以便插入工具。
3．玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~(2的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170~C持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
4．不耐热的物质采用过滤灭菌一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0．45um以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
5．空间采用紫外线和熏蒸灭菌
(1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200-300nm，其中以260nm．的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌；而且要求距照射物以不超过1．2m为宜。
(2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8m1／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g／m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
6，一些物体表面用药剂喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，1％-2％的来苏儿溶液以及0．25％-1％的新洁尔灭也可以。
7．植物材料表面用消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(explant)。
首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质-吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70％酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70％酒精浸10-30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70％酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70％酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1-2种使用见表4-2。
灭菌剂 使用浓度 持续时间／min 去除的难易 效果次氯酸钙 9％，10％ 5-30 易 很好次氯酸钠 2％ 5-30 易 很好氯化汞 0．1％，1％ 5-8 较难 最好抗菌素 4"50me／L 30-60 中 较好表4-2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3-4次即可；由于用升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗8-10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。
灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2min，开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒人无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0．5％，即在100ml加入15滴。
最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-10次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
二、无菌操作接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1％-3％的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行,
(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；
(2)在接种前20rain，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面； ·
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30rain。若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
三、接种接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放人培养基的过程。以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌，现将接种前后的程序连贯地介绍。
(1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。
(2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0．5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
(3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送人试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放，通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节约培养基和大力，一旦培养物污染可以抛弃。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。
第二节 培养和驯化一、培养指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
1．培养方法
(1)固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。
(2)液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为，50-100r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。
2．培养步骤
(1)初代培养初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：
1)顶芽和腋芽的发育采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽-苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。
适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。
茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。
用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。
2)不定芽的发育在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数情况下它先形成芽，后形成根。
另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。'在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。
在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。
3)体细胞胚状体的发生与发育体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。
4)初代培养外植体的褐变外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。 ·
褐变的主要原因如下：
①植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
②生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。
④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。
①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0．1％-0．5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
④连续转移 对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
(2)继代培养在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。
继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。
继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MSo基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS。培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。
增殖使用的培养摹对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。
在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。
(3)继代培养时材料的玻璃化
实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。
因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。
呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：
①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；
②减少培养基中含氮化合物的用量；
③增加光照；
④增加容器通风，最好进行C02施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；
⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
3．生根培养当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1／2或者1／4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。
诱导生根可以采用下列方法①将新梢基部浸入50或100X10-6IBA溶液中处理4-8h；②在含有生长素的培养基中培养4-6d；③直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根，但前二种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。
另外也可采用下列方法就可生根。①延长在增殖培养基中的培养时间；②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步)；③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。
另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。
从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体途径发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。
试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将苗移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18-20~C为宜。实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使基质温度略高于气温2-3t，这不但有利于生根和促进根系发达，而且还有利于提前成活。
移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，(约40001x左右)，以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。
二、试管苗移栽驯化试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。
试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100％的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。
从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。
另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质中可掺人75％的百菌清可湿性粉剂200-500倍液，以进行灭菌处理。
1．移栽用基质和容器适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1：1：0．5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。
(1)河砂河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1-2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0．1-0．2mm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。
(2)草炭土草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。
(3)腐殖土腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压实令其腐烂。第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。
(4)容器栽培容器可用6X 6em-10XlOcm的软塑料钵，也可用育苗盘。前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用再移，后者需要二次移苗，但省空间、省基质。
2．移栽前的练苗移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。
3．移栽和幼苗的管理从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移人高湿度的环境中。保证空气湿度达90％以上。
(1)保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当5-7d后，发现小苗有生长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。
(2)防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效地保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度800-1000倍，喷药宜7-lOd一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入0．1％的尿素，或用1／2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。
(3)一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18-20~C，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。
另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。
(4)保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。
综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。
第三节 试管苗增殖率的估算由于试管苗在接近理想的条件下生长分化，已不受季节的限制，并且有人为提供的外源植物激素的促进，增殖的速度是很快的。在生长分化中经过几个周期的培养通常按接种的繁殖体块数，或按培养瓶计算，看看能得到多少块中间繁殖体，或得到了多少瓶繁殖体，这两种方法都比较准确。但不能简单地按接种1个芽，培养后能数出多少个芽来，或按应能再切出多少块供再接种的材料来计算。有了每一周期(从接种当天到再次可供接种的当天)需要多少天，每一周期每一瓶能接种多少瓶，(每周期都能稳定地达到)每瓶有多少苗，这几个基本数字，就可以根据几何增加的原理，按下面简单的公式计算出年增殖率的理论值：
年增殖率：y；每周期增殖的倍数：x；
全年可增殖的周期数：n：365／每一周期的天数；
y=xn
如果现有5个繁殖块，每个月为一个繁殖周期，那么年增殖率为512。
从这一公式可以看出，培养周期愈短、每次增殖的倍数愈高，年增殖总倍数就更高。只要每年能增殖8-10次，每次增殖3-4倍以上，就可以满足快速繁殖的要求。
如果从100瓶开始，每瓶有10株苗，那么即使每次增殖3倍，每次45d，一年可增殖8次，年底即可达56万瓶，即560万株苗，许多植物都远远超过这一数值。当然这是一理论值，它会受到许多因素的制约。例如污染就是其中主要因素之一，另外还有设备和人力的规模与容量的限制，比如培养用的瓶子就不可能成几何级数地增加。接种、做培养基的工人也不可能如此增加，因此，这个理论数字是难以做到的。但在条件、规模具备的情况下，还是有可能做到的，如某试管苗工厂，年生产并种植成活310万株苗，最多时工人没有超过20人。平均每人每年做出十几万株苗。在设备比较好的条件下，2名工人每天生产300-500株苗还是能应付自如的，则1年生产出8-10万株苗是完全可能的。
第四节 快速繁殖工作的计划安排快速繁殖是一项复杂的系统工程，快速繁殖工作应力求做到周密细致。在具体实施中首先要限制增殖的瓶数。存架增殖总瓶数(T)不应过多或过少，如盲目增殖，一段时间后就会因缺乏人力或设备，处理不了后续的工作，使增殖材料积压，一部分苗子老化，超过最佳接转继代的时期，造成生根不良、生长势减弱、增殖倍率降低等等不良后果。增殖瓶数不足，也会造成母株数不够用，延误产苗。因此，只要适当增加比例，1个周期不到就能纠正过来。存架增殖总瓶数(了)二增殖周期内工作日数WX每工作日需用的母株瓶数S。
举例来说，在矮牵牛扩繁中每天有4人接种，每人每天按接种300瓶计算，则每个工作日需要1200瓶，按一个月为一个增殖周期，按每个月有25个工作日，则存架增殖总瓶数为：25X 1200=30，000瓶。
其次是考虑到每天接种增殖与生根的比例，需按实际情况试做后确定，一般为3：7，通过培养基中植物激素的用量、糖浓度、培养温度等条件也可加以调整。增殖倍率高的，生根的比例大，每个工作日需用的母株瓶数较少，产苗数(即生根的瓶数X每瓶植株数)较多。反之，增殖倍率低。另外因需要维持原增殖瓶数，而占用了不少材料，以致不可能有较多的材料用于生根，因此出苗数就少。由此可见调整最佳培养基，提高增殖倍率是很重要的研究项目。
从实际操作的角度讲每天接种生根的株数便是今后每天出瓶的苗数。
全年出瓶苗数(户)二全年总工作日X平均每个工作日出瓶小植株数X(1-损耗率10％)
全年产苗数X移栽成活率：实际年产苗数按公式计算的数字控制增殖总瓶数，可以使处于增殖阶段的苗子在两个周期内全部更新一次培养基，使苗子全部都处于不同生长阶段的最佳状态。下面用一个实际例子计算一下就会更清楚了。
某实验室培养多种植物，平均35d为一个增殖周期，按要求必须在42d全部更新一次培养基。那么根据其所掌握的处理继代操作的能力，在35-42d内能处理多少瓶，架子上增殖的瓶数就不应超过这一数字。假定你自己专门从事做接种工作。平均每天取用30瓶母种，转接成100瓶，其中30瓶为增殖用，以维持母株的瓶数，另外70瓶用于生根。在35-42d内有30-36个工作日，那么 存架增殖总瓶数是多少，具体计算如下,
存架增殖，总瓶数T：30X 30或30X 36即：T=900或1080(瓶)
增殖与生根比例为3：7，每天出瓶700苗(70瓶)，全年出瓶苗数(户)：300(工作日)X 700X(1-损耗率10％)二210，000(株)X90％：189，000(株)
全年实产成活幼苗数：189000X 85％(移栽成活率)二160，650(株)
如果生根需2-3周，那么生根阶段的瓶子存架数也可计算出(2-3周内有12-19个工作日)：12X 70或19X 70，目p 840-1330瓶由于在1个人全力接种的条件下，需培养架4个左右。因此提高利用率的最好办法是加强周转。
再如人们可以在有限的工作时间和工作条件下，抓紧制作培养基和高压灭菌，然后利用比较集中完整的一段时间，摆上自制的无菌接种箱做接种操作。这样可在40d的周期内总共可做6次接种，每次处理增殖好的材料为10瓶，接种到35瓶，其中10瓶仍维持增殖，余下的25瓶使幼苗生根，那么上述几项数字计算如下,
存架增殖总瓶数厂：10X6二60(瓶)
增殖与生根的比例为：10：25即1：2．5
每次25瓶，40d内接种6次，6X25：150(瓶)
全年出瓶苗数：40d一个周期，全年做9个大周期(365／40：9．1)，每40d中接种6次150瓶，全年可得：9X150：1350(瓶)，若每瓶10株，全年可得13500株。扣除污染和生根不良的弱苗约10％，应可有12150株。
全年实产成活苗数为：12150X 85％(成活率)：10328(株)。
存架生根苗总瓶数，如果苗子能在3周内生根，需占用75瓶，在4周内生根则要占用100瓶。
从上面的例子可以说明，快速繁殖的速度确是很可观的，快速繁殖是由较高的增殖倍数，较短的增殖周期和周年生产这三个因素组成的，因此，凡是应用于生产的种类都必需满足这三个因素。尤其是第一、二个因素，如果达不到要求，那将还是处于研究、开发阶段的种类。还要考虑整套技术，比如无菌操作不熟练，污染比例太高，出了苗栽不活等等。
在总体设计上要计划安排出，幼苗出瓶种植的工作量，知道一个生产体系效率的高不高，接种工序则影响最大，而且是试管繁殖中最核心的技术。况且目前世界各地都还处于手工操作阶段，短期内不太容易实现自动化。在操作中每个操作工1d最大工作量使用200个培养容器，每个容器接种10株。目前已有许多研究者着手开发实现接种操作的自动化(机器人接种)，可见需求之迫切。
植物的快速繁殖也应实行有效的管理办法，以迅速提高其生产效率。比如，按植物类型不同，无菌操作复杂程度不同，分别制定出工作的质量与数量标准，对从事操作的人员给予短期严格训练，挑选优秀的人员固定在岗位上，同时给予有吸引力的报酬。接种环节加速了，其他环节的运转也自然会被带动起来。
本章小结
(1)植物组织培养技术包括灭菌、接种、培养和驯化四个环节。
(2)灭菌是指用物理或化学的方法杀死物体表面和孔隙内的微生物及其孢子。消毒是指杀死、消除或抑制部分微生物的活动，使之不能再发生危害作用，不如灭菌彻底。
(3)常用的灭菌方法有两种：物理方法和化学方法。干热、湿热、射线处理、过滤等属于前者；升汞、来苏水、高锰酸钾、酒精等化学药剂处理则属于后者。
(4)培养基一般采用湿热灭菌法；耐热的玻璃器皿和器械一般采用干热灭菌法；镊子等接种用工具则采用灼烧灭菌法；不耐热的物质如生长调节剂等一般采用过滤除菌法。
(5)高压蒸气灭菌前，要注意排净里面的冷空气；保压时间到达后，要使指针回零才能开盖取物。
(6)接种程序包括①植物材料表面的消毒；②切割外植体；③将外植体移人培养基。
(7)培养方法主要有固体培养法和液体培养法。前者是比较常用的方法，简便易行。
(8)接种后材料的培养步骤可分为：①初代培养；②继代培养；③生根培养。
(9)驯化时要注意培养基质的选择和温、光、水、肥、气的综合管理。
(10)在快速繁殖计划安排上，要注意增殖倍数与现有的人力、物力相协调，以提高生产效率。
复习思考题
(1)灭菌和消毒有何差别?为什么?
(2)常用的灭菌方法各有哪些优缺点?
(3)采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项?
(4)实验人员进入接种室接种之前，应做哪些准备工作?
(5)接种的植物材料如何进行预处理?如何接种?
(6)根据发育方向，初代培养可分为几种类型?
(7)组织培养中，怎样尽量避免出现褐变和玻璃化苗?
(8)试管苗驯化中应注意调节什么因素?
(9)如何估测增殖率?如何安排快速繁殖计划?
第五章 植物器官的培养目的要求：
(1)一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择；
(2)掌握茎尖培养的种类和操作步骤；
(3)掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整；
(4)掌握离体叶片的培养步骤；
(5)一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。
器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体进行离体培养，是植物组织培养中最主要的一个方面，进行的植物种类最多，应用的范围也最广。器官培养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成的最好材料和方法，而且在生产实践上具有重要的应用价值，如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种。
第一节 营养器官的培养一、离体根的培养离体根培养是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系，因为根系生长快，代谢强，变异小，加上无菌，不受微生物的干扰，并能根据研究需要，改变培养的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化。另一方面，由根细胞可再生成植株，不仅证明根细胞的全能性，而且也能产生无性繁殖系，用于生产实践。其培养方法如下,-
(1)培养基 多为无机离子浓度低的White培养基，其他培养基如MS，B，等也可采用，但必须将其浓度稀释到2／3或1／2。
(2)根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发，待根伸长后从根尖一端切取长1．2cra的根尖，接种于培养基中。这些根的培养物生长甚快，几天后发育出侧根。待侧根生长约1周后，即切取侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长并长出侧根，又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面的实验研究。培养条件为暗光和25-27℃。
(3)植株再生培养 根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、在愈伤组织上分化成小植株。,
二、茎尖的培养茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。这是组织培养中用得最多的一个取材部位。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。微茎尖指带有1-2个叶原基的生长锥，其长度不超过0．5mm。普通茎尖指较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽。这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短。茎尖培养步骤如下：
(1)取材 挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。木本植物可在取材前对茎尖喷几次灭菌药剂。以保证材料不带或少带菌。用于普通茎尖培养，可先从植物的茎、藤或匍匐枝上切取2cra以上的顶梢。
(2)消毒接种 将采集到的茎尖切成0．5-1．Ocm长，并将其大叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。 将茎尖置于流水冲洗2-4h，再在95％的酒精中处理30s，然后在稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min，最后用无菌水冲洗数次，准备接种。
(3)接种 为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为0．5cm左右大小。这样取茎尖大小只能作为快速繁殖。有些植物的茎尖由于多酚氧化酶的氧化作用而变褐。所以在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时间，也可配制1％-5％Vc液，将切下的茎尖材料浸入处理一下。
(4)培养的方法和程序
①培养基 多数茎尖培养采用MS作为基本培养基或略加修改，或补加其他物质。常用的其他培养基有White，Heller，等。
培养基中生长素是必须的，如2，4-D，IAA,NAA等，它们能有效地促进芽的生长发育，但是浓度不能太高，一般用0．1mg／L左右，高于此浓度，往往产生畸变芽或形成愈伤组织。但要注意不同植物对生长素的反应是不同的。
茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型。生长太慢即接种后茎尖不增大，只是茎尖逐渐变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进人休眠状态，或者逐渐变褐死亡。引起的原因是生长素浓度太低，或是温度过低或过高；生长太快型是接种后茎尖迅速增大，在茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长，久之茎尖也形成愈伤组织，从而丧失发育成苗的能力。引起的原因一是生长素浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。二是光照太弱或温度太高。生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。
②培养条件 接种到培养基上的茎尖，置于培养室中培养，每天照光16h，照度1500-30001x，温度通常在25±2℃。并且应根据不同植物种类，或者随培养过程的不同，给予适当的昼夜温差等处理。由于生长点培养时间较长，琼脂培养基易于干燥，这可以通过定期转移和封严包口等加以解决。一般茎尖培养在40d左右可长成新梢，进行继代培养。
③继代培养 茎尖长成的新梢，可切成若干小段，转入到增殖培养基中。1个月左右，新梢又可切成小段，再转入新培养基，这样一代一代继续下去，便建立和维持了茎尖无性系。继代培养可用MSo培养基。有时也可边进行继代培养边进行诱导生根。取比较长的新梢(如1cm以上)转人生根培养基，余下较短的新梢进行继代培养。
④诱导生根 诱导生根通常采用I／2MS培养基，。Bp MS培养基的各种组成成分用量均减半的培养基。并加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。也可将切下的新梢基部浸入50或100X10-6的IBA溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。注意较高浓度的生长素对生根有抑制作用。如果新梢周龄较大、木质化程度较高，则用IBA处理的时间应适当延长或将其浓度提高。
(5)移栽入土 在生根培养1个月左右，多数新梢即可获得生长健壮而发达的根系。移植时可根据生根情况来进行。若发现新梢基部生有较浓密的不定根，长度在lem以内，就可移栽人土。移栽时通过几天的炼苗过程，从试管中取出小植株，轻轻洗掉培养基，栽入塑料营养钵或育苗盘中，营养钵盛经烧烤或常压灭菌的培养土(1分腐殖土：1分沙)。
栽后给予较高的空气湿度条件。首先营养钵的培养土要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭小拱棚，以减少水分的蒸腾，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当发现小苗有生长趋势，可逐渐减少湿度，将拱棚两端打开通风，并且减少喷水次数。使小苗适应湿度较小的条件。以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，少浇水或不浇水，促进小苗长得粗壮。
温度管理上要掌握适宜的生根温度，最适宜的温度是16-
20℃，地温较低时，可用电热线来加温。
光照管理上初期可用较弱的光照，在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加蒸腾作用，后期可直接利用自然光照。
为了提高驯化效率，可用育苗盘进行驯化生根、孔径选择2cm左右即可。孔穴装入蛭石：珍珠岩：草炭土为1：1：0．5的基质。当小苗长至5cm高左右再移人塑料营养钵中。
三、茎段的培养茎段培养指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养茎段的主要目的是快繁。其次也可探讨茎细胞的生理特点，以及进行育种上的筛选突变体的过程。
茎段培养用于快速繁殖的优点在于：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。
(1)材料的选择和处理 取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，若是木本，取当年生嫩枝或一年生枝条，剪去叶片，剪成3-4cm的小段。在自来水中冲洗1-3h，在于无菌条件下用75％酒精灭菌30-60s，再用体积为0．1％／升的汞浸泡3-8min，或用饱和漂白粉浸泡10-20min，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数次，以备接种。取材时注意茎的基部比顶部切段，侧芽比顶芽的成活率低，所以应优先利用顶部的外植体，但由于每个新梢仅一个顶芽，也可利用腋芽，茎上部的腋芽培养效果较好。还应注意尽量在生长期取芽，在休眠期取外植体，成活率降低。如苹果在3-6月取材的成活率为60％，7-11月下降到10％，12-2月都下降10％以下。
(2)培养 最常用的基本培养基为MS培养基，加入3％蔗糖，用0．7％的琼脂固化。培养条件保持25℃左右，给予充分的光照和光期。经培养后茎段的切口特别是基部切口上会长出愈伤组织，呈现稍许增大，而芽开始生长，有时会出现丛生芽，从而得到无菌苗。
在茎段培养中，促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的，依次为Kt和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长。GA对芽伸长有促进作用。
继代扩繁是茎段培养的主要一步。这可由二种途径解决：一是促进腋芽的快速生长，二是诱导形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优良特性。且方法简便，可在各种植物上使用，每年从一个芽可增殖10万株以上。第二种途径会产生变异。
继代增殖过程注意选用培养基和生长调节剂。
生根培养的目的是使再生的大量试管苗形成根系，获得完整的植株。创造适于根的发生和生长的条件·，主要是降低或除去细胞分裂素而加人生长素。由于在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素，并促使苗中保持着一定的量，因此，在生根培养中不需要加细胞分裂素。生长素的浓度，NAA一般0．1-1．0mg／L，IBA和IAA可稍高。
试管苗的生根，对基本培养基的种类要求不严，如MS，B5 White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中，除White外，都富含N，P，K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。
生根培养时增强光照有利于发根，且对成功地移栽到盆钵中有良好作用。故在生根培养时应增加光照时间和光照强度，但强光直接照射根部，含抑制根的生长，所以在生根培养时最好在培养基中加0．3％活性炭，以促进生根。
(3)移植 这是组织培养的关键一环。试管苗是在恒温、保湿、营养丰富、激素适当和无菌条件下生长的。植物的组织发育程度不佳，植株幼嫩，表皮角质层变薄，抵抗力减小减弱。移植是一个由异养转变为自养的过程。因此，在驯化时要进行炼苗。然后洗净琼脂，小心移栽，初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温，更要精心管理等。 '
四、离体叶的培养离体叶培养包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。
叶是植物进行光合作用的自养器官，又是某些植物的繁殖器官，因此叶培养不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题，而且也是繁殖稀有名贵品种的有效手段。
在自然界，很多植物的叶都具有很强大的再生能力，能从叶片产生不定芽的植物，以羊齿植物最多，双子叶植物次之，单子叶植物最少。再生成植株的方式有二种：一种是直接诱导形成芽，另一种是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株，叶的离体培养技术如下：
(1)材料选择及灭菌 取植物的幼嫩叶片冲洗干净，用70％酒精漂洗约10s，再在饱和漂白粉液中浸3，15min，或在0．1％L汞中浸3-5min，用无菌水冲洗数次，再放在无菌的干滤纸上吸干水分，以供接种用。对一些粗糙或带茸毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。一般地说，同一叶片的栅栏组织比海绵组织处于较成熟状态。在培养叶肉时因为海绵组织在分裂前就死亡，如果栅栏组织不发达的话就难于培养。
(2)接种 把灭菌过的叶组织切成约0．5cm见方小块或薄片(如叶柄和子叶)，接种在MS或其他培养基上。培养基中附加BA1-3mg／L，NAA0．25"lme／L。
(3)培养 叶接种后培养条件为每天10-12h光照，光强1500-30001x。培养约2周至4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。这时应转移到再分化培养基上进行分化培养，分化培养基的细胞分裂素含量为2mg／L左右，约10d左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点，它将发育成无根苗。若再将苗移至含NAA0．5-lmg／L的生根培养基可诱导成根，从而发育形成完整植株。叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。
第二节 生殖器官的培养一、花器官和种子的培养
1．花器官培养花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。子房和花药培养另有专门叙述，不再重复。
花器培养无论在理论研究上还是在生产应用上都有重要价值。如通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用，可以了解花器各部分对果实及种子发育所起作用，以及内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用。此外生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。其培养方法如下：
(1)取材 从健壮植株上取未开放的花蕾作外植体材料，已经开花的花蕾由于消毒困难不宜采用。先用75％酒精浸润约30s，再用饱和漂白粉浸泡10-15rain，取出用无菌水冲洗数次。
(2)接种培养 用整个花蕾培养时，只要把花梗插入培养基中。若用花器的某个部分，则需分别取下，切成小片，放人培养基中。常用的培养基有MS、B，等。若要把花器官部分培育成小植株，要加入生长激素和细胞分裂素，诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株。如菊花的花瓣接在含6-BA 2mg／L、NAA0．1 的MS培养基上，在26~(215001x光照．下，每天光照10h，培养约1周，形成少量愈伤组织。再经1个月就分化出绿色芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，经长根成植株，用于繁殖。
2．种子培养种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。早在1754年，Bonnet使不具子叶的蚕豆种子在无菌条件下培养萌发。到1904年，Hanning在无菌条件下培养胡萝卜不同发育时期的种胚，获得种子苗。随后这项技术广泛地应用于花卉、蔬菜、果树、农作物等的种子培养之中。利用种子培养可以打破种子休眠，特别对一些休眠期长的植物，可以作为大量生产试管苗的好材料，它具有植株分化容易，无菌操作方便等特点。可使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株。培养技术如下：
(1)种子灭菌 种皮厚或不饱满的种子，宜用0．1％升汞消毒10-20min。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15-30min。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95％酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。
(2)培养基 若以促进种子萌发为目的种子培养，培养基的成分要求较简单，可不加或少加生长激素。当然，对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般1％-3％。
(3)接种培养 种子培养的接种较容易，把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列，放在20-28℃的条件下培养，1000-20001x光强，每天光照10h。
二、胚胎的培养植物胚胎培养是胚及胚器官(如子房、胚珠)在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。
胚胎培养已有近百年的历史，1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展。
1．胚胎培养的意义
(1)克服远缘杂种的不育性 在高等植物的种间和属间杂交后代胚败育，胚发育不全而不能正常萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。
(2)使胚发育不全的植物获得后代 如兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6-7个细胞，多数胚不能成活。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。
(3)缩短育种年限 在杂交育种中，应用胚培养技术可以缩短育种周期1-2年。
2．离体胚培养植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养。离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养。
(1)成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。由于种子外部有较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70％酒精进行几秒钟的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。
(2)幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。随着组织培养技术的不断完善，幼胚培养技术也在进步，现在可使心形期胚或更早期的长度仅0．1-0．2mm的胚生长发育成植株。由于胚越小就越难培养。所以，尽可能采用较大的胚进行胚养。现在幼胚培养成功的有大麦、荠莱、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。
幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同，值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要特别细心，尽量取出完整的胚。在未成熟胚胎的培养中，常见有三种明显不同的生长方式，一种是继续进行正常的胚胎发育，维持"胚性生长"；另一种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为"早熟萌发"；第三种是在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。特别是进行生长调节时，就更为如此。
幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。通常存在的影响条件如下：
(1)培养基 成熟胚对培养基要求不高，而幼胚要求较高，常用的培养基有Tukey，MS，B5，Nitsch培养基，其中前者适于成熟胚培养，其他适于未成熟胚和幼胚培养。幼胚需要较高的蔗糖浓度，以提供较高的渗透压，但由于幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，并具有较高的渗透压，所以人工培养基中要创造高渗透压的条件，使它可以调节胚的生长，阻止可能渗透压的影响，并能抑制中早熟萌发中的细胞延长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。
(2)生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同，如IAA可明显促进向日葵胚的生长。IAA，Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长。一般认为IAA可使胚的长度增加，加入BA可提高胚的生存机会。
对荠菜胚的培养可以在一种简单的渗透压未调整的无机盐培养基中进行，用生长调节物质或增加蔗糖或主要盐类的浓度，不但可以诱导更小的胚的生长，而且还可以暗示渗透压与生长调节物质的复杂作用。显然，高渗透压的控制和生长调节物质的化学调节，应通过某种方式联系起来。另外在平衡的激素控制系统中，一种或几种成分的活性，依次被高浓度的蔗糖或高浓度盐所控制，即可通过渗透过程阻止细胞伸长。
(3)天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用，如番茄胚在含有50％椰乳的培养基中可维持生长。另外对胡萝卜、幼小子叶阶段的离体胚培养，也有促进作用。
另外还有一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力，可能是植物激素的细胞分裂物质和一些有机氮化合物作用的结果。
(4)温光条件 对于大多数植物的胚来说，在25-30℃为宜，但是，早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃为好。
另外，光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。
(5)其他条件 在胚培养中除要求有较高的蔗糖浓度、高渗透压以外，还要求有较高浓度的氨基酸及无机盐。
三、胚珠的培养胚珠培养是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后,取出胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。胚珠培养可以解决像兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。
对胚珠进行培养时，首先从花中取出子房进行表面消毒，然后在无菌的条件下进行解剖，取出胚珠，放在培养基上进行培养，基本培养基一般均用Nistch培养基，不过诸如MS、N6、B5等培养基也可采用。将胚珠培养成植株的关键是选择胚的发育时期，实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。另外为了培养成功，可取用带胎座甚至带部分子房的胚珠进行培养。
四、胚乳的培养胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。
取授粉4-8d后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0．5-2．0mg/L，BAO．1-1．Omg／L。
在25-27℃和黑暗条件或散射光下培养，约6-lOd胚乳开始膨大，再培养形成愈伤组织．这时应转到分化培养基上培养，分化培养基可加入0．5-3．0mg／L的BA及少量的NAA。待愈伤组织长出芽后，切下不定芽，插人生根培养基中，光下培养10-15d，切口处可长出白色的不定根。
本章小结
(1)植物器官培养是组织培养当中一个最重要的方面，应用范围最广泛。它是指植物离体的根、茎、叶、花、果和种子的无菌培养。
(2)根培养不仅可以很方便地研究根的生理代谢，而且还可以再生成幼小植株。
(3)花培养是指整个花器官或花的组成部分之一的无菌培养，基本培养基一般用MS或B5。
(4)种子无菌培养操作简便，植株分化容易，可以在一定程度上克服育种中远缘杂交的不育性。
(5)胚胎培养包括：幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培养等。胚胎的培养具有以下意义：①克服远缘杂种的不育性，②使胚胎发育不完全的植株获得后代，③缩短育种年限，提高育种效率。
复习思考题
(1)为什么说植物器官培养是组织培养的一个最重要的方面?
