生物技术与应用重组 DNA技术与 基因工程华东理工大学 张惠展重组 DNA技术与 基因工程
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重组 DNA技术与基因工程的基本概念重组 DNA技术与基因工程的基本原理重组 DNA技术所需的基本条件重组 DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化
A 重组 DNA技术 的基本定义
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念重组 DNA技术 是指将一种生物体（ 供体 ）的基因与载体 在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（ 受体 ）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术 。
因此,供体、受体、载体 是重组 DNA技术的三大基本元件。
B 基因工程的基本定义
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念基因工程 是指重组 DNA技术的产业化设计与应用，
包括 上游技术 和 下游技术 两大组成部分。 上游技术 指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA技术）；而 下游技术 则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
C 重组 DNA技术 与基因工程的基本用途
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念分离、扩增、鉴定、研究、整理 生物信息资源大规模生产 生物活性物质设计、构建 生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质
D 基因工程的基本形式
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程
D 基因工程的基本形式
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念
C 重组 DNA技术 与基因工程的基本用途
B 基因工程的基本定义
A 重组 DNA技术 的基本定义
A 重组 DNA技术的理论基础
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学
20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学
1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质 DNA
1973年 伯格 -杰克森 -考恩 -鲍耶 DNA分子体外拼接分子遗传学
1953年 沃森 -克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学基因工程
B 基因的分子生物学
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理
C 基因工程的基本原理
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理提高外源基因的剂量 —— 分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如,启动子,
增强子,操作子,终止子,上游调控序列 等列,mRNA非编码区,密码子 等
—— 分子生物学原理修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如,SD序基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产
—— 生化工程学原理
—— 分子生物学原理
D 基因工程的支撑技术
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术
DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（ PCR） 技术
D 基因工程的支撑技术
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理
C 基因工程的基本原理
B 基因的分子生物学
A 重组 DNA技术 的理论基础
A 用于核酸操作的工具酶
3 重组 DNA技术所需的基本条件限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链 DNA分子中的特定序列，并切割 DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA的入侵细菌的限制与修饰作用
hsd R,编码限制性核酸内切酶
hsd M,编码限制性甲基化酶
hsd S,编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
1968年,Smith等人首先从 流感嗜血杆菌 d株中分离出
Hind II和 Hind III
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性 I 型 II 型 III 型限制修饰 多功能 单功能 双功能蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体辅助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg2+ SAMMg2+
识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC
AACN6GTGC CAGCAG
切割位点 距识别序列 1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割 特异性切割 24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名
H i n d III H i n d III
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链 DNA分子中 4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型 回文结构
5‘ … G C T G A A T T C G A G …
3’3‘ … C G A C T T A A G C T C …
5’
EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点
EcoRI等产生的 5‘粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH P
OHP
PstI等产生的 3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ 退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分 II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
DTT 1 mM
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
Volume 20 - 100 ml
T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准 DNA所需的酶量限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
5‘
… GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘
… CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ … GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ … GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4
2.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心 10分钟、干燥限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的纯度：
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇,EDTA,SDS,NaCl等加大酶的用量,1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的甲基化程度：
大肠杆菌中的 dam甲基化酶在 5‘ GATC3’序列中的腺 嘌呤 N6位引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I,MboI等，但 BamH I、
Bgl II,Sau3A I不受影响大肠杆菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH值 等，
会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的 Star activity现象
EcoR I在正常条件下识别并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过 5%（ v/v） 时，也可切割 5‘ PuPuATPyPy3’或者5‘ AATT3’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质修复双链 DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
nick
nick
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质修复与 RNA链结合的 DNA链上缺口处的磷酸二酯键
T4-DNA连接酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C …
5’ OHP nick
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C …
5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链 DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…
5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
ATP 0.5 - 1 mM
DTT 5 mM
Volume 10 - 20 ml
T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 ℃ 反应 1 小时，
完全连接 1 mg l-DNA（ Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶平头双链 DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（ 10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入 10% PEG8000,促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（ NaCl）,最终浓度 150-200 mM
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活性大肠杆菌 DNA聚合酶 I的基本性质：
