《毒理学》网上教案第一单元 绪 论第一节 概 述
一、概念
㈠ 毒理学 是从医学角度研究化学物质对生物机体的损害作用及其作用机理的科学。但近些年来，毒理学的研究范围已扩大到各种有害因素，如核素、微波等物理因素以及生物因素等，不只限于化学物质；但经典的毒理学主要研究内容仍然是化学物质对机体的生物学作用及其机理。
㈡ 卫生毒理学 是从预防医学的角度，研究人类在生产和生活过程中，可能接触的外来化合物对机体损害作用及其机理的学科。它是毒理学的一个重要分支，亦是预防医学的基础学科，为劳动卫生、环境卫生和食品卫生等学科提供毒理学理论和研究方法，是预防医学的重要组成部分。
㈢ 外来化合物 是存在于人类生活和外界环境中，可能与机体接触并进入机体的一些化学物质。外来化合物并非人体的组成成分，也非人体所需的营养物质，而且也不是维持机体正常生理功能和生命所必需的物质，但它们可由外界环境通过一定的环节和途径与机体接触并进入机体，在机体内呈现一定的生物学作用。常见的外来化合物有农用化学品、工业化学品、药物、食物添加剂、日用化学品、各种环境污染物及霉菌毒素等。
二、卫生毒理学研究任务
在预防医学领域中，卫生毒理学的研究任务主要有三，一是研究机体与外来化合物相互作用的规律即中毒机理；二是对外来化合物进行安全性评价；三是为制订有关卫生标准和管理方案提供科学依据。
三、卫生毒理学研究方法
㈠ 动物实验
１、体内实验法
通常在整体动物进行，使实验动物在一定时间内，按人体实际接触方式接触一定剂量的受试外来化合物，然后观察动物可能出现的形态或功能变化。实验多采用哺乳动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、仓鼠、狗和猴等。通常检测外来化合物一般毒性，例如急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验等。
２、体外实验法
大多利用游离器官、原代培养细胞、细胞系和细胞器等进行。利用器官灌流技术可对肝脏、肾脏、肺和脑等进行灌流，借此可使离体脏器在一定时间内保持生活状态，与受试外来化合物接触，观察脏器出现的形态和功能变化，同时还可观察受试物在脏器中的代谢情况；游离细胞和细胞器多用于外来化合物对机体各种损害作用的初步筛检、作用机理和代谢转化过程的深入研究，有许多优点。
上述整体、器官、细胞和亚细胞水平的研究，各自都有一定的特点和局限性，在实际工作中，应主要根据实验研究目的和要求，采用最适当的方法，并且相互验证。
㈡ 人群调查
为了将动物实验的结果，在人体上进行验证，有时需要进行人群调查。根据动物试验结果和外来化合物本身的性质，选用适当的观察指标，采用流行病学的方法进行人群调查。人群调查的特点是可以取得在人体直接观察的资料，但易受许多其他混杂因素的影响和干扰；结果和评定必须去伪存真，由表及里，并与动物实验结果进行综合考虑分析，才能得出较为符合实际的结论。
第二节 毒理学主要基本概念
一、毒性
毒性是一种物质对机体造成损害的能力。毒性较高的物质，只要相对较小的数量，则可对机体造成一定的损害；而毒性较低的物质，需要较多的数量，才呈现毒性。物质毒性的高低仅具有相对意义。在一定意义上，只要达到一定数量，任何物质对机体都具有毒性；在一般情况下，如果低于一定数量，任何物质都不具备毒性；关键是此种物质与机体接触的量。除物质与机体接触的数量外，还与物质本身的理化性质以及其与机体接触的途径有关。
二、剂量
剂量是决定外来化合物对机体损害作用的重要因素。剂量的概念较为广泛，可指给予机体的数量，或与机体接触的外来化合物的数量、外来化合物吸收进入机体数量、外来化合物在靶器官作用部位或体液中的浓度或含量。由于内剂量不易测定，所以一般剂量的概念，系指给予机体的外来化合物数量或机体接触的数量。剂量的单位是以每单位体重接触的外来化合物数量表示，例如mg/kg体重。
１、致死量
致死量即可以造成机体死亡的剂量。但在一群体中，死亡个体数目的多少有很大程度的差别，所需的剂量也不一致，因此，致死量又具有下列不同概念。
⑴、绝对致死量(LD100)系指能造成一群体全部死亡的最低剂量。
⑵、半数致死量(LD50)系指能引起一群个体50%死亡所需剂量，也称致死中量。表示LD50的单位mg/kg体重，LD50数值越小，表示外来化合物毒性越强；反之，LD50数值越大，则毒性越低。
２、最大无作用剂量(maximal no-effect level)
最大无作用剂量即在一定时间内，一种外来化合物按一定方式或途径与机体接触，根据现今的认识水平，用最灵敏的试验方法和观察指标，亦未能观察到任何对机体的损害作用的最高剂量。
最大无作用剂量的确定系根据亚慢性毒性或慢性毒性试验的结果，是评定外来化合物对机体损害作用的主要依据。以此为基础可制订一种外来化合物的每日容许摄入量(acceptable daily imtarie,intake,ADI)和最高容许浓度(maximal allowable concentration,MAC)。ADI系指人类终生每日摄入该外来化合物不致引起任何损害作用的剂量。MAC系指某一外来化合物可以在环境中存在而不致对人体造成任何损害作用的浓度。
３、最小有作用剂量(minmal effect level)
最小有作用剂量 即在一定时间内，一种外来化合物按一定方式或途径与机体接触，能使某项观察指标开始出现异常变化或使机体开始出现损害作用所需的最低剂量，也可称为中毒阈剂量，或中毒阈值。在理论上，最大无作用剂量和最小作用剂量应该相差极微，因为任何微小，甚至无限小的剂量增加，对机体损害作用，在理论上也应该有相应的增加。但由于对损害作用的观察指标受此种指标观测方法灵敏度的限制，可能检不出细微的变化。只有两种剂量的差别达到一定的程度，才能明显地观察到损害作用程度的不同。所以最大无作用剂量与最小有作用剂量之间仍然有一定的差距。
当外来化合物与机体接触的时间、方式或途径和观察指标发生改变时，最大无作用剂量和最小有作用剂量也将随之改变。所以表示一种外来化合物的最大无作用剂量和最小有作用剂量时，必须说明试验动物的物种品系、接触方式或途径、接触持续时间和观察指标。例如某种有机磷化合物在大鼠(wistar品系)经给予3个月，全血胆碱酯酶活力降低50%的最大无作用剂量为10mg/kg体重。
三、效应和反应
㈠ 效应表示一定剂量外来化合物与机体接触后可引起的生物学变化。此种变化的程度用计量单位来表示，例如若干个、毫克、单位等。
㈡ 反应是一定剂量的外来化合物与机体接触后，呈现某种效应并达到一定程度的比率，或者产生效应的个体数在某一群体中所占的比率，一般以%或比值表示。
四、剂量效应关系和剂量反应关系
剂量与效应关系或剂量与反应关系是毒理学的重要概念。机体内出现的某种损害作用，如果肯定是某种外来化合物所引起，则必须存在明确的剂量效应或剂量反应关系，否则不能肯定。
剂量效应和剂量反应关系都可以用曲线表示，即以表示效应强度的计量单位或表示反应的百分率或比值为纵座标，以剂量为横座标，绘制散点图，可得出一条曲线。不同外来化合物在不同具体条件下，所引起的效应或反应类型不同，主要是效应或反应与剂量的相关关系不一致，可呈现不同类型的曲线。在一般情况下，剂量效应或剂量反应曲线有下列基本类型：
１、直线型 效应或反应强度与剂量呈直线关系；随着剂量的增加，效应或反应的强度也随着增加，并成正比关系。但在生物机体内，此种直线关系较少出现，仅在某些体外实验中，在一定的剂量范围内存在。
２、抛物线型 剂量与效应或反应呈非线性关系，即随着剂量的增加，效应或反应的强度也增加，但最初增高急速，然后变为缓慢，以致曲线先陡峭，然后平缓，成抛物线型。如将剂量换成对数值，则成直线。剂量与效应或反应关系，换成直线，可便于在低剂量与高剂量，或低反应强度与高反应强度之间进行互相推算。
３、Ｓ－状曲线 此种曲线的特点是在低剂量范围内，随着剂量增加，反应或效应强度增高较为缓慢，然后剂量较高时，反应或效应强度也随之急速增加，但当剂量继续增加时，反应或效应强度增高又趋向缓慢。曲线开始平缓，继之陡嵴，然后又趋平缓，成不甚规则的Ｓ－状。曲线的中间部分，即反应率50%左右，斜率最大，剂量略有变动，反应即有较大增减。在剂量与反应关系中较为常见，一部分剂量与效应关系也有出现。Ｓ－状曲线分为对称或非对称两种。非对称Ｓ－状曲线两端不对称，一端较长，另一端较短。如将非对称Ｓ－状曲线横座标(剂量)以对数表示，则成为一对称Ｓ－状曲线；如再将反应率换成概率单位，即成一直线。
五、损害作用与非损害作用
㈠ 非损害作用 一般认为非损害作用不引起机体机能形态、生长发育和寿命的改变；不引起机体某种功能容量的降低，也不引起机体对额外应激状态代偿能力的损伤。机体发生的一切生物学变化应在机体代偿能力范围之内，当机体停止接触该种外毒化合物后，机体维持体内稳态的能力不应有所降低，机体对其他外界不利因素影响的易感性也不应增高。稳态是机体保持内在环境稳定不变的一种倾向或能力。
㈡ 损害作用 损害作用与非损害作用相反，应具有下列特点：
１、机体的正常形态、生长发育过程受到严重影响，寿命亦将缩短。
２、机体功能容量或额外应激状态代偿能力降低。
３、机体维持稳定能力下降。
４、机体对其它某些因素不利影响的易感性增高。
应该指出，损害作用与非损害作用都属于外来化合物在机体内引起的生物学作用，而在生物学作用中，量的变化往往引起质的变化，所以损害作用与非损害作用仅具有一定的相对意义。此外确定损害作用与非损害作用的观察指标也不断的发展。
六、正常值 损害作用和非损害作用的确定，往往涉及机体许多指标的正常值范围，有时需要对正常值进行测定。首先必须明确“正常值”仅具有相对意义。在实际工作中，按目前认识水平，认为“健康”或“正常”的个体，对其进行某项观察指标测定，以其平均值±2个标准差作为正常值范围。可采用统计学方法，确定此项指标变化是否偏离正常值范围，凡某种观察指标符合下列情况之一者，即可认为已偏离正常值范围，属于损害作用或非损害作用。
1.与对照组相比，具有统计学显著性差异(P<0.05)，并且其数值不在正常值范围内。
2.与对照组相比，具有统计学显著性差异(P<0.05)，而其数值却在一般公认“正常值”范围内；但如在停止接触后，此种差异仍然持续一段时间，则属于损害作用。
3.与对照组相比，具有统计学显著性差异(P<0.05)，而其数值却在一般公认的“正常值”范围内；但如机体处于功能或生物化学应激状态下，此种差异更为明显，则属于损害作用。
第二单元 外来化合物的生物转运和生物转化
第一节 生物转运
一、生物转运的概念
外来化合物在机体的吸收、分布和代谢过程，统称为生物转运。
二、生物转运机理
外来化合物在体内的生物转运主要通过下列机理：
㈠ 简单扩散 外来化合物在体内的扩散是依其浓度梯度差决定物质的扩散方向，即由生物膜的分子浓度较高的一侧向浓度较低的一侧扩散，当两侧达到动态平衡时，扩散即中止。简单扩散过程，不需要消耗能量，外来化合物与膜不发生化学反应，生物膜不具有主动性，只相当于物理过程，故称为简单扩散。简单扩散是外来化合物在体内生物转运的主要机理。在一般情况下，大部分外来化合物通过简单扩散进行生物转运。除生物膜两则浓度梯度差可以影响简单扩散外，还有其他因素亦可对简单扩散过程发生影响。
１、外来化合物在脂质中的溶解度，可以脂水分配系数来表示，即外来化合物在脂相中的浓度与在水相中浓度的比值(脂相中的浓度/水相中的浓度)。脂水分配系数越大，越容易透过生物膜而进行扩散。但外来化合物在生物转运过程中，除经过脂相外，还要通过水相，因为生物膜的构造包括脂相和水相，所以一种外来化合物如在水中溶解度过低，即使脂水分配系数很大，也不容易透过生物膜进行扩散，只有既易溶于脂肪又易溶于水的外来化合物，才最容易透过生物膜进行扩散。
２、外来化合物的电离或离解状态。呈离子状态的外来化合物不易通过生物膜；反之，非离解状态的外来化合物则容易透过。外来化合物的离解程度决定于本身的离解常数(pK)和所处介质中的酸碱度(pH)。除上述两种主要因素外，还有许多其他因素也可对简单扩散发生影响。
㈡ 滤过
滤过是外来化合物透过生物膜上亲水性孔道的过程。大量的水可借助渗透压梯度和液体静压作用通过孔道进入细胞。外来化合物可以水作为载体，随之而被动转运。
㈢ 主动转运
外来化合物透过生物膜由低浓度处向高浓度处移动的过程。其主要特点是：①可逆浓度梯度转运，故消耗一定的代谢能量；②转运过程需要载体参加。载体往往是生物膜上的蛋白质，可与被转运的外来化合物形成复合物而转运至膜的另一侧，然后释放外来化合物，载体又回到原处，并继续进行第二次转运；③载体既然是生物膜的组成成分，所以有一定的容量；当化合物浓度达到一定程度时，载体可以饱和，转运即达到极限；④主动转运有一定的选择性。即化合物必须具有一定基本结构才能被转运；结构稍有改变，则可影响转运的进行；⑤如果两种化合物基本结构相似，在生物转运过程中又需要同一转运系统，两种化合物之间可出现竞争，并产生竞争抑制。
㈣ 载体扩散
不易溶于脂质的外来化合物，利用载体由高浓度向低浓度处移动的过程。由于不能逆浓度递度由低浓度处向高浓度处移动，所以不消耗代谢能量。由于利用载体，生物膜具有一定主动性或选择性，但又不能逆浓度梯度，故又属于扩散性质，也可称为易化扩散或促进扩散。水溶性葡萄糖由胃肠道进入血液、由血浆进入红细胞并由血液进入神经组织都是通过载体扩散。
㈤ 胞饮和吞噬
液体或固体外来化合物被伸出的生物膜包围，然后将被包围的液滴或较大颗粒并入细胞内，达到转运的目的，前者称为胞饮，后者称为吞噬。机体内外来异物的消除，例如白细胞吞噬微生物，肝脏网状内皮细胞对有毒异物的消除都与此有关。
三、吸收的概念及吸收途径
㈠ 吸收的概念
吸收是外来化合物经过各种途径透过机体的生物膜进入血液的过程。
㈡ 吸收途径
１、经胃肠道吸收
胃肠道是外来化合物最主要吸收途径。许多外来化合物可随同食物或饮水进入消化道并在胃肠道中吸收。一般外来化合物在胃肠道中的吸收过程，主要是通过简单扩散，仅有极少种类外来化合物的吸收是通过吸收营养素和内源性化合物的专用主动转运系统。
外来化合物在胃肠道的吸收可在任何部位进行，但主要在小肠。外来化合物在胃内吸收主要通过简单扩散过程。由于胃液酸度极高(pH 1.0)，弱有机酸类物质多以未能解离形式存在，所以容易吸收；但弱有机碱类物质，在胃中离解度较高，一般不易吸收。
小肠内的吸收主要也是通过简单扩散。小肠内酸碱度相对趋向中性(pH 6.6)，化合物离解情况与胃内不同。例如，弱有机碱类在小肠主要呈非离解状态，因此易被吸收。弱有机酸与此机反，例如苯甲酸在小肠中不易被吸收。但事实上由于小肠具有极大表面积，绒毛和微绒毛可使其表面积增加600倍左右，因此小肠也可吸收相当数量的苯甲酸。此外，小肠粘膜还可以通过滤过过程吸收分子量为100～200以下的小分子，胃肠道上皮细胞亦可通过胞饮或吞噬过程吸收一些颗粒状物质。
２、经呼吸道吸收
肺是呼吸道中主要吸收器官，肺泡上皮细胞层极薄，而且血管丰富，所以气体、挥发性液体的蒸气和细小的气溶胶在肺部吸收迅速完全。吸收最快的是气体、小颗粒气溶胶和脂水分配系数较高的物质。经肺吸收的外来化合物与经胃肠道吸收者不同，前者不随同门静脉血流进入肝脏，未经肝脏中的生物转化过程，即直接进入体循环并分布全身。气体、易挥发液体和气溶胶在呼吸道中的吸收主要通过简单扩散，并受许多因素影响，主要是在肺泡气与血浆中浓度差。一种气体在肺泡气中的浓度，可以其在肺泡中的分压表示，一种气体的分压即为其肺泡气总压力中所占的百分率。分压越高，机体接触的量越大，也越容易吸收。随着吸收过程的进行，血液中该气体的分压将逐渐增高，分压差则相应降低。该气体在血液中的分压将逐渐接近在肺泡气的分压，最后达到平衡，呈饱和状态。在饱和状态时，气体在血液中的浓度(mg/L)与在肺泡气中浓度(mg/L)之比，称为血/气分配系数，即气体在血液的浓度/气体在肺泡中的浓度比值。血/气分配系数越大，即溶解度越高，表示该气体越易被吸收。
气体在呼吸道内的吸收速度与其溶解度和分子量也有关。在一般情况下，吸收速度与溶解度成正比。非脂溶性的物质被吸收时通过亲水性孔道，其吸收速度主要受分子量大小的影响；分子量大的物质，相对吸收较慢，反之亦然。溶于生物膜脂质的物质，吸收速度与分子量大小关系不大，而主要决定于其脂/水分配系数，脂/水分配系数大者吸收速度相对较高。
影响化学物质经呼吸道吸收的因素还有肺泡的通气量和血流量，肺泡通气量与血流量的比值称为通气/血流比值，特别是与肺泡通气量与血流量两者的比值有关。
３、经皮肤吸收
外来化合物经皮肤吸收，一般可分为两个阶段，第一阶段是外来化合物透过皮肤表皮，即角质层的过程，为穿透阶段。第二阶段即由角质层进入乳头层和真皮，并被吸收入血，为吸收阶段。
经皮肤吸收主要机理是简单扩散，扩散速度与很多因素有关。在穿透阶段主要有关因素是外来化合物分子量的大小、角质层厚度和外来化合物的脂溶性。脂溶性的非极性化合物通过表皮的速度与脂溶性高低，即脂/水分配系数的大小成正比，脂溶性高者穿透速度快，但与分子量成反比。
在吸收阶段，外来化合物必须具有一定的水溶性才易被吸收，因为血浆水是一种水溶液。目前认为脂/水分配系数接近于1，即同时具有一定的脂溶性和水溶性的化合物易被吸收进入血液。
此外，气温、湿度及皮肤损伤也可影响皮肤的吸收。
四、分布的概念及影响分布的主要因素
㈠ 分布概念
分布是外来化合物通过吸收进入血液或其它体液后，随着血液或淋巴液的流动分散到全身各组织细胞的过程。
㈡ 影响分布的主要因素
１、外来化合物与血浆蛋白结合 外来化合物进入血液之后往往与血浆蛋白，尤其是血浆白蛋白结合。这种结合是可逆的，它可以视为外来化合物在体内分布运输的一个过程。与血浆白蛋白结合的外来化合物与未结合的游离化学物质呈动态平衡，又由于血浆白蛋白与化学物质结合的专一性不强，所以当有另一种外来化合物或药物或生理代谢产物存在时，可以发生竞争现象。例如DDE(DDT代谢物)就可竞争性置换已与白蛋白结合的胆红素，使其在血中游离。
２、外来化合物与其他组织成分结合 外来化合物还可与其它组织成分结合，如多种蛋白质、粘多糖、核蛋白、磷脂等。这些结合有分布意义，有的也有毒理意义。例如一氧化碳与血红蛋白具有高度亲合力，导致缺氧而中毒。又如除草剂百草枯不论何种途径接触，均可浓集分布于肺引起损伤。