(2)植物的离体根培养有何意义？
(3)普通茎尖培养时，怎样取材和处理外植体?在茎尖培养过程中会出现什么现象?应怎样解决?
(4)茎段培养与茎尖培养有什么主要区别?
(5)花器官培养通常指花的哪些部分培养?常用的基本培养基是什么?
(6)植物胚胎培养分为哪些类型?各有何特点和要求?胚胎培养有何重要意义?
第六章 植物无病毒苗的培育目的要求：
(1)掌握植物微茎尖培养的脱毒方法；
(2)一般掌握无毒苗木的鉴定方法；
(3)掌握组织培养脱毒苗在生产上的重要意义；
(4)一般掌握脱毒苗木的保存和利用方法。
第一节 无病毒苗培育的意义一、病毒在植物上的危害通常危害植物的病毒有几百种，并且随着生产栽培时间的延长，危害程度越来越严重，种类越来越多。尤其是靠无性繁殖的作物，如利用茎(块茎、球茎、鳞茎、根茎、匍匐茎)，根(块根、宿根)、枝、叶、芽(顶芽、侧芽、球芽、不定芽)等通过嫁接、分株、扦插、压条等途径来进行繁殖的。像苹果、葡萄、草莓等。花卉的百合、唐菖蒲、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的马铃薯、姜等。而以种子进行繁殖的种类，除豆类外，其他均可随着世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一个世代。而在无性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。一些园艺植物以小规模集约栽培，造成连作危害问题，并加重土壤传染性病毒的危害。
病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％~18％，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几十种，因此，给马铃薯生产带来严重障碍。花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。
为了提高植物的产量和质量，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。虽然通过防治细菌和真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物可治愈受病毒侵染的植物。若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病毒植株的唯一方法就是消除营养体的病原菌，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。用组织培养法消除病毒是唯一行之有效的方法。
由于病毒对植物造成如此严童的危害。所以世界各国都开始重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在全国普遍开展。
二、无病毒苗培育的意义采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。自从50年代发现通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到60至70年代组织培养的技术在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。生产无毒苗已形成一种产业，满足生产者对这种苗的大量需要。
用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。
第二节 热处理脱毒一、热处理法的发现及应用
1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可去病生长良好。以后这个方法得到了广泛的应用，每年在栽种前把大量甘蔗茎段放到大水锅里进行处理。自1954年Kassanis用热处理防治马铃薯卷叶病以后，这一技术即被用于防治许多植物的病毒病。
热处理又称温治疗法(theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。Kassanis(1954)．解释是感染植物体内病毒的含量，反映了病毒颗粒生成和破坏的程度。在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。
二、热处理方法
(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50C左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。
(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱)内，一般在35~40℃。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于38℃下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培养结合36处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒。亦可采用变温方法，如马铃薯每天40处理4h，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持了芽眼的活力。
热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说。对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。而且对寄主植物作较长时间的高温处理有钝化植物组织中的阻抗因子，致使寄主植物抗病毒因子不活化，从而增加无效植株的发生率。因此热处理需与其他方法配合应用，90才可获得良好的效果。
第三节 茎尖培养脱毒一、茎尖培养脱毒原理感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1~1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。
茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。
二、培养基一般以White、Morel和MS培养基作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。在MS培养基对某些植物的茎尖培养时，其中有些离子浓度过高应予以稀释。植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用，在双子叶植物激素大概是在第2对最年幼的叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须提高适当浓度的生长素(0.1~0.5 mg/L)与细胞分裂素，在生长素中应避免使用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜换用稳定性较好的NAA或IBA，细胞分裂素可用Kt或 BA。GA3对某些植物茎尖培养是有用的。有时茎尖培养添加活性炭。
在茎尖培养中，由于操作方便，一般都使用琼脂培养基。不过，在琼脂培养基能诱导外植体愈伤组织化的情况下，最好还是用液体培养基。在进行液体培养时，须制作一个滤纸桥，把桥的两臂浸入试管内的培养基中，桥面悬于培养基上，外植体放在桥面上。
三、茎尖培养方法在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜(8~40倍)。除了在进行植物组织无菌培养一般工具外，还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。
不过和其他器官的培养一样，在进行茎尖培养时，首要是获得表面不带病原菌的外植体。因此，一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就可以得到无菌的外植体。有时消毒处理还会增加培养物的污染率，所以选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用多菌灵0．1％和抗生素(如0．1％链霉素)。对于某些田间种植的材料，可以切取插条插入Knop溶液中令其长大，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小得多。
为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75％酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等，则要用0．1％次氯酸钠表面消毒l0min。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75％酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。
在剖取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，一只手用细镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90％酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸人无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1~2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16h2000~3000Lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。
茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同，这里不再叙述。
四、影响微茎尖培养的因素
1．外植体大小在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就魑声，而外植体越小脱毒效果越好。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节物质的培养基中，离体顶端分生组织能在组织重建过程中迅速形成双极性两端。
2．培养条件在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时光照强度便增加到4000Lx。
3．外植体的生理状态茎尖最好要由活跃生长的芽上切取，在香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中，二者没什么差别。
取芽的时间也很重要，一般选作萌动期较好。否则采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。
第四节 其他途径脱毒一、愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，仅有40％的单个细胞含有病毒，即愈伤组织无病毒植株。愈伤组织的某些细胞之所以不带病毒，其理由是：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。但是，愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。
二、茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0．4~1．0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功，并且有的已在生产上应用。
三、化学疗法脱毒许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY (马铃薯病毒)。
第五节 病毒植物的鉴定从上述途径培育得到的植株，必须经过严格的鉴定，证明确实无病毒存在，才是其正的无病毒苗，才可以提供给生产应用。鉴定的方法有多种。
一、指示植物(indicating Plant)法利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，就是枯斑和空斑的测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。
指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的。他用感染TMV的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦2~3d后叶片上出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。
由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。
在接种时从被鉴定植物上取1~3g幼叶，在研钵中加10ml水及少量磷酸缓冲液(pH值7．0)，研碎后用两层纱布滤去渣滓，再在汁液中加入少量的500~600目金钢砂作为指示植物叶片的摩擦剂，使叶面造成小的伤口，而不破坏表面细胞。以后用棉球蘸取汁液在叶面上轻轻涂抹2~3次进行接种，后用清水冲洗叶面。接种时可用手指涂抹、用纱布或用喷枪等来接种。为确保接种质量接种工作应在防蚜虫温室中进行，保温15~25℃。接种后2~6d 可见到上述症状出现。
木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物，由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。
二、抗血清(antiserum)鉴定法植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，因而是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。
抗血清鉴定法要进行抗原的制备(包括病毒的繁殖，病叶研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的采收，分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在-15--25℃的冰冻条件下。测定时，把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀。然后根据沉淀反应来鉴定病毒。
三、电子显微镜(electric microscope)检查法由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200um的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5um大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。
由于电子的穿透力很低，制品必须薄到10~100um，通常制成厚20um左右的薄片，置于铜载网上，才能在电子显微镜下观察到。近代发展使电镜结合血清学检测病毒，称为免疫吸附电镜(ISEM)。新研制的电镜铜网用碳支持膜使漂浮膜到位，用少量的稀释抗血清孵育30min，就可以把血清蛋白吸附在膜上，铜网漂浮在缓冲溶液中除去过量蛋白质，用滤纸吸干，加入一滴病毒悬浮液或感染组织的提取液，1~2h后，以前吸附在铜网上的抗体陷入同源的病毒颗粒，在电镜下即可见到病毒的粒子。这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。
四、酶联免疫鉴定法(Enzyme linked jimmunity absorption assay ELISA)
酶联免疫鉴定法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。
第六节 无病毒植物的利用一、无病毒苗的保存繁殖无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5~10年。
通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目(网眼为0.4~0.5mm大小)的网纱，才可以防止蚜虫的进入。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。有条件的地方可以到海岛或高岭山地种植保存，那里气候凉爽，虫害少，有利于无病毒材料的生长与繁殖。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。
二、无病毒苗的利用无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。一旦感染，便会影响产量和质量的保证。因此，应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。
三、无病毒苗的效果无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产20％~50％，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。
第七节 中型组织培养实验室所需物品投资核算一、固定资金中型组织培养实验室配置物品所需资金约7万元(详见表7-1和表7-2)。
表7-1 中型组织培养室年内盈余情况表7-2 组织培养所需仪器一览表二、流动资金按4个机组，I万瓶培养室的空间，年生产10万株种苗计算。每天5人8小时工作(配培养基、接种、培养观察、剔除污染，驯化、浇水等)，工资计2500元(平均500元／人)；乎均每月需要200L培养基用于接种，需流动资金月支出300元。(其中琼脂20袋／月，每袋100克，金额160元；酒精20公斤／月，金额80元；其他60元／月)；其他支出200元／月。以上共计3000元／月。
三、效益分析每年按生产10万株种苗，1元／株计算，共计收入100，000元，扣除流动资金3000×10=30，0000元，余70，000元。一年可收回投资70，000元，即赚回一个组培实验室见表7-3。
表7-3 组织培养10万株种苗所需药品一览表本章小结
(1)去除植物病毒的方法有热处理法、微茎尖培养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法。前两种是主要方法。
(2)热处理法去除植物病毒可力，为温汤浸渍处理法和热处理法。其中后者因不损伤植物材料，因而是目前最为常用的方法。
(3)病毒主要分布于植物体成熟和衰老的组织及器官中，靠维管束传播。由于茎尖尚未形成维管束，所以茎尖一般是无毒的，可用于组织培养无毒苗。
(4)无毒苗的鉴定方法主要有：①指示植物鉴定法；②抗血清鉴定法；③电子显微镜检查法；④酶联免疫鉴定法。其中，最后-种是目前比较精确和常用的鉴定方法。
复习思考题
(1)组织培养在生产脱毒苗木上有何意义?
(2)热处理为什么可以去除部分植物病毒?热处理方法分为几种，常用的是哪一种?
(3)为什么用微茎尖组织培养形成的试管苗一般是无毒的?
(4)分离微茎尖与分离普通茎尖有何区别?
(5)如何鉴定茎尖培养而成的脱毒苗确实是无毒的?
(6)怎样保存和利用无毒苗?
第七章 花药和花粉的培养目的要求：
(1)掌握花药培养和花粉培养的区别；
(2)了解花药最佳接种时期；
(3)掌握花药培养的大致过程；
(4)掌握花粉发育的四种途径；
(5)掌握花粉培养的大致过程。
花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒。按染色体的倍性来看，前者为二倍体细胞，后者为单倍体细胞。因此，花药培养属器官培养，花粉培养属细胞培养，但花药培养和花粉培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。
花粉培养和花药培养都指在合成培养基上，改变其发育机能，即不经过受精发生的细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植物。由于都能获得同花粉染色体构成相同的单倍体植株，经染色体加倍而成为正常结实二倍体植株。所以后者属于真正的纯系。这和常规多代自交纯化方法相比，可节省大量的时间和劳力。同时，花药和花粉培养是研究减数分裂，花粉生长机制的生理、生化、遗传等基础理论的最好方法。
从70年代开始，我国花培研究进展很快，包括水稻、小麦、烟草、玉米、橡胶、杨树、辣椒等几十种作物，其中烟草新品种是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种。
第一节 花药的培养花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产后再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。
一、花药材料的选择在正常情况下，花药中的花粉母细胞经过减数分裂形成4个花粉粒，开始时连在一起，外有透明的胼胝体包围。经进一步发育后，细胞体积增大，形成外壁并出现萌发孔，此时细胞核较大居中，称单核中央期。随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位置推向一边，即单核靠边期。以上均为单核期花粉。单核花粉经第一次有丝分裂后，形成一个营养核和一个生殖核，即二核花粉。生殖核再分裂一次，产生两个精核，即三核花粉最适宜的花药发育时期，因植物种和品种而不同。但大多数是单核期。根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定花粉的发育时期。但是接种前不可能把所有的花粉都进行一次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度大小与花粉发育年龄的相关性，在实际操作中取一定大小的花蕾进行的。如水稻选择剑叶叶枕抽出距下一叶，叶枕约为4~6cm的孕穗稻。
二、培养基的选择花药培养所采用的培养基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2，4-D，NAA和IAA等。诱导愈伤组织的培养基可添加2，4-D，其浓度为1~3mg／L，分化培养基可添加2~3mg／L的BA，再加少许的IAA(0.2~0.5mg／L)，生根培养基可单独添加生长素(0.5~lmg／L)。
花药培养在某些情况下，可不经愈伤组织阶段，直接产生胚状体。这是最理想的方式，这样可以免去愈伤组织和生根阶段。但多数情况下是产生愈伤组织，这时尚需要进一步转移到分化培养基中，诱导分化产生芽，这时要应用分化培养基，提高细胞分裂素的浓度，降低生长素的含量，甚至不用生长素。
基本培养基中的蔗糖浓度对花粉的诱导生长有一定作用。在辣椒花药培养中以6％的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。在番茄花药培养中需要量高达14％。其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。
三、消毒接种培养
由于花药消毒比较简便，所以应从健壮无病植株中采集花蕾，因为未开放的花蕾中的花药为花被包裹，本身处于无菌状态，可仅用70％酒精棉球将花的表面擦洗即可。也可按对其他器官消毒处理方法进行，先用70％的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸10~20min，或用0．1％升汞液消毒7~lOmin，然后用无菌水洗3~5次。
花药在消毒前，也可进行预处理，将花蕾剪下放入水中，在冰箱4~5、下保持3~4d。低温贮藏后，花药容易发生胚状组织。接种时把花蕾用解剖刀、镊子小心剥开花蕾，取出花药，注意去掉花丝，然后散落接种到培养基上，一个l0ml的试管可接种20个花药。
培养温度在23~28℃左右，每天11~16h的光照，光照强度2000~4000Lx。
脱分化培养时，可用MS+2，4-D的培养基，或N6+2，4-D的培养基，经10~30d，可诱导生成愈伤组织，或少数生成胚状体。愈伤组织增殖到1~3mm左右时，应转移到加有细胞分裂素和微量生长素的新的分化培养基上，再经20~30d，可获花粉植株。
胚状体为类似于胚的组织，它经过原胚、球形胚，然后循着与合子胚相似的发育顺序，即心形胚、鱼形胚、子叶期的顺序继续分化形成小植株。由于此途径避免了经由愈伤组织这一复杂过程，可直接由花粉形成胚状体，免去生根阶段，具有保持遗传稳定性，发育速度快的特点，所以越来越受人们研究的重视。当然胚状体也可由愈伤组织产生。
培养花药是直接产生胚状体还是产生愈伤组织，主要取决于培养基中激素的状况。一种植物的花药可以在一种培养基上长幼苗，而在另一种培养基上则形成愈伤组织。如水稻通常在含有生长素的培养基上诱导出愈伤组织，而在不含任何激素的N6培养基上长出胚状体。但在辣椒的花药培养中，只要培养基合适，甚至可以在同一花药上一部分花粉形成胚状体，而另一部分只形成愈伤组织。
四、花药培养中的花粉发育过程植物中只有少数用离体花粉培养直接产生植株，而大多数是用离体花药培养来产生花粉植株，这是因为花药壁可以在培养中提供某些生长发育物质。离体花药培养采用人工控制培养的方式，改变了花药自熟发育的途径，其花粉的发育大致有下列几种途径。
(1)营养细胞发育途径在花药离体培养中，花粉第一次有丝分裂形成不均等的营养核和生殖核。生殖核较小，一般不分裂或只分裂1~2次，就逐步退化。而体积大的营养核经多次分裂且形成了细胞壁，最后变成了多细胞团，迅速生长，很快突破细胞壁，细胞团不断分裂，穿破药壁，可以产生胚状体或愈伤组织。
(2)生殖细胞发育途径在这种途径下，营养核只分裂1~2次就退化了，而生殖核经多次分裂发育成多细胞团。
(3)营养细胞和生殖细胞同时发育的途径花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核同时进行多次分裂，因此最后形成的多细胞团包括两部分，一部分细胞较大的是由营养细胞分裂而来；另一部分细胞较小的是由生殖细胞分裂而来。
(4)花粉均等分裂途径花粉进行均等分裂形成两个均等的子核，以后二核间产生壁，形成两个子细胞，由两个子细胞形成多细胞团，迅速生长，穿破药壁而形成胚状体或愈伤组织。
第二节 花粉的培养花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是较比花粉培养难度大。
一、花粉的分离取新鲜未开的花蕾用自来水冲洗10min，用75％的酒精消毒 10~15min，无菌水冲洗2次，再用10％漂白粉上清液浸泡20min，无菌水冲洗3~4次。然后将花药放到加有基本培养基的小烧杯中，用注射器的内管在烧杯的壁上挤压花药，使花粉从花药中释放出来。用尼龙筛过滤掉药壁组滤液再经低速离心(100~160r／min)，上面的碎片可用吸管吸掉，再加入新鲜培养基。连续进行两次过滤，到每毫升含103~104个花粉的浓度就可以了。
简单的方法是花粉从花药中挤出后，用镊子取出花粉空壳，放在培养基上培养。此法适于微室栽培，但往往有药壁等体细胞混入。
二、花粉的预处理花粉经过预处理不但有利于改变正常的发育途径，而且还可以促进花粉植株的形成。
(1)低温处理低温处理通常是常用也是效果比较好的一种处理方法。在花粉第一次有丝分裂期进行低温处理时，在黑暗条件下以植株、花蕾、花粉、花药等作材料比较，以处理分离的花蕾效果最好。
(2)重力的作用在烟草花粉培养中，在从花蕾中取出花药前1h，在5℃条件下进行低温离心机离心，可提高单倍体的诱导率。另外，在玉米上试验也有同样效果。
三、培养基成分在花粉培养中可添加一些物质，有促进生长的作用。培养基选用Nitsch作基本培养基，含有诸如硝酸钙、硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰子胚乳等。
四、花粉培养方法
(1)微室培养法
取含有50~80粒花粉的一滴培养液放在微室培养装置中，为了防止花粉破裂，应在低温条件下(4℃以下)接种，然后在20℃下培养。
(2)看护培养法在装有50ml液体培养基的小培养皿中，用解剖针撕开花药释放出花粉，形成花粉悬浮液，最后稀释至0.5ml培养基中，含有10个花粉粒的细胞悬浮液。看护培养时，把花药放在琼脂培养基表面上，然后在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸。用移液管吸取l滴已准备好的花粉粒悬浮液，滴在每个小圆片滤纸上。培养在25℃和一定光照强度下，大约一个月长出细胞群。由于完整的花药发育过程释放出有利于花粉发育的物质，并通过滤纸供给花粉，促进了花粉的发育。
培养的花粉形成胚有两个途径：一是花粉核分裂产生营养核和生殖核，以后生殖核退化，营养核则继续分裂2~3周，形成多核花粉，由此形成多核的原胚；二是花粉核直接分裂，再形成胚。
本章小结
(1)花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养，但二者培养目的是一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。
(2)花药培养一般选择花粉的单核期进行接种，因为这一时期尚没有淀粉的积累。
(3)花药培养包括：选择材料-消毒-接种培养-愈合组织生成-分化出单倍体植株。
(4)花粉的发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育途径。
(5)花粉培养包括花粉的分离-预处理-培养过程。
复习思考题
(1)花药培养和花粉培养有何区别?
(2)花药培养时选择什么发育时期的花药?为什么?
(3)花药培养时培养基配制有什么特点?
