电镜及制样技术
教材：陈力编著.《生物电子显微技术教程》北京师范大学出版社 1998
参考教材：（1） 张丰德等,现代生物学技术 南开大学出版社 1996
（2） 林钧安等,实用生物电子显微术 辽宁科学出版社 1989
（3） 朱宜等,电子显微镜的原理和使用 北京大学出版社 1983
（4） 洪涛等,生物医学超微结构与电子显微镜技术 科学出版社 1996
电子显微镜意义1、光学显徽镜,细菌和细胞2、电子显微镜,病毒、噬菌体、类病毒、DNA和蛋白质大分子
电镜技术的应用与未来
先进的仪器和花样翻新的样品制备技术、生物科学、医学科学、农林科学、材料科学
第一章 基本知识透射电镜(TEM),扫描电镜(SEM),扫描透射电镜 (STEM),超高压电镜(UHVEM)
第一节透射电镜
一、基本构造
(一)电子光学系统 １电子抢 ２磁电子透镜 ３样品室 ４观察记录装置 ５真空系统
电镜与普通电镜的区别：1光源是电子束2.电磁透镜3.环境真空电镜的结构：照明系统、成像系统、观察记录系统。
(二)真空系统
l·机械泵 2·扩散泵
3．为什么要求真空?
气体分子与高速运动的电子碰撞，发生散射，引起弦光并使成像的反差偏低；气体电离放电，电子束不稳定；气体还会污染样品表面，降低成像的质量；灼热的灯丝遇会受腐蚀而容易断裂。
(三)供电系统
１小电流高压电源,加速电子和加热灯丝２大电流低压电源：电子透镜聚焦和成像
透射电镜的成像原理
(一)电子束与样品的相互作用
1·电子束与样品相互作用后产生的信息
2．与透射电镜成像有关的信息 (1)透射电子 (2)非弹性散射电子 (3)小角度弹性散射电子
(二)样品的成像反差
(三)成像原理
透射电镜性能与应用
透射电镜的分辨率与放大倍数 1,分辩率 2,放大倍数
透射电镜性能适用于透射电镜的样品
透射电镜的操作程序
1．开机
2．调试照明系统 (1)加高压 (2)加灯丝电流 (3)合轴 (4)装入样品 (5)调整z位置控制 (6)插入物镜活动光阑
3．观察与拍照 (1）选择视野 (2)改变放大倍数 (3)聚焦 (4)拍照
4．换版 (1)预抽底版真空 (2)换版 (3)预抽照相室真空
5．关机 (1)关闭灯丝电流 (2)关闭高压 (3)关闭总电源 (4)关闭循环水阀门
扫描电子显微镜
扫描电镜的成像原理
扫描电镜的仪器结构
1．电子光学系统,(1)电子枪 (2)聚光镜和物镜 (3)扫描线圈 (4)样品室
2．信号检测与显示系统,(1)二次电子检测器 (2)信号放大单元 (3)图像显示单元 (4) 操作控制单元
3．真空系统,(1)机械泵 (2)扩散泵扫描电镜的使用操作
1,开机：抽真空30 分钟 2．装入或更换样品
3．观察条件的选择 4．图像的选择与调整 5,关机超显微结构制样技术
电子束的穿透能力较弱 生物样品厚度 l0 ～100nm
制备程序,取材、固定、漂洗、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色
程序,取材
1．取材的要求,尽可能保持生物体生活状态的结构。取材操作必须做到以下几点,
(1 )低温：0 ～4℃，所用固定液及容器 应预先冷却。
(2)防损伤,取材器械要锋利，动作要轻巧。
(3)准：电镜视野很小，选择部位要准确取材
(4)快,切取组织时速度要快,1分钟之内浸入固定液。
(5)小：进入固定液的样品块要小，一般不超过mm３或截面为1mm２的小长条。
取材的方法
(1)动物材料,将动物迅速杀死并解剖，取出所需组织器官，用锋利的刀片切取一小块组织，立即放在滴有冷固定液的塑料板上细切，切成lmm3的小块，放入盛有冷固定液的小瓶中固定。
(2)植物材料：尽快放入固定液中，使样品沉到固定液的底部。一般植物叶片常切成1mm宽，2～3mm长的小条，茎和根可根据需要切成小条或lmm3的小块。表面有蜡质的叶片在50％乙醇溶液中 泡几秒至几十秒进行脱蜡，取出后用双蒸水清洗数次，再进行切取。
取材的方法
(3)体外培养细胞,先倒出培养液，加入适量的戊二醛固定液，冰浴 3～5分钟，用橡皮刮子轻轻刮下贴璧的细胞，将含有细胞的固定液移入离心管中,2000r ／min低速离心15～20分钟，使细胞聚成团块，弃去上清液，加入新鲜固定液。
(4)不易形成团块的材料：液体培养细胞、血液等离心后细胞不易形成团块的材料，先离心形成松散的小团块，然后轻轻地悬浮在固定液中，固定后再离心成松散的小团块。弃去固定液，用热吸管吸一滴已加热溶化并冷却到500C的2％琼脂加到细胞团中使细胞悬浮，进行预包埋，再用吸管取出放于载玻片上铺成薄层，固化后切成lmm3小块 。
固定
固定：用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程。化学固定法较为常用。
目的,使细胞中各种细胞器及大分子尽可能真实地保持生活状态的结构，并牢固地固定在它原来的位置上，而且不会因一系列后继的处理使其移位或丢失 。
固定剂化学固定剂可分为两大类：
凝固固定剂：丙酮、乙醇，醋酸、苦味酸等，它们使蛋白质发生凝聚沉淀。破坏了蛋白质的分子结构，仅适用于光镜样品的固定。