３、外来化合物在脂肪组织和骨骼中贮存沉积 脂溶性外来化合物可贮存于脂肪组织中，并不呈现生物学活性。只有在脂肪被动用、外来化合物重新成为游离状态时，才出现生物学作用。DDT在脂肪组织中的贮存即如此。
骨骼也可作为许多外来化合物的贮存沉积场所。例如铅可取代骨骼中的钙，被机体吸收的铅有40%可沉积于骨骼中，对机体危害相对较小。但在一定条件下，可游离释放，进入全身循环，对机体造成损害。
４、体内各种屏障的影响 机体内有若干膜屏障，对保护一些器官有重要意义。研究外来化合物在机体内的分布是否可以透过这些屏障，具有重要的毒理学意义。
⑴ 血脑屏障
由毛细血管内皮细胞和聚集包围毛细血管的星形胶质细胞的软脑膜组成的一种特殊的功能结构((血脑屏障。血脑屏障的重要性，在于保障血液和脑组织之间的正常代谢物质的交换，阻止非需要物质的进入，从而维持脑的正常功能。一般外来化合物只有分子量小，脂溶性高的才能穿透。而电离的、离子型的、水溶性大的化学物质则难于透过血脑屏障。如无机汞就不容易进入脑组织，而甲基汞则易于透过血脑屏障，造成中枢神经系统功能损伤。
⑵ 胎盘屏障
胎盘除在母体与胎儿之间进行营养素、氧、二氧化碳和代谢产物的交换外，还有阻止一些外来化合物由母体透过胎盘进入胚胎、保障胎儿正常生长发育的功能。胎盘屏障的解剖学基础是位于母体血液循环系统和胚胎之间的几层细胞构成。不同物种动物和同一物种的不同妊娠阶段胎盘细胞层数并不一样。例如猪和马有6层，大鼠、豚鼠只有一层；家兔在妊娠初期有6层，到妊娠末期仅有一层。较薄的胎盘，即细胞层数较少者，外来化合物相对容易透过，例如大鼠胎盘较人类为薄，外来化合物容易透过，故用受孕大鼠进行致畸试验可能更为繁感。
大部分外来化合物透过胎盘的机理是简单扩散，而胚胎发育所必需的营养物质，则通过主动转运而进入胚胎。
五、排泄概念和主要途径
㈠ 排泄的概念 排泄是外来化合物及其代谢产物向机体外转运的过程，是机体物质代谢全部过程中的最后一个环节。
㈡ 排泄的主要途径
１、随同尿液经肾脏排泄 肾脏排泄外来化合物的效率极高，也是最重要的排泄器官，其主要排泄机理有三：即肾小球滤过、肾小球简单扩散和肾小管主动转运，其中简单扩散和主动转运更为重要。
肾小球过滤是一种被动转运，肾小球毛细管具有孔道，直径约40(A左右，分子量在7万以下的物质皆可滤过。因此大部分外来化合物或其代谢产物均可滤出，只有与血浆蛋白结合的化学物质因分子量过大，不易透过孔道。但需指出，凡是脂/水分配系数大的化学物质或其代谢产物，则又可被肾小管上皮细胞以简单扩散方式重吸收入血。只有水溶性物质或离子型物质等才进入尿液。
肾小管主动转运实际上是肾小管主动分泌，此种主动转运可分为两种系统，一为供有机阴离子化学物质转运；一为供有机阳离子化学物质转运。此两个系统均位于肾小管的近曲小管。这两种转运系统均可以转运与蛋白质结合的物质，且存在两种化学物质通过同一转运系统时的竞争作用。
２、经肝脏随同胆汁排泄
经过肝脏随同胆汁排出体外是外来化合物在体内消除仅次于肾脏的另一种排泄途径。来自胃肠的血液携带着所吸收的外来化合物先通过门静脉进入肝脏，然后流经肝脏再进入全身循环。外来化合物在肝脏中先经过生物转化，生物转化过程中形成的一部分代谢产物，可被肝细胞直接排泌入胆汁，再混入粪便排出体外。
外来化合物随同胆汁进入小肠后，可能有二种去路：① 一部分易被吸收的外来化合物及其代谢产物，可在小肠中重新被吸收，再经门静脉系统返回肝脏，再随同胆汁排泄，即进行肠肝循环。肠肝循环具有重要生理学意义，可使一些机体需要的化合物被重新利用，例如各种胆汁酸平均有95%被小肠壁重吸收，并再被利用。在毒理学方面则由于有些外来化合物再次吸收，使其在体内停留时间延长，毒性作用也将增强。② 再有一部分外来化合物在生物转化过程中形成结合物，并以结合物的形式出现在胆汁中；肠内存在的肠菌群以及葡萄糖苷酸酶，可将一部分结合物水解，则外来化合物可重新被吸收并进入肠肝循环。
３、经肺随同呼出气排泄
许多气态外来化合物可经呼吸道排出体外。如一氧化碳、某些醇类和挥发性有机化合物都可经肺排泄。其经肺排泄的主要机理是简单扩散，排泄的速度主要决定于气体在血液中的溶解度、呼吸速度和流经肺部的血液速度。在血液中溶解度较低的气体，例如一氧化二氮排泄较快；而血液中溶解度高的物质，例如乙醇经肺排出较慢，呼吸速度的影响，在不同化合物略有不同。例如，乙醚在血液中溶解度高，过度通气时，经肺排出极为迅速。而有些不易溶于血液的气体(例如六氟化硫)的排出几乎不受过度通气的影响。
溶解于呼吸道分泌液的外来化合物和巨噬细胞摄入的颗粒物质，将随同呼吸道表面的分泌液排出。
４、其它排泄途径
外来化合物还可经其它途径排出体外。例如经胃肠道排泄、随同汗液和唾液排泄，随同乳汁排泄。此种排泄途径虽然在整个排泄过程中所占比例并不重要，但有些却具有特殊的毒理学意义。例如随同乳汁排泄。许多外来化合物可通过简单扩散进入乳汁。有机氯杀虫剂、乙醚、多卤联苯类、咖啡碱和某些金属都可随同乳汁排出。如果某种物质与母体长期反复多次接触，则容易在乳汁中浓集，重要的意义在于对婴儿的损害作用；因为按单位体重计算，婴儿通过乳汁摄入的外来化合物往往大于一般人群。
第二节 生物转化
一、生物转化的概念
外来化合物在体内经过一系列化学变化并形成其衍生物以及分解产物的过程称为生物转化，或称为代谢转化。所形成的衍生物即代谢物。外来化合物经过生物转化，有的可以达到解毒，毒性减低。但有的可使其毒性增强，甚至可产生致畸、致癌效应。所以，不应把代谢转化只看作解毒过程，而是代谢过程对外来化合物的毒性有二重性。
二、生物转化的反应类型
(一) 氧化
氧化可分为由微粒体混合功能氧化酶催化和非微粒体混合功能氧化酶催化的两种氧化反应。
微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。内质网可分为粗面和滑面二种，因而所形成的微粒体也有粗面和滑面两种，但都含有混合功能氧化酶，后者活力更强。
1.微粒体混合功能氧化酶(micrososmal mixed function oxidase,MFO)，又称为混合功能氧化酶或微粒体单加氧酶，可简称为单氧酶。在这一过程中还需要NADPH提供电子，使细胞色素P-450还原，并与底物形成复合物，才能完成这一反应过程。
混合功能氧化酶是细胞内质网膜上的一个酶系，组成较为复杂，现在已经知道的主要有细胞色素P-450氧化酶，也称为细胞色素P-450依赖性单加氧酶，还有还原型辅酶Ⅱ－细胞色素P-450还原酶。此外，还含有微粒体FDA－单加氧酶，此酶特点是不含有细胞色素P-450，而含有黄素腺嘌呤二核苷酸，代替细胞色素P-450参与单加氧酶反应。在FAD单加氧酶催化的外来化合物氧化过程中，同样需要NADPH和氧分子。
许多外来化合物都可经混合功能氧化酶催化，加氧形成各种羟化物。羟化物将进一步分解，形成各种产物，因此氧化反应可能有下列各种类型：
(1) 脂肪族羟化：亦称脂肪族氧化，是脂肪族化合物侧链(R)末端倒数第一个或第二个碳原子发生氧化，并形成羟基。
(2) 芳香族羟化：芳香环上的氢被氧化，例如苯可形成苯酚，苯胺可形成对氨基酚或邻氨基酚。在微粒体混合功能氧化酶活力测定中，可利用这一反应，即以苯胺为底物经MFO羟化后，形成对氨基酚，测定其含量，用以表示苯胺羟化酶活力。羟化过程中，也可形成邻氨基酚。
(3) 环氧化反应：外来化合物的二个碳原子之间形成桥式结构，即环氧化物。一般环氧化物仅为中间产物，将继续分解。但在多环芳烃类化合物，例如苯并(a)芘形成环氧化物后，可与细胞生物大分子发生共价结合，诱发突变以及癌肿形成。
(4) N－脱烷基反应：胺类化合物氧基N上的烷基被氧化脱去一个烷基，形成醛类或酮类。氨基甲酸酯类杀虫剂，例如西维因、致癌物偶氮色素奶油黄和二甲基亚硝胺皆可发生此种反应。二甲基亚硝胺也可在进行N－脱烷基后，形成自由甲基[CH3+]，可使细胞核内核酸分子上的鸟嘌呤甲基化（或称烷基化）诱发突变或致癌。
(5) O－脱烷基和S－脱烷基反应：与N－脱烷基反应相似，但氧化后脱去氧原子或硫原子相连的烷基。
O－脱烷基可发生于对硝基茴香醚，后者经微粒体混合功能氧化酶催化后，测定所形成对硝基酚含量，可代表混合功能氧化酶活力。
(6) N－羟化反应：羟化在N原子上进行，例如苯胺、致癌物2－乙酰氨基芴都可发生。苯胺经N－羟化反应形成N－羟基苯胺，可使血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白。
(7) 烷基金属脱烷基反应：四乙基铅可在混合功能氧化酶催化下，脱去一个烷基，形成三乙基铅。借此，四乙基铅可在机体内表现毒作用。
(8) 脱硫反应：在许多有机磷化合物经常发生脱硫反应，在这一反应中，硫原子被氧化成硫酸根脱落。如对硫磷氧化脱硫成对氧磷,毒性增强。
2.非微粒体混合功能氧化酶催化的氧化反应 肝组织胞液、血浆和线粒体中，有一些专一性不太强的酶，可催化某些外来化合物的氧化与还原，例如醇脱氢酶，醛脱氢酶、过氧化氢酶、黄嘌呤氧化酶等。
肝细胞胞液中含有单胺氧化酶和双胺氧化酶，可催化胺类氧化，形成醛类和氨，双胺氧化酶催化的氧化反应主要涉及体内生物胺类的形成，与外来化合物代谢转化关系较少。
3.前列腺素生物合成过程中共氧化反应 在外来化合物的氧化反应中，除前述微粒体混合功能氧化酶和非微粒体混合功能氧化酶催化的氧化反应外，近年来又观察到一种氧化反应，是在前列腺素生物合成过程中有一些外来化合物可同时被氧化，称为共氧化反应。
(二) 还原反应
含有硝基、偶氮基和羰基的外来化合物以及二硫化物、亚砜化合物，在体内可被还原，例如硝基苯和偶氮苯都可被还原形成苯胺。四氯化碳在体内可被NADPH－细胞色素P－450还原酶催化还原，形成三氯甲烷自由基（CCl3+ ）以致破坏肝细胞膜脂质结构，引起肝脂肪变性以及坏死等。五价砷化合物中的砷也可被还原成三价砷，三价砷化合物在水中溶解度较高，故毒性较五价砷化合物为强。
(三) 水解作用
许多外来化合物，例如酯类、酰胺类和含有酯式键的磷酸盐取代物极易水解。血浆、肝、肾、肠粘膜、肌肉和神组织中有许多水解酶，微粒体中也存在。酯酶是广泛存在的水解酶，酯酶和酰胺酶可分别水解酯类和胺类。
水解反应是许多有机磷杀虫剂在体内的主要代谢方式，例如敌敌畏、对硫磷、乐果和马拉硫磷等水解后毒性降低或消失。有些昆虫对马拉硫磷有抗药性，即由于其体内羧酸酯酶活力较高，极易使马拉硫磷失去活性。此外，拟除虫菊酯类杀虫剂也通过水解酶催化降解而解毒。
(四) 结合反应
结合反应是进入机体的外来化合物在代谢过程中与某些其它内源性化合物或基团发生的生物合成反应。特别是外来有机化合物及其含有羟基、氨基、羰基以及环氧基的代谢物最易发生。外来化合物及其代谢物与体内某些内源性化合物或基团结合所形成的产物称为结合物。在结合反应中需要有辅酶与转移酶并消耗代谢能量。所谓内源性化合物或基团的来源是体内正常代谢过程中的产物，参加结合反应的必须为内源性化合物，直接由体外输入者不能进行。
外来化合物在代谢过程中可以直接发生结合反应，也可先经过上述氧化、还原或水解等第一阶段生物转化反应(第一相反应)，然后再进行结合反应(第二相反应)，在一般情况下，通过结合反应，一方面可使外来化合物分子上某些功能基团失去活性以及丧失毒性；另一方面，大多数外来化合物通过结合反应，可使其极性增强，脂溶性降低，加速由体内的排泄过程。
根据结合反应的机理，可将结合反应分成以下几种类型：
1.葡萄糖醛酸结合 葡萄糖醛酸结合可能是最常见的结合反应，主要是外来化合物及其代谢物与葡萄糖醛酸结合。葡萄糖醛酸的来源是在糖类代谢过程中生成尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)，UDPG再被氧化生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸；UCPGA是葡萄糖醛酸的供体，在葡萄糖醛酸基转移酶的作用下与外来化合物及其代谢物的羟基、氨基和羧基等基团结合，反应产物是β－葡萄糖醛酸苷。葡萄糖醛酸必须为内源性代谢产物，直接由体外输入者不能进行结合反应。
葡萄糖醛酸结合作用主要是在肝微粒体中进行，此外肾、肠粘膜和皮肤中也可发生，外来化合物在肝脏中经结合反应后，随同胆汁排出。但有时一部分在肠道下段，可在肠菌群中的β－葡萄糖苷酸酶作用下，发生水解，则此种外来化合物可重被吸收，进行肠肝循环，使其在体内停留时间延长。
2.硫酸结合 外来化合物及其代谢物中的醇类、酚类或胺类化合物可与硫酸结合，形成硫酸酯。内源性硫酸的来源是含硫氨基酸的代谢产物，但必须先经三磷酸腺苷活化，成为3'－磷酸腺苷－5'－磷酸硫酸(PAPS)，再在磺基转移酶的作用下与酚类、醇类或胺类结合为硫酸酯。苯酚与硫酸结合较为常见。
硫酸结合反应多在肝、肾、胃肠等组织中进行；由于体内硫酸来源所限，不能充分提供，故较葡萄糖醛酸结合反应为少。
在一般情况下，通过硫酸结合反应可使外来化合物原有毒性降低丧失。但有些外来化合物经硫酸结合反应后，其毒性反而较高。例如属于芳香胺类的一种致癌物2－乙酰氨基芴（简称FAA或AAF）在体内经N－羟化反应，形成N－羟基－2－乙酰氨基芴后，其羟基可与硫酸结合，形成硫酸酯。此种AAF硫酸酯具有强致癌性，较AAF本身致癌性强。在大鼠、小鼠和狗都有此种反应发生。但有些动物肝内缺乏硫酸转移酶，无法形成硫酸酯。
3.谷胱甘肽结合 机体内有毒金属和环氧化物能与谷胱甘肽结合而被解毒。谷胱甘肽结合反应是由谷胱甘肽转移酶催化进行。谷胱转移酶在肝、肾中都含有，肝细胞胞液含量较多，近年来发现肝微粒体上亦有存在。微粒体的谷胱甘肽转移酶直接与外来化合物接触，可能在谷胱甘肽结合反应的意义更为重要。
谷胱甘肽与环氧化物结合反应非常重要。许多外来化合物，例如许多致癌物和肝脏毒物在体内可形成环氧化物，此种环氧化物大都对细胞具有较强的损害作用。例如溴化苯经代谢转化为环氧化物，溴苯环氧化物为一强肝脏毒物，可引起肝脏坏死；但与谷胱甘肽结合后，将被解毒并排出体外。谷胱甘肽在体内生成与储备有一定限度，如大量环氧化物在短时间内形成，可出现谷胱甘肽耗竭，仍可引起严重损害。
4.甘氨酸结合 有些含有羧基的外来化合物，例如有机酸可与氨基酸结合。此种结合反应的本质是一种肽式结合，与甘氨酸结合最为常见，事实上其它氨基酸也可进行这种结合。例如甲苯在体内代谢，生成苯甲酸，苯甲酸可与甘氨酸结合，形成马尿酸而排出体外。氰氢酸可经半胱氨酸结合，由唾液和尿液排泄。
5.乙酰结合 外来化合物中的芳香胺类，例如苯胺可通过其氨基与乙酰辅酶A反应，经乙酰转移酶催化使芳香胺类形成其乙酰衍生物。此外，脂族胺类药物也有类似反应。乙酰酶A的来源是糖、脂肪以及蛋白质的代谢产物。
6.甲基结合 生物胺类在体内与甲基结合的反应，也称甲基化。甲基来自蛋氨酸，蛋氨酸的甲基经ATP活化，成为S－腺苷蛋氨酸，再经甲基转移酶催化，使生物胺类与甲基结合而被解毒排泄。在外来化合物解毒中，甲基结合并不占重要地位。
二、影响生物转化因素
(一) 物种差异和个体差异
同一外来化合物生物转化的速度在不同动物可以有较大差异，例如苯胺在小鼠体内生物半减期为35分钟，狗为167分钟。同一外来化合物在不同物种动物体内的代谢情况可以完全不同。如前所述，N-2-乙酰氨基芴在大鼠、小鼠和狗体内可进行N－羟化并再与硫酸结合成为硫酸酯，呈现强烈致癌作用；而在豚鼠体内一般不发生N－羟化，因此不能结合成为硫酸酯，也无致癌作用或致癌作用极弱。
外来化合物在体内生物转化过程的个体差异还表现在某些参与代谢的酶类在各个体中的活力。例如芳烃羟化酶(arylhydrocarbon hydroxylase,AHH)可使芳香烃类化合物羟化，并产生致癌活性，其活力在个体之间存在明显差异。在吸烟量相同的情况下，AHH活力较高的人，患肺癌的危险度比活力低的人高36倍；体内AHH具有中等活力的人，患肺癌的危险度比活力低者高16倍。
(二) 外来化合物代谢酶的抑制和诱导
1.抑制 一种外来化合物的生物转化可受到另一种化合物的抑制，此种抑制与催化生物转化的酶类有关。参与生物转化的酶系统一般并不具有较高的底物专一性，几种不同化合物都可做为同一酶系的底物，即几种外来化合物的生物转化过程都受同一酶系的催化。因此，当一种外来化合物在机体内出现或数量增多时，可影响某种酶对另一种外来化合物的催化作用，即两种化合物出现竞争性抑制。
2.诱导 有些外来化合物可使某些代谢过程催化酶系活力增强或酶的含量增加，此种现象称为酶的诱导，凡具有诱导效应的化合物称为诱导物，诱导的结果可促进其它外来化合物的生物转化过程，使其增强或加速。在微粒体混合功能氧化酶诱导过程中，还观察到滑面内质网增生；酶活力增强以及对其它化合物代谢转化的促进等均与此有关。
(三) 代谢饱和状态
一种外来化合物在机体代谢的饱和状态对其代谢情况有相当的影响，并因此影响其毒性作用。例如溴化苯在体内首先转化成为具有肝脏毒作用的溴化苯环氧化物；如果输入剂量较小，约有75%的溴化苯环氧化物可转变成为谷胱甘肽结合物，并以溴苯基硫醚氨酸的形式排出；但如输入较大剂量，侧仅有45%可按上述形式排泄。当剂量过大时，因谷胱甘肽的量不足，甚至出现谷胱甘肽耗竭，结合反应有所降低，因而未经结合的溴苯环氧化物与DNA或RNA以及蛋白质的反应增强，呈现毒性作用。
(四) 其它影响因素
主要表现在年龄与性别和营养状况。蛋白质、抗坏血酸、核黄素、维生素A和维生素E的营养状况都可影响微粒体混合功能氧化酶的活力。在动物试验中如蛋白质供给不足，则微粒体酶活力降低。当抗坏血酸缺乏时，苯胺的羟化反应减弱。缺乏核黄素，可使偶氮类化合物还原酶活力降低，增强致癌物奶油黄的的致癌作用。上述酶活力降低，可能造成外来化合物转化过程减弱或减慢。
年龄对外来化合物代谢转化过程的影响，表现在肝微粒体酶功能在初出生和未成年机体尚未发育成熟，老年后又开始衰退，其功能皆低于成年，对外来化合物的代谢以及解毒能力较弱。例如大鼠出生后30天，肝微粒体混合功能氧化酶才达到成年水平，250天后又开始下降。葡萄糖醛酸结合反应在老年动物减弱，但大鼠的单胺氧化酶活力随年龄而增强。在一般情况下，幼年及老年机体对外来化合物代谢转化能力较成年为弱，所以外来化合物的损害作用也较强。
第三节 毒物动力学
一、概念
(一) 毒物动力学
是利用数学方法研究外来化合物进入机体的生物转化和生物转运随时间变化的规律和过程，称为毒物动力学，它是毒理学的一个新的分支。