(4)花粉培养时怎样使用微室培养和看护培养。
第八章 原生质体的培养目的要求：
(1)了解原生质体培养的意义；
(2)掌握原生质体分离的大致步骤；
(3)掌握原生质体培养的方法；
(4)掌握原生质体融合的方凑。
第一节 原生质体培养的意义一、原生质体(protoplast)
原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。
二、原生质体培养的意义
(1)再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
第二节 原生质体的分离要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。
一、植物材料一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
1.细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4-D2~4mg／L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2~4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的l00ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80~120r／min，在25土1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4~5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3~4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
2.叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是考虑的重要因子：
(1)光强为3000-6000Lx。
(2)温度为20~25℃培养。
(3)相对湿度在60％~80％左右。
植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。
3.植物材料的预处理对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1~2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。
二、酶
1.酶的种类构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。
果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。
2.渗透稳定剂植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40~0.80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
3.酶溶液的pH值酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时,原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
三、原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是"一步法"，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10~30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol／L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0.4~0.45mol／L的甘露醇，两者差别较大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0．53％次氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把4g叶组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。在4℃黑暗条件下培养16~24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶液中使用的等渗剂为0．55~0．6mol甘露醇。然后，酶液真空渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。
若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放人10ml的酶液中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0~6．0)，在25-33℃条件下酶解24h。原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。
四、影响原生质体分离的因素
1.酶制剂活力和纯度粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。酶的活性还与pH值有关。Onoznka纤维素酶R-10和离析酶R-10的最适宜pH值分别为5~6和4~5。不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7~6.0之间。
2.渗透稳定剂的作用在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。
五、原生质体的净化和活力测定在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1)将原生质体混合液经筛孔大小为40~100／tm的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎地吸去上清液。
3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。
4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为104~106／ml。
在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯(FDA)染色等。这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荧光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。FDA染色测活性的方法如下：
取洗涤过的原生质体悬浮液0．5ml，置于10×100mm的小试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0．01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。
第三节 原生质体的培养将有生活力的原生质体在适当的培养基和培养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细胞分裂的过程。约1~2个月后，通过细胞的持续分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2-4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导芽和根长成完整的植株。
一、培养原生质体的方法原生质体的培养方法大体和细胞培养相同，有固体培养、液体培养及周液结合培养等几种方法。
1.固体培养法该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最终浓度为0．6％左右，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，避免了细胞间有害代谢产物的影响并便于定点观察，追踪单个细胞的发育过程。
饲养培养是固体培养法的引伸。将一些射线处理过的原生质体用一薄层琼脂培养基固定在下层，而活的原生质体固定在上层。这种方法允许原生质体密度低于能生长的密度，因为它们可以从被处理过的原生质体那里获得一些有益的物质。
固体共培养方法也是饲养培养的一种方式，即把一种已知能快速生长的原生质体和一种难以培养的原生质体相混合，然后用琼脂培养基固定共同培养。这种方法使难以培养的原生质体得益于快速生长的原生质体所产生并易扩散的物质。
由于琼脂熔点较高，因此，在固定培养中保持琼脂培养基较高的温度和相对剧烈的摇动是使原生质体在培养基中分布均匀的前提。此外，琼脂对原生质体是有毒害的，只能是一些生命力较强的植物原生质体才可以用这种办法来培养。为此，人们不断寻求低毒并可在常温下凝固的物质来代替琼脂，
近年来很多实验证明，琼脂糖是一个良好的培养基凝胶剂，它不仅具有熔点低的特点，而且具有促进原生质体再生细胞分裂的作用；从对琼脂糖、琼脂及经过漂洗的纯净的琼脂的比较试验来看，发现尽管纯净的琼脂可以提高一些原生质体的植板率，但最好的结果是在琼脂糖上取得的，并且琼脂糖适用于广泛的植物中。他们发现在琼脂中不能分裂的天仙子属的品种能在琼脂糖中能持续分裂并且比在液体培养基中形成细胞团的频率高。在琼脂糖培养基中，烟草原生质体发育到细胞团所需的接种密度要比在琼脂或液体培养基中的低。在水稻原生质体培养中也证实，提高琼脂糖的浓度可以明显地提高原生质体引起的出芽现象，从而提高了培养初期的原生质体的成活率。因此，琼脂糖作为一种优良的凝胶剂，在原生质体培养中的应用越来越广泛。
2.液体培养液体培养法是在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中，常用的是液体浅层培养法，即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害较小，日便于添加培养基和转移培养物，是目前原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步的生长发育．并且难以定点观察，很难监视单个原生质体的发育过程。
在固体培养法中提到的饲养培养和共培养，也可以用于液体培养的方法。
微滴培养法是液体培养的一种方式。将悬浮有原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴接种在无菌且清洁干燥的培养皿卜．由于表面张力的作用，小滴以半球型保持在培养皿表面，然后用Paratilm封口，防止干燥和污染。如果把培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。由于小滴的体积小，在一个培养皿中可以做很多种培养基的对照实验。如果其中一滴或几滴发生污染，也不会殃及整个实验。同时也容易添加新鲜培养基。其缺点也是原生质体分布不均匀，容易集中在小滴中央。此外由于液滴与空气接触面大，液体容易蒸发，造成培养基成分浓度的提高。解决蒸发问题最简单的办法就是在液滴上覆盖矿物油。
有些研究工作需要进行单个原生质体培养。如选择出特定的原生质体和经融合处理后数量很少的融合体等。已有实验证实，单个原生质体的单独培养的关键在于培养基原体积要特别小。如油菜单个的原生质体须培养在50ml的培养基中，这种比例相当于每毫升培养基有2X104个原生质体，在这种条件下，原生质体的再生细胞可以持续分裂直到形成愈伤组织。这样小体积的微滴，是极易蒸发的，为此，Koopt设计了一个特殊的装置：首先，在一个长度为3350um。并绝对洁净的盖玻片上滴50滴2．0mol／L蔗糖小滴，每滴1ul，分布成10行，每行的距离为3.4um。然后把盖玻片在硅溶液中浸一下，使得蔗糖小滴占领的圆点外的全部盖玻片被硅化。硅化的目的是防止以后的矿物油滴相互连通。硅化后，用水小心地把蔗糖液滴洗去，然后使盖玻片干燥并灭菌。在原来蔗糖液滴占领的圆点区域加上1um的矿物油滴，再把已悬浮有原生质体的培养液用注射器注到矿物油滴中。这样制备好的盖玻片放到一个双环培养皿中，培养皿的外环加满0.2mol／L的甘露醇溶液，最后封口。由于有矿物油并且盖玻片相当于保持在一个湿润的小室中，保证了微小培养基不会蒸发，从而可以达到单个原生质体培养的目的。
二、固液结合培养法最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。这样，固体培养基中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，培养物所产生的一些有害物质，也会被固体部分吸收，对培养物的生长更有利。已证明这种方法对烟草和矮牵牛原生质体的再生细胞起到了促进分裂的作用。考虑到有效地吸附培养物所产生的有害物质，在下层固体培养基中添加活性炭，结果使原生质体形成细胞团的数量提高了23倍。由于很多实验已证实了琼脂糖比琼脂更适于原生质体培养，近年来又发展了琼脂糖固体培养和液体培养相结合的方法。用几种植物的原生质体做实验，发现尽管琼脂糖提高了植板率，但到细胞团阶段后就难以再继续发育。这可能是由于培养物把固体培养基中的营养耗尽所造成的。他们发展一种"念珠培养"法，即把含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积的液体培养基中，并在旋转摇床上振荡以利于通气。使用大体积的液体是为了防止琼脂糖块过渡破碎。用这种方法．不仅进一步提高一些种(如番茄原生质体)的植板率，而且使一些以前从来超过细胞团阶段的种，如芜菁和矮牵牛原生质体能够持续地分裂。在水稻原生质体培养中使用的琼脂糖泡培养法也是固液结合的一个好方法。把含有原生质体的琼脂糖念球养基以大约50ul一滴，滴在直径5．5cm的培养皿中，待其固化后，再向其中添加3ml液体培养基。这样，琼脂糖滴就处于液体培养基的包围之中。在培养过程中，可以通过改变液体培养基的渗透浓度来逐渐降低固体培养基的渗透浓度，以便使培养物持续地生长发育。
三、影响原生质体培养的因素
1.培养基成分原生质体培养和其他组织培养一样，培养基中需要氮、磷、钾、钙、镁、硫及铁等大量元素，以及锰、锌、钼、铜和钴等微量元素营养源。同时还需要糖类物质和许多有机营养，以及添加适当浓度的激素。由于和细胞培养相比，只去除了细胞壁，因此，原生质体培养基一般是加以改变的细胞培养基。如原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5，培养基为基础；N6培养基则以MS培养基为基础。但原生质体无论在结构上和代谢生理上和细胞毕竟有很大差异，在培养原生质体时，单纯地模仿细胞培养基往往不能达到满意的培养效果，需要考虑到原生质体的独特要求。
2.渗透压稳定剂由于去除了细胞壁，原生质体培养基中须有一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖及葡萄糖等糖类。因为这类物质既保持培养基的渗透浓度，又是原生质生长发育的碳源，因此其种类和浓度会影响培养效果。对原生质体培养来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露醇，可提高原生质体的植板率。近年来许多实验证实葡萄糖是原生体培养中比较理想的渗透压稳定剂和碳源。
不同的糖类，只对培养效果发生影响，在游离时，并无显著影响。说明在原生质体发育时，对碳源有一定的要求。随着细胞壁的再生和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度须不断降低，才对培养物的生长有利。用添加鲜培养基的方法进行杨树原生质体培养，每周使渗透剂的浓度降低0．1mol／L，导致了培养物的持续生长，易发育成愈伤组织并分化成再生植株。
3.无机盐无机盐以离子状态存在于培养基中，易于被植物细胞吸收和利用，无机盐是培养基的主要构成成分，根据其含量，可分头大量元素和微量元素两部分。
在大量元素中，对原生质体培养效果影响最大的是Ca2+和 NH4+。较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质膜的电荷平衡。因此很多游高原生质体的酶液中都添加一定量的Ca2+和其他阳离子。在培养中，较高浓度的Ca2+对原生质体的生长发育同样有利。如高浓度的钙促进了豌豆原生质体的存活和细胞分裂。因此，在很多植物的原生体培养中，应用大量元素减半的MS培养基时，但Ca2+的浓度未降低，仍保持 MS培养基中所用的浓度。
虽然氮源是植物细胞不可缺少的营养，但已发现高浓度的NH4+、可抑制马铃薯原生质体的生长发育。在有关菊苣叶肉原生质体培养研究中，把MS培养基中的氨和硝酸盐全部去掉，只用谷氨酰胺作为氮源，得到了好的结果。把水稻原生质在B5培养基上培养8~10d后，转移到完全去除无机氮素，而用4种氨基酸作为氮源的AA培养基上，获得了来源于原生质体的水稻再生植株。
4.有机成分原生质体的生长发育需要维生素类及各种有机成分，在培养蚕豆属的一个种的原生质体时，为了适应低密度的培养，人们设计了KM-P培养基，它包括丰富的维生素、氨基酸、有机酸、核苷酸、糖及糖醇等有机成分。后来这个培养基在原生质体培养中得到广泛应用。研究表明：多胺类物质对原生质体发育有一定的促进作用。有些报道认为：在培养基中添加一些天然有机物质对原生质体的生长有利，如酵母提取物、椰乳等。
5.激素激素对原生质体的生长发育是非常重要的。但由于不同的植物种对激素的种类和浓度有很不同的要求，所以对牛豆树原生质体培养认为2，4-D对细胞分裂是必不可少的。不能用NAA和IAA来代替。因此，在细胞内合成的激素和其他细胞内物质向外释放时，外渗的速度和能力也不相同。不过当内源激素外渗后，提高了培养基中激素的浓度，使得不同植物原生质体对外源激素的种类和浓度的需求产生了很大差异。
由于细胞在培养过程中能够合成一些物质并外渗到培养基中，利用这个特点来制成"条件培养基"，即对某种材料的细胞培养一定时间后，培养基中已含有这种材料外渗的激素、氨基酸等物质，再把这种材料的细胞去掉。用这种条件培养基足以促进其他材料的细胞生长。用培养了3d的长春花细胞的悬浮培养液作"条件培养基"，加到长春花原生质体培养基中，便可极大地促进长春花等原生质体的生长和分裂。用条件培养基作烟草原生质体低密度培养也可以提高培养效果。
尽管原生质体培养对激素的种类和浓度的要求有很大差异，但总的来说，生长素和细胞分裂素是必需的，并需要二者的适当搭配。同时，在不同的发育阶段需要不断地对激素的种类和浓度进行及时的调整。此外，在每一步调整激素时，还须考虑到它的后效应。如在牛豆树原生质体的培养中，再生细胞的起始分裂需要有2，4-D的存在，但它对以后的器官分化却有抑制作用。而实际上，器官分化的决定因素在愈伤组织形成的初期就发生了，如果只为了愈伤组织的发育而继续保留较高浓度的2，4-D，就有可能抑制器官发生而使原生质体培养不能获得再生植株。
6.pH值原生质体培养基的pH值一般为5.6~5.8pH值除了直接影响原生质体及再生细胞的生理活动外，还能影响外源生长素是否对培养物产生毒害。当pH值6.4时，2，4-D的浓度即使到达30mg／L，细胞也还能持续分裂。还有人认为原生质体游离时的pH值对培养效果也有影响。在酶液的pH值为5.5时，豇豆原生质体的产量最高，但pH值为6.0时产生的原生质体才具有持续的细胞分裂能力。
7.无机盐无机营养中铁、钙、铵等的浓度对原生质体培养有重要影响。铁盐大多采用MS培养基中的铁盐浓度。但当把MS培养基中的铁盐浓度降低10倍时，则可以大大增加原生质体存活和分裂的数量；适当提高培养基中钙浓度，降低铵盐浓度，有利于原生质体的存活，细胞再生和继续分裂。豌豆在高钙中3d后已有10％原生质体或再生细胞分裂，而在低钙中则只有3％。马铃薯原生质体则在100mg／L的铵盐中仅2~3d内就死亡。
8.原生质体密度的影响在原生质体培养基中原生质体的密度对分裂的影响很大，适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，且能持续进行下去，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。低密度条件原生质体不能生长的原因，可能在于细胞代谢产物扩散到培养基中去，而影响细胞内的浓度。如在培养基中添加若干代谢中间产物，低密度的原生质体生长发育也能正常进行。 第四节 原生质体的融合通过原生质体融合可实现体细胞的杂交，这是70年代兴起的一项新技术。因为应用植物的根、茎、叶等营养器官及其愈伤组织或悬浮细胞的原生质体进行融合，所以称之为体细胞杂交。体细胞杂交育种克服了远缘杂交中某些障碍，如杂交不亲和性等，从而更广泛地组合各种植物的遗传性状，为有效地培育新品种，开辟了一条崭新的途径。
一、融合方式原生质体的融合方式分自发融合和诱导融合两类。自发融合是在植物原生质体分离过程中，用酶法分解细胞壁后进行融合。这类融合是种内融合，与胞间连丝有关，融合的个体一般不能进一步发育。诱导融合是指制备出原生质体后，加入诱导剂或用其他方法促使两个亲本原生质体融合，诱导融合可以是种内的，也可以是种间的，甚至是属间、科间的融合。
诱导融合的方法大体可以分为物理的和化学的两类。前者是利用显微操作、灌流吸管、离心或振动等机械以促使原生质体融合，这种方法目前多与诱导剂结合起来使用，化学融合法是用不同的试剂作诱导剂，促使原生质体融合。目前常用的比较有效的是高pH值一高钙法和聚二乙醇法。
1.高pH一高钙法高pH一高钙法是受动物细胞融合研究的启发而产生的。用pH值9.5~10.5大于0．03M浓度Ca离子处理原生质体，融合效果较好。具体处理方法是：在原生质体沉淀中加入含有0．05MCaCl2。H2O和0．4M甘露醇，pH值调整到10．5，在37℃下保温0．5h，可使原生质体融合率达到10％左右。高pH值能导致质膜表面离子特性的改变，有利于原生质体的融合。钙能稳定原生质体，也起联系融合的作用。
2.聚乙二醇法聚乙二醇法为我国学者高国楠首创。聚乙二醇(PEG)分子式为HOCH2(CH2-0-CH2)nCH20H，分子量1500~6000水溶性，pH值4.6~6.8，因多聚程度而异。由于PEG分子中醚键的存在使其分子末端带有微弱电荷，能与水，蛋白质、糖等极性物质的正极形成氢键。PEG在相邻原生质体表面间作为分子桥，直接或间接地通过钙而起作用。当PEG分子被洗脱时，可能由于电荷紊乱和再分布，或使膜表面局部脱水，或改变构型使类脂"液态"化而引起融合。具体操作过程如下：取等量，密度相近的两种不同原生质体悬浮液，在玻璃容器内混合均匀，取150ul左右的原生质体悬浮液滴在盖玻片上。然后缓慢加入450ul左右的PEG溶液，放在20~30℃条件保温培养0.5~1h，后用原生质体培养液洗净融合剂。
二、融合过程异种原生质体先经膜融合形成共同的质膜，然后经胞质融合，产生细胞壁，最后是核融合。细胞核的融合是异种原生质体融合的关键。融合体只有成为单核细胞后才能继续生长，才能合成DNA、RNA，并进行细胞分裂，这就要求两个核必须同步分裂，如果两个核所处时期不同，一个开始合成DNA,另一个还处于合成的中途或已完成了复制，它们之间就会相互影响，导致最终不能进行细胞分裂。
本章小结
(1)原生质体培养可以再生植株，可以远缘体细胞融合，达到体细胞杂交的目的。
(2)原生质体分离可按下列步骤进行：选择材料(悬浮细胞或叶肉细胞)--预处理--酶解。
(3)原生体培养时，先要纯化细胞，然后接种在固体培养茎或液体培养基中。
(4)原生质体融合采用高pH值-高钙法，即pH值9.5~10.5，0．03MCa处理，或用聚乙二醇法。
复习思考题
(1)原生质体培养时，体细胞杂交有何意义?
(2)分离时用哪些酶，各有何作用?
(3)怎样对分离粗液进行培养?
第九章 草本花卉的组织培养目的要求：
(1)掌握菊花的生物学特性，组培快速繁殖方法及自然繁殖法；
(2)掌握非洲菊的生物学特性，建立无性繁殖系以及分株繁殖法；
(3)掌握矮牵牛的生物学特性，矮牵牛的茎段繁殖以及扦插繁殖法；
(4)掌握香石竹的生物学特性，香石竹的无毒苗培养方法以及种植的管理方法。
第一节 菊花的组织培养菊花为原产我国的多年生宿根草本花卉，已有三千多年的栽培历史，现广泛分布于世界，深受人们的喜爱，成为世界栽培面积较大的一种重要花卉。
一、形态特性和生物学习性菊花系多年生植物，株高60~180cm，茎直立粗壮，多分枝，青绿色或带紫褐色，上被灰色柔毛，具纵条沟，呈棱状，半木质化，节间长短不一。叶形大，互生，叶片有深缺刻，基部楔形，表面粗糙，叶背有绒毛。花单生或数朵聚生，边缘为舌状花，中部为筒状花，也有全为舌状或筒状花的，花序形状各异，有球形、莲座形、卷散形等。花色分为黄、白、红、紫、粉几个色系。种子为细小的瘦果，中间膨大，两端突出。
菊花适宜的生育温度为15~25℃，5~12℃是开花持久的适温，较能耐寒，宿根地下茎能耐-10℃以上的低温。
其喜阳光充足，通风良好，在光照条件下生长健壮。夏菊为中日性植物；秋菊、冬菊为典型的短日照植物，只有光照长度在12h以下时才能开花。光照的强弱对花期及花色有一定影响，开花期过长能促进花青素的形成，使一些深色、白色品种的花色更鲜艳。
菊花比较耐旱，不耐潮湿，忌低洼积水。特别是夏季暴雨后，闷热闭气天气，易造成植株死亡。
菊花栽培适宜肥沃的砂土壤，但其适应性较强，只要有排水良好的土壤都能生长。
菊花花芽分化需要生长到展叶10片左右，株高25cm以上。而开花需要有叶17片左右，株高60cm。
菊花育苗多采用扦插繁殖，一般都在5-6月扦插。当株穗间株顶芽长到15～18cm时，摘取长6~8cm的一段，在节附近下剪，将基部大叶去掉，使插穗带有3～4片已展开的叶最好。如扦插材料不足时，也可用中段，但生根缓慢。切取的接穗及时扦插，可吸水1~2h，在水中加入荼乙酸200X 10-6或吲哚丁酸20X 10-6，以促进生根和防腐。顶芽切后，从原母株基部生出的侧芽，又可作为插穗。扦插介质用砂土或珍珠岩。扦插介质不宜重复使用，以防接穗病变，腐烂。插深约2cm，间距3~4cm，插后在苗基部轻轻压紧介质，并立即浇水。一般15d可开始生根，待25d左右，根长到1．5~2cm时，便可移苗。
二、菊花的组织培养快速繁殖
1.外植体的选取、灭菌和接种用于快繁的外植体很多，如茎段、侧芽、叶、花序梗、花序轴等，但最好采用茎尖或侧芽，其次是花序轴。下面以茎尖、茎段和花序轴为外植体说明。选取无病虫害、粗壮的茎尖和茎段，要求叶密茎粗，以利于将来分化迅速，无性系后代质量好。如以花序轴为材料，应选取具该品种典型特征的、饱满充实的蕾，最好要开放而未开放的花蕾，这时花瓣外有一层薄膜包围，里面洁净无菌，采后便于表面灭菌。过于幼嫩的花蕾，不易灭菌和剥离。茎尖嫩叶不要去掉太多，以免伤口面过多，造成灭菌时过多伤害，过多的叶可在灭菌后、接种之前除去。茎段除去叶，留一段叶柄，无菌水洗后，将茎段面及叶柄再切去一小段，以减少灭菌药物的毒害。接种时按材料生长极性的上下端，正放培养基上，尤其是茎尖不可倒置或侧植。
2.培养基及培养条件适用于菊花的培养基种类很多，如MS、B5、N6、White等等。但大多采用MS培养基，添加BA2~3mg／L，NAA0．02~0．2mg／L。菊花对激素的要求并不是很严格的，适用的范围很广。菊花培养的温度范围较宽，22~28℃都可以，以24~26℃最好。培养室光照时每天12~16h为宜，光强1000~4000Lx较好。
3．继代培养外植体经培养后，一般经4~6周，茎尖直接分化出新芽，或经愈伤组织分化出新芽；茎段、花序轴侧芽萌发，可产生一至数个芽。最初分化率及分化数量都较少，但随继代次数增加。增殖方式除诱导丛生芽增殖外，也可用茎切段作微型扦插繁殖。丛芽增殖时，将芽丛切或小块，转到分化培养基中即可。微型扦插则以嫩茎梢作材料，将嫩梢剪成1节带1叶的茎段。然后将切段基部插入 MSo或MS+NAA0.1的培养基中培养，4~5周后，腋芽即生长成小植株，再照上述方法切剪茎段，重复培养。
4．生根和移栽菊花无根苗生根一般较容易，通常在增殖培养上久不转瓶，即可生根，但这种根的根毛较少或无，不利将来移栽和生长，所以常用下列方法处理：
一是无根苗的试管生根，切取3cm左右无根嫩茎，转插到 1／2MS+NAA(或IBA)0.1的培养基中，经两周即可生根。然后移栽驯化。移栽初期保持高湿度条件，营养钵基质浇透水，取出生根的试管苗，洗掉附着在根部的培养基，用竹签在基质上打一小孔，将幼苗插入基质中。然后加设小拱棚以保湿，随着幼苗的生长，逐渐降低空气湿度和基质含水量，转为正常苗的管理阶段。