非凝固固定剂：四氧化锇、醛类、高锰酸钾、重铬酸钾等，它们和蛋白质化学结合并形成分子间的交联，能较好保存蛋白质的分子结构。适用于电镜样品的固定。
理想的固定剂
(1)能迅速而又均匀地渗入组织细胞内，并能尽快地杀死细胞以减少细胞自溶。
(2)能稳定细胞物质成分，如核蛋白、核酸、糖类等使之发生交联，减少或避免在脱水、渗透及包埋过程中的抽提作用。
(3)能避免细胞结构膨胀或收缩，不产生人工假像或变形，保 证获得真实的电镜图像．
(4)能提供一定的电子反差。
几种常用固定剂
1)四氯化锇：(锇酸)其水溶液在室温下易挥发，极毒，极易还原变黑，配制和使用时需要在强通风橱中进行 。
优点：是一种强氧化剂，A.使蛋白质得以固定；B.固定不饱和脂肪酸；C.固定脂蛋白、核蛋白；D.强烈的电子染色作用 。
缺点：A．渗透能力较弱(O.1～o．3mm／h)，很容易固定不均匀；B．固定时间 l～2小时较为适宜，长时间固定组织更易溶解，变脆；C．不能保存糖元也不能固定核酸 ；D．锇酸是酶的钝化剂，不能用于细胞化学的研究
(2)戊二醛优点,A．对组织的渗透力较强，固定速度快(o．4mm／h) B．较长时间的固定不会使组织变脆 c．对糖元．核蛋白，尤其是对微管、内质网等细胞膜系统和细胞基质有较好的固定作用 D．不易使酶失活。可用于细胞组织化学的研究。
缺点 A．不能保存脂肪； B．无电子染色作用，图像反差较差。
上述两种固定剂各有其优缺点多采用戊二醛-四氧化锇双固定法,即先用戊二醛初固定,再用四氧化锇后固定。
缓冲液固定液是由某种固定剂和适当的缓冲液配制而成的。
缓冲液主要作用：维持稳定的pH值，使固定液保持生理pH值；提供适宜的渗透压，使细胞不发生肿胀或收缩；提供适宜的离子成分，使生物样品既不发生抽提，也不沉淀。缓冲液的渗透压可通过加入葡萄糖、蔗糖来调节 。
常用的缓冲液
)磷酸盐缓冲液
A．0．2mol／L磷酸缓冲液
甲液：0．2mol／L磷酸氢二钠溶液
Na 2HPO4·2H2O 35．61 g
或Na 2HPO4·7H2O 53．65 g
或Na 2HPO4·12H2O 71．64 g
加蒸馏水溶解至 1000ml
乙液：0．2mol／L磷酸二氢钠溶液
NaH2PO4 ·H2O 27．60 g
或NaH2PO4 · 2H2O 31．21 g
加蒸馏水溶解至 1000ml
0．2mol／L磷酸缓冲液的配制
0.2mol／L二钾胂酸盐缓冲液
Na(CH３)２·AsO２·3H２O 4．28g
0．1mol／L盐酸 约16ml
双蒸水加至 100ml
用0．1mol／L盐酸调pH7．2～7．4。
本液长期保存比较稳定，不易长菌。适用于电镜组织化学研究 。
常用的固定液
(1)磷酸缓冲戊二醛固定液(0．1mol／L)
四氧化锇固定液：
1,2％四氧化锇贮备液：
0·5 g四氧化锇(结晶)溶解于25rid双蒸水中
2,1％四氧化锇固定液：
取2％四氧化锇贮备液用等量0．2mo|／L磷酸缓冲液或二钾胂酸钠缓冲液稀释
影响固定效果的因素
(1)固定液的pH值：动物组织pH值7．2～7．4,植物组织常用pH6．8～7．1 。
(2)固定液的浓度：戊二醛常用浓度为1～3％，四氧化锇一般为1～2％ 。
(3)固定液的渗透压
(4)组织块大小：固定液的渗透速度慢，组织块一定要小。
(5)固定温度：通常在O~4０C固定。
漂冼
戊二醛与四氧化锇产生氧化还原反应生成细致的沉淀，四氧化锇与脱水剂也会发生反应生成沉淀，因此在双固定之间和在脱水前必须用相应的缓冲液充分漂洗，漂洗时间一般为30~60mid，也可几小时或过夜，其间更换几次漂洗液。
脱水
常用的包埋剂是非水溶性的，因此样品必须用脱水剂把组织细胞内的游离水去除干净。
常用的脱水剂：乙醇和丙酮。
采用运级脱水．即逐级升高脱水剂的浓度，逐步把水分置换出来的方法。 50％一70％一80％一90％一95％一100％(3次)，样品在每一浓度停留10～20min。
脱水一定要彻底．特别是无水乙醇(或丙酮)中不能含有水分。
渗透、包埋与聚合
理想的包埋剂应具备以下条件：粘度低。容易渗入组织。聚合均匀充分．聚合后体积收缩小，组织无变形，对细胞成分提取少，精细结构保存良好，透明度好；在电镜高倍放大下不显示结构，能耐受电子束的轰击，有良好的切割性能，切片易染色。对人体无害。
最常用的包埋剂是环氧树脂，优点是聚合均匀。收缩率小(小于2％)，不易生成气泡，在电子束的轰击下切片十分稳定，能很好地保存细胞的精细结构。
常用包埋剂
(1)Epon 812,
冬季：Epon 812 13ml,DDSA 8ml NMA 7ml
夏季：Epon 812 13ml,DDSA 7m1 NMA 8ml
配好混合液后可置于冰箱内保存备用，使用前以1．5～2％的体积比．逐滴加入DMP-30，并充分搅匀 。
常用包埋剂
(2 )618包埋剂,
环氧树脂618 5ml
DDSA 2ml
NMA 2．5ml
DBP 1．5ml
DMP-30 l～1．5％