(二) 室
室又称房室，它就是毒物动力学的数学模型，其含义是假设机体是由一个或多个室组成，室为有界的空间，外来化合物随时间变化在其中运动。室不代表解剖学的部位或器官或生理学的功能单位，而是理论的机体容积。
(三) 一室模型
一室模型或称单室模型，是将机体视为单一的室。外来化合物进入机体后，能迅速均匀地分布于全室之中。
(四) 二室模型
外来化合物在机体内随时间变化的规律呈一室模型较为少见，即外来化合物进入机体后，并非迅速和均匀地分布到全身，而是从血浆(包括体液)到组织脏器间有一个逐步分布与逐步达到平衡的过程。对化合物这种动力过程应用多室模型来表达，而其中以二室模型为多。二室模型是以“Ｉ室”表示血浆(或包括体液)，而以“Ⅱ室”表示组织脏器。“Ｉ室”也可称之为中心室，“Ⅱ室”也称为周边室。
(五) 速率过程
外来化合物在机体内随时间进程而发生的浓度(量)的变化，必然有其速率过程。由于化合物的化学结构，理化性质及在体内不同部位的生物环境和脏器的不同，其速率过程有两种。
1.一级速率过程 表明化合物在机体内随时间变化速率过程与化合物的浓度成正比。
2.零级速率过程 表明化合物在机体内随时间变化速率过程与化合物浓度无关。
二、主要参数
(一) 生物半减期 是表达与衡量一个外来化合物从体内清除速度的尺度，即化合物从机体减少一半所需的时间。单位min或h。公式为：
(2-1)
(二) 血浓度－时间曲线下面积，指血液中化合物浓度与时间作图，其曲线下的面积(单位μg·min·ml-1)。可用梯形或积分法求出。一室模型的积分法公式为：
(2-2)
式(2-2)中CO－零时血中化合物浓度。
(三) 表观分布容积 其意义为外来化合物在机体的分布相当于血浆浓度时所占体液的容积。它不是机体的生理真实容积，而是依据化合物在血浆水中的浓度推测而来。单位为ml/kg或L/kg。公式为：
(2-3)
式(2-3)中D给予机体化合物剂量。
(四) 总廓清率 其定义为单位时间内从机体内清除的表观分布容积，或视为机体对化合物的代谢廓清率加肾廓清率的总和。其公式为：
(2-4)
(五) 高峰时间 血浆中化合物达到高峰的时间(单位min或h)，其公式为：
(2-5)
式(2-5)中ka－化合物吸收速率常数。
(六) 生物利用度 或称生物有效度，是指外来化合物被吸收时入机体的量或吸收的程度，也就是化合物的吸收率。利用此参数可以比较外来化合物不同染毒途径吸收进入机体的吸收率。一般讲生物利用度较高者，对机体的损害效应也较强，其公式为：
(2-6)
第三单元 外来化合物毒性作用影响因素和联合作用
第一节 外来化合物毒性作用的影响因素
一、外来化合物的结构、理化性质及毒性效应
(一) 化学结构和毒性效应
研究外来化合物化学结构和毒性效应之间的关系，找出其规律，在毒理学研究中具有重要意义。现就已知举例介绍如下：
1.以直链饱和烃为例，这类脂肪族化合物为非电解质化合物，其毒性为具有麻醉作用。从丙烷(甲烷、乙烷例外，为惰性气体)起，随着碳原子数增多，麻醉作用增强。但达到9个碳原子之后，却又随着碳原子数增多，麻醉作用反而减弱。这是由于这类非电解化合物伴随碳原子数增加而脂溶性增大，水溶性相应减小，即脂水分配系数增大。极亲脂性化合物，由于不利于经水相转运，其在机体内易被阻滞于脂肪组织中，反而不易穿透生物膜达到靶器官。
2.有机磷化合物 均有亲电子的磷，它以共价键结合于乙酰胆碱酯酶的酯解部位。但有机磷化合物的一些取代基不同，可以影响磷原子上的电荷密度，使其毒性发生变化。保棉磷的R1与R2基团为二乙氧基，其P原子电荷为+1.041e，大鼠经LD50为16mg/kg。而当用二乙基取代二乙氧基，形成保棉磷时，P原子电荷为+0.940e，则其毒性大为下降，大鼠经LD50为1000mg/kg，二者毒性相差达60倍。
(二) 外来化合物的理化性质与毒性效应
外来化合物理化性质，如分子量、熔点、折射率、键能等等均与其毒性或毒性效应有关。现就目前讨论较多的几项介绍如下。
1.脂水分配系数 是指化合物在脂(油)相和水相的溶解分配率，即化合物的水溶性与脂溶性间达到平衡时，其平衡常数称为脂水分配系数。一种化合物的脂/水分配系数较大，表明它易溶于脂，反之表明易溶于水，而呈现出化合物的亲脂性或疏脂性。
化合物的脂/水分配系数大小与其毒性密切相关，它涉及化合物的吸收、分布、转运、代谢和排泄。
2.电离度 即化合物的pKa值，对于弱酸性或弱碱性的有机化合物，只有在pH条件适宜，使其维持最大限度成为非离子型时，才易于吸收，包括透过生物膜，发挥毒性效应。若化合物在一定pH条件下呈离子型的比例越高，虽易溶于水，但难于吸收，且易随尿排出。
3.挥发度和蒸气压 凡是化合物在常温下容易挥发，就易形成较大蒸气压，易于经呼吸道吸收。
有些有机溶剂的LD50值相似，即其绝对毒性相当，但由于其各自的挥发度不同，所以实际毒性可以相差较大。如苯与苯乙烯的LC50值均为45mg/L，即其绝对毒性相同。但苯很易挥发，而苯乙烯的挥发度仅及苯的1/11，所以苯乙烯形成空气中高浓度就较困难，实际上比苯的危害性为低。
4.分散度 粉尘、烟、雾等状态物质，其毒性与分散度有关。颗粒小分散度越大，表面积越大，生物活性也越强。分散度还与颗粒在呼吸道的阻留有关。大于10μm颗粒在上呼吸道被阻，5μm以下的颗粒可达呼吸道深部，小于0.5μm的颗粒易经呼吸道再排出，小于0.1μm的颗粒因弥散作用易沉积于肺泡壁。
(三) 外来化合物的纯度和异构体与毒性效应
论述一个外来化合物的毒性，一般是指其纯品的毒性，但在卫生毒理学实际工作中更经常的是阐明其工业品或商品的毒性。工业品往往混有溶剂，未参加合成反应的原料、原料中杂质、合成副产品等。商品中往往还含有赋形剂或添加剂。这些杂质有可能影响、加强、甚至改变原化合物的毒性或毒性效应。
有机化合物往往存在同分异构体，如二甲苯就有间位、邻位、对位三种，而且毒性也有差别。内吸磷含有硫联型和硫离型二种同分异构体，二者比重不同，溶解度可相差30倍，大鼠经LD50也相差3倍。三邻甲苯磷酸酯，即TOCP，是致迟发性神经病化合物，但当其甲基转至对位，则失去致迟发性神经病毒性。
二、实验动物物种和个体因素
(一) 实验动物的物种、品系及毒性效应
不同物种、品系的动物由于其遗传因素决定了对外来化合物代谢转化方式和转化速率的差异。转化方式不同可能因某些物种动物体内代谢反应类型有缺陷，从而产生不同的代谢产物，表现出不同的毒作用。例如2-乙酰氨基芴在大鼠、小鼠和狗体内可进行N－羟化，并与硫酸结合形成硫酸酯而呈现强致癌作用，而在豚鼠体内则不发生N－羟化，故不致癌。
同一物种动物品系不同，在遗传、生理学上的差异也表现对外来化合物毒性的差异。例如stock小鼠腹腔注射丙烯腈的LD50为15mg/kg，而NR小鼠则为40mg/kg。
(二) 实验动物个体因素与毒性效应
同一物种同一品系的不同群体动物，在相同条件下，接触一种外来化合物均有不同的剂量反应关系，说明实验动物存在个体差异。其个体差异的原因极为复杂，主要有如下几方面：
1.性别与年龄 品系相同的动物对外来化合物在毒性反应上表现出性别差异。在一般情况下，成年雌性动物比雄性动物对化学物毒性敏感，但也有例外。如马拉硫磷和甲基对硫磷对雄性大鼠毒性敏感性高于雌鼠。而对性别差异可能主要与性激素功能和代谢转化有关。
品系与性别相同的动物，年龄不同对外来化合物毒性的敏感性常不同。有人分析百余种化合物对不同年龄动物的致死量，结果表明新生动物对毒性的反应比青年或成年动物敏感，敏感性平均高3倍，出现年龄差异的原因可能是不同年龄动物酶活力、解毒能力、代谢速度、皮肤和粘膜的通透性以及肾脏清除率等方面的差别造成的。新生动物血脑屏障未发育完善，因此对某些神经毒物较敏感。
2.机体因素
人和哺乳动物的许多正常生理功能、疾病病理变化及营养与习惯往往也会影响外来化合物的毒性作用。
三、气象因素
1.气温 在正常生理情况下，高气温使机体皮肤毛细血管扩张、血循环加快、呼吸加速。凡可经皮肤或经呼吸道吸收的化合物，吸收速度将加快。如对硫磷经皮肤接触，吸收量随环境气温升高增加，尤其在30℃以上。另一方面，高温时多汗，随汗液排出氯化钠等物质增多，胃液分泌减少、胃酸降低，影响化合物经胃肠吸收。同时排汗增多，尿量减少，易于造成经肾脏随尿排出的化合物或其代谢产物在体内存留时间延长。
2.气湿 高气湿，尤其是伴随高气温的高气湿环境，可使经皮肤接触吸收的化合物吸收速度加快。因为高气湿环境汗液蒸发困难，皮肤角质层的水合作用加强，脂水分配系数较低的化合物也易吸收。此外化合物也易于粘着皮肤表面，延长接触时间。
3.气压 高气压与低气压环境条件下，接触外来化合物可以引起外来化合物的毒性改变。例如在低气压(如高原)士的宁的毒性降低，但氨基丙苯毒性增强。
四、接触途径和媒介
1.接触途径 实验动物接触外来化合物的途径不同，其首先到达的器官将有差别，中毒效应也不尽相同。在相同化合物剂量下，接触途径不同，其吸收速度、吸收率也不尽相同。一般认为，接触化合物吸收速度和毒性大小的顺序是：静脉注射>腹腔注射肌肉注射(经口>经皮。
2.溶剂和助溶剂 受试化合物常需先用溶剂溶解或稀释，有时还要用助溶剂。选择溶剂与助溶剂必须慎重，因有的溶剂或助溶剂可改变化合物的理化性质和生物活性。为此，所选用的溶剂或助溶剂应是无毒的，与受试化合物不起反应，受试化合物在溶液中应稳定。
3.化合物的稀释度 有的外来化合物经溶液稀释，由于稀释度不同(浓度不同)毒性也会受影响。一般在同等剂量情况下，浓溶液比稀溶液毒作用为强。
4.交叉接触 在毒理试验中，尤其是经皮肤接触与经呼吸道接触外来化合物的过程中，要注意防止化合物的交叉接触吸收问题。
第二节 外来化合物联合作用
一、联合作用的概念
外来化合物在机体中往往呈现十分复杂的交互作用。或彼此影响代谢动力学过程，或引起毒性效应变化，最终可以影响各自的毒性或综合毒性。毒理学把两种或两种以上的外来化合物对机体的交互作用称为联合作用。
二、联合作用的类型：
(一) 相加作用 交互作用的各种化合物在化学结构上如为同系物，或其毒作用的靶器官相同，则其对机体产生的总效应等于各个化合物成分单独效应的总和，这种现象即是化合物的相加作用。已知有些化合物的交互作用呈相加作用，如大部分刺激性气体的刺激作用一般呈相加作用；具有麻醉作用的化合物，一般也呈相加作用。
(二) 协同作用 各化合物交互作用结果引起毒性增强，即其联合作用所发生的总效应大于各个化合物单独效应的总和，这种现象即为化合物的协同作用。多个化合物之间发生协同作用的机理复杂而多样。可能与化合物之间影响吸收速率,促使吸收加快、排出延缓、干扰体内降解过程和在体内的代谢动力学过程的改变等有关。如马拉硫磷与苯硫磷的联合作用为协同作用，其机理是由于苯硫磷抑制肝脏降解马拉硫磷的酯酶之故。
(三) 拮抗作用 各化合物在体内交互作用的总效应，低于各化合物单独效应的总和，这一现象称为拮抗作用。化合物在体内产生拮抗作用可能有几种形式，一种是化合物之间的竞争作用，如肟类化合物和有机磷化合物竞争与胆碱酯酶结合，致使有机磷化合物毒性效应减弱。一种化合物间引起体内代谢过程的变化，1,2,4,－三溴苯和1,2,4.三氯苯等一些卤代苯类化合物能明显地引起某些有机磷化合物的代谢诱导，使其毒性减弱。一种是功能性或效应性拮抗，如一些中毒治疗药物，阿托品对抗有机磷化合物引起的毒覃碱症状，即为明显实例。
(四) 独立作用 两种或两种以上的化合物作用于机体，由于其各自作用的受体、部位、靶细胞或靶器官等不同，所引发的生物效应也不相互干扰，从而其交互作用表现为化合物的各自的毒性效应，对此称为独立作用。
当化合物的联合作用表现为独立作用时，如以LD50为观察指标，则往往不易与相加作用相区别，必须深入探讨才能确定其独立作用。例如酒精与氯乙烯的联合作用，当大鼠接触上述两种化合物之后的一定时间，肝匀浆脂质过氧化增加，且呈明确的相加作用。但在亚细胞水平研究，就显现出酒精引起的是线粒体脂质过氧化，而氯乙烯引起的是微粒体脂质过氧化，两化合物在一定剂量下，无明显的交互作用，而为独立作用。
第四单元 急性毒性作用及其试验方法
第一节 急性毒性试验概述及染毒方法
一、概念和试验目的
(一) 急性毒性概念
急性毒性是指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。
但须指出化合物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化合物的质与量不同而异。有的化合物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。而有的化合物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。此外，实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以“一次”含有时间因素。
(二) 实验目的
1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。
2.阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关系与中毒特征。
3.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。也可用于研究急救治疗措施。
二、实验动物和染毒方法
(一) 实验动物选择
在卫生毒理学领域中，体内试验以实验动物为研究对象，最终是为了阐明受试外来化合物对人的急性危害性质和危害强度。所以选择实验动物时，要求在其接触化合物之后的毒性反应，应当与人接触该化合物的毒性反应基本一致，虽然利用任何一种或几种实验动物的急性毒性结果向人外推都必须十分慎重，但这一选择实验动物的原则仍非常重要。
1.物种选择 以选择哺乳动物为主。目前实际应用中以大鼠和小鼠为主，尤以大鼠使用很多。需指出大鼠并非对外来化合物都最敏感。家兔常用于研究化合物的皮肤毒性，包括对粘膜的刺激。猫、狗也用于急性毒性试验，但因价贵不易于大量使用。猪为杂食动物，对一些化合物的生物效应表现与人有相似之处，尤其是皮肤结构与人较近似。但因体大、价贵，不便大量使用。
归纳起来，在进行化合物急性毒性研究中，选择实验动物的原则是：尽量选择对化合物毒性反应与人近似的动物；易于饲养管理，试验操作方便；易于获得、品系纯化，且价格较低的动物。为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。
一般研究外来化合物急性毒性，需雌雄两性动物同时分别进行，每个剂量组两性动物数相等。急性毒性使用小鼠体重以18(25g、大鼠180(240g、豚鼠200(250g、家兔2(2.5kg、猫1.5(2.0kg左右为宜。
(二) 实验动物喂养环境
实验动物喂养室室温应控制在22(3℃，家兔可控制在20(3℃，相对湿度30%～73%，无对流风。每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时需单笼饲养。饲养室采用人工昼夜为好，早6点至晚6点进行12小时光照，其余12小时黑暗，一般食用常规试验室饲料，自由饮水。
(三) 实验动物染毒方法
1.经口(胃肠道)接触 目的是研究外来化合物能否经胃肠道吸收及求出经口接触的致死剂量(LD50)等。由于外来化合物可以污染饮水及食物，因此，此种染毒方式在卫生毒理学中占有重要地位。
(1) 灌胃 是将液态受试化合物或固态、气态化合物溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。
在每一试验系列中，同物种实验动物灌胃体积最好一致，即以单位体重计算所给予的毫升数应一致，即ml/kg或ml/g计。这是因为成年实验动物的胃容量与体重之间有一定的比例。按单位体重计算灌胃液的体积，受试化合物的吸收速度相对较为稳定。小鼠一次灌胃体积在0.2(1.0ml/只或0.1(0.5ml/10g体重较合适，大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只(通常用0.5(1.0ml/100g体重)，家兔不超过10ml/2kg体重，狗不超过50ml/10kg体重。
(2) 吞咽胶囊 将一定剂量受试化合物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后后咽部迫使动物咽下。此种方式剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异味的化合物。家兔及猫、狗等大动物可用此法。
2.经呼吸道接触
例如CO、CO2等在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生活过程中以蒸气态、气溶胶、烟、尘状态污染生产与生活环境空气，此时就有可能经呼吸道吸入。研究外来化合物在上述物理性状下能否被吸入机体，且造成损害，在卫生毒理学中也占有重要位置。
实施经口接触时，实验动物在接触受试化合物前应禁食，以防止胃纳充盈影响化合物的吸收和毒性。大鼠、小鼠因主要在夜间进食，应采用隔夜禁食。接触受试化合物之后应继续禁食3(4小时。
(1) 吸入接触 分为两种方式，一是静式吸入，一是动式吸入。
① 静式吸入：系将实验动物置于一个有一定体积的密闭容器内，加入定量的易挥发的液态化合物或一定体积的气态化合物，在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境。这种接触方式，虽然有许多不足之处，但由于其设备简单、操作方便、消耗受试化合物较少，还有其使用价值；尤其是适用于小动物接触易挥发液态化合物的急性毒性研究。为保障试验顺利进行，染毒柜体积、放置动物种类和数量及放置时间相互关系见表4-1。
表4-1 实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系
动物种属
呼吸通气量
(L/小时)
最低需气量
(L/小时)
不同容积染毒柜放置动物数(只)
25L
50L
100L
300L
小 鼠大 鼠
1.45
10.18
2.45
30.5
3~5
6~10