二是无根嫩茎直接插植到基质中生根。利用菊花嫩茎易于生根的特点，可免去试管生根一道之序。剪取2~3cm无根苗，插植到珍珠岩或蛭石的基质中，基质事先用生根激素溶液浸透，l0d后生根率可达95％~100％。
菊花用组织培养片快速繁殖，一般4~6周为一个周期，增殖倍率均在5~10倍以上。若以5倍计算，平均以40d为一个周期，一年可获得100~900万株苗，比常规繁殖快数千倍。
三、菊花花瓣的培养菊花茎尖培养是在适宜的条件下，大多经培养直接诱导产生植株。而花瓣培养则要去分化，先形成愈伤组织，从愈伤组织再分化产生完整的植株，有的则可产生胚状体而长成完整植株。由于在培养中需经过愈伤组织途径，有去分化和再分化的过程，因而由花瓣培养产生的植株往往有变异产生，表现在植株、叶形、花色、花形等多方面变异，如小苗叶片的叶形、厚薄、缺刻深浅变化，光周期从短日性变为中日性，株型、花色、花型、瓣型等变化，所以花瓣培养可用来进行菊花新品种的繁育。与杂交育种和辐射育种相比，有节省设备和人力、简便易行、机遇高等优点。此外花瓣植株是通过愈伤组织途径产生的，不带病毒，所以对没有产生变异类型的菊花来讲，也可起到复壮提高种性的作用，故花瓣植株表现也生长健壮，花大而艳丽。
1.菊花花瓣培养的方法在菊花开花前2~3d将已露白的花蕾，整个剪下，在自来水下冲洗十几分钟，然后在无菌条件下，用75％的酒精浸泡10~15min进行表面灭菌，后用无菌水冲洗两次，再用10％的漂白粉澄清液浸泡20min，再用无菌水冲洗3~4次。然后用无菌滤纸吸干水分，剪取舌状花，再用解剖刀切取舌状花约5mm见方大小，接种到MS基本培养基上，添加BAl~3mg/L，NAA0.5~2mg／L。接种后置于温度25℃左右，光照强度2000Lx，每天照光12h的条件下培养。
花瓣培养10d左右，开始产生愈伤组织，呈圆块状，色淡黄至嫩绿，培养20~30d后，从愈伤组织分化产生根系，以后又分化出芽点，但不成轴状结构。有些品种在愈伤组织生长30d左右，表面可出现大量绿色圆粒状物，用放大镜可观察到似鱼卵群集，即分化形成了胚状体，这是花瓣体细胞产生的，故为无性胚，数量大、成苗多。生长到40~50d后则可见到大量的芽生长产生。
有些愈伤组织还需转移到分化培养基中，才能诱导分化得到花瓣苗。分化培养基降低生长素浓度或提高细胞分裂素的浓度。将愈伤组织切成5mm大小接人，约20~30d培养，可分化出植株。
最后需转移到生根培养基，当芽高具3~4片叶时，移人NAA0.3mg／L的MS培养基中，约经2周培养，产生数条根系，即可得到完整的试管花瓣植株。
2.菊花无病毒苗的培养菊花为多年生宿根无性繁殖作物，常年靠分离母体的一部分进行繁殖，因此病毒代代相传，在母体中逐代积累，浓度越来越高，影响植株的生长趋势、花形、花色、花的大小和产花量，过去一直没有较有效的方法克服，现已证明用组织培养的方法可根除或减缓病毒的影响。
危害菊花的病毒有：①菊花斑纹病毒，造成叶上有轻斑纹，叶脉透明，花瓣上也有斑纹；②菊花矮缩类病毒，受害株比正常株矮1／2~2／3，叶有黄色斑点或成带状，花小，开花早；③菊花轻斑驳病毒，叶有轻微斑纹，花褪色，也有斑；④番茄不孕病毒，叶片大多无病症，表现花形小，花瓣生长不整齐，有萎蔫现象。此外还有畸花病毒、绿花病毒、褪绿斑驳病毒、花叶病毒等。
(1)茎尖培养脱毒首先切取顶芽或腋芽3~5cm，并去掉展卉的叶，只留护芽的嫩芽，然后用自来水冲洗，用0，1％升汞或饱和漂白粉上清液对材料进行表面灭菌，再用无菌水涮洗数次。在双筒解剖镜下剥离生长点，分离到0．5mm以下，一般带2个叶原基。分离出的茎尖，生长点朝上，迅速接种或放置灭菌水表面，以防茎尖脱水。
菊花病毒可用指示植物鉴定法、抗血清鉴定法、电镜检查法等检测。如果检测时仍有病毒存在，就应淘汰该植株。如果已证明脱除了主要危害的病毒，只要取得一株无毒苗即可繁殖大量的无毒种苗。这样经严格鉴定的去毒苗，称为原原种，原原种种源应保存在试管里和有隔离条件和消毒制度的保护区域里栽培，以防止再度遭到病毒的侵袭。由原原种繁殖产生的植株称为原种。在有试管繁殖的条件下，可以年年栽培原种种苗，保证无病毒的影响。
(2)热处理脱毒
菊花也可采用热处理方法来进行脱毒，在35~36℃的条件下栽培2个月，可以达到脱毒的效果。但是热处理只能除去菊花矮缩类病毒和番茄不孕病毒，而不能除去菊花轻斑驳病毒和褪色斑驳病毒，后者只有通过茎尖培养途径脱毒来达到目的。 第二节 非洲菊的组织培养非洲菊别名扶郎花，原产南非。1878年英国人在南非脱兰土瓦地区发现，1887年引入英国，以后逐渐推广至全世界。
非洲菊的花朵硕大，花枝挺拔，花色艳丽多样，切花率高，栽培用功省，在温暖地区能周年不断的开花，因此，在国际切花市场上发展很快，成为世界著名的四大切花之一。
我国非洲菊早在20年代就有栽培。1987年我国科研人员解决了非洲菊的组织培养的快繁技术，使我国的非洲菊生产得到发展。
一、形态特性和生物学习性非洲菊(Gerbera hybrida)属菊科大丁草属，多年生宿根草本花卉，一般株高50~60cm。全株具细毛，叶片基生，竖直向上或斜生，其形状随植株的生长而发生变化，从小到大由椭圆形变为长椭圆形，叶片长15~25cm，宽5~8cm，羽状浅裂或深裂，叶背具细绒毛。花由舌状花和管状花组成单生头状花序，花序顶生。舌状花较大，着生于花序的边缘，排列成一轮或数轮，从而形成单瓣或重瓣花型。
非洲菊性喜冬季温和，夏季凉爽的气候条件。最适生长温度为20~25℃，最低12℃，最高不超过30℃。四季有花，以4~5月和8～10月为盛花期，低于10℃则进入休眠期。喜阳光充足的环境，每天日照时数不低于12h，能提高植株的切花率，使花朵色彩更鲜艳。土壤要求有机质丰富、排水良好、pH值为6~6.5的微酸性壤土，在盐碱化严重的土壤中难以生长良好。
二、自然繁殖与育苗非洲菊为异花传粉植物，自交不孕。其种子后代必然发生变异，因此必须采用分株、扦插和组织培养的无性繁殖方法。
1．分株只适应一些窄花瓣，分蘖力强的品种。分株多在3~4月进行。10月份切花可上市。分株时，新株必须带有芽及根，故不宜分得太小。一般1株18个月株龄可分3~4株。分株后的苗，先剪去部分叶片，以减少水分蒸腾，并除去一些老根，分株一个月后以开始生长。
2．扦插把健壮的植株掘起，洗净根部泥块，去除叶片，切去生长点，仔细地保留根茎粗大部分。再把植株种在种植箱内。当温度为22~24℃、空气湿度为70~80％时，历经10~14d，即可取下枝条进行扦插，25~30d根系形成，再移植于营养钵中培育20~30d，秧苗便育成。
6-BA能促进枝条的形成，在除去叶片和生长点之后立即给母株的根颈部喷100X10-6浓度的BA溶液，要求其母株完全被喷湿。每一次插条后，重新给母株喷6-BA溶液。一般1个母株可反复剪取插条3~4次，一共可剪10~20根插条。
母株应采用1年以上已形成根颈的植株。扦插工作最好在3 ~4月开始，这样秧苗会在下半年开花。夏天扦插则要到第二年春天才开花。
为了加快插条生根，可先把插条放入0.2％的高锰酸钾溶液中略微湿，再把基部插入市售的生根粉或500X10-6的NAA溶液中，然后再行扦插。
三、组织培养育苗由于非洲菊的茎尖数目少，剥取较困难，又容易被污染，所以常用花托作为外植体。采取直径lcm左右的花蕾，在超净工作台上用0．1％的吐温浸泡10~15min，取出洗净后再放入0．1％氯化汞中消毒20min。，取出用无菌水冲洗3~4次。用镊子和手术刀剥去苞片，切除全部小花，留下花托，将花托切成2-3mm见方的小块。培养条件为24土2℃，光照强度为2000~30001x，每天光照12~16h。
初代培养基为MS+BA2mg／L(单位下同)十NAA0．2+IAA0．2，7~10d后切口处形成愈伤组织，约2周后从花托块中央生出丛生小芽，将丛生小芽移至分化培养基，可进行继代培养；与此同时，余下的愈伤组织约4周后形成丛生芽；分化频率为60％~70％。将丛生芽切割后，转入MS+Kt5+IAA0．2培养基继代培养。待苗高2cm时，剪切转移到I／2MS十NAA0．1生根培养基中，约4周后可发出2~3cm长根系。
移栽基质可用珍珠岩和蛭石(1：1)。移栽后防雨并用遮阳网遮荫。每天喷水1~2次，每周供给1次营养液，2~3周即可成活。随后适当增加光照，培养5~6周可供大田移栽。
非洲菊的组织培养要依各地大田栽植的时间和栽植量做出计划，如某地区大田栽植定在4月份，可在9~10月间植株开花上市，当年即可取得效益。如外植体分化出芽在上年10月中旬完成，那么第一次试管增殖应在上年10月中旬至11月中旬；第二次试管增殖在上年11月中旬至12月中旬；每次增殖比例约为1：10，每次增殖时间约1个月，到次年2月可增殖4次。试管苗生根培养在2月下旬进行，为期2周；试管苗苗床移栽在3月进行，养护1个月，即可保证在4月初移栽大田。批量生产时，则可增加接种材料数量或提早增殖培养时期，以增加继代培养的次数，获得更多的生产用种苗。
四、栽培管理
1.土壤准备与定植非洲菊喜偏微酸性的壤土?基肥每1000m2可用300kg腐熟菜饼、150kg过磷酸钙、150kg氮、磷、钾复合肥及1500kg腐熟的牛粪混合后翻人土中。畦宽1．2m，畦高25cm。
种植密度以每畦种三行，株距30~35cm。1000m2共种4000~5000株。定植时间除炎热的夏季外、其余时间均可进行。
非洲菊的根系中，具有一种横截面达0．5cm的老根，被称为收缩根。因其具有收缩，并把植株向下拉的能力。因此，非洲菊的定植深度以浅栽为原则。要求根茎露出土表1~1.5cm，并以浇好第一次沾根水。反之，如栽种过深，定植后发棵慢，甚至死亡。
2.肥水管理在生长期应该充分供给水分。在冬季温室内须视温度和生长情况酌情少浇水。浇水时要注意叶丛中心不能积水，应保持干燥，不然花芽易烂。
非洲菊只要温度适宜，一年四季能不断开花，因而需在整个生育期不断进行追肥，以补给养分的消耗。其营养类型属氮钾型，肥料可以氮、磷、钾复合肥为主。一般每10~15d施1次，当发现花后叶弱、叶小、叶少时，应适当增加氮肥。
3．剥叶与疏蕾
剥叶：非洲菊除幼苗外，整个生长期为营养生长与生殖生长并进，即一边长叶，一边长花。如叶片过于旺盛，花枝数减少，甚至光长叶不开花，叶片过小过少，花枝数减少并因营养不足导致花梗过矮，花朵变小，而无商品价值。因此，在整个生育期要不断地合理剥叶。这不仅可以减少老叶对养分的消耗，促使新叶萌发，还可以加强植株的通风透光，减少病虫发生。更重要的是抑制过旺的营养生长。剥时不能单纯地剥去外层老叶，使得植株只剩下集聚在一起的小叶丛，无正常功能叶。从而破坏了植株本身生理的平衡，造成花少、花小。
正确的剥叶方法是：①剥去植株已被剪去花的那张老叶；②根据该植株分株上的叶数，来决定是否再剥叶，一般1年以上的植株约有3~4个分株，每分株应留3个叶；③将重叠拥挤在一个方向的多余叶片剥去，使叶片均匀地分布在4个方向，以利更好地进行光合作用；④如植株中间长有密集丛生的许多新生小叶，功能叶相对少时，应适当摘去中间部分小叶保留功能叶，以控制过旺的营养生长。同时让中间的幼蕾暴露于阻光之中，这一点对花蕾的发育相当重要。
疏蕾：疏蕾的作用主要是提高切花的品质，使花朵更具有商品价值，疏蕾的方法是，当一棵植株上同一时期具有3个以上相当发育程度的花蕾时，容易养分不足，应将多年的花蕾摘除。此外，在幼苗刚进入初花期时，未达到5张叶以上的功能叶或叶片很小，应将花蕾摘除，不让它开花，使它长足营养体。因为大的叶才能开出大的花，如营养体很小就让它开花，以后就一直不能开出大花。夏季切花廉价时，应尽量少让它开花，以蓄积养分，利于冬季出好花。
4.温度管理冬季切花，需在11月份盖好塑料薄膜。加强保温和增温。如果冬季夜温保持在1~2℃以上，仍可保持持续开花。
非洲菊对温差相当敏感。夜间的温度应比白天低2~3℃，如果落差太大，会造成畸形花序。灌溉的水温也相当重要，冬季水温最好较土温高出3~4℃，夏季高温时忌用冷水。
第三节 矮牵牛的组织培养一、形态特性和生物学习性矮牵牛(Petunia bybrida)，又名碧冬茄，茄科，矮牵牛属。多年生草本植物，通常作为一、二年生草花栽培，播种后当年可开花。株高40~60cm，茎直立或卧倒，全身被短毛。上部叶片对生，中下部叶片互生，卵圆形，先端尖，全缘无齿。花单生于枝顶或叶腋间，花冠喇叭状，花瓣外缘具上下起伏的波状浅裂，花茎5~6cm，花筒长6~7cm。花色丰富，白色、深浅环同的红色和紫色等，并有复色和间色镶边的品种。花萼5深裂，雄蕊5枚。朔果卵形，先端尖，成熟后2瓣裂。种子细小，千颗重0．16g。花期长，可从4月开到霜降。
矮牵牛原产南美洲，是由野生杂交培育而成的，现在世界各地均有栽培。喜温暖，向阳和通风良好的环境条件，不耐寒，耐暑热，在炎热的夏季仍能正常开花，在连日阴雨和气温较低的环境下开花不良，多不结实。要求排水良好疏松的酸性沙质土地，土壤保持湿润，但不要过湿，否则枝条容易徒长而倒伏。
二、栽培技术矮牵牛育苗可通过种子、扦插及组织培养等方法，在大量栽培的情况下，现多采用后者育苗，其次是通过种子和扦插。
(1)播种育苗 可春播亦可秋播，秋播在9月上旬进行，发芽适温为20℃，lOd左右苗可出齐，冬季需移人温床或温室越冬。春播在4月下旬进行，夏季可以开花；如欲提早开花需提早在温室内盆播，4月下旬至5月上旬定植。
矮牵牛种子极其细小，为了保证出苗整齐，最好先播人浅盆内，用盆底浸水法给水，盖上玻璃和白纸保温保湿。长出真叶后间苗1次，然后移栽到三号盆内继续培养，最后脱盆定植。
(2)扦插繁殖 有些大花瓣品种结实困难，即便能采收到种子，播种苗也不能保持原品种的优良特性，因此须扦插繁殖。
为了保存大花瓣品种的母株做扦插材料，每年秋季花谢后应将一部分存放在温室内越冬。准备采集插条的母株应事先将老株剪掉，利用根蘖处荫生出来的嫩枝做插条，15~20d即可生根。发根的适温为20~25℃，5~6月或8~9月扦插的成活率最高。
三、组织培养育苗
1.片接种矮牵牛选择嫩叶作为外植体效果较好。可从播种、扦插所繁殖的植株上取材。在此之前2~3周，最好把母株置于温室内培养，不喷水。剪下健壮无病的嫩叶，将其进行常规消毒后备用。把已经灭菌的嫩叶切成5mm见方的小块，然后接种到MS+BA0.5的诱导培养基上。培养2~3周后会有愈伤组织出现，有时也会直接从外植体上生出小芽。随着培养的继续，在愈伤组织上会出现绿色突起，以后这些突起就会形成芽丛。分离芽丛转接到MS+BA0．05的继代培养基上。继代增殖迅速，20d即可继代一次，增殖系数高达30~50，而且随继代次数的增加，分化系数也逐渐加大。当嫩茎长到1~1.5cm高时，即可把它们剪下诱导生根，接种到1／2MS+NAA0．05的生根培养基中。培养条件为22~25℃，10~12h／d，1500~2000Lx。
2.茎尖茎段接种选择茎尖、带芽的茎段作为外植体，先用肥皂水刷洗，流水冲洗l0min，70％酒精消毒30s，在含有数滴吐温-20的1％安替福民溶液中浸泡5min，0．1％升汞中浸3min，无菌水冲洗3~4次，用消毒滤纸吸干表面水分，无菌条件下切取茎尖0．5cm或带腋芽茎段lcm接种到MS+6-BAl+IBA0．02的诱导培养基上。1周后，芽开始萌动，逐渐长大成新梢。继代可用切割茎段法进行。最后，进行生根培养。当嫩茎长出5~7条1~1.0cm左右长的新根时，即可进行移栽，基质可采用经过灭菌处理的珍珠岩和蛭石。移栽前期，要将空气湿度控制在80％~90％间，遮光率为60％，环境温度控制在16~20℃间。经1~2个月的管理，即可定植于富含腐殖质的砂质壤土中。矮牵牛喜微潮偏干的土壤环境，浇水不宜过多。在定植时不必施用基肥，随着小苗的长大，可每周追施一次稀薄液体肥料。矮牵牛虽喜阳光充沛的环境，但试管苗在定植后不可接受过强的日光照射。矮牵牛喜凉爽、忌高温，最好将环境温度保持在12~20℃。小苗高6~10cm时摘心一次。
第四节 香石竹的组织培养
香石竹又名康乃馨，因其花朵绮丽、高雅、馨香，开花时间长，便于包装运输，容易贮藏和保鲜，单位面积产值高，适应于工业化生产，故在世界各地广泛栽培，是世界销售量最高的切花，约占切花销售总额的40％。
一、形态特性和生物学习性香石竹为石竹科石竹属草本植物，原产南欧地中海北岸、法国到希腊一带，须根系，茎直立，多分枝，株高70~100cm，茎部半木质化。叶线状披针形，全缘，叶质较厚，上半部向外弯曲，对生，基部抱茎。花通常单生或2~3朵聚伞状排列，
香石竹是一种中日性花卉。喜干燥、通风良好的环境，忌高温多湿，一年四季，除炎热的高温外，其余时间都能开花。香石竹为喜冷凉植物，最适宜的生长温度为19~21℃，冬春季节白天宜保持在15~18℃，晚间保持在10~12℃，夏秋季节白天宜保持在18~21℃，晚间宜保持在12~15℃。
香石竹喜保肥通气和排水好及腐殖质丰富的砂质壤土，土壤通气间隙占30％左右最为理想，最适宜的土壤pH值为6~6.5。
香石竹的主要品系按其来源可分为美国香石竹和地中海香石竹(或称欧洲香石竹)，美国香石竹原产美洲，其适应性强，生长势旺、节间较长、叶片较宽，但耐寒性差，因此适合温室栽培。地中海香石竹原产意大利、法国、美国。植株节间较短，叶片狭长，不易裂苞，较耐低温，产量高。近几年采用美国香石竹和地中海香石竹杂交，培育出一些生长势强、花色艳丽、茎杆强壮、耐低温、抗病性强、产量较高的品种。
二、自然繁殖与育苗香石竹可用扦插、播种等方法进行自然繁殖。
1.扦插育苗
(1)插穗最好采用母本茎中部二三节生出的侧芽作插穗。中部位以下的侧芽较弱，不充实，发根以后生长不好；中部位以上的侧芽，由于节间长，尽管容易发根，但不久生出花蕾，应避免采用。
采插穗时，用左手握住母株，用右手抵住侧芽的中间使之弯曲而扒下，这样不伤母株茎，扒下的插穗需进一步整理。过长的插穗从节的部位折断，保留叶4~6片，插穗长6～8cm。每20～30支扎作一捆，浸入水中，使其吸水30~60min，然后浸入一定浓度的NAA或IBA溶液中，或用市售生根粉处理，以促进生根。
(2)扦插苗床可采用带有自动喷雾苗床进行扦插育苗。如临时性育苗，最简单的方法是，选择靠近自来水的大棚，做宽度1.2m左右的苗床，里面放人基质。上面安上喷水管道。长度则根据插穗的多少来决定。放入的基质厚约8cm，过厚易潮湿，过薄易干燥。采用珍珠岩与稻糠灰各一份混合的基质，生根效果最好，且生根后苗较健壮；也可就地取河沙、田园土拌和使用。苗床大多建在温室或大棚内，常久用时，可用水泥铺砌成固定式水槽。
(3)扦插方法扦插事先将基质浇水，株行距1.5×2.5cm，插深1．5cm，插穗垂直于土面，插后立即浇上薄水，使插穗与基质紧密相接。
(4)扦插时间扦插以春秋两季生根快、成活率高，15～20d左右能起苗，冬季发根较慢，约30～40d左右可起苗。夏季如有自动喷雾的全光浴苗床，扦插成活率也比较高，最快13d左右就能发根。但高温高湿，或排水不畅，很容易烂苗，感病，严重影响成活率。
2.扦插后的养护管理扦插后的养护管理应根据气候条件而定。通常气温高、苗床水分挥发快，床面喷水间隔时间要求短。反之，冬天喷水间隔要长些。在未生愈伤组织前不得太湿，以防止伤口腐烂，愈合发根后可适当增加水分。在发根前吸水能力较差，必须用草帘遮荫，以防太阳直接照射。
三、组织培养育苗
1.取材、灭菌和接种香石竹组织培养大多取其茎尖作培养材料。从田间或温室中长势健壮无病的植株上选择较为粗壮而处在营养生长阶段带有2～3对成熟叶片的嫩芽，剥去成熟叶片，留下嫩芽，在清水中清洗后，用70％的酒精消毒1min，再用2％的次氯酸钠消毒15min。，或用0.1％升汞消毒8min，最后用无菌水漂洗3~4次，经无菌滤纸吸干水分后，放在干净的培养皿中备用。在超净工作台上剥开茎端，切下茎尖，立即接入预先配置好的培养基上，一般每只三角瓶接人3~5个茎尖。作为快速繁殖，切取0．5cm大小的茎尖进行培养。作为脱毒培养，则要在双筒解剖镜下切取0．3~0．4mm的茎尖进行培养。
2.培养基和培养方法通常选用MS为基本培养基，也可用White作基本培养基。附加BA或KT 0．5～2mg／L(单位下同)；NAA、IAA浓度为0．2～2，2，4-D为0，1~1。培养方式有固体培养和液体培养。可采用液体和固体培养交替进行。如选用White(无机盐浓度的5倍)基本培养基附加NAA2，对切取的茎尖进行液体培养，促进愈伤组织的形成和生长。1个月后切除基部部分愈伤组织后转入到附加NAA1的White液体培养基中培养2周，待小苗长到0．5cm左右，把小苗转入到MS附加Kt 0．5的固体培养基内进行增殖培养，然后再用MS培养基附加BA0．5和NAA 0．2进行继代培养，从而获得较高的繁殖系数和高质量的组织培养苗。
3.芽的诱导和繁殖从茎尖诱导芽的发生通常有两个途径。一是诱导茎尖直接形成芽苗或芽丛；二是先诱导茎尖产生愈伤组织，再使愈伤组织分化产生不定芽。茎尖以何种途径产生芽苗或芽丛取决于所接种茎尖的大小以及培养基中激素的种类、浓度和配比。将较大的茎尖接种于附加BA2、IAA0．5的MS固体培养基上，经1个月以上的培养可形成芽头众多的芽丛，而若将较小的茎尖接种于附加BA0．5、2，4-D1的MS固体培养基上，经1个月左右的培养可诱导形成2~3mm大小的愈伤组织，再将愈伤组织转入附加BA2，IAA0．5的MS固体培养基上，经过2~3周培养可使愈伤组织分化形成不定芽。将茎尖直接形成的芽丛切割成单芽或用愈伤组织分化形成的不定芽接种于附加BA0．5~2、IAA0．5的MS固体培养基上，经3~4周的培养可诱导单芽增殖产生芽丛。
在继代培养中需根据幼芽的生长状况，调节培养基中激素的浓度，以获得较多健壮的幼苗。
4.生根培养切取1~2cm长的幼苗，接种在无激素的1／2MS培养基上培养，经15~20d的生长，即可产生根系。温度20~25℃，光照强度约20001x．每天维持10~12h的光照。
5.移栽驯化当组织培养苗发出的新根长约0.5~lcm时可移出移栽。在组织培养苗移出前，应先在室内自然的光照和温度、湿度条件下炼苗2～3d，使之逐步适应外界的气候条件。自然情况下10月中旬至翌年5月为最佳移栽期。移栽的基质要求疏松、通气和排水良好，使用前还需要进行消毒处理。移栽的容器可用塑料软钵内装珍珠岩等基质。移栽时用镊子小心地将组织培养苗取出，尽量不要伤根，轻轻地去掉附着在苗子根部的培养基，以防止霉菌侵染。用细竹签在基质上打孔，将种苗插入基质中，最后将盆钵置于盛有清水的容器中吸水，使根系与基质充分接触。
移栽后的头几天，需要防风、保湿，可设置塑料小拱棚，用喷雾器间歇喷水，以保持一定的湿度。并将温度保持在12~15℃。2周后可完全不遮荫，进行全光照正常养护，精心管理，补充肥水，及时防治病虫，培育壮苗。
四、栽培技术
1.土壤准备香石竹喜肥，不耐水湿以肥沃透气好的砂壤土为佳。但砂性较强的土壤影响植株根系的生长，严重时甚至烧根死亡。因此，在定植前，最好测一下电导值和pH值。香石竹生长周期较长、需肥量大，故必须施足腐熟的厩肥、饼肥、过磷酸钙等基肥。一般每棚可施厩肥1ton、过磷酸钙100kg。香石竹最忌连作，因此生产上常采用轮作进行换土。种植田块要求供水排水方便。
2.作畦与定植作宽1．0m、沟宽50cm的畦，尽可能作高畦面以增高地势。定植密度在15X18cm左右，1000m2约栽植15000-8000株。定植深度要浅，因为浅栽的幼苗容易成活。且发根、发棵快。在生长旺盛时，再结合松土进行培土。
3.摘心香石竹摘心后就会从丛节上发生侧枝，所以可用摘心来决定分花枝的枝数以及调节开花时期和生育状态。
第一次摘心在定植后约30d，幼苗6、7节长时进行。摘心尽可能在中午高温、太阳光足时进行，以利伤处收口。摘心时，从基部起5、6节处，一手揪紧中心叶，用力快速摘取生长点；另一手牢固地握住幼苗的基部，使摘取时不致于将根提升起来。
第二次摘心在第一次摘心后，发生的侧枝长有5、6个节时进行，其方法与要领与一次相同。各侧枝也分别摘心。由第一侧枝摘心后又能长出2~3个第二级侧枝，因而第一级侧枝如有3～5个，则第二侧枝为6~10个。所以当原分枝数较多，也可进行半次摘心。即只对一半侧枝进行摘心，另一半侧枝数保留。一般每株保留3~6个侧枝，将其余侧枝从基部处剪去。
最后的摘心时期，根据不同的品种和切花时期而不同；对于12月至翌年2月的切花，一般7月中旬结束摘心；要求"五一"节盛花的，摘心务必在2月初结束。
4.张网为避免外面的侧枝弯曲而妨碍生育，要提前张网，使茎正常发育。当苗高距畦面15cm时，张第一层网，以后随着茎的生长而张第二、三、四、五层网，同层之间相距25cm。
目前市场上有售香石竹的专用尼龙网，可节省劳力，这种专用网在拉第一层的时候，可同时安上能调节到第四、五层的网。张网时需每隔3m2距离树一桩子，用以缚扎尼龙网，使尼龙网绷紧不松弛。
5.肥水管理小苗定植后随即浇透水，使土壤与根系充分接触，提高定植后的幼苗成活率。但根际土过湿容易发生茎腐，高温期间更是如此。因而从定植后不久，必须在行间浇水，使根际土壤经常保持几分干燥。但过于干燥，生育会明显变差。
在9月中旬至10月下旬气温15℃左右时期，可增加浇水量。夏季浇水时间，必须掌握在清晨和傍晚进行；冬季浇水则在中午前后进行。但在11月或翌年2~3月，由于昼夜温差大，如浇水过多，花朵容易开裂，因此浇水量要严加控制。
香石竹苗期要掌握薄肥勤施，可用稀粪水、菜饼水或含氮、磷、钾、钙、镁的液肥。当9~10月或3~4月生长旺盛期需要大量养分时，可在张网之前结合中耕进行一次施肥，即用菜籽饼、骨粉或速效性的复合肥，在植株根穴处施入。张网后再结合浇水进行追施。随着植株的不断生长，在中后期逐渐减少氮肥用量，而适当增加磷、钾肥用量。花蕾形成后，可每隔一星期喷一次磷酸二氢钾，以提高茎杆硬度。
香石竹对养分的吸收量在品种间有很大的差异，但一般吸肥规律的趋势是，钾(K2O)>氮>氧化钙>五氧化二磷>氧化镁。香石竹以硝酸钙、硝酸钾、磷酸铵、硼砂等溶解于水作液肥施用，效果最好。
6.摘芽和摘蕾香石竹摘心后萌发的侧芽，除保留5~6个作为开花枝外，其余健壮的嫩芽可打下作为插穗，以繁殖下一代用。对于一些不健壮或节位较高的侧芽，应尽早摘去，否则影响植株的光照和通气。开花枝上的花蕾，留下最顶端的一个，其余在长到豆子大小之前铲除。
7.花萼破裂的防止大花系比中花系花萼破裂发生的多，有时会出现50％以上萼裂泡，其原因主要是花瓣生长迅速，致使花萼被挤破。这也就是花瓣达60片以上的大花种特别容易发生萼裂的原因。一般认为，萼裂与温度、土壤水分的关系很大。在成花阶段，若遇持续的低温，由于花瓣数或花朵数增加。再加上昼夜温差大，萼裂较多发生。在低温时期多量浇水，或者肥量过多，或氮、磷、钾三元素不均衡，尤其磷成分过多时，都会造成花蕾破裂。
为了防止花萼破裂，要提高栽培棚内夜间温度，白天充分换气，使昼夜温差小；适当浇水，避免从过干急剧地变成过湿，同时降低白天的温度。
近年已有物理防止花萼破裂的办法，即在开花的1～2周内，用塑料带把花萼部分捆卷成钵状，或者安上铁丝环，用(30~50)×10-6赤霉素处理黄豆大小的花蕾，也能起到减少花萼破裂的作用。
五、病虫害的防治
1.病害香石竹是一种比较娇气并易感病的植物，易感染的病害有茎腐病、叶斑病、锈病和病毒病等。
茎腐病：高温时易发生，由于镰刀菌侵入导管，根茎部分变软弱，白天萎缩，不久即枯死，大多通过土壤传染。其预防方法是，采用排水良好的地块，并全面消毒，避免深植，谨慎浇水，不要长时间淋雨，苗床要求通风良好，移栽时不伤茎。
此病如果发生，即将病株带根土拔除，并使其周围土干燥，而后灌注甲氧乙氯汞800~1000倍，或者土壤消毒剂"敌克松"500倍液。
2.虫害蓟马，蚜虫等为主要害虫，还有红蜘蛛、夜盗蛾、斜纹夜盗娥等。
(1)红蜘蛛 高温干燥时发生，若大规模发生则不易绝灭，因此，早期可喷施杀螨剂。使用敌敌畏等杀虫熏烟剂，能有效地防治。但在高温多湿和整个开花期易产生药害，要避免使用。此外，使用喷雾装置，对植株连续喷雾，也能起到一定的防治效果。
(2)蓟马 高温干燥时易发生。蛀食尚未展开的心叶，使展开的叶产生斑点、萎缩，叶色浓淡不匀。也寄生在花和花蕾上，造成花瓣边斑点。其防止方法与红蜘蛛相同。
(3)蚜虫 多发生在高温、透气差的时候，苗和新叶受害显著，造成发育不良。蚜虫又是病毒病的传染媒介，因而需要及早防治要反复喷药，药剂以毒性低的有机磷剂马拉松、敌敌畏、氧化乐果、乙酸甲胺磷为好。夜盗蛾、斜纹夜盗蛾可采用苯硫磷、敌敌畏等驱除。
六、切花及保鲜香石竹切花的剪取在夏季可每天进行一次，冬季一般每星期一次，剪花宜在下午进行。香石竹的切花适期为低温期花开六成，高温期花开四成。剪取后，每20支花扎成一束，翌晨即可上市。暂时不出售的切花，可将茎下2~3对叶除去，更新切口，然后立即插入水中吸足水。在5~6℃的冷藏室中贮藏。但要注意，不能和水果、蔬菜、月季、郁金香、紫罗兰等放在一起。
当5~6月与9~10月香石竹产大于销时，可在香石竹花苞露色、十字开口时剪下，用保鲜剂处理贮藏，以使淡季不淡，旺季不弃花。具体方法：在1000g蒸馏水中加入硝酸银50mg，硫代硫酸钠500mg、蔗糖70g将溶液加热到40℃，剪去香石竹末端2~3cm。并立即插入溶液中，再在温度约10℃的黑暗冷库中放置20h后取出，在0~1℃的温度下吸于水，再装入塑料薄膜袋中，贮藏在1℃的冷库中，可贮藏12~16个星期。
复习思考题
(1)菊花生物学特性有哪些?怎样用叶片进行快繁?