依次棍合前4种于40～50０C下搅拌20～30min，逐滴加入DMP-30，再充分搅拌后放置37０C温箱中使气泡逸出渗透渗透,用包埋剂逐步渗入组织细胞内取代脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被包埋剂填充。即用包埋剂逐步取代脱水剂。样品置于100％丙酮及等量包埋剂混合液中渗透数小时，再将样品置于纯包埋剂中过夜或更长。如用乙醇作为脱水剂，样品在进入包埋剂前应用环氧丙烷或丙酮过渡。
包埋与聚合包埋与聚合,将渗透好的组织块放入适当的模具中，灌满包埋剂包埋，再经加温使包埋剂聚合成坚硬的固体。
包埋,(1)常规包埋 (2)定向包埋 (3)倒扣胶囊，包埋室内湿度最好在60 ％左右。
聚合,恒温箱中加温聚合。 聚合时间：一般为37０C12小时，45０C12小时· 60０C 24小时 ；也可在60０C一次聚合４8小时 。
超薄切片
1,支持膜的制备,
铜网上覆盖的这层薄膜叫支持膜，厚度约200A，透明无结构．能承受电子束的轰击。常用的支持膜为Formvar (聚乙烯醇缩甲醛),用氯仿配制 0．3％Formvar制膜液。
2．玻璃刀的制作：
钻石刀质地坚硬锋利，经久耐用，但其价格昂贵，操作要求也很严格。玻璃刀，其制作简便，价格低廉，但刀刃不耐用。
3,包埋块的修整,
4．超薄切片：装包埋块．装玻璃刀，检查刀刃．调节样品与刀刃的关系，加槽液，选择切片速度，切片,捞切片。
超薄切片的染色
光学显微镜切片是经过各种生物染料染色后呈现不同颜色，以此来识别各种组织结构。
超薄切片的染色以组织细胞 的不同结构对电子散射程度不同，而显示出各种超微结构，染色的目的是增强样品中各种结构 的电子散射能力,提高样品的反差，只呈现黑白对比。
电子染色,利用某些重金属盐(如铀，铅、锇、钨等)能与细胞的某些结构成分相结合．以增强电子散射能力，从而达到提高样品反差的目的。
超薄切片常用的染色液普遍采用双重染色法，即先用铀染色，再用铅染色。
(1)醋酸双氧铀,能与组织细胞内大多数成分结合，但对膜结构染色效果较差。用50％或70％乙醇配制，染色液一般用1－3％的饱和溶液。淡黄色，最适pH值为4～5。对光不稳定，应密封避光冷藏，其有一定的放射性和化学毒性。
(2)柠檬酸铅,具有很高的电子密度，对细胞各结构成分均显示极大的亲和力，尤其对细胞膜系统及脂类物质的反差很好
硝酸铅 Pb(NO３)２ l,33 g
柠檬酸钠 Na３C６H５O７·2H２O 1．76 g
双蒸水 30ml
上述成分充分混匀后加入１ N氢氯化钠水溶液8ml,使溶液透明，然后再用双蒸水加至50m1 。
超薄切片的染色常用滴染法,
1．铀染,将醋酸双氧铀染液滴于蜡盘中，将捞有切片的铜网（有切片面）朝下漂浮在染液液滴上,避光染色15~30min。用镊子夹持铜网依次在3个盛有重蒸水的小烧杯中作上下运动以进行清洗。每回清洗各20~30次，再用滤纸尖吸去水分。
2．铅染,另一蜡盘中的四周放一些固体氢氧化钠。柠檬酸铅染液滴于蜡盘中,将铀染后的铜网切片面朝下漂浮在染液液滴上，盖严蜡盘盖，染色10~20min，在另外3杯重蒸水中清洗后吸干备用。
负染色技术正染色,超薄切片的染色是用某些染色剂增强样品结构本身的电子密度，在图像中呈现黑色，背景未被染色而呈现光亮 。
负染色,是用某些高电子密度的物质包围低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑色，而样品却呈现透明的光亮，这样在黑色的背景中就很清晰地反衬出光亮的样品形貌 。
负染色技术：快速简易，而且分辨率高(可达20A) 。可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、大小及表面结构的特征 。
常用的负染色液
应具有较高的电子密度和较强的电子散射能力以产生足够的图像反差，在电子束的轰击下不升华，溶解度大，不易析出沉淀，而且在电镜下不呈现可见结构，分子小，容易渗入不规则表面的凹陷中，与样品不发生化学反应等特征。
1．磷钨酸钾 (PTA)：包括磷钨酸钾(KPT)和磷钨酸钠(NaPT),用重蒸水配成l～3％的水溶液使用时，应用1N氢氧化钠溶液将负染液的pH值调至6．4～7．O,可保存在室温下，比较稳定。适用于大多数直接取样的样品和纯化样品，颗粒细，反差良好，图像背景干净，杂质少。缺点是显示样品结构细节较差。
常用的负染色液
2．醋酸铀：用重蒸水配成 0．2～ 0．5％水溶液，pH4．5左右。醋酸铀对光不稳定，避光保存。能较好地显示病毒颗粒结构的细节，反差较强，对样品的破坏作用小，缺点是细小的颗粒性的杂质较多，需过滤后使用。
3．甲酸铀,适用于具螺旋对称的病毒颗粒,能显示出病毒的蛋白质亚基结构，用重蒸水配成O．5～1％水溶液，pH值为3·5,使用时用lN氢氧化钠将pH值调至4．5～5．2。甲酸铀极不稳定。
4．钼酸铵：适用于有界膜的生物样品的负染，反差较弱，但性能稳定，破坏作用小。一般用重蒸永配成1～2％水溶液，使用时用盐酸或氨水调pH4．0～9．O。
染色方法
1．滴染法,
(1)先将样品制备成适当浓度的悬浮液，用细滴管吸取悬液滴在有支持膜的铜网上使其形成一小液滴。静置片刻，用小滤纸尖在铜网边缘吸去多余的样品，使样品在铜网上仅留一薄层液膜，在液膜未干时滴上染液，染色1-2min，用滤纸尖在铜网边缘吸去染液，自然干后即可观察。这是常规的负染方法。