12~15
1~2
36~40
5~6
② 动式吸入：是指实验动物处于空气流动的染毒柜中，染毒柜装置备有新鲜空气补入与含受试化合物空气排出的动力系统和随时补充受试化合物的配气系统。动式吸入接触方式一般来讲优于静式吸入接触，但其装置复杂，消耗受试化合物的量大，易于污染操作室环境。
3.经皮肤接触 液态、粉尘态和气态外来化合物匀有接触皮肤的机会。有的化合物不仅能与外露皮肤接触并吸收，还有的化合物可以穿透衣服而经皮肤吸收。
(1) 经皮肤吸收 研究外来化合物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠。但由于研究化合物经皮肤吸收的毒性(求经皮LD50)所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替。
定性试验：为考察一个外来化合物能否经皮吸收引起中毒，可先进行定性试验。小鼠或大鼠的浸尾试验是常用的定性试验方法。
定量试验：是在实验动物已脱好毛的部位定量涂布受试化合物，以求该化合物经皮吸收的剂量－反应关系，求经皮LD50。
(2) 局部作用试验 不少外来化合物可以引起皮肤接触部位的局部损伤。研究化合物局部毒性作用常用皮肤斑贴法或兔耳法。
4.注射途径接触受试物 采用注射途径进行外来化合物的急性毒性试验，主要用于比较毒性研究，以及化合物的代谢、毒物动力学和急救药物筛选等研究。
表4-2 几种动物不同注射途径注射量(ml)范围注射途径
小鼠
大鼠
豚鼠
兔
狗
静脉肌肉皮下腹腔
0.2~0.5
0.1~0.2
0.1~0.5
0.2~1.0
1.0~2.0
0.2~0.5
0.5~1.0
1.0~3.0
1.0~5.0
0.2~0.5
0.5~1.0
2.0~5.0
3.0~10
0.5~1.0
1.0~3.0
5.0~10.0
5.0~15.0
2.0~5.0
3.0~10.0
－
第二节 急性毒性试验程序与急性毒性评价
一、急性毒性试验程序
(一) 急性试验剂量分组
探讨外来化合物急性毒性应首先测定其半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)。对一个未知毒性的外来化合物求其LD50(LC50)，应先做预试验。做预试验方法很多，这里仅介绍其中一种。首先了解分析受试化合物的化学结构和其理化性质，确定其所属已知化合物或其衍生物的种类，有何特殊基团及其分子量、熔点、沸点、比重、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组，再上下各推一到两个剂量组做预试验。每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。
初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log4＝0.6)来划分各组剂量。
求外来化合物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定。一般设置5(7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6(8只、家兔4(6只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异，则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。
(二) 观察持续时间
测定外来化合物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化合物之后两周内的总死亡数。对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。也可仅计算24小时的死亡率，有些速杀性化合物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。
在观察期间应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。
(三) 症状观察
观察实验动物接触外来化合物的中毒症状是了解该化合物急性毒性的十分重要的一环，是补充LD50这个参数不足的重要方面。故应详细地观察动物的中毒症状、发生和发展过程及规律，死亡前症状特点、死亡时间等等。这有助于揭示化合物甚至同类化合物的不同衍生物的急性毒性特征。
很多化合物在实验动物接触的初期往往先出现兴奋现象，有的化合物在动物接触的初期首先表现为抑制现象，在观察期间应注意观察其体重变化。这有助于了解受试化合物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应。此外，不少化合物还可以引起受试实验动物粘膜刺激症状，如出汗、流涎，甚至有血性分泌物，瞳孔改变等。
(四) 病理学检查和其它指标观察
二、急性毒性评价
应当重视病理组织学检查。凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查。对存活动物于观察期结束后应做病理学检查。
外来化合物的急性毒性分级标准用于对急性毒性进行评价。但各种分级标准还没有完全统一。我国目前除参考使用国际上几种分级标准外，又提出了相应的暂行标准。不论我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。
表4-3 工业毒物急性毒性分级标准毒性分级
小鼠一次经口
LD50(mg/kg)
小鼠吸入2小时
LC50(ppm)
兔 经 皮
LD50(mg/kg)
剧 毒高 毒中 等 毒低 毒微 毒
<10
11~1000
101~1000
1001~10000
>10000
<50
51~500
501~5000
5001~50000
>50000
<10
11~50
51~500
501~5000
>5000
表4-4 化合物经口急性毒性分级标准毒性分级
小鼠一次经口
LD50(mg/kg)
大约相当体重70kg人的致死剂量
6级，极毒
5级，剧毒
4级，中等毒
3级，低毒
2级，实际无毒
1级，无毒
<1
1~50
51~500
501~5000
5001~15000
>15000
稍尝，<7滴
7滴~1茶匙
1茶匙~35g
35~350g
350~1050g
>1050g
表4-5 外来化合物急性毒性分级(WHO)
毒性分级
大鼠一次经口LD50(mg/kg)
6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)
LD50
(mg/kg)
兔经皮对人可能致死的估计量
总 量
g/kg (g/60kg)
剧 毒高 毒中 等 毒低 毒微 毒
<1
1~
50~
500~
5000~
<10
10~
100~
1000~
10000~
<5
5~
44~
350~
2180~
<0.05
0.05~
0.5~
5~
>15
0.1
3
30
250
>1000
联合国世界卫生组织推荐了一个五级标准(表4-5)。
总之，从表4-3到表4-5可见各种分级标准有相同之处，也有相异之点，但都有不完善的地方。
第五单元 亚慢性和慢性毒性作用及其试验方法
第一节 亚慢性毒性作用及其试验方法
一、概念和试验目的
(一) 概念
亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。
(二) 试验目的
亚慢性毒性试验的目的，主要是探讨亚慢性毒性的阈剂量或阈浓度和在亚慢性试验期间未观察到毒效应的剂量水平，且为慢性试验寻找接触剂量及观察指标。
二、亚慢性毒性试验设计
(一) 亚慢性试验期限
亚慢性毒性试验的期限“多日”的确切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为3～6个月，而在工业毒理学中认为1～3月即可。这是考虑到人类接触大气、水和食品污染物的持续时间一般较久，而在工业生产过程中接触化合物仅限于人一生中的工作年龄阶段，且每日工作不超过8小时之故。
现有学者主张进行实验动物90天喂饲试验为亚慢性毒性试验，即将受试物混合物饲料或饮水中，动物自然摄取连续90天。这是由于有研究报道认为动物连续接触外来化合物3个月，其毒性效应往往与再延长接触时间所表现的毒性效应基本相同，故不必再延长接触期限。相应地主张呼吸道接触可进行30天或90天试验，每天6小时，每周5天。经皮肤试验进行30天。
（二）实验动物和染毒途径
1、实验动物的选择
亚慢性毒性作用研究一般要求选拔两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性特征。
由于亚慢性毒性试验期较长，所以选择被动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右。
2、染毒途径
亚慢性毒性试验接触外来化合物途径的选择，应考虑两点：一是尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式，二是应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种。
（三）剂量选择与剂量分组
亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型的损伤。此剂量的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此化合物LD50的1/20(1/5为最高剂量。
化合物亚慢性毒性试验应求出其剂量－反应关系，只有求出剂量－反应关系才能阐明受试化合物的亚慢性毒作用特征，并为慢性毒性试验打下基础。为此，亚慢性试验至少应设计三个染毒剂量组及一个正常动物对照组，必要时再加一个受试化合物的溶剂对照组。最低剂量组的剂量应相当于亚慢性的阈剂量水平或未观察到作用水平，中间剂量组动物以出现轻微中毒效应为度。组内动物个体体重相差应不超过平均体重的10%，组间平均体重相差不超过5%。小动物每组不应少于20只，大动物不少于6(8只。
（四）观察指标
1、一般性指标
1）.一般综合性观察指标 这类指标是非特异性观察指标，它是外来化合物对机体毒性作用的综合性总体反映。
① 动物体重 实验动物在亚慢性方式接触外来化合物过程中，有多种因素均可影响动物体重的增长，包括食欲变化、消化功能变化、代谢和能量消耗变化等。体重变化的表示方式，可将接触组与对照组同期体重绝对增长的重量加以比较和统计学处理。也可将接触组与对照组同期体重百分增长率(以接触化合物开始时动物体重为100%)进行统计和比较。
② 食物利用率 亚慢性试验期间必须注意观察并记录动物的饮食情况，在此基础上计算食物利用率，即动物每食入100g饲料所增长的体重克数。分析比较接触组与对照组食物利用率，有助于分析受试化合物对实验动物的生物学效应。
③ 症状 实验动物在接触外来化合物过程中所出现的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间均应记录和分析。
④ 脏器系数 或称脏/体比值，是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100g体重计。如肝/体比，即(全肝湿重/体重)(100。此指标的意义是实验动物在不同年龄期，其各脏器与体重之间重量比值有一定规律；若受试化合物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变，可以增大或缩小，因此，脏/体比值是一个灵敏、有效和经济的指标。
2）.一般化验指标 主要指血象和肝、肾功能的检测，在亚慢性试验中研究外来化合物对实验动物的毒性作用，使用这类指标，一般为筛检性和探讨性。通常血象检测包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量等。肝、肾功能也是一种常规指标，如SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣镜检等。
2、病理学检查 亚慢毒性试验中应重视病理学检查。凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。必要时作组织化学或电镜镜检。
第二节 蓄 积 作 用
一、蓄积作用的概念
外来化合物一次性进入机体之后，可经代谢或原型排出体外，但当化合物与机体发生亚慢性接触，将反复进入机体，而且当进入的速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化合物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化合物的蓄积作用。
二、蓄积作用的研究方法
现仍认为外来化合物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础。一种外来化合物有无蓄积作用是评定该化合物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据。
依蓄积作用的概念，实验动物亚慢性或亚急性接触外来化合物之后,当用化学分析方法能够测得机体内存在该化合物或其代谢产物时，称之为物质蓄积。但是有的化合物在机体内虽不能被测出，却在长期接触下出现了慢性中毒现象，此时习惯上称之为功能(机能)蓄积。功能蓄积可能是由于贮存体内的化合物或其代谢产物的数量极微，不能检出物质的蓄积或者是由于每次机体接触化合物之后所引起的损害累积所致。
蓄积作用的研究方法有多种，现仅介绍两种常用的方法。
(一) 蓄积系数法
此种方法的原理是在一定期限之内以低于致死剂量(小于LD50剂量)，每日给予实验动物，直至出现预计的毒性效应(或死亡)为止，计算达到预计效应的总累积剂量，求出此累积剂量与一次接触该化合物产生相同效应的剂量的比值，此比值即为蓄积系数(K值)。在卫生毒理学实际工作中，蓄积作用试验多用小鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标，其K值计算公式如下：
(5-1)
式(5-1)中LD50(n)表示引起一半动物死亡的累积总剂量；LD50(1)表示引起一半动物死亡的一次剂量。
如果有多次接触中，实验动物对受试化合物发生过敏现象，则可能出现K<1。一个化合物的蓄积作用较弱，由K>1。一般认为K>5时，此化合物的蓄积作用极弱，蓄积系数评价标准见表5-1。
表5-1 蓄积系数评价标准蓄积系数(K)
蓄积作用分级
<1
1~
3~
5~
高 度 蓄 积明 显 蓄 积中 等 蓄 积轻 度 蓄 积
虽然蓄积系数法具有一定使用价值，但是某些外来化合物的慢性中毒效应，无法用K值表示。例如多数有机磷化合物是属于轻度蓄积(K>5)，但当小剂量反复与机体接触后，红细胞与脑组织的乙酰胆碱酯酶可以持续降低，而且伴有一定程度的中枢神经系统症候。
(二) 生物半减期法
生物半减期法是用毒物动力学原理阐明外来化合物在机体内的蓄积作用特征。
外来化合物在机体内蓄积的速度和量与单位时间内吸收该化合物的速度和量以及清除速度和量有关。任何化合物如果以相等的时间间距恒速地吸收入血液，则化合物一定剂量范围内在机体中的蓄积量不是直线地无限增加，而是有一定的极限。这是因为受试化合物在吸收进入机体的同时存在着该化合物在体内代谢转化与清除的过程。当受试化合物的吸收过程与代谢转化、清除过程达到动态平衡时，化合物的蓄积量就基本上不再增加。T1/2较短的化合物达到蓄积极限所需的时间也短，但是一旦机体停止接触该化合物，也易于很快从机体内清除完毕。
第三节 慢性毒性作用及其试验方法
一、概念和试验目的
(一) 慢性毒性概念
慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。
(二) 试验目的
慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。
二、慢性毒性试验设计
（一）慢性毒性试验期限
一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；而环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。
但是，也有学者认为大鼠为进行慢性毒性试验动物，接触受试化合物1年以上不一定必要。多次经验证明延长接触1年以上，大鼠也不再出现新的毒性效应(致癌试验除外)。例如有报道在122种化合物中，大鼠连续接触3个月之后才出现毒性效应的只有3种(占2.46%)，其它化合物均在3个月内已出现毒性效应。因此认为以大鼠为试验对象时连续接触外来化合物90天，即可确定受试化合物的长期无作用水平。但是，这种观点还存有争论。因此在食品及环境毒理学中进行慢性毒性试验，接触外来化合物的时间仍以2年为好。
（二）实验动物与饲养环境
1、实验动物
慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢性毒性试验相同。但实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组。
实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重10(12g；大鼠出生后3(4周，体重50(70g。性别要雌雄各半。
2、动物饲养环境
慢性毒性试验实验动物的饲养条件和饲养环境与亚慢性毒性试验相同。
（三）接触途径
慢性毒性试验多为经口与经呼吸道接触。经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定。工业毒物的试验通常每日吸入4～6小时。环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。
（四）剂量的选择与分组
为制定外来化合物卫生标准而进行慢性毒性试验时，一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组)。以求出明确的剂量－反应关系。