(2)非洲菊有哪些生物学特性怎样用花托进行快繁?
(3)矮牵牛对温度、光照及土壤有何要求、怎样及茎段进行组培繁殖?
(4)香石竹对温度。水分有何要求?怎样培育无毒苗?
第十章 兰科花卉的组织培养目的要求：
(1)掌握百合生物学特性和快速繁殖方法；
(2)掌握兰科植物组培的大致过程；
(3)掌握卡德兰属兰花组培的几个环节；
(4)掌握蝶兰属花梗组培的方法。
第一节 百合的组织培养全世界已发现百合约89余种，主要分布地区是中国、日本、北美和欧洲等温带地区。
北美百合协会将百合园艺品种划分为10个种系，观赏栽培的主要是4个种系，即亚洲百合杂种系，包括卷丹、川百合、山丹等；茶香百合杂种系，包括：席香百合与台湾百合的杂种或杂交品种；东方百合杂种系，包括：席子百合、天香百合、日本百合、红花百合及其与湖北百合的杂种。麝香百合杂种系，麝香百合又名铁炮百合、复活节百合，株形端正。花色清白给人以清纯、高雅的印象，是切花中的佳品。
我国近年来，昆明、上海、深圳的百合切花生产发展较快，已形成三大生产基地。目前国内切花栽培的百合大多是亚洲型，主要从荷兰、日本引进，经过几年的栽培试验，已筛选出一批适合我．国生产的品种。
一、形态特性和生物学习性百合是百合科(Liliaceae)百合属植物的统称，为多年生的草本植物。鳞茎无皮，广卵形，直径5~8cm，肉厚三披针形，白色或黄白色，茎高30~90cm，直立，上叶多而散生，披针形，叶色从浓绿到淡绿色，光滑。花单生或数花横向着生茎顶，花朵呈喇叭状、筒状，有清香。花被先端外卷，花被筒深处淡绿色。
百合属于球根花卉，要求肥沃、疏松和排水良好的沙壤土，以有利于鳞茎发育膨大。而粘重坚实的土壤由于土壤孔隙度小，通气性能差，抑制土壤微生物的活动，养分不能很好分解，造成土壤养分供应不足，影响百合根系生长和鳞茎发育。百合一般喜微酸性土壤，土壤pH值在5.5~6.5最为适宜。但有些种类如王百合、川百合、卷丹等也能耐微碱性土壤生长。渥丹、湖北百合和兰州百合等能在pH值为8.2的土壤条件下生长。但土壤碱性太大或过酸，对大多数百合种类都不适合。百合一般不耐盐。另外，盆栽土壤以腐叶土、培养土和粗沙的混合土为宜。盆栽百合时，应在每年休眠期将鳞茎上部盆土取出，更换新的肥沃土壤，2年后应翻盆重栽，切忌连年不换。
百合生长的最适温度为15~25℃，温度低于10℃，百合生长缓慢，甚至停滞。耐寒力强的种类，夜间可耐1.6℃的低温。温度超过30℃，则会影响百合的正常发育，出现"盲花"现象。生长过程中，以昼温21～23℃，夜温15-17℃最为理想。开花的适温为15~20℃。
百合生长要求湿润，怕干燥。湿润的空气对百合茎叶生长十分有利。但大棚栽培时空气湿度过高，通风欠差，茎叶、花蕾容易发生病害。如果土壤过于湿润、积水或排水不畅，造成土壤空气中氧气的含量低于5％时，就会影响百合根系的发育，造成鳞茎患病腐烂死亡。盆栽百合的水分调控，应随植株的生长而逐渐增加，花期供水要充足，花后应减少，地上部分枯萎后要停止水分供给。盆土过湿，同样导致鳞茎发育不良，甚至腐烂死亡。
百合的根系十分发达，吸收水分和养分的能力很强，因此对土壤肥力要求并不高。生长期间除需一定数量的氮、磷、钾肥(比例为5：10：5)，还需补充钙、镁、硫等肥料以及铁、硼、锰、铜、锌、钢等微量元素。为此，栽培百合前，正确地施用肥料和调节土壤肥力，对提高产品的质量关系十分密切。在百合现蕾开花时，氮素营养不能缺少，否则会影响百合花的质量。在石灰质的土壤中，容易形成不可吸收态的硼酸钙，用这种土壤种植百合，很容易造成缺硼的现象，导致百合开花不良。
通风对棚室栽培百合十分重要。百合在大棚或日光温室栽培时，常由于通风不及时，造成棚内温度过高，使百合不抽花薹，开花率降低。另外，北方在3~4月百合采花后，棚内温度逐月上升，特别晴天阳光充足时，白天温度可高达30～35℃以上，这对百合地下鳞茎发育十分不利，必须通过遮阴和通风来调节温度。棚室内通风不足，还会导致空气湿度过大，使百合发生病害，及时通风，降低棚内湿度，可减少病害的发生和蔓延。
百合属于长日照植物，每天增加光照时间6h，能提早开花，如果光照时间减少，则开花时间将推迟。百合在生长过程中，喜柔和光照和半阴，也能忍受短时间强光照。但长期阴雨、光照不足，植株易徒长，会引起花蕾脱落，开花数减少，"盲花"增多，花朵色彩暗淡，影响切花质量。若光照充足、适度，百合植株生长健壮，花茎粗壮，叶片肥厚，花色鲜艳。其中卷丹、湖北百合和黎香百合等种类较耐阳光照射。
若9~10月种植，由鳞底盘部发根，于秋冬季发芽，低温期以簇状态越冬，到春暖时分抽薹，花芽分化，而开花、结果、秋冬来临时地上部逐渐枯萎，再以鳞茎休眠状态在深土中越冬。
如铁炮百合是在生育中进行花芽分化的。其鳞茎首先必须解除休眠，然后感受0~20℃的低温，花芽分化适温为10~20℃。铁炮百合对温度较敏感，在8~30℃范围内，花芽分化随温度越高，分化越早。然而在25℃以上时，花芽未完成发育以前易发生花萎枯现象：在较近分化温度下限的10-13℃下，分化缓慢，但花数增加；当出现低温或昼夜温差大时或30℃左右高温，容易发生裂萼现象。
花蕾在现蕾时向上，接着向下；在开花时横向或稍斜向下，由分化到开花间，品种有差异。如乔治品种在分化后3~4周就可感触到其花蕾，其后14~17d现蕾，再过45d左右开花。
二、繁殖方法主要方法是分球和鳞片扦插繁殖，还有采用叶插和分珠芽，新铁炮百合可播种繁殖。
1.分球百合老鳞茎(母球)生长过程中，于茎轴上逐渐形成小鳞茎，称"茎生小球"，经一年栽培，可分生1~3个甚至7~9个小球，适当深栽及摘除花蕾，均有助于子球发生，小鳞茎待明春播于苗床，大者10年，小者培养2~3年可当种球。
2.鳞片扦插取成熟健壮的老鳞茎，阴干数日后剥下鳞片，斜插于湿润木屑或颗粒泥炭中，温度以20~25℃为适，一般8~9月插，经2~4个月生根发叶，并在鳞片基部生长出小磷片，基质含水量在60％~ 80％，前期高水分，后期低水分，过分湿润易腐烂。为防止病菌感染，应尽量除去外层鳞片，1片鳞片可获50～60个子球，自鳞片扦插、生根、发芽至植株开花，一般需2~3年。
3.叶插及分珠芽将开花植株的茎生叶自茎上拉下，扦插到湿润介质如蛭石、木屑中，保持20~C左右温度，每日光照16~17h，经3~4周后产生愈伤组织和小群茎，一个半月后，小鳞茎产生新根。铁炮百合一般不用珠芽繁殖，但如卷丹(又称虎皮百合)等有叶腋生珠芽特性。铁炮百合经叶插、茎播后，也会形成珠芽。采珠芽贮于砂中，春插于苗床，2~3年后开花。
4.播种新铁炮百合的最大特点是由实生苗栽培，于12月上旬播种，采用条播或撤播。播种用土以土壤4、腐叶土4、河砂2的比例混合。播后覆土，以不见种子为适，充分灌水、覆盖，温度白天25℃以下，夜间10℃左右，播后1个月可整齐地发芽。
三、百合的组织培养百合的组织培养繁殖自20世纪70年代后期开始，日本人以叶片为外植体诱导出大花卷丹的小植株，我国于80年代初由兰洲百合的花药、花丝等培育出完整小植株。80年代以后，培养出去病毒的百合种苗和通过胚培养获得远缘杂交的新品种。
1.花器的组织培养
(1)取材和灭菌采取开花前数日的花蕾。花蕾的表面用酒精灭菌，再在酒精灯上灼烧数秒钟，以后放在无菌培养皿内剥开花蕾，花丝，子房，花柱等分别切取3～5mm长，接种到培养基上。也可用花瓣和萼片培养。
(2)培养基及培养条件采用MS，KC等培养基，蔗糖浓度以7.0％为适，这样发芽和子球形成率可达90％左右。光照度2000Lx，每天照用15h，保温20℃。
(3)生长情况花器部位 从百合花器不同部位的培养来看，以花丝的部位为好，成活率很高，发芽较多，再是子房和花柱部分。可从各部位发芽，形成子球，通常是经过两个途径，一个是从切中处形成愈伤组织，以后再发芽；再是从切口直接产生芽。
花器培养植株 麝香百合花器培养得到的植株，生长约6个月即可开花，未发现不正常现象，只是母株的花较大，且全株无病毒症状。
培养条件 花柱、花梗、茎段等用MS+IAAl+BA0．2培养基，叶片用MS+NAAI+BA0．1；分化植株时，MS+NAA2+IBA0．4+Kt0．05，培养基内均加蔗糖3％和琼脂0．7％，pH值5.8~6.5。
2.鳞片组织培养百合鳞片等培养，对于扩大培养材料来源，加快繁殖速度和培养得到无病毒苗等皆有重要意义。
初代培养 由于其鳞茎材料都生长在土中，受土壤微生物的影响，所以污染率相当高。为此外植体消毒要严加注意，可应用次氯酸钠，高浓度漂白粉过滤液、酒精和中性皂等几种消毒剂并用的方法。取0．5cm2鳞片小块接人MS+2，4-D1+IAAI+Kt0．5诱导培养基中，置于20土2℃，照光9-10h／d，光强1200Lx条件下培养。接种后的2周里，即有98％左右的鳞片切块在近轴面或边缘上诱导，也有淡黄色的不定芽原基呈环状突起，多数每块上有2~4个，这些不定芽原基继续生长4周后，可形成中间抽出绿色的白色小鳞茎，在小鳞茎基部发生一些粗壮的根。将幼苗切成1.5~2cm长的片断，接种到诱导愈伤组织的培养基上。3周后叶子的基部、叶脉、叶缘上均可诱导出一团团淡黄色的愈伤组织，以叶基部的平均数为多。
继代培养 分化培养时，可用MS+NAA2+IBAO．4+Kt0.05培养基。将愈伤组织转移到分化培养基上，10周后，愈伤组织逐渐膨大，来分化出许多大小不等的鳞茎，并在小鳞茎的基部长出许多粗壮的根。有少数的小鳞茎中间可长出绿芽。将小鳞茎分离出以后，留下的愈伤组织转移到相同的新鲜分化培养基上，一段时间后仍能分化出小鳞茎。
子球的形成能力，与外植体采收时间有关，一般以春季接种效果为好。另外。与外植体分离部位有关见表11-1。在叶尚未展开的基部或花器顶部5cm范围内选取的外植体，其子球的形成情况都较好。此外，子球的形成以百合鳞片外植体的向心面为多，故外植体接种时还要考虑到接种的适宜接触位置见表11-2。
生根培养 百合试管苗移栽时首先应把根部的培养基清洗干净，以免受细菌或真菌污染而影响幼苗生长。在试管苗移栽前，放在4~10℃低温条件下锻炼2～3周，这样移栽后的幼苗生长更加健壮。移栽幼苗最好用消毒的腐殖土或泥炭土加蛭石的混合基质，移栽用育苗盘必须清洗消毒。同时，移栽后注意湿度管理，相对湿度控制在80％~90％。同时要防止烈日曝晒，后期幼苗不宜浇水过多，并及时喷洒药剂预防病虫危害。
表11-1 鹿子百合鳞片不同部位分离的外植体的子球形成能力表11-2 麝香百合的不同接种方法与子球形成的区别秋季小鳞茎移栽到盆中的成活率较高，且能继续生长，抽出绿芽。入冬后进人休眠，地上部枯萎。移植前的培养温度及培养基所含的无机盐、激素和蔗糖浓度对新产生子球的发根和休眠有较大的影响，也会影响以后上盆的成活率。
从以上可以总结出百合诱导成苗大致有以下几种途径：
(1)鳞片小切块诱导 鳞片小切块接种后，一般先分化出黄绿色或绿色球形突起的小芽点，继而芽点逐渐增大，长成小鳞茎，并可生长出叶片，形成苗丛，生根后即可以从试管中取出，移栽于育苗盘，再过渡到大田。也可将小鳞茎继代培养扩大繁殖。
(2)叶片诱导 在超净台上取无菌叶片，接种于培养基上，培养30d后即可分化出带根的小鳞茎。培养60d后，每个单叶片形成的小鳞茎一般又可分化出带有根系的丛生小鳞茎4~6个。叶片培养可直接插入培养基中，叶片也可平放于培养基上培养。
(3)无菌小鳞片诱导 取试管中的无菌小鳞茎，在超净台上将其小鳞片逐片接种于培养基上，鳞片基部向上或内侧面向上，培养 30d左右即可开始分化，再培养30d左右即可分化出小鳞茎和根系，培养60d后，每个小鳞片一般又可分化出带有根系的丛生小鳞茎4~6个。
(4)愈伤组织诱导 上述的外植体在分化成苗过程中，常常也可伴随颗粒状似胚性细胞团的愈伤组织产生。该愈伤组织可在连续不断的继代培养中，一方面不断地继续增殖相似的愈伤组织，另一方面又不断地分化成苗。
一般每个试管里的愈伤组织可分化成苗20~40个，这样即可周而复始分化出大量的试管苗。
百合用组织培养繁殖方法解决了因持续进行营养繁殖而引起的种球退化现象，使百合种球得到提纯与复壮。
四、打破休眠的方法百合切花栽培中首先要解决的技术问题是；避免因球根之休眠而导致发芽率不高及盲花。由于同一圃场生产的球根，其休眠状态各种各样，尤其休眠深的球根，仅靠贮藏无法打破休眠。促成栽培打破休眠的实用方法有：
1.冷藏
13~15℃预冷，3～5℃冷藏6-7周，于11月定植。抑制栽培可用泥炭苔在冷藏箱填装茎球，以1℃预冷6~8周，提高其渗透压后，以-2℃的温度贮藏14~15个月，然后以10~15℃的温度逐渐解冻，而后定植。但长期贮藏将使切花品质下降。填充材料先浸水以保持一定湿度。
2.温水浸泡泡入足够量的温水中，使球根心部的温度均一。开始于48℃左右的温水中，每隔2~3min提起再泡人，如此反复2~3次，则容易均匀，然后在45℃温水中浸泡1h。注意应严格掌握水温，接近50℃高温，即使是短时间，也会发病。温水浸泡对麻烦的根螨防除有极好的效果，也有可能加强植株生长势。
3.激素处理采用1000x10-6GA溶液浸泡，为避免发根阻碍，可先将球根倒置浸泡一半，而后恢复正常位置予以静置。
五、病虫害的防治危害百合切花生产的主要病害是病毒病和球根腐烂病，要定期喷波尔多液，适当轮作，进行土壤和鳞茎消毒。目前，最根本有效的方法是使用由生长点培养的无病毒种球。
百合栽培中还有一种常见的生理性病害，即叶烧病，其主要特征是当植株高约20cm时，幼叶出现黄绿色或白色斑点。叶烧轻微。植株仍可生长；若严重，白斑点变成褐色斑，该处叶片会出现卷曲，更严重者，所有的叶片及幼嫩花苞均受损，植株停止生长。发病的原因主要是根系生长不良或土壤盐分过高所致。此外，若植株生长过快，根系发育慢于地上部分生长，或由于蒸发过大、气温过于干燥或变化过大、阳光过强等都易发病。通常大球比小球易发生叶烧病。
防治方法：
(1)勿选种易叶烧的百合品种，更不要选该品种的大球；
(2)选择发根性好的种球，并宜适当深植；
(3)种植前土壤进行淋洗；
(4)及时做好防治根部病虫害工作；
(5)夏季阳光过于强烈时，应遮荫，并每天洒水两次，以降低蒸腾作用；
(6)不可使植株生长过快，室温最好保持在10℃左右。
第二节 兰花的组织培养技术兰花系兰科(Orchidaceae)植物，在自然条件下主要靠分株繁殖，繁殖率一年只有几倍，所以无法大量繁殖生产，而且由于长期进行无性繁殖，带病毒株增多，逐渐使种性降低，影响生长。
法国Morel(1952年)等以大丽花茎尖进行培养试验，得到了无病毒植株。后来他观察到虎头兰的茎尖在无菌钓培养基上能形成扁圆形的小球体，这些小球体与种胚发育成的原球体非常相似，故称为原球茎。原球茎增殖很快，并可形成幼苗。这一方法和技术很快在兰花生产上得到了广泛的应用，成为常规的兰花繁殖方法。以后在不少国家和地区发展成为"兰花工业"。目前已有66个属几百种兰花可以用组织培养的方法来繁殖。
兰花培养成功的关键，首先是形成无性繁殖系原球茎。
一、培养部位大多数植物根、茎、叶和花器等各个部位都能培养成功。而兰科植物可以培养的部位主要是顶芽和侧芽，一部分种类可以采用隐芽等休眠芽，个别可从叶片培养得植株，各属适宜培养的部位也有区别。
1.新芽的茎尖茎尖是细胞分裂最旺盛的部分，也是培养成功率最高的部位，但需要较高的分离技术。
2.休眠芽在顶芽失去发芽力时它能发芽。其芽裸露，故分离技术简单，但易污染，所以要注意灭菌。
3.茎的隐芽茎的隐芽是较难分离的芽，其成活率与休眠芽差不多。
4.花梗当兰花开花约一个月后，剪取其花梗顶端及若干个花梗腋芽，切成2～3cm长的切段，每段带一腋芽，基部向下插于培养基中。
二、茎尖的选取、灭菌和接种
1.芽的准备和灭菌正在生长中的芽是最理想的培养采集物，一般取2～6，m大小切取下来，上面包括有数个隐芽和生长芽，生长芽是培养成功率最高的部位，休眠芽剥起来较困难，生长也较慢。切下后，先充分用流水冲洗，并把最外面的1~2片苞叶去掉，再用10％次氯酸钠或漂白粉溶液(10g漂白粉溶解于140ml水中，充分搅拌匀后，静置之约20min，取上清液)中浸10~15min。灭菌的时间和灭菌的浓度应根据芽的大小和成熟度用不同种属进行调整。
灭菌后的芽应放在无菌条件下进行剥离和切割，卡特兰类容易产生褐变，在切割时应将芽放在无菌水中操作，这样会比在空气中褐变的机会少些。以消除病毒为目的时要尽量小些，可以小到0.1mm：若以繁殖为目的，培养物可在2~5mm左右。大体积的剥离可以肉眼直接操作，太小时需要在解剖镜下才能看清。
2.接种
茎尖接种以固体培养基为好，但因属而异，如蕙兰属在培养基培养形成原球茎，以后则用固体培养基进行继代培养，而卡德兰属和石斛属这一类易变褐枯死的属，以在液体培养基为好。
3.继代培养接种后1~2个月培养的茎尖即可形成原球茎球状体，以后即发芽生根长叶。应在其发芽前把它切成小块进行转移，让它继续不断地形成原球茎球状体。这样连续的进行继代培养，短时间可以得到大量的原球茎球状体，方法是从培养基中取出原球茎球状体，在灭过菌的培养皿内，用灭过菌的解剖刀将其切成小块，再接种到培养基中。
4.培养基和培养条件在兰花茎尖培养中，要求有四种培养基：
(1)适于形成原球茎的初代培养基 是从芽上剥出的生长点直接接种用的培养基，对于许多兰花来说，MS培养基最好。另外KnudsonC(KC)培养基也不错。
(2)适于繁殖原球茎的继代培养基 虎头兰用KC+10％椰乳的液体培养基，在KC+NAAl+Kt0．01固体培养基也有较好的结果。卡特兰可用MS+NAAl+BA5。
(3)适于原球茎分化的培养基 一般来讲原球茎分化苗是比较容易的，通常用基本培养基培养，就能分化幼苗和根。
KnudsonC培养基配方：
磷酸二氢钾0.25g(以下单位相同)、硝酸钾1、硫酸铵0.5。
培养条件为光照12h，保持22℃的温度。
5.液体振荡培养采用旋转振荡机进行液体振荡培养，保持22℃的恒温，24h连续照明，可得到大量的原球茎球状体。应用这个方法，有利于大量繁殖原球茎球状体。液体培养一天进行2~3次振荡就可解决氧和营养的供应问题，也可达到使组织极性消失的目的。用1~2次／分的自动振荡，累计1天达几个小时。
振荡旋转形成的原球茎球状体的凹面少，多成为近圆形的组织块。故旋转不要太快为好。
从液体培养基往固体培养基的转移，因由液体培养基形成的原球茎状体体积较大，可切成10块以上的小块转移到固体培养基，繁殖形成茎叶和根。以后由于长出的幼苗较多，发育不良，可在茎叶5~10mm长时从试管内取出，在培养皿内将苗分开。再进行培养，可得到整齐优良的苗。
6.试管苗的移栽试管苗有3~4叶大小(因种类而异，兰属高5~8cm)，根2~3条时可移植，种植要求与实生苗相同。
(1)从试管内取的苗用水将琼脂冲洗掉(苗大难冲洗时，可将水冲人试管内)，水冲洗不彻底会发生霉菌腐烂。
(2)经水冲洗的苗放在旧报上，吸干水分阴晾1h再定植。
(3)管理上，温室控制在50％的弱光，温度20~25℃，保持一定的湿度，不能完全密闭，也要注意通风。根在开始生长后可1周浇一次1000倍的合肥料。
第三节 兰科植物主要属的培养一、卡德兰属的培养
1.材料的准备和灭菌新芽选择5~10cm长，可从基部采芽。先在流水中冲洗，以后切去叶片再行消毒。消毒剂可采用酒精，漂白粉等。
采芽方法是侧芽在除掉1~2个叶后，在节的下面横切，再在叶的两侧纵切，最后再从芽的后面茎1mm深处薄薄切取。顶芽是留一片叶子，余皆除去，再从顶部往下四面进行纵切，最后切1mm3大小。切下的茎尖放在灭菌的培养皿内的滤纸上，接着再接种到液体培养基中。
采用MS培养基，蔗糖浓度为2％，添加NAA0．1、CMl0％，pH值调整在5.5，速度为2r／min的液体旋转培养。
2.培养条件和继代培养培养的温度，以在15～20℃为好，这样排出的变褐物质少，成活率高，成活以后，则以保持在25℃的恒温以生长好。光照强度以500-2000Lx为好，每天照明16~22h。将采后经2个月液体旋转培养产生的纵切为4，再继代培养，接种的培养基，除基本盐类，还有维生素，氨基酸，NAA0．186ml／L，Kt0．02ml／L，GA30．173ml／L，蔗糖30g／L，琼脂6g／L，不加CM。经营1~2个月所有的球茎球状体可发根。在KC培养基加20g／L的蔗糖发根就慢。长期的液体培养，也会引起材料的变黑、枯死，所以对繁殖不一定有利。
3.防止培养材料变褐用各种方法防止从茎尖到形成原球茎球状体中组织的变褐，是培养能否成功的一个关键。
变褐是由于伤口的多酚氧化酶氧化所致。同时这种物质很快在培养基中扩散，使整个组织变褐枯死。现在还没有防止变褐枯死的方法，但采用下列处理对防止褐变有一定的效果。
(1)采芽后，用无菌水冲洗再接种。
(2)在培养基中加(50～100)x10-6变褐防止剂芸香甙。
(3)开始培养到成活，保持温度15~20℃。
(4)调整培养基的合适pH值。pH值4.5~5.0时排出的变褐物质最多，而pH值5．5时就少，成活率就高。
(5)6～8月采芽，由于排出褐化物质多，成活率也就低。
二、蝶兰属(Phalaenopsis)的培养
1.尖的培养
(1)将芽除去叶后，用水冲洗，再用10％的漂白粉表面灭菌15min。除去叶原基后，用5％的漂白粉中灭菌l0min，以后用无菌水冲洗3~5次。
(2)切取茎尖和各叶基部的腋芽，约2~3mm大小，用小刀切取后直接接种到培养基中。
(3)培养基采用Vacin和Went培养基，添加15％CM进行液体培养，或加9g／L的琼脂进行固体培养皆可。
(4)培养条件为温度25℃，光照强度2000Lx，照明16~24h。液体培养基用60r／min的速度进行振荡培养，培养7~10d再转移到新的培养基，培养1个月后转移到固体培养基。在这种条件下培养1个月即可形成原球茎球状体，以后再进行继代培养，不断繁殖原球茎球状体。
2.花梗腋芽的培养
(1)采芽 将带腋芽的花梗进行冲洗，用10％的漂白粉溶液表面灭菌20min，除去腋芽的苞叶，再在5％的漂白粉溶液中表面灭菌3min，无菌水冲洗净。经过灭菌的材料放在培养皿内的滤纸上保存，这样可减少操作转移时空气的污染。
(2)不带花梗组织，仅取腋芽，接种到培养基上。
(3)培养基和培养条件，禾芽用德兰属1号培养基为好，原球茎球状体的繁殖也用采芽所用的培养基；育苗用卡德兰属1号加10％香蕉汁为好，育出的苗鲜重可比不加的重3倍。培养条件是光照强度2000Lx，光照时间每天13h，保持恒温25℃。
(4)继代培养，用原球茎球状体繁殖，用培养基进行数代继代培养，不能中止。也不会白化，继代培养时不要切得太小。
(5)育苗，不切成小块继续培养就分化产生叶片，发根前分切移到育苗的培养基，3~6个月可得到能栽植的苗。
3.片的培养从开花植株叶片的培养产生原球茎球状体，这个方法最有希望，但目前较为困难。这首先要从花梗腋芽培养得到植株，再从其切取叶片培养。
(1)培养准备和接种，采开花或开花后的花梗，表面灭菌后切成约4cm长，除去各节的叶接种到培养基上。
(2)培养基和培养条件，用Vacin和Went(1949)培养基，添加CM20％，蔗糖2％，琼脂1％，也可不用CM，而加BA5.0温度28℃，20℃的低温花芽伸长，芽多。光照度500Lx，日照16h。芽不长时，可转移到加BA的培养基，可再生带营养芽的植株。
(3)叶片是从试管内培养的材料上切取，故不必要再灭菌。用 Kyoto改良培养基，加复合肥料3．5g／L、肌醇1000、烟酸1、维生素B11、NAAl、腺嘌呤10、BAl0、蔗糖2％、琼脂1.0％。
(4)叶片的切取培养，切取展开叶最上部先端、中央或基部约6~8mm2大小，接种到培养基上。培养条件为25℃恒温，光照度500Lx，照明16h。
(5)继代培养，为繁殖原球茎球状体，用改良的Kyoto培养基进行继代培养，或在Vacin和Went培养基中去掉蔗糖和琼脂，加20％的CM的液体培养基进行振荡培养。
(6)育苗用培养基和育苗方法，育苗可在简单的培养基进行静置培养。原球茎球状体2~3个月即可萌芽，形成叶，以后转移到Kyoto培养基，加10％的香蕉汁，经数月后可得到能移至外面的大苗。
第四节 兰花种子的无菌发芽培养一、培养意义兰花的种子极小，一个朔果中有1300~400000粒种子。薄薄的种皮包着分化不完全的胚，没有胚乳，所以与其他植物种子不同，很不容易发芽。美国康乃尔大学的Knudson采用无机盐、糖、琼脂和水配制的人工合成培养基，成功地进行了兰花种子发芽。这样，弄清了兰花种子发芽的机制，所谓共生发芽的问题，是由于兰花种子发育不完全，要凭共生才能得到发芽所需的养分，而人工提供其所需养分时也就同样可达到促进发芽的目的。
无菌发芽的成功，在实践上有很大的价值。因兰花有性杂交很容易，所以通过无菌发芽培养，简化了发芽育种技术，也就促进了兰花的杂交育种工作。以后又有许多关于培养基无机盐种类和组合，糖的种类和浓度，维生素、激素和天然复合物的作用、适宜的 pH值等的研究，所以也就产生了各种各样的培养基。
二、材料的准备和灭菌从朔果中取出种子来培养，与胚培养不同，只对种子进行表面灭菌，因此要防止杂菌进入种子。
通常兰花种子从授粉到受精完成要60～90d，朔果成熟到裂开要6个月至1年以上的时间，裂开前为采种的适期，但此时水分易进入，易感染细菌和霉菌，快开裂时可用纸包好，在干燥器内开裂，这样较保险。也可在干燥器内保存，再放到冷藏室，这样兰花种子保存5~6年还具有发芽力。
兰花成熟的种子要经过灭菌才能接种，一般采用漂白粉作为灭菌剂。漂白粉10g溶解在40ml蒸馏水中，振荡后静置15min，取±面的澄清液供灭菌用。因兰花的种类不同有的会产生危害作用，同一种类种子成熟强度不同也有区别。
一般来讲漂白粉对蝶兰属、万带兰属、仙人指甲兰属等单茎性种太弱，因此应采用3％H202和200倍的鸟斯普龙液灭菌。
三、培养基自Knudson无菌发芽成功以后，在应用中关于发芽用的培养基也产生了不少。兰花不同的种、属，乃至同一种内种子的情况不同及发芽生长过程中对营养的要求也有区别，因此设计出完全符合不同种类、不同发育阶段要求的培养基是困难的，通常在培养基中添加复合有机物，对种子发芽和幼苗的生长有较好的作用。
陈种子与新种子相比，更需一些特殊物质，如维生素类的烟酸对发芽有作用，特别是万带兰属、蝶兰属、石斛属等这方面的要求更突出。
1.Knudson C
Ca(NO3)2·4H20 1．000g (NH4)2S04 0．500g
MgSO4·H20 0．250g KH2PO4 0．250g
FeSO4·H20 0．025g MnSO4·4H20 0．0075g
蔗糖 20．00g 琼脂 15．00g
蒸馏水 1000ml
pH值5.0
2.Vacin和Went
Ca3(P04)2 0．200g KN03 0．525g
KH2P04 0．250g MnSO4·7H20 0．250g
(NH4)2SO4 0．500g Fe2(C4H4O6)3·2H20 0．025g
MnS04·4H20 0．0075g 蔗糖 20．00g
琼脂 16．00g 蒸馏水
pH值5.0~5.2
四、接种培养兰花种子在漂白粉溶液中浸泡消毒20min。以后用无菌吸管吸取消毒瓶底部少量种子，置于播种瓶内的培养基上，大约每瓶滴人2~3滴即可，滴人时应注意分散均匀。接种后，应将瓶拿起轻轻倒转，使种子在培养基上分布均匀。
接种后置于20~25℃的培养室内培养。由于发芽培养，生长量大，故当培养基干燥时，应加入无菌水，要注意无菌操作，防止污染。接种后10~14d种开始膨胀，6周内种子转绿，以后发育为原球茎，长出很多须根，约培养2~3个月可产生第一片叶，接着出现第2~3片叶，也产生第一条小根，完整植株形成，不断长大，9~10月小苗可移栽。
复习思考题
(1)百合的生物学特性怎样?怎样用鳞茎进行组织培养?