(2)有些样品(如病毒)的悬液滴在铜网上形成边缘分布，用滤纸吸时丢失的样品较多，可用微量加样器在铜网中部加一小滴样品悬液。放在自然状态下(或放在灯下微加热)，待液滴未干时加一小滴染液，令其自然干燥。这种方法对一些浓度低的样品可有较好的效果。
2．漂浮法：在封口膜上滴几滴样品悬液，再将有支持膜的铜网膜面朝下漂浮在样品液滴上。漂浮片刻，样品被吸附在铜网的支持膜上，取出铜网用滤纸尖吸去样品余液，铜网上仅留一薄层液膜，待液膜未干时，放于染液的液滴上漂浮。染色1～2min后吸去染液，自然干燥。也可在染液液滴中加入少量样品，混匀，将有支持膜的铜网漂浮在混合液面上，用滤纸吸去余液后自然干燥。
负染色应注意的问题
1．负染色液的pH值,
2,样品悬液的pH值：一般应使样品悬液呈中性或稍偏酸性(pH6～7为宜) 。
3,样品悬液的纯度：需提纯
4．样品与染液的均匀分布：采用某些分散剂
(1)牛血清白蛋白(BSA),适用于高度纯化的颗粒性悬液，方法是把0·005－0·05％牛血清白蛋白溶液加到样品悬液内。
(2)杆菌肽,接30－50mg／ml的浓度配制成水溶液，作为沉淀物的稀释液。
5．染色时机：一般应在滤纸吸去样品悬液之后稍等片刻，在看不见残留的液体但又未干燥时滴加染液。
扫描电镜样品制备技术
多数生物样品有两个弱点,一是含有较多的水分，而且去掉水分发生变形；二是干燥后的样品不导电。干燥和导电是扫描电镜制样的关键。如何把生物样品干燥而又不产生形变?目前有多种方法，空气干燥法、临界点干燥法、真空干燥法、冰冻干燥法等等。
一常规方法
1．取材：取样时要准确。体积不宜过大，以减少不必要的观察量。并且解剖用具要锋利，动作要轻巧，防止因挤压而损伤样品。
2．固定：一般进行双固定，即先用1％～3％的戊二醛／缓冲液在室温或4℃下前固定，再用1％锇酸／缓冲液在4℃下固定10~60分钟。
3．清洗,(1)蛋白酶消化法,(2)去除粘液法 (3)超声法
4 脱水和置换：系列乙醇或丙酮逐级脱水．用乙酸异戊酯置换100％的乙醇。
5 干燥：临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等
6 喷涂：喷涂要在真空条件下进行真空喷镀法和离子溅射法干燥样品的方法
一、临界点干燥
基本原理：在一定的温度和压力之下，某物质的液态和气态界面消失，由液态瞬间转化为气态。此时的温度即该物质的临界温度也就是该物质的临界点(C．P),此时某物质在其气液面消失的状态下,表面张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。
二、临界点干燥的程序
(1)置换：用乙酸异戊酯置换100％乙醇。
(2)仪器准备：检查仪器的捧放系统注入少量液体二氧化碳，再用放气阀排出．以检查排放是否通畅。同时对样品室预降温 。
(3)准备样品：将样品正面朝上放好，并盖牢。
(4)注入液体二氧化碳：缓慢注入样品室约60％～80％的体积。
(5)调温：控温20 ℃保持15－20分钟，使液体二氧化碳充分置换乙酸异戊酯，再调至35－4０℃之间，使压力维持在73kg／cm2以上，稳定后维持5－10分钟。
(6)排气：缓慢排出。
(7)取样,气压降至零后，取出样品，迅速放入玻璃干燥器中。
导电法
金属镀膜法：先把样品粘在样品台上(一般为铜块)，再镀上一层很薄的，并且非常均匀的金属膜(一般镀20nm厚的金)。
(一)离子溅射镀膜法（离子喷涂法）：
低真空条件下，位于阴极的金属物质进行辉光放电时，由于空气离子的冲击作用，金属原子(或分子) 均匀地飞散落在已粘有样品的样品台上，样品台和样品的表面就会附着一层金属薄膜。
(二)真空喷镀镀膜法：
在真空条件下，把某些金属丝加热到一定的温度时，该金属就会急剧地蒸发。蒸发的金属原子(或分子)就会喷落样品台表面，使其覆盖上一层金属薄膜。
二．直接观察法
1,固体样品的直接观察法：2,活体样品的直接观察法,
三．游离细胞的观察法
1．滤纸吸附法,2．金属片法：3．玻璃片法,
教材：陈力编著.《生物电子显微技术教程》北京师范大学出版社 1998
参考教材：（1） 张丰德等,现代生物学技术 南开大学出版社 1996
（2） 林钧安等,实用生物电子显微术 辽宁科学出版社 1989
（3） 朱宜等,电子显微镜的原理和使用 北京大学出版社 1983
（4） 洪涛等,生物医学超微结构与电子显微镜技术 科学出版社 1996
电子显微镜意义1、光学显徽镜,细菌和细胞2、电子显微镜,病毒、噬菌体、类病毒、DNA和蛋白质大分子
电镜技术的应用与未来
先进的仪器和花样翻新的样品制备技术、生物科学、医学科学、农林科学、材料科学
第一章 基本知识透射电镜(TEM),扫描电镜(SEM),扫描透射电镜 (STEM),超高压电镜(UHVEM)
第一节透射电镜
一、基本构造
(一)电子光学系统 １电子抢 ２磁电子透镜 ３样品室 ４观察记录装置 ５真空系统
电镜与普通电镜的区别：1光源是电子束2.电磁透镜3.环境真空电镜的结构：照明系统、成像系统、观察记录系统。
(二)真空系统
l·机械泵 2·扩散泵
3．为什么要求真空?