染毒组剂量的选择可参考三组数据。一是以亚慢性阈剂量为出发点，即以亚慢性阈剂量或其1/5 (1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/50(1/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组；一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50 的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实验动物个体敏感性差异。组间剂量差一般以5(10倍为宜，最低不小于两倍。
（五）观察指标
观察指标的选择，应以亚慢性毒性试验的观察指标为基础。其中包括体重、食物摄取、临床症状、行为、血象和血液化学、尿的性状及生化成分以及重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。一些观察指标变化甚微，为此应注意三点：一是试验前应对一些预计观察指标，尤其是血、尿常规及重点测定的生化指标进行正常值测定，废弃个体差异过大的动物；二是在接触外来化合物期间进行动态观察的各项指标，应与对照组同步测定；三是各化验测定方法应精确、可靠、且进行质量控制。
应重视病理组织学的检查。凡试验期间死亡的动物，都应做病理组织学检查。
第六单元 外来化合物致突变作用及其评价
第一节 诱发突变的类型
一、基因突变
基因突变即遗传物质在分子水平上的改变，有碱基置换、移码和大段损伤。
(一) 碱基置换
碱基置换是某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变。此时首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。原来的嘌呤被另一种嘌呤置换，或原来的嘧啶被另一种嘧啶置换，都称为转换；原来的的嘌呤被任一种嘧啶置换，或与此相反，原来的嘧啶被任一种嘌呤置换，都称为颠换。无论是转换还是颠换都只涉及一对碱基，是名符其实的点突变，其结果可造成一个三联体密码子的改变；此时可能出现同义密码、错义密码或终止密码。由于错义密码所编码的氨基酸不同，于是基因表达产物的蛋白质有可能受到某种影响，终止密码可使所编码的蛋白质肽链缩短。
(二) 移码
移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变，故称移码。其结果是从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列完全改变；也可能使读码框架改变其中某一点形成无义密码，于是产生一个无功能的肽链片段，移码较易成为致死性突变。
(三) 大段损伤
大段损伤是DNA链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，涉及数以千计的核苷酸。 缺失的片段远远小于光学显微镜可观察到的染色体缺失，故称小缺失。它往往是DNA断裂的结果，有时在减数分裂过程中发生错误联合和不等交换也可造成小缺失。小缺失通常可引起突变。
小缺失游离出来的DNA片段可整合到另一染色体某一位置而形成插入。每次整合都可发生突变。小缺失的片段也可倒转后仍插入原来位置而造成基因重排。
二、染色体畸变
染色体畸变包括染色体结构异常和数目异常。
(一) 染色体结构异常
染色体结构异常是染色体或染色体单体受损而发生断裂，且断端不发生重接或虽重接却不在原处。能使染色体或染色单体发生断裂的物质称为断裂剂，这种作用的发生及其过程称为断裂作用。断裂作用的关键是诱发DNA链断裂。大多数化学断裂剂像紫外线一样，只能诱发DNA单链断裂，故称为拟紫外线断裂剂。这种断裂需要经过S期的复制，才能在中期相细胞出现染色单体型畸变。少数化学断裂剂与电离辐射一样，可诱发DNA双链断裂，故称为拟放射性断裂剂。所以如在S期已发生复制之后或G2期发生作用，在中期相呈现染色单体型畸变，而在G0期和G1期作用，则经S期复制，就会在中期相呈染色体型畸变。由于拟放射性断裂剂能在细胞周期任一时期发生作用,并在立即到来的中期相观察到染色体结构改变，故称S期不依赖断裂剂。
在任何情况下见到的染色单体型畸变都将在下一次细胞分裂时衍生为染色体型畸变。
1.染色体畸变 是染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的结构异常，可分为下列类型：
(1) 裂隙和断裂：都是指染色体上狭窄的非染色带。过去以带宽超过染色单体宽度为断裂，不超过者为裂隙。此种线状连接多排列成直线或圆滑弧形。无线状连接者为断裂，保持线状连接者为裂隙。一般认为裂隙属于非染色质损伤。裂隙一向不计入畸变范围。
(2) 无着丝粒断片和缺失：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，就会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体，后者称为带着丝粒断片。常将无着丝粒断片简称为断片，在下一次细胞分裂时断片因无着丝粒，故不能进入分裂的核中而滞留在细胞质中，称为微核。如断片很小，小于染色单体宽度，则称为微小体。
(3) 环状染色体：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体；如果是一条较长的无着丝粒断片的两端连接，就形成无着丝粒环。
(4) 倒位：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180(再重接，称为倒位。
(5) 插入和重复：当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。如此时有缺失的染色体和有插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。
(6) 易位：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。
2.染色体单体畸变 指某一位点的损伤只涉及姐妹染色单体中的一条。
(1) 染色单体裂隙、断裂和缺失：含义与染色体型畸变的裂隙、断裂和缺失基本相同，不同的是染色体中一条染色单体的结构改变。染色单体断片在下一次细胞分裂中也可滞留于细胞质而成为微核。
(2) 染色单体交换：是两条或多条染色单体断裂后变位重接的结果。在同一染色体内的染色单体交换称为内换，在不同染色体之间的染色单体交换称为互换。
(3) 姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange,SCE)：当使用差示染色法时，可见到染色体的两条姐妹染色单体染色一深一浅。如某一染色体在姐妹染色单体间发生同源节段的内换，就会使两条姐妹染色单体都出现深浅相同的染色，但同源节段仍然是一深一浅。这种现象称为SCE。1978年ISCN(人类细胞遗传学命名国际体制)将SCE列入染色单体型畸变的范围，但其发生机理目前倾向于与染色单体断裂无关。
(二) 染色体数目异常
各种生物都有其固定的染色体数目和核型。以动物正常体细胞染色体数目2n为标准，染色体数目异常可能表现为整倍性畸变和非整倍性畸变。整倍性畸变可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变系指比二倍体多或少一条或多条染色体。例如：缺体是指缺少一对同源染色体，单体或三体系指某一对同源染色体相应地少或多一个，四体则指其比同源染色体多一对；于是在染色体数目上相应为2n-2、2n-1，2n+1和2n+2。
第二节 化学诱变的分子机理
一、直接以DNA为靶的诱变
(一) 碱基类似物取代
有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物。它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置。例如5－溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶，2－氨基嘌呤(2-AP）能取代鸟嘌呤。
(二) 烷化剂的影响
烷化剂是对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用的物质。烷化剂的种类很多，最常见的有烷基硫酸酯、N－亚硝基化合物、氮芥和硫芥等环状烷化剂和卤代亚硝基脲等。各类烷化剂其分子上的烷基各不相同，因而烷化活性有别，有一般情况下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。
目前认为最常受到烷化的是鸟嘌呤的N－7位，其次是O－6位。而腺嘌呤的N－1、N－3和N－7也易烷化。
认为鸟嘌呤的N－7位发生烷化后可导致鸟嘌呤从DNA链上脱落，称为脱嘌呤作用。致使在该位点上出现空缺，即碱基缺失，其结果是移码突变。
(三) 致突变物改变或破坏碱基的化学结构
有些化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，有时还引起链断裂。
例如，亚硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应变为次黄嘌呤和尿嘧啶。羟胺能使胞嘧啶C－6位的氨基变成羟氨基。这些改变都会造成转换型碱基置换。但是亚硝酸虽然也能使鸟嘌呤变为黄嘌呤，但是由于黄嘌呤的配对性能与鸟嘌呤一致，故并不发生碱基置换。
还有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂。
(四) 平面大分子嵌入DNA链
有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称为嵌入剂，它们多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8(102nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。如果嵌入到新合成的互补链上，就会使之缺失一个碱基；如果嵌入到模板链的两碱基之间，就会使互补链插入一个碱基。无论多或少一个碱基都造成移码突变。
二、不以DNA 为靶的间接诱变
化学物的间接诱变可能是通过对纺锤体作用或干扰与DNA合成和修复有关的酶系统。
(一) 纺锤体抑制
一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程。诱发这种作用的物质称为有丝分裂毒物，又称干扰剂。无论纺锤体是部份或完全受抑制，都称为有丝分裂效应。完全抑制时细胞分裂完全抑制，细胞停滞于分裂中期。秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，因此这种效应又称秋水仙碱效应或C－有丝分裂。有些干扰剂仅使细胞群体的有丝分裂数减少，被称之为抗有丝分裂剂。
干扰剂不直接作用于遗传物质，故严格说来并非真正的致突变物，但它同样可诱发突变，特别是诱发与遗传性疾病有密切关系的非整倍体，故引起密切注意，并作为致突变物的一个特殊类型来看待。
(二) 对酶促过程的作用
对DNA合成和复制有关的酶系统作用也可间接影响遗传物质。例如，一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏从而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸在DNA合成时的不平衡也可诱发突变。再有，铍和锰除可直接与DNA相互作用外，还可与酶促防错修复系统相作用而产生突变。
第三节 突变后果
一、体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，其次，胚胎体细胞突变可能导致畸胎，当然畸胎的发生还与亲代生殖细胞突变有关。据报道人类妊娠最初3个月自然流产中有60%有染色体畸变，在一定程度上,这是致突变物透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代的生殖细胞突变的后果。
二、生殖细胞突变的后果
如果突变发生在生殖细胞，无论是在其发育周期的任何阶段，都存在对下一代影响的可能性，其影响可分为致死性和非致死性两类。致死性影响可能是显性致死或隐性致死。显性致死即突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死需要纯合子或半合子才能出现死亡效应。
如果生殖细胞突变为非致死性，则可能出现显性或隐性遗传性疾病，包括先天性畸形。在遗传性疾病频率与种类增多的同时，突变的基因，以及染色体损伤，将使基因库的遗传负荷增加。基因库是指一种物种的群体中在生殖细胞内具有，并能传给下一代的全部基因的总和。
第四节 化学致突变物的检测
一、致突变试验
(一) 基因突变试验
1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
又称Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性。
试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。在掺入试验中，受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少有五个剂量点，并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中，混匀后铺在最低营养平皿上，37℃培养48小时，计数可见菌落数。判断阳性结果的标准是，如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并有剂量－反应关系，即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等辅助因子，作为代谢活化系统。如不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物；加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
2.哺乳动物细胞基因突变试验
哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞，OUA位点突变仅适用于CHO细胞，HGRPT和TK可分别使6－硫代鸟嘌呤(6－TG)转移上磷酸核糖及使5－溴脱氧尿苷磷酰化，它们的代谢产物可掺入DNA引起细胞死亡，因此正常细胞在含有这些硷基类似物的培养基中不能生长，在致突变物作用下此两个位点发生突变的细胞对这些硷基类似物具有抗药性，可以增殖成为克隆(细胞集落)。Na+/K+ATP酶是细胞膜上的Na+/K泵，鸟本苷可抑制此酶活性引起细胞死亡，当致突变物引起该位点突变后，Na+/K+ATP酶对鸟本苷的亲和力下降，而酶活性不变，故对培养基中的鸟本苷产生抗药性，并可增殖为克隆。
(二) 染色体畸变试验
1.染色体分析
观察染色体形态结构和数目改变称为染色体分析。在国外常称为细胞遗传学检验，但这一名称有时广义地包括微核试验和SCE试验，因为这两个试验同样也是在显微镜下观察细胞染色体的改变。
对于结构畸变，一般只观察到裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、粉碎、双或多着丝粒染色体和射体。对于缺失，除染色单体缺失外，需作核型分析。即染色体摄影拍片后，再排列进行细微观察或用电子计算机进行图象分析。对于相互易位，除生殖细胞非同源性染色体相互易位外，倒位、插入、重复等均需显带染色才能发现。
对于数目畸变，需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。但是经过一次有丝分裂后，一些结构畸变可能因遗传物质的丢失而致细胞死亡，因此不能发现。所以应安排多次收获时间，以便分别检查断裂剂的作用。收获时间的安排还应考虑外来化合物可能在细胞周期的不同时期产生作用，以及延长细胞周期的作用。
体细胞的染色体分析可作体内或体外试验，体内试验多观察骨髓细胞，体外试验常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞，例如人外周淋巴细胞。体内试验与人体实际接触情况相似，但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验由于受试物与细胞直接接触，故往往比体内试验灵敏。
2.微核试验
经致突变物作用后，染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核，称为微核。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。常用小鼠，至少设两个处理组，最高剂量为LD50/7的80%(LD50/7为在7天内使半数动物死亡的剂量)，另一组为LD50/7的40%，灌胃或腹腔注射，同时设阴性和阳性对照组，每组至少8只动物，雌雄各半。给毒方案有多种，如连续四天，每天一次。第五天处死，取骨髓，涂片，固定，染色。每鼠计数1,000个PCE的微核出现率。当经适当的统计学分析，处理组微核率显著高于阴性对照组，并呈现剂量－反应关系时，可认为受试物对该试验动物的骨髓细胞有致染色体损伤的作用。
(三) DNA损伤试验
1.姐妹染色单体交换(SCE)试验
