药用植物、低氧作用对细胞色素 P450
的影响高亚鹏主要内容
一 CYP450（ P450）简介
二 药用植物及低氧条件对 CYP450的影响
1、甘草、芫花对 P450的影响
2、银杏叶提取物对大鼠肝细胞 P450蛋白表达的影响
3、慢性间断性低氧对大鼠肝细胞 P450的影响一 CYP450简介细胞色素 P450 (CYP450或 P450)：是广泛存在于生物体内的一类含 血红素 和硫羟基 的蛋白，由结构和功能相关的基因超家族编码形成的超家族酶系，
在 450 nm处有最大吸收峰，因其还原态与 CO结合后在 450nm有特异性吸收峰而得名，相对分子质量 50 kDa。本质为 末端氧化酶 。
分布及存在状态,
原核生物,CYP450游离于胞质中，为一种可溶性蛋白 ;
真核生物,CYP450作为一种膜结合蛋白，主要分布在内质网和线粒体内膜上。
生理功能,CYP450主要参与内源性物质 (胆酸、维生素 D、脂肪酸和激素等 )
和外源性物质 (药物、毒物、杀虫剂等 )的生物转化。
P450活性中心,由含铁血红素和半胱氨酸组成。
p450活性中心
P450的命名,
1993年 Nelso等科学家制定了根据氨基酸序列，能反映种族间 P450酶基因超家族内进化关系的统一命名法,
凡氨基酸同源性大于 40%的视为同一家族 (family)，用 CYP后标一阿拉伯数字表示，如 CYP2;氨基酸同源性大于 55%以上者为同一亚族
(subfamily)，在家族的后面加一个大写字母表示，如 CYP2D,每一个亚族中的单个形式的 P450酶 (individual)，则是在表达式后再加一个阿拉伯数字，如 CYP2D6。目前己知哺乳动物体内有 14个 CYP家族 (包含 26个亚族 )，涉及体内大多数药物代谢的主要有 3个基因家族 (CYP1,CYP2和
CYP3)
在哺乳动物肝脏中，参与药物代谢的 P450酶系主要是 CYP1-CYP3家族的 7
种酶，分别为：
CYP1A,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和 CYP3A4。
P450的催化反应机制：
p450催化反应机制
Lewis碱末端加氧功能使其在碳同化、激素合成、
外源物质降解、前致癌物的活化等方面起着重要作用。
1 驰豫态
CpdI
CpdO
P450是自然界中最具催化作用多样性的生物催化剂。它有很广的底物谱，包括外源物如药物、
工业化合物、抗体等；
也包括多种内源物如甾醇、荷尔蒙以及其他生理过程产生的脂类等。
P450参与的反应可以归纳为包括羟基化，环氧化，脱烷基化等在内的数十种类型,
p450催化的各种类型的化学反应二 药用植物及低氧条件对 CYP450的影响
1、甘草、芫花提取液对 P450的影响
目的,研究甘草、芫花对主要药物代谢酶 CYP1A2,CYP2E1、
CYP3A1/2 酶活性的影响，为阐明基于药物代谢酶的中药相反作用的机制提供参考。
方法,制取甘草、芫花提取液；将大鼠随机分为空白组、甘草组 (0.75g/kg/d),芫花组 (0.25 g/kg/d ),甘草芫花合用组 (1.00g/kg/d ),每组 6 只。空白组给予生理盐水,各药物组连续灌胃给药 7 d 后处死动物,
取肝脏,采用超速离心法制备微粒体,高效液相色谱法测定微粒体中 CYP1A2,CYP2E1 活性 ;采用紫外可见分光光度法测定
CYP3A1/2 活性。
植物提取液制备,
甘草提取液制备流程：
芫花提取液制备同上,最终药液浓度定为 0.02g/mL；
合用组提取液按中国药典 Ⅰ 部规定的临床剂量比例称重，制备同上，最终药液浓度定为 0.08 g/mL。
浓缩为 0.06g/ml
甘草（称重）
加热回流 3次加去离子水 浸泡 60 min
过滤旋转蒸发超速离心法制备肝微粒体流程肝匀浆上清液沉淀 （微粒体） 上清液弃去沉淀离心,10500g 1h
离心,10000g 20 min
肝脏称重，剪碎加匀浆介质,Potter匀浆器储存于液氮中
结果：甘草、芫花对 P450 酶起相互拮抗作用。甘草可明显增加 CYP1A2,CYP2E1 及 CYP3A1P2 的酶活性,是 P450酶的诱导剂,可能是其在一定范围之内具有解毒作用原因之一。