(2)兰科植物培养过程包括哪几个环节?
(3)卡德兰怎样组织培养?
(4)蝶兰怎样用花梗组织培养方法繁殖?
第十一章 水果作物的组织培养目的要求：
（1） 掌握草莓微茎尖培养的大致过程，掌握鉴定草莓无毒病苗的方法；
（2） 掌握培养苹果无毒苗的方法；
（3） 掌握苹果树形特点；
（4） 掌握葡萄的茎尖培养过程。
第一节 草莓的组织培养一、形态特性和生物学特性
草莓为重要的浆果植物，栽培分布很广，其总产量在浆果类中仅次于葡萄，居世界第二位。草莓果实柔软多汁，含丰富的糖、酸、矿物质，维生素等。草莓可鲜食，也可加工成果酱，果酒等。其颜色鲜艳，是良好的配餐食品。
草莓繁殖容易，结果早，收效快。尤其是近年的促成栽培，利用塑料大棚、日光温室，使草莓的成熟期大大缩短，从11月份到次年的6月份，都有新鲜的草莓上市，填补了水果的淡季市场。
1,形态特性草莓（Fragaria）属多年生草本植物，植株矮小，呈半平卧丛状生长，根系属须根系，在土壤中分布较浅。草莓的茎呈短缩状，分地上和地下部分，地上短缩茎节间极短，节密集，其上密集轮生叶片，叶腋部位着生腋芽。地下短缩茎为多年生，是贮藏营养物质的器官，也可发育成不定根。匍匐茎是草莓的特殊地上茎，是其营养繁殖器官，茎细，节间长，一般座果后期发生。叶属于基生三出复叶，呈螺旋状排列，在当年生新茎上总叶柄部与新茎连接部分，有两片托叶顶端膨大，圆锥形且肉质化。离生雄蕊20~35枚。雌蕊离生，呈螺旋状排列在花托上，数目从60~600不等。花序为二歧聚伞花序至多歧聚伞花序。果实为假果，主要是花托膨大肉质化形成，瘦果以聚合果形成生于花托上。果实成熟时果肉红色，粉红色或白色。
2,生物学习性草莓根系在土壤温度达到2℃时开始活动，在10℃时开始形成新根，根系生长的最适温度为15~20℃，秋季温度降低到7~8℃时生长减弱。春季气温达5℃时植株开始萌芽，茎叶开始生长。草莓是喜光植物但又比较耐阴。光照充足，植物生长旺盛，叶片颜色深，花芽发育好，能获得较高的产量。相反光照不良，植株生长势弱，叶柄及花序柄细。叶片色浅，花朵小，果实小，着色不良。草莓的根系分布较浅，加上植株矮小，叶片较大，因此蒸发量大。在整个生长季节，叶片几乎都在不断地进行老叶死亡、新叶发生的过程，叶片更新频繁。这些特点，决定了草莓对水分要求较高，但在不同的生长发育时期，对水分的要求不同。开花期土壤的含水量应不低于最大田间持水量的70%。果实膨大及成熟期土壤含水量应不低于80%，而秋季9，10月份，土壤持水量达60%即可，草莓不耐涝，要求土壤既有充足的水分供应，又要有良好的通气条件。草莓对土壤适应性强，在各种土壤上都能生长。但由于是浅根性作物，要求肥沃、疏松、透水、通气的中性微酸性或微碱性土壤。
二、栽培方法在自然条件下，草莓用匍匐茎分株法繁殖，这种方法繁殖系数高，保持了母本的优良性状。在繁殖囿设1m宽行距，50~60cm株距定植，从5月到9月均可繁殖。囿内保证肥水供应，保持土壤湿润、疏松，减少结果量。匍匐茎发生后，将其向母株四周拉开，排列均匀，并在偶数节上压土促发根系，每条匍匐茎上可形成3~5个壮实的子幼苗，待茎苗长到3~4片叶时可以移出，作为定植苗用。移出时每株小苗靠母株一侧的匍匐茎留2cm长剪断。起出的苗可进行假植，假植宽度以15×15cm为宜，假植深度以根和叶柄分界线埋入土壤1cm为宜，假植后要做好管理工作。
三、草莓脱毒苗的培养
1.热处理脱毒将草莓植株在40~41℃温度下处理4~6周，然后取微茎尖培养。
2,微茎尖脱毒
(1) 初代培养 取草莓生长健壮的母株或匍匐茎上的顶芽，用自来水流水冲洗2~4h，然后剥去外层叶片，在无菌条件下，用0.5%次氯酸钠溶液表面消毒5min，并不停地搅动促进药液的渗透。在无菌条件和解剖显微镜下剥取茎尖分生组织，以带有一个叶原基的茎尖为度。0.2mm的茎尖无病毒率可达到100%，但接种后的成活率下降，并延长培养时间。茎尖分离后，迅速接入MS+BA0.25+NNAA0.25或White+IAA0.1培养基中。培养条件为22~25℃，日照16~18h光强3000lx。经2~3个月的培养，可生长分化出芽丛，一般每簇芽丛含20~30个小芽为适。注意在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠，所以较高的温度和充足的光照时间必须保证。
(2) 继代培养 把芽丛割成芽丛小块，转入MS培养基中，令其长大，以利分株，待苗长大到 1~2cm时，可将芽丛小块分成单株，再转入前述的分化培养基中，又会重复上述过程，达到扩大繁殖的目的。
(3) 生根培养 在培养基中加入NAA1或IBA1，使发根整齐，
由于草莓地下部分生长加快，发根力较强，也可将具有两片以上正常叶的新茎从试管中取出进行试管外生根。
(4) 驯化 用镊子把草莓苗从试管瓶中取出，洗掉根系附带琼脂培养基。事先备好8×8cm或6×6cm的塑料营养钵，内装等量的腐殖土和河砂。栽前压实，浇透水，用足签在钵中央打一小孔，将试管苗插入其中，压实苗基部周围基质，栽后轻浇薄水，以利幼苗基部和基质密合。
栽后的试管苗要培养在湿度较大的空间内，一般加设小拱棚保湿，并经常浇水，以增加棚内湿度，以见到塑料薄膜内表面分布均匀的小水珠为宜。约过7~10d后。当检查有一定的根系生出，可逐渐降低湿度和土壤含水量，进入正常幼苗的生长发育管理阶段。
3．花药培养花药培养操作简单，因经愈伤组织途径，再分化得到的即为无病毒苗，所以可免去病毒鉴定工作。
（1） 取材与培养取花粉发育单核期的花蕾，置于洁净培养皿中，内放一层滤纸，
滴蒸馏水数滴保湿。将处理放入3~4℃冰箱中低温保存3~4d。经预处理的花蕾先在70%酒精中浸泡半分钟，取出放入新配制的饱和漂白粉上清夜中消毒10min，用无菌水冲洗3次。然后在超净工作台上剥取花药，立即接种。花粉发育时期可采用醋酸洋红压片鉴定，培养基为MS+2，4-D0.4+IAA2。去分化阶段培养条件为24~26℃，10h/d，1500lx,20d后可产生乳白色的愈伤组织。
（2） 植株分化将诱导出的花药愈伤组织转移1/2A基本培养基，添加GA0.5，
BA0.5和三十烷醇4。愈伤组织经培养后很快转绿，以后微带淡紫红色，15d后在表面分化出半球形小突起，转为绿色。20d后分化出幼叶、幼茎，并有不少突起物，以后陆续分化出新梢。
四、草莓无病毒苗的鉴定草莓花药培养得到的为无病毒苗，而用生长点培养得到的植株，则必须经过病毒鉴定，确定其不带病毒，才可以大量繁殖，用于生产。
1,草莓病毒的种类草莓病毒主要有四种，为斑驳病毒，皱叶病毒，脉结病毒和轻型黄边病毒。斑驳病毒在EMC指示植物上表现不整齐的黄色小斑点；皱叶病毒在指示植物UC-1上产生不整齐的小斑点，以及不整齐的叶脉，叶柄暗褐色；脉结病毒在指示植物EMC上表现小叶向后反转成风车状，尖端卷曲，叶脉呈带状褪绿；轻型黄边病毒对EMC指示植物产生红叶，数日即枯。
2,草莓病毒的鉴定方法因草莓的病毒在通过汁液接种不感染，所以通常采用小叶嫁接法来进行鉴定。
首先从被鉴定的草莓采集长成不久的新叶，除去两边的小叶，中央的小叶带1~1.5cm的叶柄，把它削成楔形作接穗。而指示植物则除去中间的小叶，在叶柄的中央用刀切入1~1.5cm，再插入接穗，用线把接合部位包扎好。为了防止干燥，在接合部位涂上少量的凡士林。为保证成活，在2周内，可罩上塑料袋，置于半见光的场所。约经2周时间，撤去塑料袋。若带有病毒，嫁接后1~2个月，在新展开的叶、匍匐茎或老叶上会出现病症。
五、草莓无病毒苗的繁殖和利用
1,防止蚜虫的危害草莓无病毒苗的繁殖重要的是要防止无病毒苗的再度污染。由于草莓病毒主要是蚜虫传播的，所以要搞好防蚜虫工作。传播草莓病毒的主要有草莓茎蚜、桃蚜和棉蚜。其中分布最广泛的是草莓茎蚜，身体着生有钉状的毛，可以寄生寄主的全株各个部位上。草莓病毒通过蚜虫吸吮汁液而得到传播，短时间即可完成。防治时可使用马拉松乳剂，氧化乐果乳剂等接触杀虫剂，防治期5~6月，9~10月，特别是9~10月一次，可防止蚜虫的越冬。
为保证种苗的无病毒，在原种种苗生产阶段，应在隔离网室中进行。传播草莓病毒的蚜虫较小，可以通过大于1mm网眼，故应采用0.4~0.5mm大小的规格，其中以300号防虫网为好。
2．繁殖程序及提高繁殖率的措施草莓无病毒苗的繁殖程序可分五步，包括：脱病毒鉴定生产出无毒苗、原种种苗培养、原种种苗繁殖、良种种苗繁殖，生产用苗繁殖和栽培苗繁殖，前四步在隔离室中进行，后一步在露地进行。为提高无病毒母株的繁殖株数可采用赤霉素处理和摘蕾的方法。赤霉素处理用5×10-6的浓度，在5月上旬和6月上旬分两次进行。摘蕾可减轻母株的营养负担，促进匍匐茎的大量发生，田间地每一株可繁殖150~200株。
3,生产管理工作母株必须保证每株有大于3.3m2的营养面积。再是注意匍匐茎排列位置，不要交措重叠，这不利采苗，采苗也要适时进行。无论秋季或春季种植，繁殖床必须要进行土壤消毒，小面积可用蒸气剂料盒消毒，防治草莓萎缩病、根腐病、萎凋病等的发生。
隔离繁殖囿通常施缓放性肥料，每公亩用3ton；为促使匍匐茎发生，要经常灌水。
第二节 苹果的组织培养一、形态特性和生物学特性
1.形态特性苹果（Malus pumila）属落叶乔木，树木高大，生长势强，枝条多直立生长，幼叶和枝上有毛，花淡红或淡紫红色，边缘色泽较深。大多数品种自花不孕，果实由子房和花托两部分组成，果实呈圆、长圆等形状，果皮绿色或红色等。
2,生物学特性：
年平均温度在7~14℃的地区均可栽培，春季8℃左右开始生长，平均气温18~24℃较为适合。年降雨量600~800mm即可基本满足苹果生长的需要。苹果是喜光植物，需全日照在2200~2800h，可满足其对生长的需要。苹果需要土层深厚，透气性好，保肥力较强，富含有机质，排水良好的沙壤土和砾质壤土。此外苹果喜微酸性到中性土壤，ph值4.0以下生长不良，ph值7.8以上则易发生失绿等缺素症状。
二、苹果的花粉培养
（1）选取小孢子处于单核期的花蕾。小孢子单核期的花芽外部形态特征是：花芽已充分开放，有4~5片叶完全展开，中心花蕾吐红，周围花蕾明显增大，但花序尚未分离。
（2）把花蕾插入水中，放在1~3 ℃的冰箱上预处理。
（3）取花蕾在70%的酒精浸约0.5min，再在10%漂白粉上清夜中浸15~20min，无菌水冲洗3~5次。
（4）胚状体的诱导。从花蕾中取出花药，接种到MS+2,4－D0.4+KT0.2+IAA4+3~8%蔗糖的固体培养基上培养，每瓶30~50个花药。在25~30℃下培养70d后，由变褐的花药裂口处开始产生胚状体。
（5）无根苗的诱导。把产生胚状体的花药接种到MS+IBA0.5+GA30.1+BA1+3~5%蔗糖的固体培养基上培养，在25~30℃和光照10h下，约经40~100d以上，胚状体可形成次生胚状体或丛生芽，进而发育成无根苗。
（6）根系的诱导。切取无根苗，转接到1/2MS+IAA1.5+15~2%蔗糖的固体培养基上培养。约经15~20d，小苗茎基部长出根，形成完整植株。也可用50~100mg/L IBA溶液浸泡苗梢基部15~30min，再插入无生长素的培养基上，也能较顺利地诱导生根。
（7）花粉植株的移栽。在春、秋季进行，保持15~20℃和高空气湿度，一般可使成活率达到40%以上。
（8）对有些不易生根和提早开花的植株，可用嫁接法进行繁殖。
三、苹果的茎尖培养
（1）从健壮母株上，选取带芽或茎尖的茎段，先用70%~75%的酒精浸30~60s，再用10%的次氯酸钠溶液浸泡10~15min，或用0.1%升汞液浸5~7min，最后用无菌水洗3~5次。
（2）剥取茎尖材料接种。为了培养无病毒苗，取的茎尖材料应小，一般为0.1~0.2mm。为了加速无病毒材料的繁殖，应切取较大的茎尖，约0.3~0.5mm大小，甚至带芽的较大茎段，茎尖的大小同培养的难易有关，大的分化率高，分化速度快。所以除了特殊的目的外，宁肯用较大的茎尖。
（3）把茎尖接种在MS或LS+BA2+300~500CH或LH+3%蔗糖的培养基上，诱导芽的分化。在25~30℃和光照下，先培养7~10d，见茎尖膨大转绿，再培养在黑暗中，可加快分化和绿化苗的生长。一般在暗培养中增殖2~3代。随后要转入光照下,以使苗生长健壮。光强以1500~2000lx为宜。
（4）把伸长的芽接种到MS+BA0.5~1+CH300培养基上，这时苗会长大并产生丛生苗。每4~8周可分别繁殖一次，每个月约可增殖5~10倍。
（5）切取2cm以上的带顶芽的苗切段，插入1/2MS或其他低盐培养基（如White和Nitsh）中，附加IAA1、IBA0.2和GA33，可有效地促进生根。
对生根困难的苹果砧木M9的试管苗生根，以先接种在含有IBA2、162mg/L根皮酚的LS培养基上，培养4~7d后，转入无激素的LS培养基，生根快而频率高。
（6）苹果的试管苗也可以不进行生根，而直接嫁接到苹果矮化砧木上，既可保持树体有良好的矮化特性，又可通过采用无病毒繁殖材料妥善地解决无病毒繁殖问题。
（7）生根苗移出进行砂培2~3周，最后移到土壤中，其成活率可达26.7%~56.9%。
四、胚的培养
（1）幼胚培养一般在授粉后30~50d内取幼果，因这时种子内的胚已开始发育，较易培养成功。成熟胚培养取自处于成熟期果实的种子。胚培养的材料只需进行表面消毒，一般用70%酒精擦拭即可。
（2）切开果实，取出种子，剥出幼胚或成熟胚，接种在BA0.25+IAA0.5的1/2MS培养基上。培养条件为25~30℃和1500~2000lx光照14h。
（3）分化增值时，把苗切段移植到加有BA0.5~1.0和CH300的1/2MS培养基上,在光下培养，可使绿苗得到增殖和生长。
（4）苗的生根或嫁接和移栽方法，同茎尖培养。
五、栽培管理
1．育苗苹果育苗主要通过嫁接，需进行砧木和接穗的选育等过程，这里就不再介绍，可翻阅有关书籍。
2．土壤管理土壤要求深翻，以创造苹果根系生长的有利因素。翻时，表土与底土分别放，填土时，表土放在底层，底土放在上层，翻时最好结合加施有机质肥料、或混施肥料。注意不要伤粗根（直径1cm以上），还要避免暴露时间太久，防止日晒或冻伤。
填土后注意湿度，土干要灌水，雨季注意排水，以免水泡伤根。
3．施肥时期和方法
（1）基肥 主要是迟效性肥料，能较长期的供应苹果吸收。施肥时期，结果树一般在苹果采收后，秋、冬季生长高峰来到之时，即8月下旬到9月，最好在秋稍停长后即进行。基肥以环状施肥法为主。
（2） 追肥 应根据一年生长物候期的需要及时补给速效性肥料，以调节生长与结果的关系，也为下年打好开花、结果的基础。追肥一般分为以下几次：开花前追肥、花后追肥和秋季稍停止生长后追肥。追肥用放射状沟施。
（3）根外追肥 也叫叶面喷肥，如一株20年生的苹果树，根部施肥用尿素2.5kg，根外追肥一般只要100~200g。根外追肥比根部追肥效果快，如用氯化钾进行根外追肥30s后在叶片内就有钾的成分存在，一般2h后即可被吸收利用。根外追肥，还可以同防治病虫害喷药相结合，可以节省劳力，且简单易行。
根外追肥，最好是在较为湿润和无风的天气进行，以早晨露水未干或傍晚时进行较好。干燥多风的情况下，水分蒸发快，浓度容易升高，往往引起药害。
4．灌溉和排水苹果的需水临界期是在春末夏初新梢迅速生长、叶幕大量形成时。此时正是我国主要苹果产区的干旱季节。当土壤含水量少于土壤田间最大持水量的60%~80%时，就需要灌水。为了防止果园的冬旱，在苹果落叶土壤封冻时，要灌封冻水，以提高果树的抗寒越冬能力。目前苹果园多采用喷灌、滴灌或渗灌等方法。
5．疏花疏果，调整负载量
达到结果期的苹果树，以及进入盛果期的苹果树要促进形成花芽。有了花芽，还要千方百计的保花保果，既要开花良好，又要座果率高。若座果过多，须进行疏花、疏果来调整负载量。
疏花疏果的基本理论依据是叶果比。国际上公认的苹果叶果比约为30~40:1。疏花疏果可采用手工和化学疏花疏果等方法。
6．整形技术现在通用疏散分层形，其主要的结构为：
（1）主干，一般高50~70cm。
（2）全树有主枝5~6或7个。第一层3个主枝邻接或临近，相距在20~40cm之内，在1~2年之内选定。主枝的开张角在60~70度。第二层1~2个主枝，第三层2个主枝（三杈枝落头）。
（3）层间距，第一层主枝（基部3个主枝）距第二层主枝层间距80~100或120cm。2~3层的间距可50~60或70cm。
（4）侧枝，基部3个主枝各有侧枝2~4个，上层主枝各有侧枝1~3个。
（5）树高，中心干全长2~2.5m。树高在4~5m，冠径5~6或7m。从1年生苗定植算起，平均每年留成一个主枝。到落头完毕，约13~15年定形。
7．修剪技术可分为休眠期修剪（冬剪）和生长期修剪（夏剪）。这里主要介绍前者。
冬季修剪在调节生长与结果矛盾中所要达到的主要作用：一是促使一部分枝条加强生长，恢复树势，延缓衰老：二是促使一部分枝条能形成花芽：三是有花芽的结果枝促使其结好果，提高质量。即在树冠中，合理的形成三类枝条，即生长枝、成花枝、结果枝。也就是为了克服大小年，使树冠内形成比例适当的三类枝。具体剪法和反应的主要趋势如下：
（1）苹果枝梢自然生长规律是一年比一年短。为了加强生长，对一年生枝在充实满芽部位中截，则有利于中截枝所发新梢的生长。
（2）直立封顶枝（大叶芽枝）能冒条旺长，枝、干所发生的徒长枝，都是自然更新现象，都有利于生长。
（3）回缩修剪多年生枝，缩剪到有向上的壮枝、壮芽处，起到更新复壮作用，有利于生长。
（4）树冠过于郁闭，适当疏剪外围枝，有利于通风透光，对整体生长与成花都有利。
（5）长放是有利于成花的剪法。新梢任其自然生长，必然按其本身生长发育规律，一年比一年短，因而停止生长早，有利于营养物质的积累，促进花芽分化，形成结果枝。
（6）打盲节，在春秋梢交界的瘪芽处短截，它的作用同长放相似。
（7）留橛，剪营养枝留短橛。短橛上留下的都是瘪芽，发出的新梢短，停止生长早，有利于形成花芽。
（8）剪掉封顶枝破顶芽。去掉封顶枝破顶芽使下面一些芽充实饱满程度相似，控制单轴延长生长，可以生成几个短枝，有利于形成花芽。
（9）改变直立枝的方位。拿枝，即修剪时把一年生强旺直立枝，距基部10cm处弯平。拿弯时，使有清脆折裂声，轻伤木质部，改变方位，有利于营养集中于形成花芽。此外，弯、拐、别、压等也起到同样作用。
（10）有花芽的多年生枝，要适当回缩，保留壮枝壮花芽。大年树的一些中长果枝，可破顶芽，减少花量，当年在形成花芽。
第三节 葡萄的组织培养一、形态特征和生物学习性葡萄（Vitis vinifera）在全世界的果品生产中，产量及栽培面积一直居于首位。其果实除作为鲜果食用外，主要用于酿酒，还可制成葡萄汁、葡萄干和罐头等加工品。葡萄不仅味美可口，而且营养价值较高。成熟的浆果中含有15%~25%的葡萄糖和果糖以及多种对人体有益的矿物质和维生素。
(1) 形态特性。葡萄属落叶木质藤本植物，葡萄地上部分的茎细长柔弱，髓部较大，组织较疏松。节上具有卷须，使新梢可以缠绕其他树木或支架上向上攀援。叶近圆型或卵型，3~5裂，基部心形。圆锥花序。
(2) 生物学习性：葡萄是深根性作物，其根系在土壤中的分布状况，随气候、土壤型、地下水位、栽培管理方法的不同而发生变化。但在大多数情况下，根系垂直分布最密集的范围，是在20~80cm的深度内，但在不同的栽培管理条件下，根系的分布也将随着发生变化。
葡萄的根富含肉质，髓射线发达，能贮藏大量的有机营养物质，如糖、蛋白质和单宁等。葡萄的枝蔓上很容易产生不定根，故在生产上多采用扦插法繁殖。在大气潮湿的情况下，枝蔓上往往长出气生根。
葡萄原产于温带地区，不太抗寒。葡萄的根系抗寒力很弱，大部分欧洲种葡萄的根系在－5~－7℃时即受冻，某些美洲种能忍受－11~－12℃左右的低温。
二、葡萄的组织培养
1.选材接种 从田间生长旺盛的葡萄新梢顶端取1~2㎝的茎尖。除去幼叶后在5%次氯酸钠溶液中浸泡2~3min，消毒灭菌，以后用无菌水冲洗3次，再在0.1%升汞溶液中浸泡约2min，以后用无菌水冲洗4次。在无菌条件下分离出约2㎜长的茎尖，接种到培养基上。
2.培养基 葡萄茎尖分化培养基以MS培养基（无机盐减半为好），再添加BA1~2，NAA0.01，LH100，蔗糖2%，琼脂0.6%，而B5培养基愈伤组织化严重，茎尖生长不好。
3.茎尖的分化 葡萄1~2㎜茎尖接种后成活率皆较高见表12-1，