SCE是染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换，SCE可能与DNA的断裂和重接有关，提示DNA损伤。SCE试验可分为体外试验、体内试验和体内、体外结合试验。体外SCE试验可采用贴壁生长的细胞，如CHO、V79、CHL等，也可用悬浮生长的细胞，如人外周血淋巴细胞。细胞在含5-溴脱氧尿苷(BrdU)的培养液中生长两个周期。由于Brdu是嘧啶类似物，可于合成期中掺入DNA互补链，所以在下一个中期所见染色体姐妹染色单体之间各有一条互补链掺入了Brdu，于是Brdu对称姐妹染色单体造成同等的干扰，其染色并无区别。但到了第二个周期中期相，每个染色体中只有一条染色单体保留了原来不带Brdu的模板链，而另一条染色单体则是上一周期带Brdu的互补链成为模板链。于是经两个周期的Brdu掺入互补链可使两姐妹染色单体所含Brdu量不相等，从而出现染色差别。如果Brdu仅在第1周期掺入，第2周期不掺入，则第2中期相似可见姐妹染色单体染色有差别。如果DNA单链发生了断裂，而且在修复过程中发生重排，就在第2周期可见姐妹染色单体同位节段的相互交换。经差别染色后，可观察到两条明暗不同的染色单体。若两条染色单体间发生等位交换，可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段进行识别和计数。
2.程序外DNA合成试验
基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量，这一掺入量可反映DNA损伤后修复合成的量。由于此种合成发生在DNA正常复制合成主要时期以外，故称为程序外DNA合成(unschedule DNA synthesis UDS)试验或DNA修复合成试验。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则就需要人为地将细胞阻断于G1期，使增殖同步化。然后在药物的抑制下使残存的半保留DNA复制降低到最低限度，才能避免掺入水平很高的半保留复制对掺入水平很低的程序外DNA合成的观察。
二、试验结果的评定
各种致突变试验都有其特定的观察终点，但实验结束后都面临一个共同的问题，即所取得的数据表示阳性结果或表示阴性结果。
在评定阳性或阴性之前，应首先检查实验的质量控制情况。致突变试验的质量控制是通过：① 盲法观察和② 阴性对照和阳性对照的设立。盲法观察是观察人员不了解所观察的标本的染毒剂量或组别，可免除观察人员对实验数据产生主观影响。阴性对照指不加受试物的空白对照，有时则是加入为了溶解受试物所用溶剂的溶剂对照。阳性对照是加入已知突变物的对照，对于体外试验应包括需活化的和不需活化的两种已知致突变物。空白对照应和溶剂对照的结果一致，如有显著差异则可能表明有实验误差，如溶剂对照结果显著高于空白对照则可能溶剂具有致突变性。阴性对照和阳性对照结果都应与文献报告或本实验室的历史资料一致。如差异较大也说明可能有实验误差。发现这些质量控制指标存在任何疑问时，均应查清存在的问题，并加以解决后，重新进行实验。
阳性结果应当具有剂量反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异。如果低剂量组或低、中两剂量组与对照组之间的差异有显著性，而高剂量组差异无显著性，则阳性结果不可信或无意义。此时应检查影响实验的因素，在排除影响因素后，应考虑是否为剂量反应关系曲线的特殊形式所致，即曲线上升至一定程度后下降。如怀疑及此，应当在零剂量与最高观察值的剂量之间重新设计染毒剂量。
阴性结果的判定条件是：① 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量，使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大，毒性低的化学物，在细菌试验中往往以5mg/皿作为最高剂量。② 各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外来化合物。
无论阳性还是阴性结果都要求有重现性，即重复试验能得到相同结果。
第七单元 外来化合物致癌作用及其评价第一节 概念一、直接致癌物有些致癌物可以不经过代谢活化就具有活性，称为直接致癌物。
二、前致癌物
大多数致癌物必须经过代谢活化才具有致癌活性，这些致癌物称为前致癌物。
三、近致癌物在活化过程中接近终致癌物的中间产物称为近致癌物。
四、终致癌物经过代谢转化最后产生的活性代谢产物称为终致癌物。
第二节 化学致癌物及其分类
一、化学致癌物
是指具有诱发肿瘤形成能力的化学物。
二、化学致癌物分类
致癌物可分为三大类：
遗传毒性致癌物直接致癌物
这类物质绝大多数是合成的有机物。包括有内酯类如β-丙烯内酯等；烯化环氧化物如1，2，3，4-丁二烯环氧化物；亚胺类；硫酸酯类；芥子气和氮芥；活性卤代烃类等等。
前致癌物前致癌物分为天然和人工合成两大类。
人工合成的主要有：多环或杂环芳烃类如苯并（a）芘、3-甲基胆蒽等；单环芳香胺类如邻甲苯胺等；双环或多环芳香胺类如联苯胺等；喹啉类；硝基呋喃类；硝基杂环类；烷基肼类等等。
天然物质主要有黄曲霉毒素、环孢素A、烟草和烟气、槟榔及酒精性饮料。
无机致癌物铀、镭、氡等可能由于其放射性致癌。镍、铬、钛、锰等金属及其盐类可在一定条件下致癌。
在无机致癌物中，有些能损伤DNA，但有些可能通过改变DNA聚合酶而致癌。
非遗传毒性致癌物这一类致癌物经过致突变试验证明，不能与DNA发生反应。
促癌剂如TPA是小鼠皮肤癌诱发试验的促癌剂；苯巴比妥对大鼠肝癌有促癌作用；色氨酸和糖精对膀胱癌有促癌作用；丁基羟甲苯、DDT、多卤联苯、氯丹、七氯和四氯二苯并对二恶英（TCDD）等。
细胞毒物能导致细胞死亡的物质可引起代偿性增生，以至发生肿瘤。如氮川三乙酸使锌进入肾脏，由于锌的毒性，造成细胞死亡，结果引起增生和肾肿瘤。
3．激素雌性激素和干扰内分泌器官功能的物质可引起动物肿瘤或使这些器官的肿瘤形成增多。
如孕妇使用雌性激素（已烯雌酚）保胎可能使其女儿在青春期发生阴道透明细胞癌。有些物质不是激素，但干扰内分泌系统而致癌，如3-氨基三唑诱发大鼠甲状腺肿瘤与干扰甲状腺素合成有关。
4．免疫抑制剂如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等免疫抑制剂或免疫血清均能使动物和人发生白血病或淋巴瘤，但很少发生实体肿瘤。
5．固态物质动物皮下包埋塑料后，经过较长的潜伏期，可导致肉瘤形成。石棉在人和动物的胸膜表面可引起胸膜间皮瘤。石棉和其他矿物粉尘，如铀矿或赤铁矿粉尘，可增强吸烟致肺癌的作用。
6．过氧化物酶体增生剂能使啮齿动物肝脏中的过氧化物酶体增生的各种物质都可诱发肝肿瘤。如降血脂药安妥明、降脂异丙酯、增塑剂二-苯二甲酸酯和有机溶剂1，1，2-三氯乙烯。
（三）暂未确定遗传毒性的致癌物有不少致癌物未能证明损伤DNA，但又对其作用所知有限，不足以归入非遗传毒性致癌物一类。如四氯化碳、氯仿、某些多氯烷烃和烯烃等。另外，硫脲、硫乙酰胺、硫脲嘧啶和噻吡二胺等都有致癌性。
第三节 致癌作用的影响因素联合作用
（—）致癌性的增强除促癌剂可增强致癌作用外，还有助癌剂也有这种作用。助癌剂是在接触致癌物之前或同时接触的情况下增强整个致癌过程。机理可能有：
增强致癌物的吸收；
增强遗传毒性致癌物的代谢活化或使其解毒减弱；
抑制DNA修复；
选择性增强DNA受损细胞的增殖。
同时接触或先后接触两种或多种致癌物，致癌作用有时可增强，表现为相加或协同作用，被称为共致癌作用或协同致癌作用。如二乙亚硝胺和偶氮染料都可分别诱发肝癌，同时接触则肝癌发生率相对增高。
（二）致癌性的抑制
在许多动物试验中发现非致癌物与致癌物同时存在，可出现拮抗现象。多发生于非致癌物的化学结构与致癌物相似的情况下，特别是前者的剂量远较后者为高时尤易发生。如多环芳烃经部分羟化后失去致癌活性，再与原先完整的芳烃结构物质同时存在时，将抑制后者的致癌性。拮抗作用的机理可能是：
在靶器官中发生竞争性的取代；
活化作用酶系统活力发生改变；
全身作用使解毒效果和受体比例发生改变。
营养因素蛋白质
如蛋白质含量增高，高于50%时，可减少肿瘤发生；如低于正常，对偶氮染料致癌性的易感程度增高；完全缺乏蛋白质可减少某些致癌物诱发特异器官肿瘤的可能性。
脂肪许多化学致癌物，尤其是当靶器官为大肠或激素敏感器官如乳腺、子宫内膜和前列腺等时，在动物试验中高脂肪饲料可使致癌作用增强。
碳水化合物人类结肠癌的发生与低渣易消化食物有关。动物试验证实麦麸、米糠和果胶能降低某些大肠致癌物的致癌性。高溶解度的碳水化合物可增加饲料中致癌物的吸收。
矿物质与维生素许多矿物质与维生素是体内一些酶的辅酶或辅因子，缺乏可对机体的产生影响，使之对致癌物反应异常。 如核黄素对偶氮染料诱发大鼠肝癌有影响，还与口腔的肿瘤诱发过程有关。 维生素A摄入不足使人类易患宫颈癌或膀胱癌。维生素E和其它合成抗氧化剂可减轻某些致癌物对一些靶器官诱发肿瘤。硒也有抗氧化作用，似乎也能降低肿瘤发生率。维生素C和E能防止亚硝胺和亚硝酰胺形成，可降低肝、呼吸道和上消化道的肿瘤形成。
宿主因素物种、品系和器官特异性在人和动物，肿瘤发生常存在物种差异。此种差异与生物转化的差异有关。如豚鼠对芳香胺2-AAF有抗性，其原因是该致癌物仅能小量转化为近致癌物N-羟化衍生物，而大量转化为不致癌的7-羟化衍生物。再如2-萘胺可诱导人、犬、猴和仓鼠膀胱癌，但对小鼠仅诱发肝癌和肺癌，在大鼠和兔几乎对各器官均不能诱发肿瘤。
年龄新生动物幼仔对某些致癌物比年龄较大者易感。如多环芳烃类在新生大鼠或小鼠能很快诱发肝脏肿瘤，但在初成年者则不易诱发。同样，黄曲霉毒素B1可对新生小鼠诱发肝脏肿瘤，对断奶小鼠则不能诱发。
3．性别和内分泌平衡流行病学调查发现某些肿瘤在某一性别发生较多,试验研究也同样证实这一现象。如2-AAF主要在雄性大鼠诱发肝癌；邻氨基偶氮甲苯对雌性小鼠比雄性更易诱发肝癌。
内分泌平衡的保持极为复杂，一种激素含量的改变往往引起全面重新调节，直至达到新的平衡。对于胚胎、新生儿和性成熟前期，无论动物或人，外来化合物都可对内分泌器官的分化造成永久影响，以后由于内分泌平衡失调或组织受体反应的改变而致癌。如孕妇用大量的二乙基已烯雌酚可使其女儿青春期前的阴道癌危险性增高。
第四节 化学致癌物危险评价化学致癌物危险评价包括两方面：一是定性的，即该化学物能否致癌；二是定量的，即进行剂量反应关系分析，以推算可接受的危险度的剂量，或人体实际可能接触剂量下的危险度。
由于致癌是一种后果严重的毒性效应，因此致癌性评定的工作极其复杂。需要严密设计的人群流行病调查才能判定对人的致癌性；动物试验只有长期终生试验才被公认为确切证据。这些调查和试验都不容易进行，因此先进行致突变试验，可对受试物的致癌性进行初步推测。对非遗传毒性致癌物则需要进行体外恶性转化试验和短期动物致癌试验。
构效关系分析致癌物的化学结构种类繁多，分析从一种同系物着手，找出该系物质化学结构中与致癌性关系最密切的构份，以及其他构份改变时所产生的影响。如对数百种多环芳烃类化合物的小鼠皮肤癌诱发试验结果做的构效关系分析表明，不仅化学结构的微小变化都关系着致癌性的强弱，而且与其立体结构性的变化也有密切关系。
通过致突变试验进行致癌物筛检此筛检又称为短期致癌物筛检试验。首先应明确，致突变试验是依据大多数致癌物具有致突变性而大多数非致癌物无致突变性来对受试物进行致突变检测。筛检阳性的受试物可能是具有遗传毒性的致癌物，也可能是具有遗传毒性的非致癌物；阴性的受试物可能是非遗传毒性的非致癌物，还有可能是非遗传毒性的致癌物。
试验组合根据目前对致癌机理的认识，遗传毒性致癌物可能有多种致癌机理，因此要求试验组合尽可能反映较多的遗传学终点。
致突变试验观察到的现象所反映的事件称为遗传学终点。国际环境致突变物致癌物防护委员会（ICPEMC）1983年提出把致突变试验所反映的遗传学终点分为5类：
DNA完整性的改变（形成加合物、断裂、交联）；
DNA重排或交换；
DNA碱基序列改变；
染色体完整性改变；
染色体分离改变。
其中第3实际指基因突变，而第4和第5依次指染色体结构改变和数目改变。
试验组合应反映3种或5种终点。有一种试验阳性，即可认为该受试物为致突变物，因而就可能是遗传毒性致癌物。组合中出现阳性越多，受试物致癌可能性就越大。
一般在试验组合中，每一遗传学终点只选一个试验即可。在终点相同的各种试验中应优先选择体内试验。
我国食品安全性毒理学评价程序中的致突变试验组合有体外试验和整体试验。体外试验中Ames试验为必做项目。在整体试验中，可在微核试验和骨髓细胞染色体畸变中任选一项；在显性致死试验和睾丸生殖细胞染色体畸变分析中任选一项。
（二）筛检试验的可靠性
对各种致突变试验可靠性的验证，常用一定数量的已知致癌物和已知非致癌物进行，并以灵敏度和专一性来衡量。灵敏度又称阳性符合率，即在试验中已知致癌物呈现阳性结果的比例；专一性又称阴性符合率，是在试验中已知非致癌物呈现阴性结果的比例。此外，还有准确度和预报价值来表示筛检的可靠性。
恶性转化试验又称细胞转化试验，是指对培养细胞诱发与肿瘤形成有关的表型改变。此种表型改变是因致癌物所致核型改变的结果，其改变包括细胞形态、细胞生长能力、生化表型等变化，以及移植于动物体内能形成肿瘤的能力。本试验的观察终点是恶性变的细胞，如将此种细胞移植于动物体内可形成肿瘤。
哺乳动物长期致癌试验哺乳动物长期致癌试验又称哺乳动物终生试验，是目前公认的确证动物致癌物的经典方法，较为可靠。化学致癌的一个最大特点是潜伏期长，在啮齿动物进行1至2年的试验即相当于人类大半生时间。如果用流行病学调查方法确证一种新化学物的致癌性，一般需要人类接触受试物20年后才能进行。
（一）动物选择在致癌试验中选择动物最重要的依据是对诱发肿瘤的易感性。因此，要考虑物种、品系、年龄和性别。
物种的选择对受试物有特定的靶器官时尤为重要。如大鼠对诱发肝癌敏感，小鼠对诱发肺肿瘤敏感。
品系也不同。如同是小鼠,A系及亚系诱发肺肿瘤敏感。
还应考虑自发肿瘤，应选自发率较低者。
年龄多使用断乳或断乳不久的动物，性别一般是雌雄各半。
（二）动物数量
为避免假阴性，每组动物数较一般毒性试验为多。如当对照肿瘤自发率为1%，而染毒组肿瘤发生率为20%时，每组动物需要40只才能有90%的把握度为阳性；如自发率上升为10%，或肿瘤发生率下降为10%，则每组动物需214只或114只。所以一般提出每组最少50只动物是指当对照组肿瘤自发率为1、5、10、20或30%时，染毒组肿瘤发生率应相应为20、30、40、50或60%才有0.9以上的把握度获得阳性结果。
（三）剂量设计
一般使用三个剂量。较低剂量为前一级较高剂量的1/3至1/4，最低剂量最好相当于或低于人类实际可能接触的剂量。最高剂量应为最大耐受量。理想的最大耐受量不应致死，也不引起可能缩短寿命的毒性表现和病理改变，与对照组相比体重下降不大于10%。
（四）试验期限与染毒时间
原则上试验期限要求长期或终生。一般情况下小鼠最少1.5年，大鼠2年；可能时分别延长至2年和2.5年。
一般主张一直染毒至试验结束。但也有人认为，为减少中途非肿瘤死亡，应在9至12月后即停止染毒，以便使动物可由中毒或亚中毒状态恢复，存活时间较长和存活动物也较多。对于完全致癌物无较多影响，对于促癌剂有可能出现可逆过程，以至肿瘤发生率下降。
（五）结果的观察、分析和评定
主要分析指标有：
肿瘤发生率多发性 多发性是指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。
潜伏期致癌物剂量越大潜伏期越短。可以用各组第一个肿瘤出现的时间作为该组的潜伏期。这种办法只适用于能在体表观察的肿瘤。对内脏的肿瘤，则需分批剖杀，计算平均潜伏期。
分析结果应注意有无剂量反应关系。染毒组应与对照组作显著性检验。存在剂量反应关系，并与对照组差异显著时，为阳性结果。
哺乳动物短期致癌试验是指在有限的短时间内完成而不是终生，又指观察的靶器官限定为一个而不是全部器官和组织。
小鼠肺肿瘤诱发试验一次或多次给予受试物后，或一次给予受试物一至两周后持续多次给予促癌剂，16至30周左右结束试验，如受试物具有诱发肿瘤作用，可在肺组织发现肿瘤。
大鼠肝转变灶诱发试验肝癌发生过程有几种明显的肝细胞病灶。较早发现的是转变灶，进一步发展成为瘤性结节。用酶组织化学和免疫组织化学方法将转变灶和结节中的谷氨酰转肽酶和胚胎型谷胱甘肽转移酶染色，显色表明有肝癌细胞生化表型的癌前细胞。
小鼠皮肤肿瘤诱发试验
小鼠皮肤表面涂抹某些致癌物能诱发乳头状瘤或癌，皮下注射可诱发肉瘤。一般9个月左右结束试验，如在启动后加用佛波醇酯，则缩短至20周左右。
雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验多环烃芳香胺、氯烷、亚硝基脲等能在9个月以内诱发乳腺癌。
由于肺和肝是最常见的发生肿瘤器官，也是许多致癌物的靶器官，因此小鼠肺肿瘤和大鼠肝转变灶试验的应用价值较高。
六、致癌物的最终确定
人类致癌物的确定主要根据：
流行病学调查结果能够重复；
有剂量反应关系；
有动物致癌试验阳性结果支持。
对动物致癌物的确定有的认为只有一种试验动物结果为阳性，甚至是哺乳动物短期致癌试验阳性，即可认为致癌；有的则要求在多种或多品系动物试验中，或在几个不同实验中，特别是不同剂量或不同染毒途径见恶性肿瘤发生率增高；或在肿瘤发生率、出现肿瘤部位、肿瘤类型或出现肿瘤的年龄提前等各方面极为明显突出，才能确定为动物致癌物。
第八单元 外来化合物的生殖发育毒性及其评价第一节 概念
一、生殖发育
生殖发育是哺乳动物衍繁种族的生理过程，其中包括生殖细胞（或称配子，即精子和卵细胞）发生、卵细胞受精、着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称为繁殖过程。
二、生殖毒性
外来化合物对生殖过程的损害作用，即生殖毒性。
三、发育毒性
外来化合物对发育过程的损害作用，即发育毒性。
四、生殖毒理学
主要研究外来化合物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验。
五、发育毒理学
主要研究外来化合物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。
六、外来化合物对生殖发育损害作用特点