配伍后与芫花组比较,三种亚酶的活性均有不同程度升高,
说明甘草抵消了芫花对几种亚酶活性的抑制作用甘草芫花对 p450含量的影响 甘草芫花对 p450活性的影响
2、银杏叶提取物对大鼠肝细胞 P450蛋白表达的影响目的,研究银杏叶提取物对大鼠肝脏细胞色素 P450酶 CYP1A1、
CYP1A2,CYP2Bl/2,CYP3Al蛋白表达的影响。
方法,银杏叶提取物分 10mg/kg,100mg/kg两个剂量,将大鼠分为 3组,每组 6只。 3组分别以银杏叶提取物 0,10mg/kg、
100mg/kg灌胃处理 10d。取出肝脏。超速离心法制备肝微粒体，按 Lowry法测定肝微粒体蛋白含量,-70℃ 贮存备用。
,0灌胃,为对照组。蛋白免疫印迹杂交法测定 CYP1A1、
CYP1A2,CYP2B1/2,CYP3A1的蛋白表达。
蛋白免疫印迹杂交 测定 流程凝胶成像系统扫描光密度值电转移缓冲液辣根过氧化物酶标记
(非放射性）
结果：
银杏叶提取物能显著诱导大鼠
CYP1A1,CYP1A2、
CYP2B1/2、
CYP3A1的蛋白表达水平,影响与之同时服用的药物的疗效。
3、慢性间断性低氧对大鼠肝脏细胞 P450的影响
目的,利用大鼠,研究慢性间断性低氧对药物代谢相关的肝细胞 P450酶的 CYP3A2和 CYP2E1的影响,旨在为临床合理用药提供帮助。
方法,健康♂鼠分 5组,每组 8只。即,对照组
(Control组 ),低氧 3 d组 (H3 组 ),低氧 7 d 组
(H7组 ),低氧 14 d 组 (H14组 ),低氧 28 d组 (H28
组 )。对照组呼吸空气。低氧结束后取新鲜肝组织以超速离心法制备微粒体并提取 RNA。
眼球取血，制取血清，并酶法测定 ALT和 AST活性，
用分光光度法测微粒体 ERD（ CYP3A的标志酶）、
ANH（ CYP2E1的标志酶）活性。 RT-PCR检测大鼠肝细胞 P4503A2,2E1的 mRNA表达水平。 PCR产物经
1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离并染色后,进行电泳条带峰体积定量,测定 CYP3A2 和 CYP2E1 基因与
GAPDH（内对照）基因扩增条带峰体积的比值。
结果：
（ 1） 慢性间断性低氧对大鼠血清 ALT和 AST活性的影响与对照组比较,各实验组大鼠血清 ALT和 AST活性无改变,提示慢性间断性低氧对肝功能无明显影响。
（ 2） 慢性间断性低氧对大鼠肝微粒体中 ERD 和 ANH活性的影响间断性低氧 3d 后,大鼠肝微粒体 ERD 和 ANH 酶活性有所升高,但不明显 。当低氧达到 7 d 后,大鼠肝微粒体 ERD 和 ANH
活性均明显升高,表现为时间依赖性,28 d 时诱导率分别可达 155.5 %和 42.2 %
（ 3）慢性间断性低氧对大鼠肝 CYP3A2和 CYP2E1 mRNA表达影响
RT-PCR结果分析显示,随着间断性低氧作用时间的延长,大鼠肝组织中
CYP3A2 /GAPDH 和 CYP2E1 /GAPDH 的比值逐渐增高。低氧 7 d后,上述两种比值与对照组比较差异有显著性 ( P < 0.05),提示慢性间断性低氧呈时间依赖性增强 CYP3A2和 CYP2E1基因的 mRNA表达水平 ( Fig1～ 3)。
结论：
慢性间断性低氧对肝功能无明显影响，但能明显增加大鼠 ERD（ CYP3A2）,ANH（ CYP2E1）活性,其机制可能与其在转录水平上提高肝脏 CYP3A2和
CYP2E1的基因表达水平有关。这是首次发现慢性间断性低氧可显著提高肝脏 CYP3A2 和 CYP2E1 的活性,
可为相关疾病的药物治疗和发病机制研究提供参考总之,细胞色素 P450作为和药物代谢及细胞因子相关的重要酶类,在药物代谢和免疫中起着相当重要的作用,对于它的研究将有助于新药的开发,并能帮助人们更加清楚的认识药物的代谢途径。随着对细胞色素 P450研究的深入,
将有更多相关的代谢途径被发现,人们开发新药的视野也将更加开阔,新药开发的速度也将加快,质量进一步提高。
Thank you for your attention !