3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-OH
5‘ ppp dN
Mg2+3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA pol I
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
缺口前移标记法大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的基本用途：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a-32P-dATP
）
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Nick translation
制备 32P标记的探针DNase I
DNA pol I
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本性质：
大肠杆菌 DNA聚合酶 I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得 N端三分之二的大肽段，即为 Klenow酶
Klenow酶仍拥有 5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性 和 3‘ →5 ‘
的核核酸外切酶活性,但失去了 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途：
补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
DNA片段的同位素末端标记
cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定 DNA序列
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow a-32P-pppdA dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA酶的基本特性：
在无 dNTP时，可以从任何 3‘ -OH端外切在只有一种 dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性和 3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,切平由核酸内切酶产生的 3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ T4-DNA聚合酶
5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C …
5’注意：该酶也能降解双链 DNA,只是其活性比单链降解活性低很多
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（ a-32P-
dATP）
5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH
HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘
T4-DNA pol
T4-DNA pol
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
DNA聚合酶依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,以 RNA为模板聚合 cDNA链
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
反转录酶 Mg2+ dNTP
5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA
DNA聚合酶依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,双向外切 DNA-RNA杂合链中的 RNA链反转录酶
3’ RNA
5’ DNA3’
5’
3’ RNA
5’ DNA3’
5’
反转录酶
5’ DNA3’
核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶 VII（ ExoVII）
大肠杆菌的核酸外切酶 VII不需要 Mg2+
ExoVII
3’
5’3’
5’
3’
5’ 3’
5’
核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ ExoIII）
ExoVII
3’
5’3’
5’
Mg2+
3’
5’3’
5’
大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从 3‘ 端外切核酸酶双链核酸外切酶,l 核酸外切酶 （ lExo）
lExo
3’
5’3’
5’
Mg2+
l核酸外切酶特异性地从 5‘ 端外切
3’
5’3’
5’
核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（ Aspergillus oryzae）
Zn2+必需最适 pH范围为 4.0 - 4.3
需要 NaCl 10 - 300 mM
降解单链 DNA的速度比降解双链 DNA快 75000倍降解单链 DNA的速度比降解单链 RNA快 7倍核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切单链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’
S1 Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T…
3’
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切带缺口或缺刻的双链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A…
5‘
nick
gap
S1
Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-
G3‘ … C-G-A-G-T-
C
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A…
5‘
核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的重要用途,在 DNA上定位 RNA（ S1 mapping）
DNA
mRNA
杂交
S1
EcoRI
核酸酶单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（ A.espejiana）
Ca2+
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
ssDNA or RNA
Ca2+
Ca2+
核酸酶单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的基本用途：诱发 DNA突变
EcoRI A
B C
EcoRIEcoRI
B C A
Bal31
B C A
环化
A
C
核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（ TdT）
TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的 DNA聚合酶,随机掺入 dNTPs
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Mg2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘
TdT的基本特性：
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO AAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAOH 3‘
p 5‘
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘AAAAAAAAAAA
核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（ CIP）
来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（ BAP）
5‘ p OH 3‘
DNA or RNA
5‘ ppp dN
5‘ pppN
BAP / CIP
OH 3‘5‘ HO
5‘ HO dN
5‘ HO N
核酸修饰酶
T4-多核苷酸磷酸激酶（ T4-PNP）
T4-PNP的基本特性：在 DNA,RNA,dNR,NR的 5‘ -OH上加磷
5‘ HO
3‘ HO
OH 3‘
OH 5‘
T4-PNP Mg2+ pppATP（ g-32P-ATP）
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
用于探针的末端同位素标记：
B 用于基因克隆的载体
3 重组 DNA技术所需的基本条件质粒（ plasmid）
噬菌体或病毒 DNA
考斯质粒（ cosmid） 与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有合适的筛选标记具有较 高的外源 DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是 DNA型的绝大多数的天然 DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，
即 cccDNA
质粒 DNA的分子量范围,1 - 300 kb
质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主复制质粒 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid
质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
rop
（ +）
Rop
RNA II
RNA I
3’
5’
5’
3’
质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ ori） 的结合
Pcop cop P/Orep rep ori
Cop Rep
质粒质粒的基本特征质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为 质粒的不相容性,不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1,pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101,F,RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成 不相容性群质粒质粒的基本特征质粒的不相容性,分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，
因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如 F,Col,R质粒等如 Col,R的其它成员非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ ColE1） 在接合型质粒的存在和协助下，也能发生 DNA转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定质粒质粒的基本特征携带特殊的遗传标记野生型的质粒 DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对 DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr
ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1
RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：
高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数 1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自 pSC101 拷贝数小于 10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头 polylinker
整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制
pBR3 2 2
4 3 6 3 b p
Or ig in o f Rep lic a t io n
ROP
ROI
S a l I
Bam H I
Tc
r
P v u I
P s t I
P s t I
E c o R I
Cla I
Hin d II I
Hin d II
Bal I
Ap
r
pBR322：
氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell
用于基因克隆质粒重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
拷贝数 2000 - 3000 / cell
用于基因克隆和测序装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
B a m HI
pU C 18
2 6 8 6 b p
Ap
r
l a c Z'
ori
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
396 452
E coRI S stI K p n I S m a I X b a I S a lI P stI S p h I Hi n d III
质粒重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19,正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/19
Plac lacZ’MCS
b-半乳糖苷酶的 a-肽段ab
O
H
H
H
OH
H
O H
H O H
CH 2 OH
O
N
Cl
Br
Cl
Br
Cl
Br
O
N
N
5-溴 -4-氯 -3-吲哚基 -b-D-半乳糖苷
X-gal
质粒重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z：
多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
用于外源基因的高效表达注意,T7和 SP6启动子特异性地由噬菌体 DNA编码的 RNA聚合
2743 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
pGEM-3E PSP6
酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如：
E.coli BL21（ DE3） 等质粒质粒 DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒 DNA：
氯化铯密度梯度离心法质粒 DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒 DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒 DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒质粒 DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加 CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取 cccDNA
稀释沉淀 cccDNA
proteins
ocDNA
L-DNA
cccDNA
RNAs
质粒质粒 DNA的分离纯化碱溶法：
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加 NaOH和 SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体 DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚 -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 DNA
用无 DNase的 RNase去除残余的 RNA
cccDNA
L-DNAocDNA
D-DNAT-DNA
质粒质粒 DNA的分离纯化沸水浴法：
用含有 EDTA和 Triton X-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴 40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒 DNA
噬菌体或病毒 DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。
噬菌体或病毒的上述特性使得它们的 DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体的生物学特性,生物结构
l 噬菌体是 大肠杆菌的温和型噬菌体
l 噬菌体 由外壳包装蛋白和 l-DNA组成
l-DNA全长 48502个核苷酸
l-DNA上 至少有 61个基因
l 噬菌体生物学特性,生物结构
5’ TCCAGCGGCGGGG 3’
3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS
COS
cos 头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因
DNA合成控制 基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因
l - DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期
E.coli
吸附 LamB受体注入 复制包装裂解噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期体内包装
100个左右的拷贝包装范围为原 DNA的 75 - 105%
即 36 - 51 kb
D
A
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,溶原状态
l噬菌体感染大肠杆菌后,除能裂解细胞外,也可能将其
DNA直接整合到宿主细胞的染色体 DNA上,并不产生子代噬菌体颗粒,这种情况为 溶原状态 。 整合主要由 l-DNA上的 cI和 int
两基因的产物所激活,而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质 。 人们可以根据需要改变 l-DNA或宿主细胞的性质,使噬菌体或处于 溶菌状态,或处于溶菌状态
DNA重组技术一般需要 l噬菌体进入溶菌状态噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度野生型 l-DNA包装的上限为 51kb,本身长度为 48.5kb,只有当插入的外源 DNA片段不大于 2.5kb时,才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒 。 因此缩短野生型 l-DNA的长度,可以提高装载量 。 其实野生型 l-DNA上约有 40-50%的片段是复制和裂解所非必需的 。 根据切除的多少,可将 l-DNA分成两大类载体：
插入型载体取代型载体噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度 37 kb
插入片段大小：
0 - 14 kb
（ 51 – 37）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度 10 kb
（ 51 – 26）
载体长度 26 kb
插入片段最大装载长度 25 kb
（ 36 – 26）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,删除重复的酶切位点野生型的 l-DNA链上有 5个 EcoRI位点和 7个 HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至 1 - 2个同时，为了便于各种来源的 DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记与质粒不同，野生型 l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装 选择标记是 l-DNA克隆载体构建的重要内容
l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：
免疫功能类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 imm434
imm434基因编码一种阻止 l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的 l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源 DNA插入到标记基因中，基因灭活,l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 lacZ
lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到 lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产生蓝色透明斑噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突变 。
大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因,其编码产物校正
tRNA能专一性地纠正这一突变 。
将野生型 l-DNA上 D和 E两个头部包装蛋白的基因中的 CAG密码子突变成 UAG。 当这种 l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后,不能合成有活性的头部蛋白,也就不能被包装和裂解细菌,这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散,而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的主要类型：
插入灭活型载体 Charon2,Charon6,lgt11
取代型载体 lEMBL4,lgtlc,lNM762,Charon40
正选择型载体 lEMBL1,lL47,l1059
野生型的 l噬菌体不能在 P2噬菌体溶源性 的细菌中繁殖（ Spi+），
这种生长抑制表型受 l-DNA上的 red和 gam两个基因控制。若将外源 DNA取代 red和 gam,重组 噬菌体便拥有 Spi-表型，能在 P2噬菌体 溶源性 的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA重组分子的体外包装：