气体分子与高速运动的电子碰撞，发生散射，引起弦光并使成像的反差偏低；气体电离放电，电子束不稳定；气体还会污染样品表面，降低成像的质量；灼热的灯丝遇会受腐蚀而容易断裂。
(三)供电系统
１小电流高压电源,加速电子和加热灯丝２大电流低压电源：电子透镜聚焦和成像
透射电镜的成像原理
(一)电子束与样品的相互作用
1·电子束与样品相互作用后产生的信息
2．与透射电镜成像有关的信息 (1)透射电子 (2)非弹性散射电子 (3)小角度弹性散射电子
(二)样品的成像反差
(三)成像原理
透射电镜性能与应用
透射电镜的分辨率与放大倍数 1,分辩率 2,放大倍数
透射电镜性能适用于透射电镜的样品
透射电镜的操作程序
1．开机
2．调试照明系统 (1)加高压 (2)加灯丝电流 (3)合轴 (4)装入样品 (5)调整z位置控制 (6)插入物镜活动光阑
3．观察与拍照 (1）选择视野 (2)改变放大倍数 (3)聚焦 (4)拍照
4．换版 (1)预抽底版真空 (2)换版 (3)预抽照相室真空
5．关机 (1)关闭灯丝电流 (2)关闭高压 (3)关闭总电源 (4)关闭循环水阀门
扫描电子显微镜
扫描电镜的成像原理
扫描电镜的仪器结构
1．电子光学系统,(1)电子枪 (2)聚光镜和物镜 (3)扫描线圈 (4)样品室
2．信号检测与显示系统,(1)二次电子检测器 (2)信号放大单元 (3)图像显示单元 (4) 操作控制单元
3．真空系统,(1)机械泵 (2)扩散泵扫描电镜的使用操作
1,开机：抽真空30 分钟 2．装入或更换样品
3．观察条件的选择 4．图像的选择与调整 5,关机超显微结构制样技术
电子束的穿透能力较弱 生物样品厚度 l0 ～100nm
制备程序,取材、固定、漂洗、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色
程序,取材
1．取材的要求,尽可能保持生物体生活状态的结构。取材操作必须做到以下几点,
(1 )低温：0 ～4℃，所用固定液及容器 应预先冷却。
(2)防损伤,取材器械要锋利，动作要轻巧。
(3)准：电镜视野很小，选择部位要准确取材
(4)快,切取组织时速度要快,1分钟之内浸入固定液。
(5)小：进入固定液的样品块要小，一般不超过mm３或截面为1mm２的小长条。
取材的方法
(1)动物材料,将动物迅速杀死并解剖，取出所需组织器官，用锋利的刀片切取一小块组织，立即放在滴有冷固定液的塑料板上细切，切成lmm3的小块，放入盛有冷固定液的小瓶中固定。
(2)植物材料：尽快放入固定液中，使样品沉到固定液的底部。一般植物叶片常切成1mm宽，2～3mm长的小条，茎和根可根据需要切成小条或lmm3的小块。表面有蜡质的叶片在50％乙醇溶液中 泡几秒至几十秒进行脱蜡，取出后用双蒸水清洗数次，再进行切取。
取材的方法
(3)体外培养细胞,先倒出培养液，加入适量的戊二醛固定液，冰浴 3～5分钟，用橡皮刮子轻轻刮下贴璧的细胞，将含有细胞的固定液移入离心管中,2000r ／min低速离心15～20分钟，使细胞聚成团块，弃去上清液，加入新鲜固定液。
(4)不易形成团块的材料：液体培养细胞、血液等离心后细胞不易形成团块的材料，先离心形成松散的小团块，然后轻轻地悬浮在固定液中，固定后再离心成松散的小团块。弃去固定液，用热吸管吸一滴已加热溶化并冷却到500C的2％琼脂加到细胞团中使细胞悬浮，进行预包埋，再用吸管取出放于载玻片上铺成薄层，固化后切成lmm3小块 。
固定
固定：用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程。化学固定法较为常用。
目的,使细胞中各种细胞器及大分子尽可能真实地保持生活状态的结构，并牢固地固定在它原来的位置上，而且不会因一系列后继的处理使其移位或丢失 。
固定剂化学固定剂可分为两大类：
凝固固定剂：丙酮、乙醇，醋酸、苦味酸等，它们使蛋白质发生凝聚沉淀。破坏了蛋白质的分子结构，仅适用于光镜样品的固定。
非凝固固定剂：四氧化锇、醛类、高锰酸钾、重铬酸钾等，它们和蛋白质化学结合并形成分子间的交联，能较好保存蛋白质的分子结构。适用于电镜样品的固定。
理想的固定剂
(1)能迅速而又均匀地渗入组织细胞内，并能尽快地杀死细胞以减少细胞自溶。
(2)能稳定细胞物质成分，如核蛋白、核酸、糖类等使之发生交联，减少或避免在脱水、渗透及包埋过程中的抽提作用。
(3)能避免细胞结构膨胀或收缩，不产生人工假像或变形，保 证获得真实的电镜图像．
(4)能提供一定的电子反差。
几种常用固定剂