接种成活的茎尖1个月左右开始分化幼叶和侧芽，2个月左右，由于侧芽的不断增生，形成芽丛。由于不同品种对BA和NAA的反应不同，故生长有明显区别，巨峰、大粒白香蕉、赤霞珠等品种，由于顶端优势强，侧芽生长势弱，故增殖率低，但成苗率高；白羽、白雅、白谢希、贵人香等大多数品种侧芽分生能力强，可在幼茎上多次分枝，故成苗率低；2号大白粒等个别品种，则幼茎短缩膨大呈球形，很难成苗。
4.茎尖苗的生长 在茎尖分化培养中产生的成苗率低和成苗困难，密集生长的芽丛，可将分化培养基中的BA浓度减低至0.5，同时添加GA30.2，则经1个月的培养，就可长成2~3㎝高的幼茎。此外黑暗处理对幼茎的伸成，提高成苗率，也有明显的效果。详见表12-2。
5、生根与移栽切取2~3cm的茎尖苗，接种到MS+IAA0.4+NAA0.05培养基中，进行生根培养，其中添加和琼脂0.4%，1~~2周后幼苗开始生根，1个月形成完整的根系，同时具备5~6片新叶，射干年根率一般在90%以上。
移栽时洗去根上的培养基，栽到蛭石基质内，使根系具有良好的通气条件，种后盖上塑料薄膜，经7~10d锻炼适应后可去掉，移栽成活率在90%左右。
提高葡萄试管苗移栽成活率要注意：1、幼苗生长要健壮；2、要保持空气湿度；3、根际通气良好；4、要尽量减少杂菌污染；5、浇灌的溶液浓度不能过高。
三、葡萄无病毒苗的培养葡萄受到26种病毒的危害。由于病毒的危害，葡萄的长势减弱，产量降低，果实的糖分含量减少，风味变劣。葡萄卷叶病是危害最大的病毒病，在不同品种上表现不同，但多数叶片变红，自基部起向内卷，似革质增厚，粗糙易脆；有的叶脉绿色，叶肉黄色；有的品种则表现矮化。此病可减产10~50%，造成果实糖分含量降低，成熟期推迟2周，紫葡萄果色变绿。
现在已广泛用茎尖组织培养和热处理结合的方法来培育葡萄无病毒苗。茎尖脱毒的方法也兼有短期大量繁殖的作用，所以应用上具有很大的意义。
1、热处理理脱毒热处理可以 有不同的方法：
( 1)葡萄无性系处理材料置于38℃，CO21200×10-6的人工空气侯箱内。经30min处理，较易从枝条尖端或休眠芽中除去扇叶病毒。卷叶病毒则处理3个月或更长时间也难以除去。黄点病毒处理11个月也无效。
(2) 将感染材料的修面芽插入健康指示植物的蔓中，然后在38
℃的环境中保持2个月，以后取出枝条和接种芽继续生长。
(3) 直接将葡萄蔓浸泡在50℃的 温水中10~20min，可以治疗皮尔斯病，但不能治疗黄点病及卷叶病。
2、组织培养脱毒技术茎尖组织培养脱毒要经过7个时期：A茎尖接种后的变绿增长期；B形成畸形叶期；C形成许多芽和芽的伸长期；D许多芽展开小叶伸长期；E诱导发跟期；F地上部和地下部的伸长期；G上盆期。茎尖脱毒培养各期生长见图12-1。
【【【【【【【【【【【】】】】】】】】】】】
(1) 茎尖接种后变绿、增大期的培养从被病毒感染的植株上取材，在5℃下冷藏保存。以后在25℃，
相对湿度80%，16h的长日照条件下水培。再从长出新芽经消毒后切取茎尖进行培养，大小约0.2~0.3mm（带一个叶原基）。
以MS培养基作基本培养基本能添加GA3，否则培养的茎尖大部分黄化，生成膨软的组织，一转移就完全损失。实验结果以1/2MS，添加NAA0.1，BA1.0，Kt0.5，腺嘌呤4.0，蔗糖30g/L，琼脂6.0，pH5.8为好。培养的茎尖成活率较低，仅13.3%，
(2) 从畸形叶和茎叶伸长期处于变绿、增大起的茎尖如继续在上述培养基进行继代培养。
不仅不生长，最后还会枯死。将原来培养基中的NAA0.1，改换为IAA0.2，采用1/2MS，添加IAA0.2，BA0.1，KT0.5，腺嘌呤4.0，蔗糖30g/L的培养基。则有34.1%的茎尖可生长到达畸形叶期。
在上述培养基对从畸形叶期到较多芽的形成及伸长期，同样是合适的，有76.7%的茎尖可生长到C期。从C期到茎叶伸长期（D期）则应将上述培养基中的BA和蔗糖浓度各降低一半，即采用1/2MS，添加IAA0.，BA0.，Kt0.，腺票呤，蔗糖15g/L的培养基。有94.4%茎尖的茎叶皆能很好的生长。
(3) 小叶展开到到上部分和地下部的生长期（从D期到F期）
为诱导生根，将2cm左右的芽切下，转入Galzy（1964）培养基，添加NAA0.1，经60d的生长，发根率可达到89.8以上，而地上部分也进行生长的只占10.2%。为促进地上部也同时进行生长，在诱根培养20d，根长0.5cm左右时转入无激素的Galzy(1964)培养基，，则有73.7%的植株地上和地下都可以同时生长，经1个月培养，地上都可达4~5cm，叶数可达5片左右。
(4) 上盆（G）期从培养瓶中取出苗时要注意绝对不要伤根，家昂琼脂冲洗掉，
以后种在以蛭石为基质，直径6cm的塑料钵中，栽培温度15~25℃，光照度为3000lx；光照时间为一天16h,相对湿度80%的锻炼室中进行。约培养20天，地上部开始伸长，发绿，则可移至通常的温室中进行隔离栽培。
(5) 无病毒苗的大量繁殖处于小叶展开期的材料，茎叶常集中在一起，成为丛状，可以一个个进行分离，再接种到1/2MS培养基上，添加IAA0.2，BA1，KT0.6，腺嘌呤4.0，蔗糖15g/L的培养基，即可使小叶展开、伸长，得到植株。这样反复继代培养，可繁殖得到大量的无病毒苗。
3、葡萄无病毒苗的鉴定和生产从组织培养得到的葡萄无病毒苗，要经过指示植物法等鉴定途径，确认无病毒存在，才可以繁殖生产，推广应用。
葡萄卷叶病毒尚无草本寄主。。常用芽接指示植物，品种有Baco、Mission和Ln-33，其中以Ln-33反应较灵敏，有的每株嫁接后当年秋天发病，而Mission需经4年才表现症状。Ln-33易繁殖，易嫁接，抗霜霉病，无自然感染的黄点病，嫁接后只表现温和症状，是现有的最好指示植物。葡萄黄点指示植物有Ln-33、Baco-22A、E sparte是最好的指示植物，春天嫁接，第二年秋天即出现症状。
经过鉴定确实无病毒，则应建立葡萄种苗库，由生产单位技术部门分工协作，进行系统的选育检验和生产见图12-2。
四、葡萄花粉（Pollen）的培养培养方法为取花粉单核靠边期的花药，该期的外部标志为花穗上密集的小花刚开始分离，而花穗上退化叶叶尖未变褐时进行接种。
【【【【【【】】】】】】缺图自田间取来的花穗先用自来水冲洗，以后在70%酒精中浸15s，再在饱和和漂白粉澄清液中消毒7min，无菌水冲洗3次后接种。以后暗培养，控温26±1℃。
诱导培养基为改良B5添加BA2，2，4-D0.5，蔗糖2%，琼脂0.6%。成苗培养为MS（大量元素减半），添加BA0.1，NAA（或IAA）0.01，蔗糖1%~2%，琼脂0.4%，PH值6.0。
花药接种后3d陆续变褐色（加活性炭的不变），接后12d可假案花药裂口处长出愈伤组织，20~30d为生长感旺盛期。产生的愈伤组织可按其颜色和质地分三类：甲类白色，质地紧密而脆，球形，表面有颗粒状突起；乙类白色，疏松，球形不规则，有些品种呈红色；丙类淡黄色，松软，甚至迅速，易老化。
五、子房（Ovaary）的培养葡萄的子房培养无论对葡萄基础生理研究和园艺方面的应用皆有一定意义。
（1） 分离培养。取开花前两天的花，经灭菌后，小心地去掉花冠和雄蕊，而不要伤害子房，用小刀将子房从基部切下，接种到Nitsch培养基上。培养室保温25℃，光照2500kx,每天照明12h。
（2） 有机添加物的作用。有机添加物对培养子房的发育皆有促进作用，依其作用大小依次为麦芽提取液、鲜葡萄汁、黄瓜汁和葡萄蔓汁。
（3）生长调节物质的作用。葡萄子房培养在添加有植物生长调节物质的培养基中，可促进单性生长，并在培养15周后在有些处理中可以观察到浆果变色的情况。
从培养子房的体积看，在基本培养基中添加有BA0.2的处理，要超过对照（无激素）。子房体积最大的为添加BA0.2、NAA0.2、GA31。
六、栽培管理
1,栽植前的土壤准备葡萄是深根性作物，必须在定植前对土壤进行深耕熟化与改良，为根系创造适宜的生长条件，才能使植株保持健壮和稳产，高产。在平地建立葡萄圆，一般采用大棚架栽培的情况时带壮栽植沟的深度为1m左右，宽度为1.5m左右，长度与行长相等。如土壤结构不好，则采用客土法或填入粗有机质加以改良。深翻一般在秋季进行，在土壤结冻前，将取出之土填入沟内，然后充分灌水，使土壤下沉，以2便与在次年春定植苗木。
2、栽植密度影响葡萄栽植密度的主要因素包括：气候、土肥大会条件、品种、架式和管理方法等。
以架式与整枝形式为例，架式与整枝形式一般棚架栽培要求的行距较大，而篱架栽培要求的行距较小。在行距超过4 m的情况下，为了更有效的利用行间的土地面积则以采用棚架栽培为有利。整枝形式与栽植密度有密切关系。大型整枝要求株行距要大，反之则较小。棚架龙干式整枝，往往是根据主蔓的数目确定株距。篱架上应用龙干式整枝，则根据龙干式的长度确定株距。篱架在采用大型农机具（如果收机、修剪机）、高主干整形的情况下，行距不能小于2.7~3m，在采用以手工劳动为主的情况下，行距还可适当缩小。
3、定植时期和方法我国北方各省一般以春植为主，当昼夜平均温度达到10℃左右时即可栽植。苗木自储藏室内取出后，最好在清水没浸泡1~2d，然后根据栽植深度以及苗木质量进行修剪，地上部剪留长度以栽植后地表上能露出2~3个节为度。栽植后露出地面的枝条需要用土覆盖，培土高出顶芽2~3cm即可。以防止春季早的风将枝条抽干。带芽眼膨大后，再逐步弄松或撤去浮土，如覆土浅而不板结，幼芽可自行拱出土面。
栽植深度一般多在30~40cm左右，在气候炎热而干旱，土壤为沙性时，或在严寒地区，为了减轻根系冻害，可适当深栽。
4、葡萄的架式、整形和修剪葡萄的架式主要可分为柱式架、篱架和棚架。整形主要有头状整枝、扇形整枝和龙干整枝。修剪方式可分为短梢修剪（结果母枝剪留1-4节），中梢修剪（5-7节），长梢修剪（8-15节）三者应协调组合，有条不紊。
（1） 架式 葡萄是多年生蔓性植物，，枝蔓细长而柔软，因而在栽培上须设立支架。葡萄的支架主要有柱式架、篱架、棚架三种类型。棚架是在垂直的立柱上架设横梁，横梁上牵引铁丝，形成一个水平或倾斜的棚面，葡萄枝蔓分布在棚面上，故称为棚架。这种架式在我国的历史最悠久，分布也很广泛，在平地及丘陵上都可采用。
（2） 整形 葡萄的整枝形式有头状、扇形及龙干形我们 主要介绍龙干整形中的"高宽垂"模式所谓高是指适当提高主干的高度（1-1.6cm）和棚架的高度（1.6
-1.9cm）。"宽"是指适当的加宽篱架的行距（3-3.6cm）."垂"是指架面的新梢不加引缚，任其自由下垂生长。
（3） 修剪 冬季修剪对结果母枝剪留的长度有：短梢修剪，
中梢修剪和长梢修剪。在采用中、长梢修剪时，为了控制结果部位的外移和保证每年获得质量较好的母枝，一般都采用双枝更新的修剪方法。即在中梢或长梢的下位留一个具有2个芽的预备枝，上发出的2个新梢，靠上位的仍按中、长梢进行修剪，下位的仍剪留2个芽作为预备枝。
短枝修剪2则不需另外留预备枝，短梢本身起到结果母枝和预备枝的双重作用。但在每年冬季修剪时仍应尽可能选留靠近主蔓的新梢作为短梢结果母枝，使结果部位不至外移。当枝组基轴过长时，宜及时利用下部潜伏芽发出的新梢进行回缩更新，使结果部位不致远离主蔓。
5、施肥方法基肥主要采用池内撒施或沟施，或两种方法交替使用。
(1) 池面撒施 棚架栽培的葡萄，为了便于灌水，在植株周围往往垒有池埂，池面宽1.5~~2.5m，长3m左右。施肥时将池内的表土取出15~~30cm厚的一层，以少伤根为原则。再将肥料均匀撒施于池内，然后将表土填回至地面高度。
(2) 沟施 在距根干50~100cm处挖条沟、轮状或放射状沟，棚架也可在架下与架后，每年轮流施肥，沟深宽各30~40cm，施入肥料后覆土。开沟的深度、宽度及与根干的距离，可根据根系分布的深浅及远近加以伸缩，以不大量伤根为原则。
6、灌水
葡萄在新梢迅速生长期和浆果迅速膨大期对水分的反应最为敏感。生长前期缺水，会造成新梢短、叶片和花序小、座果率降低，对当年产量有严重影响。在浆果迅速膨大初期 缺水，往往对浆果的继续膨大产生不良影响。即使过后有充足的水分供应，也难以浆果达到正常大小。在果实成熟期轻微缺水可影响浆果成熟和提高果汁中糖的浓度。但严重缺水则回延迟成熟。并使浆果颜色发暗，甚至引起日烧。浆果成熟期水分过多，常招致含糖量和品质降低。
灌水时期、次数和每次的灌水量应根据当地的具体情况，予以灵活掌握。一般可参考下列几个只要的时期进行灌水。
（1） 出土后至萌芽前灌一次水。这次灌水可促进植株萌芽整齐，有利于新勺早期的迅速生长。
（2） 花序出现至开花前灌水1~2次，可促进新梢、叶片迅速生长和花序的进一步分化与增大。
（3） 开花后至浆果着色以前，可根据降雨量的多少和土壤类型灌水2~3次。这一时期内进行灌水有利于浆果迅速膨大，对增产有显著效果。酿造及制干用品种，在采收前1~3周不宜灌水，以免降低浆果的含糖量。
（4） 防寒前灌一次封冻水，有利于减轻根系越冬冻害和减轻下一年早春的干旱。
7、采收鲜食用葡萄如采收过早，色泽与风味均差，而且会使产量受到损失，采收过迟会降低浆果的贮运性，一般在浆果接近或达到生理成熟时就应及时采收。
酿造用葡萄一般需要根据不同酒类所要求的含糖量进行采收。
（1） 采收方法采收时用手指捏住穗梗，用疏果剪留穗梗3~5cm左右剪断，随即放入果筐，送到果场分级包装。
（2） 包装远途运输的葡萄必须加以妥善包装，外销主要采用小型木箱或塑料箱，内径长40cm宽30cm，高13~15~cm，箱内四周上下均衬垫瓦棱纸板。纸板上留有通气孔，每穗葡萄先用一张蜡纸包好，逐穗放入箱内，最后加盖钉牢或缚牢。
七、葡萄的冬季防寒一般欧洲种葡萄的芽眼，在冬季只能忍受-16~~-18℃左右的低温，根系的抗寒力更低，一般在土温达到-5~-7℃时即发生冻害。因此，在我国北方大部分地区葡萄越冬时需要埋土防冻。
地上实埋防寒法。将枝蔓压倒顺着行向平放在地面上，用草绳捆成一束，然后直接用土覆盖，这是在华北、西北和东北南部地区广泛采用的方法。在比较寒冷的地区，可在枝蔓上先盖一层有机物，然后覆土，覆土时土块一定要打碎盖严，不使透风，取土部位尽可能离植株远些，以减轻根系冻害。
埋土防寒通常是在冬剪之后至土壤结冻以前进行，华北地区大致在11月上、中旬，东北中部地区在10月下旬。东北北部地区在10月中旬。
第四节 无花果的组织培养一,特性和生物学习性
1、形态特征无花果（Ficus carica）为桑科、无花果属的落小乔木，是一种亚热带果树，叶掌状3~`5裂，大而粗糙，背面被柔毛 。花单性，隐于囊状总花花托内，果实由总花托和其他花器官组成，呈扁圆状或卵形，成熟后顶端开裂，肉质柔软，味甜。具有观赏和药用兼备的价值。
2、生物学特性用无性繁殖法繁殖的无花果，通常于栽植后2~3年开始结果。6~`7
年进入盛果期。以后树冠不断扩大，产量逐渐增长，经济年限可延续40~70年。而在适宜的条件下起寿命可达百年以上。
无花果的生长势很强。幼树的新梢或徒长枝年生长量可达到2m以上。无花果也有多次生长的习性，因而形成树冠较快进入结果期也较早。无花果的萌芽和发枝力比其他原产亚热带和温带南部的落叶果树（如柿、石榴）为弱，因此，它形成比较稀疏的树冠。外观上骨干枝非常明显。
无花果的潜伏芽较多，寿命可达到数十年，又积易在骨干枝上，形成大量不定芽，因而其枝条恢复力积强，树冠容易更新。
无花果不耐寒，冬季温度达-12℃时新梢顶端就开始受冻死亡。
无花果能耐较高的温度而不致受害。一般来说，适宜于比较温暖的气候。以年平均温度15℃，夏季平均最高温为20℃，冬季平均最低温度为8℃，5℃以上的生物学积温达4800℃的地区，对无花果的生长与结果最为有利。
二．无花果的茎段培养由于无花果扦插繁殖成活率低，用带腋芽的茎段培养成完整植株，可以为大量繁殖提供途径。无花果繁殖的方法是将采来的健壮的嫩茎削去大叶片，留下带腋芽的茎段，切成3~4cm长的小段，用流水冲洗3h,以清除表面污染物。然后放入75%酒精中，再用0.1%氯化汞消毒7~10h，最后用无菌水冲洗4~5次，在无菌条件下将茎段横切成长约1 cm，按原生长方向接种到MS+BA0.5~1.0长芽培养基中,8天后外植体接触培养基的一端切口周围长出嫩绿色、质地紧密的愈伤组织，同时腋芽开展开，愈伤组织和腋芽的诱导率均为100%。待外植体愈伤组织膨大增生时，取出在无菌条件下，纵切成小块，将其中带有展开的芽和部分愈伤组织的小块外植体植入丛生芽增殖培养基MS+BA1~2+NAA0.1-0.2中。随后愈伤组织继续扩大，腋芽萌生成绿色簇生状，每个腋芽上可生出15~28个芽丛，逐渐长成苗丛。当一部分芽长高至2~3cm时，切取单苗转移到生根培养基上MS+NAA0.2上，11天左右开始生根。20d左右长成具有根系的完整植株，这时可取出移栽，成活率达98%。培养温度23~31℃，12~14h/d，光照强度为1700~2400lx左右。
若要继代培养，只需将小苗剪下，用茎尖或带腋芽的茎段接种到丛生芽增殖培养基上，即可得到以上的结果。
三．栽培技术
1．繁殖
（1） 扦插法 通常于秋季落叶后或早春树液流动前剪取插条。
插条宜选组织充实的枝条，剪成长20cm,每50~100条捆成一束。秋季采条要埋土越冬。土温较高，温度适宜，无花果极易生根。在管理条件较好时几乎100%成活。
（2） 其他繁殖方法 宅旁园地上少量栽培时。可用压条法繁殖。一般多采用水平、曲枝或堆土压条法，压条繁殖所得的苗木，根系强健，植株壮旺，有利于提前结果。
2．定植无花果发根要求温度较高（9~10℃），春季栽植树郊果较好。
3．整形修剪无花果适于整成多主枝自然开心及有主干的无层。其定干高度约
40~60cm。由于无花果发枝力较弱，树冠中一般不要过分密集，所以疏剪程度尽量从轻。对以收获冬果受冻的枯枝及时剪除，注意选择新的徒长枝来代替。
4．灌水和施肥无花果为较抗旱的果树，但在新梢及果实迅速生长期限，其需水果较大。为保证正常生长和结果，需进行灌溉。春旱季节及新梢、果实迅速生长期间灌溉更为重要。落叶后结合冬耕蓄水灌溉，对增强越冬性非常有利。
无花果幼树生长不良时，每株施氮50~70g、磷8~100g、钾40~60g。已成年结果园每亩地施入氮6~8kg、磷8~10kg、钾4kg。施肥时期以落叶前后（基肥），早春新梢旺盛生长前，春、夏果及秋果迅速膨大前（追肥）为宜。天旱时施肥应结合灌水进行。
5．病虫害防治与树体保护
（1） 病虫防治 无花果的病虫害较少，比较严重是桑天牛，其幼虫蛀食加害树干和大枝。主要防治方法：每年6~7月成虫产卵期，人工捕杀；用5%可湿性滴滴滋涕1份加小麦5份，或高梁面3份加除虫菊一份，加水混合成膏状物，堵塞虫孔，以毒杀幼虫。
（2） 越冬保护 幼龄无花果生长较旺，枝条易速冻害，需要防寒越冬。据实践证明，5年以后，树体扩大，越冬能力增强，不必再行保护。
（3）防止落果与促进成熟 落果的主要原顺有以下几方面：1，土壤干旱，供水不足，果实未熟干缩早落；2，土壤积水，根系吸收活动受到抑制，引起生理干旱，落果或落叶；3，根部害虫加害根系，削弱了根的有为收活动相起的。
（3） 秋季气温下降使果实延迟成熟，甚至脱落，在华北地区这种情形比较普遍。
6．采收无花果的成熟期较长，因此，无花果最适于分期采收。充分成熟的聚合果，此时采收果实，风味最佳；但充分成熟的无花果不耐运输。因而外运的需适期采收。无花果的采收宜在干燥的晴天进行。
本章小结
（1）草莓脱毒苗的培养方式主要有微茎尖培养和花粉培养两种。无毒苗在用于生产之前，必须经过病毒鉴定。一般由嫁接法进行。无毒苗的繁殖程序可以发为五步，即鉴定出无毒苗、原种种苗培养、原种种苗繁殖、良种种苗繁殖和生产用苗繁殖。
（2）苹果花粉培养由于以下几个阶段组成：1，选取适期花蕾；2，花蕾预处理和消毒；3，诱导胚状体形成；4，诱导生根；5，移栽。
（3）苹果的栽培管理要注意几个问题：1，育苗技术；2，土壤改良；3，施肥方法；4，灌溉时期；5整形和修剪技术。
（4）葡萄茎尖培养经过下列变化：茎化、尖接种后变绿，增大期；形成畸形叶期；芽形成和伸长期；形成小叶和叶伸长期限；生根期；地上部和地下部伸长期；上盆期。
（5）在葡萄栽培架式，棚架是应用最广泛的类型。冬季防寒措施常用地上实埋防寒法。
(6) 无花果可采用扦插法进行繁殖，但成活率不高。而采用茎段组织培养可大大提高成活率。
第十二章 马铃薯的组织培养目的要求:
(1)掌握马铃薯脱毒培养的大致过程以及马铃薯脱毒苗的鉴定方法;
(2)掌握马铃薯的生物学习性;
(3)掌握番茄的生物学特性及快速繁殖方法.