l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒,方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了 l噬菌体的大肠杆菌中提取,现已商品化 。 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：
一部分缺少 E组份,另一部分则缺少 D组份 。 包装时,当且仅当这两部分包装蛋白与重组 l-DNA分子混合后,包装才能有效进行,任何一种蛋白包装液被重组 l-DNA污染后,均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒,这也是基于安全而设计的噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA及其重组分子的分离纯化：
将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期加入 l噬菌体或重组 l噬菌体的悬浮液,37℃ 培养 1小时用新鲜培养基稀释，继续培养 4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度已达 1013 -1014 / L,大肠杆菌细胞已完全裂解超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放 l-DNA
乙醇或异丙醇沉淀 l-DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA作为载体的优点：
l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌
l-DNA载体的装载能力为 25 kb,远远大于质粒的装载量重组 l-DNA分子 的筛选较为方便重组 l-DNA分子的提取较为简便
l-DNA载体适合克隆和扩增外源 DNA片段，但不适合表达外源基因噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,生物结构
M13噬菌体的外型呈丝状
M13 噬菌体 由外壳包装蛋白和 正 链 DNA组成
M13 DNA全长 6407个核苷酸
M13 DNA上 至少有 10个基因
2700个外壳蛋白分子
M13 噬菌体 不裂解宿主细胞，但抑制其生长噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,感染周期
+ DNA
（ +） DNA
RFDNARFDNA
RFDNA- DNA
II
V
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的构建：
III VI I IV II X V VII IX VIII
野生型 M13RF-DNA
III VI I IV II X V VII IX VIII
M13mp系列载体
lacZ‘polylinker
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的特点：
使克隆的 DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在 DNA定向突变中非常有用
M13重组分子筛选简便被 M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 1.5 kb
噬菌体或病毒 DNA
与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病毒基因组 DNA。
动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：
单链 DNA病毒 双链 DNA病毒单链 RNA病毒 双链 RNA病毒
RNA病毒在自我复制时大多存在相应的 DNA中间反应物，
这些中间体可作为载体进行常规的 DNA重组。
考斯质粒与噬菌粒
l-DNA载体和 M13-DNA载体的装载量最大分别为 25 kb和
1.5 kb,但在很多情况下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段，
考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体 DNA
的装载量。
在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体 DNA的长度，
就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体 DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组 DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。
考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的构建：
考斯质粒是一类人工构建的含有
1978年 Collins和 Hohn发明构建
pHC79
6400 bp
Tcr
l fragmentcos
ori
Apr PstI
BamHI
SalI
l-DNA cos序列和 质粒复制子的特殊类型的载体
cos site - carrying plasmid
1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段装载范围为 31 - 45 kb
考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的特点：
能像 l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞装载量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞 中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解 受体细胞考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（ phagemid or phasmid）
噬菌粒载体的特点：
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体 包装序列、复制子以及 质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像 M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的 M13mp系列要大很多（ 10 kb）
能像质粒那样在受体细胞 中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链 DNA能获得同等长度的单一单链 DNA
考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pUC118 / 119
pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG
pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG
500 个拷贝
3200 bp
MCS
lacZ’
lacI
ori
Apr
M13-MG
pUC118 / 119
表示 M13辅助噬菌体 DNA
考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pBluescript 体外转录载体
pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7
2958 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
f1-ori
pBluescript PT3
噬菌体启动子 PT3和 PT7强化外源基因的转录提取出来的单链 DNA重组分子在噬菌体 RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录人造染色体载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往 需要 克隆数百甚至上千 kb 的 DNA片段,此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。
将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源 DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，
它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人造染色体（ BAC）
酵母人造染色体（ YAC）
人造染色体载体细菌人造染色体（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）
细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子 F质粒的基础上构建的，其装载量范围在 50 - 300 kb之间各种类型的 pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝
pBACs主要适用于：
克隆大型基因簇（ gene cluster） 结构构建动植物基因文库人造染色体载体酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列酵母人造染色体的构建：
pYAC4
CEN4
EcoRI
URA3
TELBamHITEL
ori
Apr
TRP1
ARS1
酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的 选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的 选择标记
YAC载体的装载量为 350 - 400 kb
人造染色体载体酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
酵母人造染色体的使用：
pYAC4
CEN
EcoRI
URA
TELBamHITEL
ori
Apr
TRP
ARS EcoRIEcoRIEcoRI
BamHI 连接转化酵母菌重组酵母染色体
C 用于基因转移的受体菌或细胞
3 重组 DNA技术所需的基本条件各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-,recC-,hsdR-
）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA-）
具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全,生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是
DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达
DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，
农作物品质的改良遗传操作繁琐实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒,C600,W3110,HB101,JM83、
JM101（ Aps,Tcs,Cms）
用于接受 l-DNA,LE392,ED8654
酵母菌哺乳动物细胞 CHO