1)四氯化锇：(锇酸)其水溶液在室温下易挥发，极毒，极易还原变黑，配制和使用时需要在强通风橱中进行 。
优点：是一种强氧化剂，A.使蛋白质得以固定；B.固定不饱和脂肪酸；C.固定脂蛋白、核蛋白；D.强烈的电子染色作用 。
缺点：A．渗透能力较弱(O.1～o．3mm／h)，很容易固定不均匀；B．固定时间 l～2小时较为适宜，长时间固定组织更易溶解，变脆；C．不能保存糖元也不能固定核酸 ；D．锇酸是酶的钝化剂，不能用于细胞化学的研究
(2)戊二醛优点,A．对组织的渗透力较强，固定速度快(o．4mm／h) B．较长时间的固定不会使组织变脆 c．对糖元．核蛋白，尤其是对微管、内质网等细胞膜系统和细胞基质有较好的固定作用 D．不易使酶失活。可用于细胞组织化学的研究。
缺点 A．不能保存脂肪； B．无电子染色作用，图像反差较差。
上述两种固定剂各有其优缺点多采用戊二醛-四氧化锇双固定法,即先用戊二醛初固定,再用四氧化锇后固定。
缓冲液固定液是由某种固定剂和适当的缓冲液配制而成的。
缓冲液主要作用：维持稳定的pH值，使固定液保持生理pH值；提供适宜的渗透压，使细胞不发生肿胀或收缩；提供适宜的离子成分，使生物样品既不发生抽提，也不沉淀。缓冲液的渗透压可通过加入葡萄糖、蔗糖来调节 。
常用的缓冲液
)磷酸盐缓冲液
A．0．2mol／L磷酸缓冲液
甲液：0．2mol／L磷酸氢二钠溶液
Na 2HPO4·2H2O 35．61 g
或Na 2HPO4·7H2O 53．65 g
或Na 2HPO4·12H2O 71．64 g
加蒸馏水溶解至 1000ml
乙液：0．2mol／L磷酸二氢钠溶液
NaH2PO4 ·H2O 27．60 g
或NaH2PO4 · 2H2O 31．21 g
加蒸馏水溶解至 1000ml
0．2mol／L磷酸缓冲液的配制
0.2mol／L二钾胂酸盐缓冲液
Na(CH３)２·AsO２·3H２O 4．28g
0．1mol／L盐酸 约16ml
双蒸水加至 100ml
用0．1mol／L盐酸调pH7．2～7．4。
本液长期保存比较稳定，不易长菌。适用于电镜组织化学研究 。
常用的固定液
(1)磷酸缓冲戊二醛固定液(0．1mol／L)
四氧化锇固定液：
1,2％四氧化锇贮备液：
0·5 g四氧化锇(结晶)溶解于25rid双蒸水中
2,1％四氧化锇固定液：
取2％四氧化锇贮备液用等量0．2mo|／L磷酸缓冲液或二钾胂酸钠缓冲液稀释
影响固定效果的因素
(1)固定液的pH值：动物组织pH值7．2～7．4,植物组织常用pH6．8～7．1 。
(2)固定液的浓度：戊二醛常用浓度为1～3％，四氧化锇一般为1～2％ 。
(3)固定液的渗透压
(4)组织块大小：固定液的渗透速度慢，组织块一定要小。
(5)固定温度：通常在O~4０C固定。
漂冼
戊二醛与四氧化锇产生氧化还原反应生成细致的沉淀，四氧化锇与脱水剂也会发生反应生成沉淀，因此在双固定之间和在脱水前必须用相应的缓冲液充分漂洗，漂洗时间一般为30~60mid，也可几小时或过夜，其间更换几次漂洗液。
脱水
常用的包埋剂是非水溶性的，因此样品必须用脱水剂把组织细胞内的游离水去除干净。
常用的脱水剂：乙醇和丙酮。
采用运级脱水．即逐级升高脱水剂的浓度，逐步把水分置换出来的方法。 50％一70％一80％一90％一95％一100％(3次)，样品在每一浓度停留10～20min。
脱水一定要彻底．特别是无水乙醇(或丙酮)中不能含有水分。
渗透、包埋与聚合
理想的包埋剂应具备以下条件：粘度低。容易渗入组织。聚合均匀充分．聚合后体积收缩小，组织无变形，对细胞成分提取少，精细结构保存良好，透明度好；在电镜高倍放大下不显示结构，能耐受电子束的轰击，有良好的切割性能，切片易染色。对人体无害。
最常用的包埋剂是环氧树脂，优点是聚合均匀。收缩率小(小于2％)，不易生成气泡，在电子束的轰击下切片十分稳定，能很好地保存细胞的精细结构。
常用包埋剂
(1)Epon 812,
冬季：Epon 812 13ml,DDSA 8ml NMA 7ml
夏季：Epon 812 13ml,DDSA 7m1 NMA 8ml
配好混合液后可置于冰箱内保存备用，使用前以1．5～2％的体积比．逐滴加入DMP-30，并充分搅匀 。
常用包埋剂
(2 )618包埋剂,
环氧树脂618 5ml
DDSA 2ml
NMA 2．5ml
DBP 1．5ml
DMP-30 l～1．5％