外来化合物对生殖发育的影响以及损害作用具有一定的特点。一方面生殖发育过程较为敏感。一定剂量的外来化合物对机体其它系统或功能尚未造成损害作用，但生殖发育过程的某些环节可能己经出现障碍。另一方面外来化合物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。一般毒性作用仅表现在直接接触某种外来化合物的个体并造成损害，而外来化合物对生殖发育过程的损害，不仅直接涉及雌雄两性个体，同时还可在其第二代个体也可造成损害，而且此种损害作用甚至在第二代以后世代的个体还有所表现。
第二节 生殖毒性及其评定
一、生殖毒性表现
外来化合物对生殖过程的损害作用可以表现为性淡漠、性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变、月经失调或闭经、卵巢萎缩、受孕减少、胚胎死亡、生殖力降低、不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死、精子数目减少等。
二、生殖毒性作用的评定外来化合物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行，过去也称为繁殖试验。生殖毒性试验可以全面反映外来化合物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断奶后生长发育可能发生的影响。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育情况（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。此外还可同时观察出生幼仔是否有畸形出现，但畸形观察主要在发育毒性评定中进行。
（一）试验方法原则生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。
一般设三个剂量组，另设对照组。最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。
最高剂量组轻度中毒的概念是进食量显著减少，体重明显下降。要求最高剂量组出现轻度中毒的目的是表明在已能引起中毒剂量下，如仍不致影响正常生殖过程，则表示该受试物确实不具有生殖毒性作用。反之，如剂量过低，则难于确定受试物是否确实不具有生殖毒性，有可能因剂量不足，未达到最小有作用剂量。
剂量的确定可用少数动物进行预试，如已进行过亚慢性和急性毒性试验，则最高剂量也可略高于亚慢性毒性试验中最大无作用剂量，或相当于LD50的1/10左右。最低剂量可相当于最高剂量的1/30。如经多次试验确实证实1 000mg／kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其它剂量试验。
动物接触受试物的方式应参照人类实际接触途径。一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取；也可采用灌胃或胶囊法。试验期间每周应根据动物体重并参照进食量（大鼠可按每日15～20g，小鼠每日5～10g计算）和要求的摄入剂量（mg/kg体重／日）调整饲料中应混入受试物的数量。应始终保持达到动物应摄入的剂量。
利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各16～20只，或雌性16～20只，雄性8～10只。
（二）试验方法
现以大鼠为例，介绍三代两窝生殖试验法和两代一窝生殖试验法：
1,三代两窝生殖试验大鼠断奶或出生8周后，开始喂受试物或以其它方式与受试物接触，共进行8～12周，即直到性发育成熟，相当出生后4个月左右。每周至少称体重一次，记录进食量并观察有无中毒症状或死亡。将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比例为1：1或2：1，直到受孕或进行3周为止。雌鼠受孕后即单笼饲养，继续接触受试物。交配3周后，如仍未受孕，则停止交配，并进行生殖器官病理学检查。
确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片，检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。
亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共生出仔鼠两窝，分别为F1a 和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8 ～12周，直到性发育成熟，选出雌雄各16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a，F2a 断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b 断奶后，将F1b 淘汰。F2b 交配处理方法与F1b 相同。但F2b 也可只交配一次，所产仔鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。
2．两代一窝和一代一窝生殖试验近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一窝试验法，我国国家环境保护局《化学品测试准则（1990年）》即采用两代生殖试验或一代生殖试验。两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同，但只进行到第二代F2，每代只交配一窝。
（三）观察指标在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部生育繁殖过程，可观察下列4个指标：
1．受孕率 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况。
妊娠雌性动物数
受孕率= ———————— × 100%
交配雌性动物数
2．正常分娩率 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响。
正常分娩雌性动物数
正常分娩率= ————————× 100%
妊娠动物数
3．幼仔出生存活率 反映雌性动物分娩过程是否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在出生4天内死亡。
出生后4天存活幼仔数
幼仔出生存活率= ———————————× 100%
分娩时出生幼仔数
4．幼仔哺乳成活率 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力。
21天断奶幼仔存活数
幼仔哺乳成活率= ———————————× 100%
出生后4天幼仔存活数
第三节 发育毒性及其评定
一,基本概念
（一）发育毒性某些外来化合物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体表现可分为：
1．生长迟缓。即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下，较正常的发育过程缓慢。
2．致畸作用。由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。
3．功能不全或异常。即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。
4．胚胎或胎仔致死作用。某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增加。在一般情况下，引起胚胎或胎仔死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作用剂量，但高于致畸作用的剂量。
致畸作用是外来化合物发育毒性的一种具体表现，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程。有些文献中将致畸作用称为发育毒性，可以理解为发育毒性的侠义概念。
（二）畸形、畸胎和致畸物
器官形态的异常称为畸形。
具有畸形的胚胎或胎仔，称为畸胎。
凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物称为致畸物或致畸原。
（三）胚胎毒性作用
外来化合物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。
（四）母体毒性作用
母体毒性作用是指外来化合物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常；严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。
（五）母体毒性作用与致畸作用关系外来化合物的母体毒性作用与致畸作用的关系有下列几种：
1,具有致畸作用，但无母体毒性出现。表明此种外来化合物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意。
2．出现致畸作用的同时也表现母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系。
3．不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。
4．仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。
5．在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。此种情况并不能确定受试物确实不具致畸作用。可能是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不具有致畸作用。在对一种外来化合物进行致畸试验时，如未观察到致畸作用，也无母体毒性表现，应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论。
母体毒性与致畸作用的剂量关系之间，并无固定比值；一般情况下，致畸作用剂量较母体毒性作用剂量为低。
二、致畸作用的毒理学特点
（一）器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感
具有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。有性生殖动物由受精卵发育成为成熟个体的过程，可概括为胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育以及新生儿发育等阶段。着床前的胚胎对胚胎致死作用较为易感，对致畸作用并不如此。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易表现的发育毒性是生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生。
在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期。在常用试验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17天，小鼠器官发生期为7.5～16天，家兔为11～20天。在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常，但如在着床前胚泡形成阶段接触致畸物，则往往出现胚胎死亡，畸形极少。大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4天，开始着床日约为5.5～6天；小鼠分别为3～4天和4.5～5天；家兔分别为3～4天和7天。
同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如，以20mg/kg体重剂量环磷酰胺在受精后第8～12天期间，每日分别给予小鼠，虽然畸形多出现于前肢趾部，但畸形种类，则可因给予的日期不同而分别为多趾，并趾，缺趾和无趾。如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂。同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。
发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间。大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天之间，脑约为10天，头与脊椎骨约为11天，腭为12～13天，泌尿生殖器官约为15天。
（二）剂量与效应关系较为复杂剂量效应关系复杂的表现及原因是：
（1）机体在器官形成期间，与具有发育毒性的化合物接触，可以出现畸形，但也可引起胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但二者增强程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更较明显，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。
（2）某种致畸物可以引起一定的畸形，但在同一条件下，给予更高的剂量，并不出现同一类型畸形。可能由于较高剂量往往造成较为严重的畸形，较低剂量一般引起的轻度畸形，而严重畸形有时可将轻度畸形掩盖。例如一种致畸物在低剂量时，可以诱发多趾，中等剂量时则诱发肢长骨缩短，高剂量时可造成缺肢或无肢。
（3）许多致畸物除具有致畸作用外，还有可能同时出现胚胎死亡和生长迟缓；而且不同表现还可以相互影响，又无一定规律。
2．致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭 最大无作用剂量与100%致畸剂量之间距离较小，一般相差1倍，曲线斜率也较大。往往100%致畸剂量即可出现胚胎死亡，剂量再增加，即引起母体死亡。还有人观察到致畸作用最大无作用剂量与引起100%胚胎死亡的最低剂量仅相差2～3倍。例如剂量为5～10mg/kg体重的环磷酰胺给予受孕小鼠不表现致畸作用，但增加到40mg／kg体重，可引起100%胚胎死亡。
过低剂量不足以显示确实存在的致畸作用，可得出错误的结论；剂量过高可使大量胚胎死亡或对母体毒性作用过强，都可影响结果的正确性。另外，评定一种致畸物对人体危害时，应充分考虑人体可能实际接触的剂量。
（三）物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显
任何外来化合物的损害作用都存在物种以及个体差异，但在致畸作用中更较突出。同一致畸物在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。例如，杀虫剂西维因对豚鼠具有致畸作用，对家兔和仓鼠并不致畸。农药二嗪农和除草剂草完隆对豚鼠与家兔致畸，但对仓鼠未见致畸作用。反应停对人类以及其它灵长类动物具有强烈致畸作用，但对小鼠和家兔即使接触较大剂量，其致畸作用仍极为轻微。
种间差异既同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大。例如，脱氢皮质酮和生物染料锥虫蓝以及反应停都有这种现象。
物种及种间差异，可能由于同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异；再由于致畸物主要是通过母体胎盘作用于胚胎或胎仔，而不同物种动物胎盘构造也不相同。这些差异可能是由于遗传因素，既基因型差异。
三、外来化合物发育毒性的评价致畸作用是发育毒性中最重要的一种表现，所以外来化合物发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死。传统常规致畸试验是评定外来化合物是否具有致畸作用的标准方法，多年来很多国家和机构都采用和推荐这一方法。
（一）传统常规致畸试验（致畸试验）
1．动物选择致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。
根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数；而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。但大鼠对一般外来化合物代谢速度，往往高于小鼠和家兔，以致对化学致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性。大鼠在器官发生期初期，其胎盘具有卵黄囊，称为卵黄囊胎盘，在器官发生期后期，将转变为绒膜尿囊胎盘，有些外来化合物，例如锥虫蓝可以干扰通过卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程，并因此致畸，出现阳性结果；而人类胎盘不具有卵黄囊胎盘阶段，不存在同样问题，所以有时此种结果对人类为假阳性。
小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。
2．剂量分组
由于致畸作用的剂量效应（反应）关系曲线较为陡峭，斜率较大，最大无作用剂量与引起胚胎大量死亡以及母体中毒死亡的剂量极为接近。因此在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡；较多母体死亡也应避免。
一般应先进行预试，预试的目的是找出引起母体中毒的剂量。
根据预试结果可以确定正式试验剂量。应最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。