毕赤酵母啤酒酵母
3 重组 DNA技术所需的基本条件
C 用于基因转移的受体菌或细胞
B 用于 基因克隆的载体
A 用于核酸操作的工具酶
5
2
3
4
1
6
7
8
9
重组 DNA技术与基因工程的基本概念重组 DNA技术与基因工程的基本原理重组 DNA技术所需的基本条件重组 DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化
A 重组 DNA技术 的基本定义
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念重组 DNA技术 是指将一种生物体（ 供体 ）的基因与载体 在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（ 受体 ）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术 。
因此,供体、受体、载体 是重组 DNA技术的三大基本元件。
B 基因工程的基本定义
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念基因工程 是指重组 DNA技术的产业化设计与应用，
包括 上游技术 和 下游技术 两大组成部分。 上游技术 指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA技术）；而 下游技术 则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
C 重组 DNA技术 与基因工程的基本用途
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念分离、扩增、鉴定、研究、整理 生物信息资源大规模生产 生物活性物质设计、构建 生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质
D 基因工程的基本形式
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程
D 基因工程的基本形式
1 重组 DNA技术与基因工程的基本概念
C 重组 DNA技术 与基因工程的基本用途
B 基因工程的基本定义
A 重组 DNA技术 的基本定义
A 重组 DNA技术的理论基础
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学
20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学
1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质 DNA
1973年 伯格 -杰克森 -考恩 -鲍耶 DNA分子体外拼接分子遗传学
1953年 沃森 -克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学基因工程
B 基因的分子生物学
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理
C 基因工程的基本原理
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理提高外源基因的剂量 —— 分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如,启动子,
增强子,操作子,终止子,上游调控序列 等列,mRNA非编码区,密码子 等
—— 分子生物学原理修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如,SD序基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产
—— 生化工程学原理
—— 分子生物学原理
D 基因工程的支撑技术
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术
DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（ PCR） 技术
D 基因工程的支撑技术
2 重组 DNA技术与基因工程的基本原理
C 基因工程的基本原理
B 基因的分子生物学
A 重组 DNA技术 的理论基础
A 用于核酸操作的工具酶
3 重组 DNA技术所需的基本条件限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链 DNA分子中的特定序列，并切割 DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA的入侵细菌的限制与修饰作用
hsd R,编码限制性核酸内切酶
hsd M,编码限制性甲基化酶
hsd S,编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
1968年,Smith等人首先从 流感嗜血杆菌 d株中分离出
Hind II和 Hind III
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性 I 型 II 型 III 型限制修饰 多功能 单功能 双功能蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体辅助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg2+ SAMMg2+
识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC
AACN6GTGC CAGCAG
切割位点 距识别序列 1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割 特异性切割 24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名
H i n d III H i n d III
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链 DNA分子中 4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型 回文结构
5‘ … G C T G A A T T C G A G …
3’3‘ … C G A C T T A A G C T C …
5’
EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点
EcoRI等产生的 5‘粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH P
OHP
PstI等产生的 3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ 退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分 II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
DTT 1 mM
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
Volume 20 - 100 ml
T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准 DNA所需的酶量限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
5‘
… GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘
… CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ … GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ … GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4
2.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心 10分钟、干燥限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的纯度：
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇,EDTA,SDS,NaCl等加大酶的用量,1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的甲基化程度：
大肠杆菌中的 dam甲基化酶在 5‘ GATC3’序列中的腺 嘌呤 N6位引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I,MboI等，但 BamH I、
Bgl II,Sau3A I不受影响大肠杆菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH值 等，
会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的 Star activity现象
EcoR I在正常条件下识别并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过 5%（ v/v） 时，也可切割 5‘ PuPuATPyPy3’或者5‘ AATT3’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质修复双链 DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
nick
nick
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质修复与 RNA链结合的 DNA链上缺口处的磷酸二酯键
T4-DNA连接酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C …
5’ OHP nick
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C …
5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链 DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…
5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
ATP 0.5 - 1 mM
DTT 5 mM
Volume 10 - 20 ml
T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 ℃ 反应 1 小时，
完全连接 1 mg l-DNA（ Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶平头双链 DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（ 10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入 10% PEG8000,促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（ NaCl）,最终浓度 150-200 mM
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活性大肠杆菌 DNA聚合酶 I的基本性质：
3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-OH