依次棍合前4种于40～50０C下搅拌20～30min，逐滴加入DMP-30，再充分搅拌后放置37０C温箱中使气泡逸出渗透渗透,用包埋剂逐步渗入组织细胞内取代脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被包埋剂填充。即用包埋剂逐步取代脱水剂。样品置于100％丙酮及等量包埋剂混合液中渗透数小时，再将样品置于纯包埋剂中过夜或更长。如用乙醇作为脱水剂，样品在进入包埋剂前应用环氧丙烷或丙酮过渡。
包埋与聚合包埋与聚合,将渗透好的组织块放入适当的模具中，灌满包埋剂包埋，再经加温使包埋剂聚合成坚硬的固体。
包埋,(1)常规包埋 (2)定向包埋 (3)倒扣胶囊，包埋室内湿度最好在60 ％左右。
聚合,恒温箱中加温聚合。 聚合时间：一般为37０C12小时，45０C12小时· 60０C 24小时 ；也可在60０C一次聚合４8小时 。
超薄切片
1,支持膜的制备,
铜网上覆盖的这层薄膜叫支持膜，厚度约200A，透明无结构．能承受电子束的轰击。常用的支持膜为Formvar (聚乙烯醇缩甲醛),用氯仿配制 0．3％Formvar制膜液。
2．玻璃刀的制作：
钻石刀质地坚硬锋利，经久耐用，但其价格昂贵，操作要求也很严格。玻璃刀，其制作简便，价格低廉，但刀刃不耐用。
3,包埋块的修整,
4．超薄切片：装包埋块．装玻璃刀，检查刀刃．调节样品与刀刃的关系，加槽液，选择切片速度，切片,捞切片。
超薄切片的染色
光学显微镜切片是经过各种生物染料染色后呈现不同颜色，以此来识别各种组织结构。
超薄切片的染色以组织细胞 的不同结构对电子散射程度不同，而显示出各种超微结构，染色的目的是增强样品中各种结构 的电子散射能力,提高样品的反差，只呈现黑白对比。
电子染色,利用某些重金属盐(如铀，铅、锇、钨等)能与细胞的某些结构成分相结合．以增强电子散射能力，从而达到提高样品反差的目的。
超薄切片常用的染色液普遍采用双重染色法，即先用铀染色，再用铅染色。
(1)醋酸双氧铀,能与组织细胞内大多数成分结合，但对膜结构染色效果较差。用50％或70％乙醇配制，染色液一般用1－3％的饱和溶液。淡黄色，最适pH值为4～5。对光不稳定，应密封避光冷藏，其有一定的放射性和化学毒性。
(2)柠檬酸铅,具有很高的电子密度，对细胞各结构成分均显示极大的亲和力，尤其对细胞膜系统及脂类物质的反差很好
硝酸铅 Pb(NO３)２ l,33 g
柠檬酸钠 Na３C６H５O７·2H２O 1．76 g
双蒸水 30ml
上述成分充分混匀后加入１ N氢氯化钠水溶液8ml,使溶液透明，然后再用双蒸水加至50m1 。
超薄切片的染色常用滴染法,
1．铀染,将醋酸双氧铀染液滴于蜡盘中，将捞有切片的铜网（有切片面）朝下漂浮在染液液滴上,避光染色15~30min。用镊子夹持铜网依次在3个盛有重蒸水的小烧杯中作上下运动以进行清洗。每回清洗各20~30次，再用滤纸尖吸去水分。
2．铅染,另一蜡盘中的四周放一些固体氢氧化钠。柠檬酸铅染液滴于蜡盘中,将铀染后的铜网切片面朝下漂浮在染液液滴上，盖严蜡盘盖，染色10~20min，在另外3杯重蒸水中清洗后吸干备用。
负染色技术正染色,超薄切片的染色是用某些染色剂增强样品结构本身的电子密度，在图像中呈现黑色，背景未被染色而呈现光亮 。
负染色,是用某些高电子密度的物质包围低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑色，而样品却呈现透明的光亮，这样在黑色的背景中就很清晰地反衬出光亮的样品形貌 。
负染色技术：快速简易，而且分辨率高(可达20A) 。可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、大小及表面结构的特征 。
常用的负染色液
应具有较高的电子密度和较强的电子散射能力以产生足够的图像反差，在电子束的轰击下不升华，溶解度大，不易析出沉淀，而且在电镜下不呈现可见结构，分子小，容易渗入不规则表面的凹陷中，与样品不发生化学反应等特征。
1．磷钨酸钾 (PTA)：包括磷钨酸钾(KPT)和磷钨酸钠(NaPT),用重蒸水配成l～3％的水溶液使用时，应用1N氢氧化钠溶液将负染液的pH值调至6．4～7．O,可保存在室温下，比较稳定。适用于大多数直接取样的样品和纯化样品，颗粒细，反差良好，图像背景干净，杂质少。缺点是显示样品结构细节较差。
常用的负染色液
2．醋酸铀：用重蒸水配成 0．2～ 0．5％水溶液，pH4．5左右。醋酸铀对光不稳定，避光保存。能较好地显示病毒颗粒结构的细节，反差较强，对样品的破坏作用小，缺点是细小的颗粒性的杂质较多，需过滤后使用。
3．甲酸铀,适用于具螺旋对称的病毒颗粒,能显示出病毒的蛋白质亚基结构，用重蒸水配成O．5～1％水溶液，pH值为3·5,使用时用lN氢氧化钠将pH值调至4．5～5．2。甲酸铀极不稳定。