的影响高亚鹏主要内容
一 CYP450（ P450）简介
二 药用植物及低氧条件对 CYP450的影响
1、甘草、芫花对 P450的影响
2、银杏叶提取物对大鼠肝细胞 P450蛋白表达的影响
3、慢性间断性低氧对大鼠肝细胞 P450的影响一 CYP450简介细胞色素 P450 (CYP450或 P450)：是广泛存在于生物体内的一类含 血红素 和硫羟基 的蛋白，由结构和功能相关的基因超家族编码形成的超家族酶系，
在 450 nm处有最大吸收峰，因其还原态与 CO结合后在 450nm有特异性吸收峰而得名，相对分子质量 50 kDa。本质为 末端氧化酶 。
分布及存在状态,
原核生物,CYP450游离于胞质中，为一种可溶性蛋白 ;
真核生物,CYP450作为一种膜结合蛋白，主要分布在内质网和线粒体内膜上。
生理功能,CYP450主要参与内源性物质 (胆酸、维生素 D、脂肪酸和激素等 )
和外源性物质 (药物、毒物、杀虫剂等 )的生物转化。
P450活性中心,由含铁血红素和半胱氨酸组成。
p450活性中心
P450的命名,
1993年 Nelso等科学家制定了根据氨基酸序列，能反映种族间 P450酶基因超家族内进化关系的统一命名法,
凡氨基酸同源性大于 40%的视为同一家族 (family)，用 CYP后标一阿拉伯数字表示，如 CYP2;氨基酸同源性大于 55%以上者为同一亚族
(subfamily)，在家族的后面加一个大写字母表示，如 CYP2D,每一个亚族中的单个形式的 P450酶 (individual)，则是在表达式后再加一个阿拉伯数字，如 CYP2D6。目前己知哺乳动物体内有 14个 CYP家族 (包含 26个亚族 )，涉及体内大多数药物代谢的主要有 3个基因家族 (CYP1,CYP2和
CYP3)
在哺乳动物肝脏中，参与药物代谢的 P450酶系主要是 CYP1-CYP3家族的 7
种酶，分别为：
CYP1A,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和 CYP3A4。
P450的催化反应机制：
p450催化反应机制
Lewis碱末端加氧功能使其在碳同化、激素合成、
外源物质降解、前致癌物的活化等方面起着重要作用。
1 驰豫态
CpdI
CpdO
P450是自然界中最具催化作用多样性的生物催化剂。它有很广的底物谱，包括外源物如药物、
工业化合物、抗体等；
也包括多种内源物如甾醇、荷尔蒙以及其他生理过程产生的脂类等。
P450参与的反应可以归纳为包括羟基化，环氧化，脱烷基化等在内的数十种类型,
p450催化的各种类型的化学反应二 药用植物及低氧条件对 CYP450的影响
1、甘草、芫花提取液对 P450的影响
目的,研究甘草、芫花对主要药物代谢酶 CYP1A2,CYP2E1、
CYP3A1/2 酶活性的影响，为阐明基于药物代谢酶的中药相反作用的机制提供参考。
方法,制取甘草、芫花提取液；将大鼠随机分为空白组、甘草组 (0.75g/kg/d),芫花组 (0.25 g/kg/d ),甘草芫花合用组 (1.00g/kg/d ),每组 6 只。空白组给予生理盐水,各药物组连续灌胃给药 7 d 后处死动物,
取肝脏,采用超速离心法制备微粒体,高效液相色谱法测定微粒体中 CYP1A2,CYP2E1 活性 ;采用紫外可见分光光度法测定
CYP3A1/2 活性。
植物提取液制备,
甘草提取液制备流程：
芫花提取液制备同上,最终药液浓度定为 0.02g/mL；
合用组提取液按中国药典 Ⅰ 部规定的临床剂量比例称重，制备同上，最终药液浓度定为 0.08 g/mL。
浓缩为 0.06g/ml
甘草（称重）
加热回流 3次加去离子水 浸泡 60 min
过滤旋转蒸发超速离心法制备肝微粒体流程肝匀浆上清液沉淀 （微粒体） 上清液弃去沉淀离心,10500g 1h
离心,10000g 20 min
肝脏称重，剪碎加匀浆介质,Potter匀浆器储存于液氮中
结果：甘草、芫花对 P450 酶起相互拮抗作用。甘草可明显增加 CYP1A2,CYP2E1 及 CYP3A1P2 的酶活性,是 P450酶的诱导剂,可能是其在一定范围之内具有解毒作用原因之一。