5‘ ppp dN
Mg2+3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA pol I
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
缺口前移标记法大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的基本用途：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a-32P-dATP
）
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Nick translation
制备 32P标记的探针DNase I
DNA pol I
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本性质：
大肠杆菌 DNA聚合酶 I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得 N端三分之二的大肽段，即为 Klenow酶
Klenow酶仍拥有 5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性 和 3‘ →5 ‘
的核核酸外切酶活性,但失去了 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途：
补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
DNA片段的同位素末端标记
cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定 DNA序列
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow a-32P-pppdA dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA酶的基本特性：
在无 dNTP时，可以从任何 3‘ -OH端外切在只有一种 dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性和 3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,切平由核酸内切酶产生的 3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ T4-DNA聚合酶
5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C …
5’注意：该酶也能降解双链 DNA,只是其活性比单链降解活性低很多
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（ a-32P-
dATP）
5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH
HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘
T4-DNA pol
T4-DNA pol
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
DNA聚合酶依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,以 RNA为模板聚合 cDNA链
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
反转录酶 Mg2+ dNTP
5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA
DNA聚合酶依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,双向外切 DNA-RNA杂合链中的 RNA链反转录酶
3’ RNA
5’ DNA3’
5’
3’ RNA
5’ DNA3’
5’
反转录酶
5’ DNA3’
核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶 VII（ ExoVII）
大肠杆菌的核酸外切酶 VII不需要 Mg2+
ExoVII
3’
5’3’
5’
3’
5’ 3’
5’
核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ ExoIII）
ExoVII
3’
5’3’
5’
Mg2+
3’
5’3’
5’
大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从 3‘ 端外切核酸酶双链核酸外切酶,l 核酸外切酶 （ lExo）
lExo
3’
5’3’
5’
Mg2+
l核酸外切酶特异性地从 5‘ 端外切
3’
5’3’
5’
核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（ Aspergillus oryzae）
Zn2+必需最适 pH范围为 4.0 - 4.3
需要 NaCl 10 - 300 mM
降解单链 DNA的速度比降解双链 DNA快 75000倍降解单链 DNA的速度比降解单链 RNA快 7倍核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切单链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’
S1 Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T…
3’
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切带缺口或缺刻的双链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A…
5‘
nick
gap
S1
Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-
G3‘ … C-G-A-G-T-
C
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A…
5‘
核酸酶单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的重要用途,在 DNA上定位 RNA（ S1 mapping）
DNA
mRNA
杂交
S1
EcoRI
核酸酶单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（ A.espejiana）
Ca2+
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
ssDNA or RNA
Ca2+
Ca2+
核酸酶单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的基本用途：诱发 DNA突变
EcoRI A
B C
EcoRIEcoRI
B C A
Bal31
B C A
环化
A
C
核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（ TdT）
TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的 DNA聚合酶,随机掺入 dNTPs
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Mg2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘
TdT的基本特性：
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO AAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAOH 3‘
p 5‘
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘AAAAAAAAAAA
核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（ CIP）
来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（ BAP）
5‘ p OH 3‘
DNA or RNA
5‘ ppp dN
5‘ pppN
BAP / CIP
OH 3‘5‘ HO
5‘ HO dN
5‘ HO N
核酸修饰酶
T4-多核苷酸磷酸激酶（ T4-PNP）
T4-PNP的基本特性：在 DNA,RNA,dNR,NR的 5‘ -OH上加磷
5‘ HO
3‘ HO
OH 3‘
OH 5‘
T4-PNP Mg2+ pppATP（ g-32P-ATP）
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
用于探针的末端同位素标记：
B 用于基因克隆的载体
3 重组 DNA技术所需的基本条件质粒（ plasmid）
噬菌体或病毒 DNA
考斯质粒（ cosmid） 与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有合适的筛选标记具有较 高的外源 DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是 DNA型的绝大多数的天然 DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，
即 cccDNA
质粒 DNA的分子量范围,1 - 300 kb
质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主复制质粒 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid
质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
rop
（ +）
Rop
RNA II
RNA I
3’
5’
5’
3’
质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ ori） 的结合
Pcop cop P/Orep rep ori
Cop Rep
质粒质粒的基本特征质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为 质粒的不相容性,不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1,pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101,F,RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成 不相容性群质粒质粒的基本特征质粒的不相容性,分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，
因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如 F,Col,R质粒等如 Col,R的其它成员非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ ColE1） 在接合型质粒的存在和协助下，也能发生 DNA转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定质粒质粒的基本特征携带特殊的遗传标记野生型的质粒 DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对 DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr
ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1
RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：
高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数 1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自 pSC101 拷贝数小于 10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头 polylinker
整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制
pBR3 2 2
4 3 6 3 b p
Or ig in o f Rep lic a t io n
ROP
ROI
S a l I
Bam H I
Tc
r
P v u I
P s t I
P s t I
E c o R I
Cla I
Hin d II I
Hin d II
Bal I
Ap
r
pBR322：
氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell
用于基因克隆质粒重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
拷贝数 2000 - 3000 / cell
用于基因克隆和测序装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
B a m HI
pU C 18
2 6 8 6 b p
Ap
r
l a c Z'
ori
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
396 452
E coRI S stI K p n I S m a I X b a I S a lI P stI S p h I Hi n d III
质粒重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19,正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/19
Plac lacZ’MCS
b-半乳糖苷酶的 a-肽段ab
O
H
H
H
OH
H
O H
H O H
CH 2 OH
O
N
Cl
Br
Cl
Br
Cl
Br
O
N
N
5-溴 -4-氯 -3-吲哚基 -b-D-半乳糖苷
X-gal
质粒重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z：
多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
用于外源基因的高效表达注意,T7和 SP6启动子特异性地由噬菌体 DNA编码的 RNA聚合
2743 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
pGEM-3E PSP6
酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如：
E.coli BL21（ DE3） 等质粒质粒 DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒 DNA：
氯化铯密度梯度离心法质粒 DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒 DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒 DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒质粒 DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加 CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取 cccDNA
稀释沉淀 cccDNA
proteins
ocDNA
L-DNA
cccDNA
RNAs
质粒质粒 DNA的分离纯化碱溶法：
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加 NaOH和 SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体 DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚 -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 DNA
用无 DNase的 RNase去除残余的 RNA
cccDNA
L-DNAocDNA
D-DNAT-DNA
质粒质粒 DNA的分离纯化沸水浴法：
用含有 EDTA和 Triton X-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴 40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒 DNA
噬菌体或病毒 DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。
噬菌体或病毒的上述特性使得它们的 DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体的生物学特性,生物结构
l 噬菌体是 大肠杆菌的温和型噬菌体
l 噬菌体 由外壳包装蛋白和 l-DNA组成
l-DNA全长 48502个核苷酸
l-DNA上 至少有 61个基因
l 噬菌体生物学特性,生物结构
5’ TCCAGCGGCGGGG 3’
3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS
COS
cos 头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因
DNA合成控制 基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因
l - DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期
E.coli
吸附 LamB受体注入 复制包装裂解噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期体内包装
100个左右的拷贝包装范围为原 DNA的 75 - 105%
即 36 - 51 kb
D
A
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,溶原状态
l噬菌体感染大肠杆菌后,除能裂解细胞外,也可能将其
DNA直接整合到宿主细胞的染色体 DNA上,并不产生子代噬菌体颗粒,这种情况为 溶原状态 。 整合主要由 l-DNA上的 cI和 int
两基因的产物所激活,而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质 。 人们可以根据需要改变 l-DNA或宿主细胞的性质,使噬菌体或处于 溶菌状态,或处于溶菌状态
DNA重组技术一般需要 l噬菌体进入溶菌状态噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度野生型 l-DNA包装的上限为 51kb,本身长度为 48.5kb,只有当插入的外源 DNA片段不大于 2.5kb时,才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒 。 因此缩短野生型 l-DNA的长度,可以提高装载量 。 其实野生型 l-DNA上约有 40-50%的片段是复制和裂解所非必需的 。 根据切除的多少,可将 l-DNA分成两大类载体：
插入型载体取代型载体噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度 37 kb
插入片段大小：
0 - 14 kb
（ 51 – 37）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度 10 kb
（ 51 – 26）
载体长度 26 kb
插入片段最大装载长度 25 kb
（ 36 – 26）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,删除重复的酶切位点野生型的 l-DNA链上有 5个 EcoRI位点和 7个 HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至 1 - 2个同时，为了便于各种来源的 DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记与质粒不同，野生型 l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装 选择标记是 l-DNA克隆载体构建的重要内容
l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：
免疫功能类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 imm434
imm434基因编码一种阻止 l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的 l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源 DNA插入到标记基因中，基因灭活,l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 lacZ
lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到 lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产生蓝色透明斑噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突变 。
大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因,其编码产物校正
tRNA能专一性地纠正这一突变 。
将野生型 l-DNA上 D和 E两个头部包装蛋白的基因中的 CAG密码子突变成 UAG。 当这种 l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后,不能合成有活性的头部蛋白,也就不能被包装和裂解细菌,这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散,而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的主要类型：
插入灭活型载体 Charon2,Charon6,lgt11
取代型载体 lEMBL4,lgtlc,lNM762,Charon40
正选择型载体 lEMBL1,lL47,l1059
野生型的 l噬菌体不能在 P2噬菌体溶源性 的细菌中繁殖（ Spi+），
这种生长抑制表型受 l-DNA上的 red和 gam两个基因控制。若将外源 DNA取代 red和 gam,重组 噬菌体便拥有 Spi-表型，能在 P2噬菌体 溶源性 的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA重组分子的体外包装：