4．钼酸铵：适用于有界膜的生物样品的负染，反差较弱，但性能稳定，破坏作用小。一般用重蒸永配成1～2％水溶液，使用时用盐酸或氨水调pH4．0～9．O。
染色方法
1．滴染法,
(1)先将样品制备成适当浓度的悬浮液，用细滴管吸取悬液滴在有支持膜的铜网上使其形成一小液滴。静置片刻，用小滤纸尖在铜网边缘吸去多余的样品，使样品在铜网上仅留一薄层液膜，在液膜未干时滴上染液，染色1-2min，用滤纸尖在铜网边缘吸去染液，自然干后即可观察。这是常规的负染方法。
(2)有些样品(如病毒)的悬液滴在铜网上形成边缘分布，用滤纸吸时丢失的样品较多，可用微量加样器在铜网中部加一小滴样品悬液。放在自然状态下(或放在灯下微加热)，待液滴未干时加一小滴染液，令其自然干燥。这种方法对一些浓度低的样品可有较好的效果。
2．漂浮法：在封口膜上滴几滴样品悬液，再将有支持膜的铜网膜面朝下漂浮在样品液滴上。漂浮片刻，样品被吸附在铜网的支持膜上，取出铜网用滤纸尖吸去样品余液，铜网上仅留一薄层液膜，待液膜未干时，放于染液的液滴上漂浮。染色1～2min后吸去染液，自然干燥。也可在染液液滴中加入少量样品，混匀，将有支持膜的铜网漂浮在混合液面上，用滤纸吸去余液后自然干燥。
负染色应注意的问题
1．负染色液的pH值,
2,样品悬液的pH值：一般应使样品悬液呈中性或稍偏酸性(pH6～7为宜) 。
3,样品悬液的纯度：需提纯
4．样品与染液的均匀分布：采用某些分散剂
(1)牛血清白蛋白(BSA),适用于高度纯化的颗粒性悬液，方法是把0·005－0·05％牛血清白蛋白溶液加到样品悬液内。
(2)杆菌肽,接30－50mg／ml的浓度配制成水溶液，作为沉淀物的稀释液。
5．染色时机：一般应在滤纸吸去样品悬液之后稍等片刻，在看不见残留的液体但又未干燥时滴加染液。
扫描电镜样品制备技术
多数生物样品有两个弱点,一是含有较多的水分，而且去掉水分发生变形；二是干燥后的样品不导电。干燥和导电是扫描电镜制样的关键。如何把生物样品干燥而又不产生形变?目前有多种方法，空气干燥法、临界点干燥法、真空干燥法、冰冻干燥法等等。
一常规方法
1．取材：取样时要准确。体积不宜过大，以减少不必要的观察量。并且解剖用具要锋利，动作要轻巧，防止因挤压而损伤样品。
2．固定：一般进行双固定，即先用1％～3％的戊二醛／缓冲液在室温或4℃下前固定，再用1％锇酸／缓冲液在4℃下固定10~60分钟。
3．清洗,(1)蛋白酶消化法,(2)去除粘液法 (3)超声法
4 脱水和置换：系列乙醇或丙酮逐级脱水．用乙酸异戊酯置换100％的乙醇。
5 干燥：临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等
6 喷涂：喷涂要在真空条件下进行真空喷镀法和离子溅射法干燥样品的方法
一、临界点干燥
基本原理：在一定的温度和压力之下，某物质的液态和气态界面消失，由液态瞬间转化为气态。此时的温度即该物质的临界温度也就是该物质的临界点(C．P),此时某物质在其气液面消失的状态下,表面张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。
二、临界点干燥的程序
(1)置换：用乙酸异戊酯置换100％乙醇。
(2)仪器准备：检查仪器的捧放系统注入少量液体二氧化碳，再用放气阀排出．以检查排放是否通畅。同时对样品室预降温 。
(3)准备样品：将样品正面朝上放好，并盖牢。
(4)注入液体二氧化碳：缓慢注入样品室约60％～80％的体积。
(5)调温：控温20 ℃保持15－20分钟，使液体二氧化碳充分置换乙酸异戊酯，再调至35－4０℃之间，使压力维持在73kg／cm2以上，稳定后维持5－10分钟。
(6)排气：缓慢排出。
(7)取样,气压降至零后，取出样品，迅速放入玻璃干燥器中。
导电法
金属镀膜法：先把样品粘在样品台上(一般为铜块)，再镀上一层很薄的，并且非常均匀的金属膜(一般镀20nm厚的金)。
(一)离子溅射镀膜法（离子喷涂法）：
低真空条件下，位于阴极的金属物质进行辉光放电时，由于空气离子的冲击作用，金属原子(或分子) 均匀地飞散落在已粘有样品的样品台上，样品台和样品的表面就会附着一层金属薄膜。
(二)真空喷镀镀膜法：
在真空条件下，把某些金属丝加热到一定的温度时，该金属就会急剧地蒸发。蒸发的金属原子(或分子)就会喷落样品台表面，使其覆盖上一层金属薄膜。
二．直接观察法
1,固体样品的直接观察法：2,活体样品的直接观察法,
三．游离细胞的观察法
1．滤纸吸附法,2．金属片法：3．玻璃片法,