第一节 马铃薯的组织培养马铃薯（Solanum.tuberosum）是一种全球性的重要经济作物。适应性广，营养价值高，耐贮藏适运输，既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应的重要蔬菜。
马铃薯原产于拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物。但是，当发现从外地引种栽培1~2个周期后，明显发现产量降低，植株变矮，并有卷叶的现象产生，经检测证明这是由于病毒引起的退化现象。
危害马铃薯的病毒有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、奥古巴花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。由于马铃薯是无性繁殖作物，病毒逐代积累，日益严重，引起严重退化。马铃薯卷叶病毒和马铃薯养病度的一些株系，可使块茎产量减少50%~80%。法国Morel和他的同时们，1955年从患病马铃薯植株中选取到了无病植株，为治疗作物病毒开辟了进途径。
一、特性和生物学习性
1、马铃薯的形态特性
(1) 根 马铃薯的根系由出生根和匍匐根两部分组成。出生根在块茎发芽后基部发生，构成其只要吸收根系。水者芽的伸长，陆续在芽的各个叶节处匍匐茎的两侧及下方发生匍匐根，水平生长。
（2）茎 马铃薯分地上部分和地下部分，地沙锅内茎的主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。块茎与匍匐茎相连的一端叫薯尾或脐部，另一端叫薯顶，块茎表面分布着芽眼。薯顶压延分布较密，发芽早，发芽势强，即具有顶芽优势。生产上的整薯播种、带着顶部芽眼切块，都是发挥顶芽优势的有效措施。
（3）叶 马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。以后发生的叶奇数羽壮全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。
（4）花 马铃薯的话为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。
(5) 果实、种子 马铃薯果实为球星或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。中指可用来繁殖，但后代性状分离大。
2,生物学习性-
马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温为12~18℃。地上茎叶生长温度为17~21℃，25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，-1℃时受冻。
块茎形成要求昼温14~24℃，夜温12~14℃，土温16~18℃。土温20℃以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎，25~30℃时已经长成的块茎也会小时而变成细长茎，结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥活以及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。
马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题，表现为植株长势衰弱，株形矮化，分枝变少，薯块变小，产量逐降低，造成退化的原因和学说多种，综合而言，主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老饿导致种性退化，而病毒和细菌病害的浸染，以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度。
二,栽培管理播种须经催芽处理，方法是播种前30~40d，将选好的健康种薯装入袋或筐中，放在15~18℃和相对湿度60%~70%的火炕上或室外，厚度以2~3层种薯为易，保持15~18℃和7%~80%空相对湿度，晚间收回。经15~20d，能形成0.5~1.5cm长、紫绿色粗壮的芽，芽基部已发生根尖和兢的原始体。
将催芽种薯纵切成4~5块，每块25g 左右，带1~2个芽。切口抹草木灰；，放20℃和80~90%空气相对湿度下，促进伤口愈合，防块茎腐烂。
3月中旬左右播种，密度为60~70×15~30cm，开沟10cm深，播后覆土平均，增强 保墒。干旱时，播前或播后浇水。播后覆盖地膜，可早出苗和增加产量。春薯可和棉花或玉米间作。
春薯管理的重点在于促进早出苗,早发棵、早结薯。80%出苗时中耕松土，提高地温。奇苗后半月左右，行间撒硫酸铵10~12kg，后浇水中耕，促发苗和长棵迅速形成茎叶和地下匍匐茎。发棵初期施肥，以后适当控制肥水，地不汉不浇水，多次浅耕保墒，防植株旺长面延长结薯。封垄前大培土一次，培土高12~15cm，不埋没主茎的功能叶。开花后地下块茎膨大，要求湿润疏松的土壤，在初花、盛花和终花期连浇三水。，这时期缺水会明显减产，后期可减少浇水，更不能大水漫灌。收前5~7d停水，促薯皮老化，以利贮藏。
三、马铃薯脱毒技术马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累于所结块茎中，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50％以上。经科技人员研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响到马铃薯的生产。通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。
因此，采用组织培养技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。
1．脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。
2．茎尖培养脱毒
（1） 取材和培养一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗1h左右，无菌条件下先用95％的酒精浸润组织，在用5％的漂白粉溶液浸泡5~10min，然后用无菌水冲洗2~3次。为了减少污染机会，可将块茎彻底消除后，放在无菌容器中培养，然后在去取茎尖。分离茎尖时，把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留2个叶原基，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgIAA,0.1mgGA3、p H值5.8。也可White培养基，附加0.1~1mg/L的NAA和0.05 mg /L 的BA。培养条件：21~25℃、3000 lx、16h/d。
（2） 继代和生根培养成功的马铃薯脱毒苗，经鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法括繁。取试管苗单节切段扦插在固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右使可发育成5~10cm高小植株，可在进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，试管苗多节接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。
试验表明：多节液体培养试管苗比固体培养基生根快，长的粗壮，便于栽培，同时省去大量琼脂，降低成本，提高试管苗成活率。培养基可用不加任何激素的MS。培养基中的烟酸、肌醇都可以减去，琼脂浓度也可降低。切断繁殖的速度很快，在25~28℃光照度在3000~4000lx，连续光照的条件下，一般每月能增加7~8倍。
(3) 驯化 为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力，移植前对试管苗要进行光、温锻炼。炼苗期温室内的温度：白天23~27℃，夜间不低于14℃。炼苗的具体方法是：移植前7d左右，将长有3~5片叶、高2~3cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养室移至温室排好。为防止强光、高温灼伤试管苗，在温室顶上加盖一层黑色遮阳网。一般不能全遮，以使温室内仍保持一定光照和较高的温度，并在摆放试管苗的畦内浇上水，维持试管苗周围的湿度。移至温室的试管苗，经管仍处于瓶口的瓶内，但由于封口膜透气性好，瓶内的温度下降，使试管苗的茎叶变硬，加上光照增强，茎杆变粗，叶片肥厚浓绿，有效的抑制了土壤和真菌的浸染，从而提高了试管苗的抗逆性和对环境条件的适应能力，以及移植成活率。
移植时，将装好基质的营养钵紧密的排放于温室内，已经整好的阳畦内，可采用珍珠岩作为基质，有条件的话，也可采用灭过菌的疏松土壤。每1m2排放营养钵300个左右。排好后用喷壶浇透水，将经光、温锻炼好的试管苗从瓶内用镊子轻轻取出，放到15℃的水中洗去培养基，放入盛水的容器中，随时取随时扦插，防止幼苗失水。大的幼苗可截为2段，每个营养钵插一个茎段，上部茎段和下部茎段分别扦插到不同的钵内。苗高不足2.5cm的不在截段,直接移植到另一畦内．扦插时茎段插入营养钵土表下1~2个带叶茎芽(茎尖)土表上茎尖处的腋芽(顶芽)形成幼苗的茎叶，下部茎尖发生新根，即形成一株完整的脱毒苗，供将来的切繁的基础苗。扦插完成之后随之撒少量营养土，然后用细雾水喷浇，使扦插茎段同基质很好的接触，以免使茎段裸露土表不能成活。随后用旧报纸盖好，遮光保湿２～３d，茎段生出新根后将覆盖的报纸及时去掉。
扦插的基础苗成活后，其水分、温度及养分管理应根据气候变化和苗情而定。一般情况，扦插后最初几天，每天上午喷一次水，保持幼苗及基质湿润。但喷水量要少，避免因喷水过多造成地温偏低而影响幼苗生长和成活。切忌暴热时间凉水浇苗。为提高水温，可提前用桶存水于温室中。随幼苗生长逐渐减少浇水次数，但每次用水量逐渐加大。此外为保持温室中有较高的湿度，以防幼苗茎皮硬化，影响切繁效果，在育苗不需要浇水的时候应将温室内所有空地全都浇上水，在幼苗生长及整个切繁期，温室内的相对湿度保持正在８５％以上，气温白天控制杂２５～２８，夜间保持在１５以上。基础苗切繁前和培育大田定植苗，一般不在追肥。但基础苗开始切繁后２～３d要喷一次营养液，此后每隔１０d 一次，直至切繁终止。见表１３－１。
表１３－１营养液的成分及用量成分 KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2.2H2O
浓度 950 800 180 85 220
3,脱毒苗切繁
　 基础苗成活进入正常后便可切繁，但切繁量的多少和质量的高低，除与前边提到的水与温湿度条件有关外，能否掌握正确的切繁方法和适宜的切繁苗龄也是非常重要的。
脱毒苗切繁主要是剪取顶部芽尖茎段（主茎芽尖和腋芽芽尖）直接扦插。正确的切繁原则是：保证每次剪切后，基础苗仍能保持交好的株型和营养面积与较多的茎节，不仅生长正常，而且又能萌发出多个腋芽供下次剪切，具体方法是：扦插后１５天左右，当基础苗长有４-５个展出叶、苗高３.５-４厘米时进行首次切繁。从基础苗茎基部上数２-３个茎芽上方，用锋利刀片将上部茎芽切下（茎段不小于１厘米），扦插到浇透水的营养钵内。培育供大田定植的脱毒苗，也可以作为供切繁的基础苗。如生产脱毒小整薯，可直接扦插到用营养土做好作为的畦床上或备好的专用的无土培养盘中，扦插方法与扦插后的管理同试管苗扦插方法与管理。第一次剪切后１０天左右，基础苗上萌发的腋芽长大时进行第二次切繁，同第一次一样，将剪切腋芽基部的第一个叶片留下继续萌发腋芽，将上部茎尖芽段剪下扦插。如基础苗上出剪取的腋芽外，仍有多个未萌发或未长大的腋芽时，可将牙牙全部切下。如果是高位腋芽，要连同着生腋芽的茎段一起剪下，以便基础苗始终保持较好、有利于继续切繁的株型，延长切繁期，以后无论切繁多少次，其方法和原则相同。在生产需要时间允许，所有切繁培育成的脱毒苗均可作为基础苗进行切繁。基础苗最后一次进行切繁时，除最基础留下一个茎芽外，其余无论大小全部剪下扦插，并将多余的茎、叶清除，使其发育成一株正常的脱毒苗供大田定植。
四、马铃薯无病毒苗的鉴定材料
1、指示植物鉴定在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定中是最常用的方法，Ｘ病毒、Ｓ病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种。Ｙ病毒、Ｍ病毒和Ａ病毒等也可用此法来接种。
2、鉴定寄生的准备马铃薯病毒的寄生范围狭窄不一，如卷野病毒只能感染茄科少数病毒。而Ｘ病毒除茄科外，还能感染笕科的千日红，藜科的笕色藜等。马铃薯常用的鉴定寄生植物有笕科的千日红，茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等。寄生植物应在无虫网室中培养，温度控制在１５-２５，提供充足的肥、水、光等条件，保证幼苗健壮生长。系统发病来鉴定寄生，一般用３～５片真叶的幼苗，局部发病的寄主利用充分展开的真叶。每个病毒样品可接种３株，并做好标记。
３.接种液制备及接种一般以表现病状明显的叶作为接种材料。叶片洗净后。在消毒的研钵中研成糊状，用纱布滤出汁液，在意蒸馏水稀释１０倍作为接种物，以防过浓的汁液对鉴定寄生产生伤害作用。
在鉴定寄生植物的叶面，均匀的喷布６００目的金刚砂，也可将金刚砂少许混入接种物中，然后用左手心紧靠在寄主的背面，以右手实指蘸取接种液，均匀的在叶背面擦过，以不造成叶片产生伤痕为度，最后把叶面上多余的接种物用清水冲洗干净，放置在１５～２４的防虫室中，一般５－１０天可发病。
五、马铃薯无病毒株的繁殖和保存
1．无病毒株的繁殖通过茎尖培养只能得到很少的无病毒植株，而生产上需要数以万计的健康种薯。同时无病毒植株并没有对该病毒获得免疫能力，仍会在繁殖中再次侵染。如何在以后繁殖中防止受病毒再侵染是很关键的一环。目前在生产上来用的方法很多，下面介绍主要的几种。
（１） 直接块茎繁殖这是常用的方法，把少量无病毒小苗直接移入无虫网室的土壤中，
利用产生的块茎继续繁殖，并进行严格的病毒鉴定，一旦发现病毒再侵染，即行淘汰，将经过５～６次繁殖的无病毒块作为一级原种，提供大田繁育体系作进一步扩大繁殖。
（２） 扦插繁殖把无病毒植株栽于无虫室的营养钵中，１～２个月以后切顶芽做插枝。切去顶芽后，又处进侧芽发生，很快长成侧枝。扦插时，将扦插最下面的叶除去，插入经过消毒的砂壤中，插入深度为两个节间。在插后１周时间内，维持土壤湿润，插枝就能产生新根。有些插枝地下部分会结出块茎，应及时除去，否则这些插枝不能生根，最后会枯死。经过2周多的生长时间，插枝就可以多移栽，或供作进一步切取插枝的母株，或让其块茎提供一级原种。母株应经常更新，防止因太老导致生根很困难。
（３） 组织培养切段繁殖利用试管保存无病毒植株资源是一有效途径。试管植株体积小，
占用的空间少，可大量地保存植株。长期保存马铃薯无病毒试管植株的方法有三种：
（１） 继代培养对保存的无毒不断地继代培养，每个品种可以接种2－10瓶。
为便于保存可选用较大的150ml三角瓶，内加入一半以上体积的培养基。基琼脂含量要高于一般培养基，可用不含激素牟基本培养基，以延缓小苗生长。每瓶接种2－3个切段。培养温度可在5－２５℃，在较低温度下，保存的时间更长。用不含激素的基本培养基。光照度为1000lx。为样每隔2－3个月继代培养一次，达到保存的目的。
（２） 低温保存当试管的植株长至2cm左右进，放入温度为4℃的冰箱中，
并放在暗处保存，可达1年左右。
第二节 番茄的组织培养一、形态特征和生物学习性
1,形态特征番茄属茄科草本植物。苗期直立生长，成熟期呈匍匐生状态，植株高大，生长势强。番茄茎节上还能长出不定根，如将一段枝剪下，能发育一株新个体，番茄的叶片为长羽状，在叶轴上生有裂片，顶生裂片，小裂片，间裂片，这些裂片是叶的深裂，缺刻的变化。两性花，聚伞花序，小果型品种多为总状花序。番茄子为扁平短卵形，在一端的边缘有一个向内凹陷，种子外面覆以粗毛，呈褐色或黄褐色。种子较小，寿命3-4年。
2．生物学习性番茄属于喜温性蔬菜，较耐低温，但不耐炎热，在月平均温度18-25℃的季节里生长良好，为喜光性作物，需12-14h/d，光照度为40000-50000lx。对水分需求量极大，要求土壤湿度在65%-85%，空气湿度50%-60%为宜，番茄对土壤条件要求不严格，肥沃的壤土利于高产，此外在有机肥充足的情况下，通气良好的砂土壤也能获得高产。番茄对土壤要求酸碱度是pH值5-7，适于微酸性或中性土壤。番茄是最需肥的一种作物，据测，亩产5000kg番茄，需吸氮17kg,磷5kg。钾26kg。
二、栽培管理
1,育苗播种前种子需进行处理，可用0.1%高锰酸钾容液浸泡种子30min
或用10%磷酸三钠溶液浸泡种子40-45min。以预防基他病害，促使幼苗健壮生长，防止徒长，还可以采用2.5公斤水加5g矮状素，7g瑞毒霉混合液浸泡4-5h。把浸过种的种子移至25-30℃条件下催芽，催芽之间要有充足的空气，经常检查和翻动种子并每天用浅水冲洗1-20次。如此经2-3d即可发芽。如若在番茄2叶一心时分苗，播种密度为每平方米10-15g，如一叶一心时分苗，则播种密度为15-20g，播种前床内灌足底水，灌水量以床土8-10cm深的土层为宜。然后采用撒播，条播或点播的方法播种，种子上覆适量的土即可。播种后，使床温在白天保持5-28℃，夜温15℃以上，当番茄幼苗出土70%左右还应注意通风换气。当第一片真叶生长时即可分苗。即播种后25-35d进行，分苗后白天温度在25-35℃间，夜间15-18℃间，当幼苗6-7叶时可进行移植。定植密度为50×30cm或50×33cm。定植后到拉秧 需浇水5-6次。主要在定植期，定植中后期，第一花序始花期，当第一穗果长至核桃大小时浇水。此外需在9月中旬浇催果水时，旋入氮、磷、钾复合肥25-30kg或速效肥，以后还要追施有速效肥1-2次。
2,植株调整大棚或温室番茄一般采用单扦插整枝，留2-3穗果实，并注意，
最上面的果穗要留2-3片叶，而后摘心。在秋分前后天气转冷时，应将各花穗中未坐果的花朵摘除。并且对各花的幼果需进行疏果。使每个花穗保留4-5个果实，畸形果应当摘除，以提高所结果的商品价值。
三．组织培养番茄组织培养的方法是取番茄幼嫩叶片外植体经清水洗涤，在无菌条件下，用0.1%升汞浸泡4min，再用无菌水冲洗3-4次，然后切成0.5cm×0.5cm小块，接种于诱导培养基MS+BA2mg/L+IAAI中。培养温度25℃，每天光照10h，光照度2000lx。6 在后叶片开始膨大，边缘有小突起产生。并向外反卷；16d后长出大量愈伤组织，呈浅绿色或淡白色，质地较密，但无芽产生。当其增至0.8-1cm时，挑选新鲜、上部稍带淡绿色点的愈伤组织转入分化培养基MS+BA4中，一星期后均有小芽产生；15d后，将较大的芽转接到生根培养基MS+IAA2中，6d左右下部产生白色小点，并逐渐形成白色根，11d后即形成完整植株。将培养有根试管苗的瓶口打开。煅炼3d后取出，洗去根上带有的培养基，移栽到营养土中，浇透水，并罩上不、薄膜，以保温保湿，4-5d后去掉薄膜，新叶长出时即定植田间。
四．胚的培养
(1)外植体的制备 授粉后30-40d收获果皮完整的果实，果实放入95%乙醇中表面消毒，浸在5%NaCI中5min，用无菌蒸馏水充分淋洗。果实放在无菌吸水纸上，除去种子上的胶状复被。
(2)培养基 MS培养基类。按常规加蔗糖、肌醇、维生素和琼脂，并附加硫胺素0.3。Ph值调节到6.0。用附加2,4-D2和椰乳100ml/L的MS用做愈伤组织启动和保存培养基。愈伤组织培养基不加维生素。芽再生培养基附加BA1.5，蔗糖浓度降到3%-2%，生根培养基加NAA-2。
(3)培养条件 愈伤组织启动和保存，用暗培，27℃。愈伤组织在2周内产生。当见其生长时，应立即继代在新的培养基上。芽再生和生根在室温20-30℃.16h/d。每3周芽再生培养一次。3个月内可取得芽，再过3周生根。
五．病虫害防治
番茄常患的病是立枯病。立枯病为害茎基部。基防治方法为(1)苗床选择干燥，排水良好的地块，前茬是非茄科植物；(2)加强苗床管理，切实做好苗床不、保温，防止冷风或低温侵袭，避免幼苗受冻；(3)床土消毒；(4)药剂防治，幼苗出土后发病，可喷施58%瑞毒锰锌可湿粉剂500倍液，75%百菌清可湿性粉剂，600倍液。隔7-10d喷药1次，药剂可用50%年海因可湿性粉剂800倍液，70%代森锰可湿性粉剂400倍液等等。
此外还有晚疫病，病毒病，叶霉病，斑枯病等。防治方法：(1)实行倒茬轮作；(2)种子处理；(3)清洁田园；(4)药剂处理。
虫害主要有小地老虎为害幼苗心叶，蚜虫危害植株。温室白粉虱为害叶。棉铃虫为害嫩茎、叶和芽，虫害防治主要是药剂处理。
第三节 桔梗的组织培养一、形态特性和生物学习性
1．形态特性桔梗为桔梗科属多年生草本植物。株高30~90cm.根肥大肉质，圆柱形，下部减细，外批淡黄褐色。茎直立，全株光滑，单一或分株。叶互生，茎下部叶有时对生或3~4片轮生；有柄或无柄；叶片卵状至卵状披针形，长3~6cm，宽1~2.5cm,先端尖，基部楔形或近圆形，边缘有不规则锯齿，叶面绿色，背面淡绿白色，两面均光滑。花单生或数朵成疏生的总状花序；花萼绿色，长1cm，尖段有与齿状裂片，花冠呈状，蓝紫色或白色，大型的直径3~5cm。蒴果倒卵圆形，成熟时先端裂开。种子卵形，有三棱，长2~2.5mm，宽1.2mm黑褐色。花期为7~9月，果期为8~10月。
2、生物学习性桔梗喜欢生长在阳光充足，温暖湿润，雨量充沛的丘陵地区。它对温度要求不严，播种期温度在8－9为好，移栽期气温为10左右较为适合。适于在降雨量在700－2000的地区栽植。土壤以土层深厚，疏松湿润，排水良好，腐殖质高的壤土，砂质壤土为宜。PH值为6.5－7，以磷、钾多，水热条件良好的土壤条件有得生长发育和根系长。粘重或干燥土不宜栽植。
二、栽培管理
１,播种桔梗播种的季节一般在寸水前后。在播种前首先在苗圃施堆肥或厩肥2000－2500公斤，深翻细耙整平作畦。播种时应先开浅沟1－3深，然后将种子撒于沟内采用撒播或条播，然后覆盖火烧土或细堆肥至不见种子为宜。亦可把种子拌和其中。
条播在畦上按沟心距20－25，以120倍的灰肥加种子撒播于沟内更均匀，用种量0.5公斤。撒播用种量约1公斤。播后畦面盖稻草保湿。
播后半月左右即可发芽出苗，选阴天揭去稻草。苗高7时间苗，拨去密弱苗用杂草，施稀淡人畜粪尿，每亩1000－1500公斤，6月下旬及9月各施追肥1次。
２,组织培养一般用茎尖和茎段作为外植体，接种和培养方法参照其他作物的方法。
３,移栽移前将大田深翻25－30，施入堆肥或厩肥1500－2000公斤，过磷酸钼25公斤做基肥，并耙平作畦。春季以尺蛰到春分移栽最好。
桔梗喜肥，生长期间宜多施追肥，一般结合中耕除草时追肥。第一次亩施稀淡人畜粪废水1000－1500公斤，第二次亩施猪烘水1500－2000公斤，促进根部生长肥大，注意雨季排水。
三、病虫害的防治病害。桔梗通常所患的病害有：根线虫病、桔萎病、班病和轮纹病。根结线虫病危害细根、侧根，生长细弱，枯萎病危害幼苗及成年植株，引起料根枯萎死亡。斑枯病，轮纹病危害叶片，引起叶枯黄。对于上述危害的防治措施是：①实行轮作制；②清除病残株烧毁，加强田间管理；③某苗时用3%甲斟民柳大理磷颗粒8－10公斤/亩。或55克线磷颗粒剂4－5公斤/亩施入寺壤杀死线虫；④选用抗病品种，与水稻轮作；⑤叶斑病可用1：1＝100波尔多液或50%多菌灵1000倍液喷治。
虫害。桔梗通常所患的虫害有：拟地甲、白丝虫、蚜虫等，其中拟地甲危害根部，白丝虫蛀食根茎使之死亡，此外对于蚜虫危害的防治措施是：用90%敌百虫800倍液或50%锌硫1000倍液喷治，白丝虫危害可用土壤消毒处理。
复习思考题
（１） 对马铃薯脱毒苗的培养大致分几个阶段？各阶段是怎样操作的？
（２） 马铃薯的生物学习性有哪些？
（３） 番茄的生物学习性有哪些？番茄是怎样快速繁殖的？