l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒,方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了 l噬菌体的大肠杆菌中提取,现已商品化 。 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：
一部分缺少 E组份,另一部分则缺少 D组份 。 包装时,当且仅当这两部分包装蛋白与重组 l-DNA分子混合后,包装才能有效进行,任何一种蛋白包装液被重组 l-DNA污染后,均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒,这也是基于安全而设计的噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA及其重组分子的分离纯化：
将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期加入 l噬菌体或重组 l噬菌体的悬浮液,37℃ 培养 1小时用新鲜培养基稀释，继续培养 4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度已达 1013 -1014 / L,大肠杆菌细胞已完全裂解超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放 l-DNA
乙醇或异丙醇沉淀 l-DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA作为载体的优点：
l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌
l-DNA载体的装载能力为 25 kb,远远大于质粒的装载量重组 l-DNA分子 的筛选较为方便重组 l-DNA分子的提取较为简便
l-DNA载体适合克隆和扩增外源 DNA片段，但不适合表达外源基因噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,生物结构
M13噬菌体的外型呈丝状
M13 噬菌体 由外壳包装蛋白和 正 链 DNA组成
M13 DNA全长 6407个核苷酸
M13 DNA上 至少有 10个基因
2700个外壳蛋白分子
M13 噬菌体 不裂解宿主细胞，但抑制其生长噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,感染周期
+ DNA
（ +） DNA
RFDNARFDNA
RFDNA- DNA
II
V
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的构建：
III VI I IV II X V VII IX VIII
野生型 M13RF-DNA
III VI I IV II X V VII IX VIII
M13mp系列载体
lacZ‘polylinker
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的特点：
使克隆的 DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在 DNA定向突变中非常有用
M13重组分子筛选简便被 M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 1.5 kb
噬菌体或病毒 DNA
与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病毒基因组 DNA。
动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：
单链 DNA病毒 双链 DNA病毒单链 RNA病毒 双链 RNA病毒
RNA病毒在自我复制时大多存在相应的 DNA中间反应物，
这些中间体可作为载体进行常规的 DNA重组。
考斯质粒与噬菌粒
l-DNA载体和 M13-DNA载体的装载量最大分别为 25 kb和
1.5 kb,但在很多情况下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段，
考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体 DNA
的装载量。
在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体 DNA的长度，
就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体 DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组 DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。
考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的构建：
考斯质粒是一类人工构建的含有
1978年 Collins和 Hohn发明构建
pHC79
6400 bp
Tcr
l fragmentcos
ori
Apr PstI
BamHI
SalI
l-DNA cos序列和 质粒复制子的特殊类型的载体
cos site - carrying plasmid
1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段装载范围为 31 - 45 kb
考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的特点：
能像 l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞装载量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞 中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解 受体细胞考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（ phagemid or phasmid）
噬菌粒载体的特点：
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体 包装序列、复制子以及 质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像 M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的 M13mp系列要大很多（ 10 kb）
能像质粒那样在受体细胞 中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链 DNA能获得同等长度的单一单链 DNA
考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pUC118 / 119
pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG
pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG
500 个拷贝
3200 bp
MCS
lacZ’
lacI
ori
Apr
M13-MG
pUC118 / 119
表示 M13辅助噬菌体 DNA
考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pBluescript 体外转录载体
pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7
2958 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
f1-ori
pBluescript PT3
噬菌体启动子 PT3和 PT7强化外源基因的转录提取出来的单链 DNA重组分子在噬菌体 RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录人造染色体载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往 需要 克隆数百甚至上千 kb 的 DNA片段,此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。
将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源 DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，
它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人造染色体（ BAC）
酵母人造染色体（ YAC）
人造染色体载体细菌人造染色体（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）
细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子 F质粒的基础上构建的，其装载量范围在 50 - 300 kb之间各种类型的 pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝
pBACs主要适用于：
克隆大型基因簇（ gene cluster） 结构构建动植物基因文库人造染色体载体酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列酵母人造染色体的构建：
pYAC4
CEN4
EcoRI
URA3
TELBamHITEL
ori
Apr
TRP1
ARS1
酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的 选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的 选择标记
YAC载体的装载量为 350 - 400 kb
人造染色体载体酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
酵母人造染色体的使用：
pYAC4
CEN
EcoRI
URA
TELBamHITEL
ori
Apr
TRP
ARS EcoRIEcoRIEcoRI
BamHI 连接转化酵母菌重组酵母染色体
C 用于基因转移的受体菌或细胞
3 重组 DNA技术所需的基本条件各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-,recC-,hsdR-
）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA-）
具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全,生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是
DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达
DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，
农作物品质的改良遗传操作繁琐实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒,C600,W3110,HB101,JM83、
JM101（ Aps,Tcs,Cms）
用于接受 l-DNA,LE392,ED8654
酵母菌哺乳动物细胞 CHO
毕赤酵母啤酒酵母
3 重组 DNA技术所需的基本条件
C 用于基因转移的受体菌或细胞
B 用于 基因克隆的载体
A 用于核酸操作的工具酶