配伍后与芫花组比较,三种亚酶的活性均有不同程度升高,
说明甘草抵消了芫花对几种亚酶活性的抑制作用甘草芫花对 p450含量的影响 甘草芫花对 p450活性的影响
2、银杏叶提取物对大鼠肝细胞 P450蛋白表达的影响目的,研究银杏叶提取物对大鼠肝脏细胞色素 P450酶 CYP1A1、
CYP1A2,CYP2Bl/2,CYP3Al蛋白表达的影响。
方法,银杏叶提取物分 10mg/kg,100mg/kg两个剂量,将大鼠分为 3组,每组 6只。 3组分别以银杏叶提取物 0,10mg/kg、
100mg/kg灌胃处理 10d。取出肝脏。超速离心法制备肝微粒体，按 Lowry法测定肝微粒体蛋白含量,-70℃ 贮存备用。
,0灌胃,为对照组。蛋白免疫印迹杂交法测定 CYP1A1、
CYP1A2,CYP2B1/2,CYP3A1的蛋白表达。
蛋白免疫印迹杂交 测定 流程凝胶成像系统扫描光密度值电转移缓冲液辣根过氧化物酶标记
(非放射性）
结果：
银杏叶提取物能显著诱导大鼠
CYP1A1,CYP1A2、
CYP2B1/2、
CYP3A1的蛋白表达水平,影响与之同时服用的药物的疗效。
3、慢性间断性低氧对大鼠肝脏细胞 P450的影响
目的,利用大鼠,研究慢性间断性低氧对药物代谢相关的肝细胞 P450酶的 CYP3A2和 CYP2E1的影响,旨在为临床合理用药提供帮助。
方法,健康♂鼠分 5组,每组 8只。即,对照组
(Control组 ),低氧 3 d组 (H3 组 ),低氧 7 d 组
(H7组 ),低氧 14 d 组 (H14组 ),低氧 28 d组 (H28
组 )。对照组呼吸空气。低氧结束后取新鲜肝组织以超速离心法制备微粒体并提取 RNA。
眼球取血，制取血清，并酶法测定 ALT和 AST活性，
用分光光度法测微粒体 ERD（ CYP3A的标志酶）、
ANH（ CYP2E1的标志酶）活性。 RT-PCR检测大鼠肝细胞 P4503A2,2E1的 mRNA表达水平。 PCR产物经
1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离并染色后,进行电泳条带峰体积定量,测定 CYP3A2 和 CYP2E1 基因与
GAPDH（内对照）基因扩增条带峰体积的比值。
结果：
（ 1） 慢性间断性低氧对大鼠血清 ALT和 AST活性的影响与对照组比较,各实验组大鼠血清 ALT和 AST活性无改变,提示慢性间断性低氧对肝功能无明显影响。
（ 2） 慢性间断性低氧对大鼠肝微粒体中 ERD 和 ANH活性的影响间断性低氧 3d 后,大鼠肝微粒体 ERD 和 ANH 酶活性有所升高,但不明显 。当低氧达到 7 d 后,大鼠肝微粒体 ERD 和 ANH
活性均明显升高,表现为时间依赖性,28 d 时诱导率分别可达 155.5 %和 42.2 %
（ 3）慢性间断性低氧对大鼠肝 CYP3A2和 CYP2E1 mRNA表达影响
RT-PCR结果分析显示,随着间断性低氧作用时间的延长,大鼠肝组织中
CYP3A2 /GAPDH 和 CYP2E1 /GAPDH 的比值逐渐增高。低氧 7 d后,上述两种比值与对照组比较差异有显著性 ( P < 0.05),提示慢性间断性低氧呈时间依赖性增强 CYP3A2和 CYP2E1基因的 mRNA表达水平 ( Fig1～ 3)。
结论：
慢性间断性低氧对肝功能无明显影响，但能明显增加大鼠 ERD（ CYP3A2）,ANH（ CYP2E1）活性,其机制可能与其在转录水平上提高肝脏 CYP3A2和
CYP2E1的基因表达水平有关。这是首次发现慢性间断性低氧可显著提高肝脏 CYP3A2 和 CYP2E1 的活性,
可为相关疾病的药物治疗和发病机制研究提供参考总之,细胞色素 P450作为和药物代谢及细胞因子相关的重要酶类,在药物代谢和免疫中起着相当重要的作用,对于它的研究将有助于新药的开发,并能帮助人们更加清楚的认识药物的代谢途径。随着对细胞色素 P450研究的深入,
将有更多相关的代谢途径被发现,人们开发新药的视野也将更加开阔,新药开发的速度也将加快,质量进一步提高。
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