一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为1／100～1／30。这一原则在预试中也可试用。如已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。也有人以亚慢性毒性试验的最大无作用剂量为高剂量，并以其1／30为低剂量，可供参考。
每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。在一般常规试验中，除设有3个剂量组和一个对照组外，如受试物溶于某种溶剂或介质中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果，另设阳性对照组，按大鼠每kg体重15 000IU维生素A剂量，或将每ml含50 000IU维生素A的浓鱼肝油，按每100g体重1 ml剂量给大鼠灌胃。此外敌枯双、五氯酚钠等也可采用。
3．动物交配处理
将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涂片精子检查。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。准确确定受孕日对精确掌握动物接触受试物时间、最后处死动物及确定进行检查的日期非常重要。
由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。
大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始给予受试物，每日一次，持续到第15天。如拟深入研究何种器官对受试物更为易感，则应在上述期间将受试物每日分别给予一批动物，每批动物只接触受试物一次，最后可以根据畸形出现的情况，确定受试物的主要靶器官。
接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。
试验期间每2～3天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。
4．胎仔检查自然分娩前1～2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。
活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。
以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。
5．结果评定在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一个畸形；如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。计算时还要对剂量效应（反应）关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照组结果进行比较。
（1）活产幼仔平均畸形出现数,即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。
畸形总数
活产幼仔平均畸形出现数= ———————————
活产幼仔总数
（2）畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。
出现畸形的胎仔总数
畸胎出现率= ——————————— × 100%
活产胎仔总数
（3）母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算。
出现畸胎的母体数
母体畸胎出现率= ———————————× 100%
妊娠母体数
6．致畸物以及发育毒性作用物危险度评定
（1）欧共体（EEC）和经济合作与发展组织（OECD）建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：
1级，已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷；
2A级,对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系；
2B级,动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料；
3 级，尚无结论性肯定致畸证据或资料不足；
4级,动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸
（2）致畸指数,母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比，即母体LD50／胎仔最小致畸作用剂量。这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。
（3）相对致畸指数（RTI）：成年动物最小致死剂量（LD01）与引起5%活产胎仔出现畸形的剂量（tD05）之比值，即LD01／tD05。
（4）母体毒性与发育毒性比值：或称成年毒性与发育毒性比值，即对母体最低损害作用剂量（A）与胎仔最低损害作用剂景（D）之比（A／D）。一般认为A／D比值为3或3以上者，则具有发育毒性危险性。比值越大，危险性越高，3以下者，相对危险性较低或不具危险性。在一般情况下，大多数化合物A／D比值均在3以下，以及1～2范围内。关于母体和胎仔最低损害作用的具体表现，在母体主要为体重增长减少，出现某些临床症状以及死亡，对胎仔则为致畸以及其它发育毒性表现。
第九单元 外来化合物的免疫毒性作用及其试验方法第一节 外来化合物对免疫功能的影响
一、免疫毒理学概念
免疫毒理学（immunotoxico1ogy）是毒理学与免疫学间的边缘学科，也是毒理学的一个新分支。它主要研究外来化合物和物理因素对人和实验动物免疫系统产生的不良影响及其机理。免疫毒理学是在免疫学和毒理学的基础上发展起来的，是一门十分年轻的学科。
很多外来化合物、各种化疗药物及物理因素都会引起免疫功能产生一定的变化，而且这种变化往往在其它毒性症状之前发生。因此研究外来化合物对免疫功能的影响，一方面可对它们的毒性作出全面的评价，另外还可从免疫功能的检查中寻求外来化合物对机体损伤的早期检测指标。
很多外来化合物是一些小分子的物质，特别是金属，它们本身的分子量很小，不能引起免疫应答，但在进入机体的过程中能与某种蛋白结合形成完全抗原；抗原刺激机体产生免疫反应。这些化学物质所引起的毒性反应并不一定遵循剂量—反应关系。研究外来化合物对免疫功能的影响，有助于对其造成损害的临床表现及病理过程有进一步的了解。
二、影响免疫功能的外来化合物
许多外来化合物（药物、食品添加剂）及物理因素（电离辐射、微波、高温）等，都会引起免疫功能改变。
1,具有免疫抑制的外来化合物
（1)多卤代芳香族：多氯联苯（PCB）、多溴联苯、四氯二苯对—二恶英、六氯苯等。
（2)多环芳烃类：苯蒽、7，12—二甲基苯蒽、三甲基胆蒽、苯并(a)芘等。
（3)有机氯和有机磷农药,DDT、敌百虫、甲基对硫磷等。
（4)金属：铅、镉、砷、汞、锌、铜、甲基汞等。
（5)其它：二氧化氮、二氧化硫、一氧化碳、臭氧、氯乙烯、苯、苯乙烯等。
2,引起自身免疫的外来化合物
（1)各种药物：抗高血压剂、抗心律失常剂、抗惊厥剂、抗菌剂。
（2)各种金属：锂、金、汞、镉等。
（3)其它化学物：乙醇、氯乙烯、甲基胆蒽、苯尿噻唑等。
3,引起过敏反应的外来化合物
有抗氧化剂、抗生素（新霉素、先锋霉素、青霉素等）,氯胺T,二异氰酸酯、二氯酚、乙二胺、甲醛、金属（铂、镍、铍、汞）等。
三、外来化合物对免疫系统作用的特点反应的灵敏性
很多外来化合物对免疫系统造成不良反应的剂量往往低于它们的一般毒性作用剂量。如小鼠长期接触低剂量的甲基汞、四乙基铅和砷酸钠在表现出明显中毒反应之前，却出现免疫功能改变。又如原苏联学者研究大气和水体中化学污染物的毒性时，发现许多污染物引起变态反应的浓度比出现一般毒性作用的浓度低若干数量级。
2．反应的复杂性主要表现在免疫反应的双重性和作用的选择性。一种外来化合物对机体可产生免疫增强或免疫抑制两种效应，它取决于化学物质剂量大小、进入机体途径以及检测时间。如给抗原前给动物腹腔注射镉，可观察到动物抗体生成细胞（PFC）增加；但在给抗原后2天给镉，则PFC明显减少。氨基硫羰基咪唑啉酮在一定剂量下具有免疫抑制作用，但当剂量加大时抑制作用反而不明显。
很多外来化合物可选择性地损伤免疫反应的一个方面或是某个免疫细胞的亚类。例如皮质类固醇损伤辅助T细胞，而环孢菌素对各类T细胞均有损伤作用。环磷酰胺主要对活化增殖的细胞有毒性，而且对B细胞的毒性比T细胞大。
四、外来化合物对免疫功能影响的表现
（一）使免疫功能受到抑制或免疫缺损
很多外来化合物可对机体的免疫功能产生抑制作用，包括体液免疫功能和细胞免疫功能，抑制程度取决于接触的剂量。如苯并(a)芘、多氯联苯（PCB）、多溴联苯等。
（二）改变宿主的防御机制、降低机体抵抗力机体在接触外来化合物后，可以改变其对细菌、病毒、寄生虫以及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力，通常由于细胞介导免疫或体液免疫严重抑制而造成宿主对一些感染因子敏感性增加，抵抗力下降。
如动物接触臭氧、二氧化硫、二氧化氮、光化学烟雾、汽车废气、铅尘、氧化镍等外来化合物会造成肺部防御能力受损，表现在死亡率和杀死细菌率、细菌的繁殖及侵入血循环等方面的变化。
（三）产生变态反应
变态反应是病理性免疫反应。机体受抗原刺激后，产生异常的体液或细胞免疫反应导致生理功能紊乱或组织损伤，称为变态反应。
引起变态反应性病变的抗原物质称为变应原或过敏原。变应原可能是完全抗原，如异种血清蛋白质、微生物、霉菌、植物、花粉、皮片、尘螨等；也可是半抗原，即许多分子量较小的外来化合物如三硝基氯苯、氯化苦、镍和铂等某些金属、工业化学物氯乙烯等，它们本身没有抗原性，但当它们与某些蛋白质结合后就能起到抗原作用，毒物与蛋白结合的能力与该物质化学结构中的某些活性基团有密切关系。
化学物质引起的过敏反应有以下几个特点：①反应表现不同于该物质的一般毒性反应，组织病变不同于该物质的中毒变化，而是变态反应性炎症；②初次接触某种化学物质后经过1～2周，再次接触同一物质，反应即可出现；③不完全遵循毒理学的剂量—反应规律，很小的剂量进入机体即可致敏，再接触小量即可出现症状。
根据过敏反应出现的快慢和抗体是否存在，可将变态反应分为四型：一型是抗原进入机体后，反应即刻出现，称为速发型变态反应；另一型是抗原进入机体后1～2天反应才出现，称为迟发型变态反应，此种类型反应与致敏的淋巴细胞有关。另外还有两个中间型。
1．第Ⅰ型：速发型或反应素型 Ⅰ型变态反应是IgE介导的变态反应。其发生过程是当过敏体质的机体，初次接触过敏原后，可产生IgE 抗体，凭籍IgE Fc段，抗体结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面，使机体产生致敏状态，可维持半年至数年。当致敏的机体再次接触相同的过敏原时，过敏原即与细胞表面的IgE 结合，使细胞脱颗粒，并释放多种药理活性物质，引起毛细血管扩张、通透性增加、腺体分泌增多及平滑肌收缩为特点的病理变化。如果这种作用发生在支气管则产生支气管哮喘；如作用于皮肤可出现红肿、寻麻疹等；如作用于胃肠道则出现呕吐、腹痛、腹泻等症状。
引起Ⅰ型变态反应的过敏原很多，除常见的花粉、霉菌、动物皮片、灰尘和食物外，许多化学物质如间苯二酚、甲醛、甲苯二氰酸酯、氯化苦、某些有机氯的化合物（如六六六、DDT）和铂盐、镍盐等金属化合物。
2．第Ⅱ 型：细胞毒型或溶细胞型 Ⅱ 型变态反应是抗体（IgG或IgM）引起带抗原的组织细胞的损伤或功能障碍。IgG或IgM抗体与机体细胞（靶细胞）表面的抗原结合，通过活化补体、巨噬细胞吞噬或K细胞的抗体依赖细胞毒作用引起细胞的破坏死亡。
常见的靶细胞有红细胞、粒细胞、血小板、肾小球血管基底膜、肝细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞以及一些内分泌细胞等。长期接触铅的工人以及慢性苯中毒患者和苯接触工人可发生溶血性贫血、白细胞减少症或血小板减少性紫癜。
3．第Ⅲ型：免疫复合物型 Ⅲ型变态反应是由于抗原抗体复合物在组织中沉积而引起的炎症反应。炎症反应涉及补体的活化和嗜中性粒细胞的浸润，释放出许多水解酶并造成组织损伤。
目前有资料表明，一些毒物如汞、铅、铋、铀、金等化合物可使肾细胞发生改变，引起免疫反应，造成过敏性肾病综合征。接触高浓度氯乙烯工人也可以产生免疫复合物，这些免疫复合物可能是氯乙烯产生毒性反应的机理。
有些超敏性肺炎如“农民肺”也属于这一类型。患者死亡后肺组织免疫荧光研究表明，有免疫球蛋白的沉积和补体的沉积，因此可被视为免疫复合物病。根据不同的工作种类和不同的有机粉尘尚可发生一系列类似的肺部疾患，如“蔗糖肺”,“蘑菇工人肺”,“麦芽工人肺”,“纸浆工人肺”等。临床表现为咳喘，主要在小支气管肺泡壁形成免疫复合物，吞噬细胞对复合物吞噬并有水解酶释出，引起组织水肿、出血、坏死，形成肉芽肿。
4．第Ⅳ型：迟发型或细胞免疫型 Ⅳ型变态反应是由免疫的TD细胞与特异抗原的反应而引起组织损伤。表面具有特异性受体的致敏淋巴细胞再次与抗原相遇，引起细胞增殖，并释放淋巴因子，吸引和激活非特异性的巨噬细胞。由于细胞的增殖和浸润，可诱发迟发型变态反应。
有许多化学物质引起的迟发型变态反应，表现为接触性皮炎与湿疹，这类职业性皮炎约占整个职业性皮炎的60%。引起这类皮肤病的化学物质有镍、铬、砷、汞、松节油、润滑油、硝基萘及苯胺染料、甲醛、鞣酸、二硝基氯苯、重铬酸盐、环氧树脂、酚醛树脂等。
这类皮炎发生的机理是这些化学物质与表皮角质蛋白结合后，皮肤脂质作佐剂，使T淋巴细胞母细胞化，并在淋巴结和脾脏中增殖，这些致敏的淋巴细胞再回到血循环中，当再次接触相同致敏原，经过24小时后，可发生急性皮炎，48至96小时达到高峰。临床表现为局部皮肤发红、出现硬结和水泡。转为慢性时，局部出现湿疹及明显的苔癣样变。
铍病可出现慢性肺部肉芽肿、间质性肺炎、过敏性皮炎。接触少量铍即可发病，其临床表现与剂量无明显关系。铍中毒时可见血清丙种球蛋白含量增高，皮肤斑贴试验阳性，说明发生了迟发型变态反应。
（四）产生自身免疫反应自身免疫是指机体对自身组织成分或细胞抗原失去免疫耐受性，导致自身免疫效应细胞和／或自身抗体产生，并造成自身损伤的病理过程。自身免疫病理反应占优势导致的疾病，即自身免疫病。自身免疫病的本质属于超敏反应，与超敏反应的区别在于诱发自身免疫病的抗原来源于自身细胞或组织，并有明显的遗传倾向。
关于外来化合物引起自身免疫反应和自身免疾病，其基本病理特征为化学物质作为自身抗原，刺激机体免疫活性细胞，特别是辅助T细胞，进而激活B细胞，产生一种或多种抗自身抗体，与靶部位的自身抗原结合，形成抗原抗体复合物，导致相应的组织或器官发生结构改变和功能障碍。如氯化汞引起的自身免疫性肾炎，可见染毒鼠血清IgE 和IgG浓度显著升高，T细胞依赖性淋巴结（PLN）明显增大，脾脏 IgG 分泌细胞增多，血清抗核抗体（ANA）、抗DNA抗体和抗肾小球基底膜（GBM）抗体阳性，病理切片可见肾小球基底膜和外周血管有线状或颗粒状免疫复合物沉积。
第二节 免疫毒理试验中常用的方法
为鉴定外来化合物对免疫系统的毒性，必须建立一系列灵敏、特异、简便、快速的检测方法，大多数免疫毒理学家认为，要建立一组实验方法来评价免疫毒性。
一、病理学常规检查
病理学检查对于评价外来化合物对免疫功能的影响十分有用。外来化合物接触实验动物后，对免疫系统的毒性作用可表现为淋巴器官重量或组织学的变化、淋巴组织及骨髓的细胞量或质的变化和外周血淋巴细胞数改变。因此为了观察化学物质对免疫功能的影响，首先可对免疫器官进行大体解剖观察，如果发现胸腺重量下降和胸腺发生萎缩，就应着重检查细胞免疫功能；有人观察到动物接触已烯雌酚、TCDD或环磷酰胺，胸腺重量与细胞免疫功能状况呈很好的正相关。
二、淋巴细胞增殖反应试验
淋巴细胞增殖反应试验是测定T细胞和B细胞功能活性的简便方法，重复性也较好。
检测方法有形态学方法、同位素掺入法和颜色反应法。颜色反应法测定活细胞及增殖细胞转化程度简单、快速，在对一定数量细胞测定时，具有与同位素掺入法同样的灵敏度，是一种常用的方法。
三、体液免疫功能检测
有许多方法可用来检测体液免疫功能，包括抗体滴度、抗体形成细胞（PFC）及B细胞受体试验等。
抗体形成细胞试验是一种敏感而且常用的方法。通常用的抗原有绵羊红细胞（SRBC）、牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（0valbumin）、脂多糖（LPS）等。
用琼脂单向扩散法测定人血清免疫球蛋白的含量，虽不很敏感，但却是很常用的方法。
四、细胞免疫功能检测
细胞免疫功能主要由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。
用来测定细胞免疫功能的方法有体内法（迟发型变态反应、移植物抗宿主反应、皮肤移植排斥反应）和体外法（淋巴细胞增殖、T细胞毒性及淋巴因子的产生）。
体内检测迟发型变态反应的方法应用较广，在一般情况下迟发型变态反应可以反映机体细胞免疫状况。原理是当致敏的T细胞再次接触相应的抗原后，就能引起局部的致敏淋巴细胞释放出多种淋巴因子，导致以单核细胞浸润为主的炎症反应，表现为皮肤红肿硬结。这种反应一般在抗原注射后24～48小时可以见到。
在人体检测迟发型变态反应可采用皮试法。皮试法中所用的抗原有特异性病原微生物性抗原，如结核菌素（OT）、白喉病毒、腮腺炎病毒等；还有非特异性抗原，如二硝基氯苯、二硝基氟苯及植物血凝素等。结果判定是根据硬结的纵横直径平均值，一般在5mm以上为阳性反应。
动物迟发型变态反应检测常用绵羊红细胞（SRBC）、牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（0valbumin）等。在用绵羊红细胞作为抗原时，一般致敏剂量为l x 108个细胞，致敏注射部位可在背部皮下注射或腹腔注射，经过5天后用l x 108个／20ul的SRBC注射一侧足掌，另一侧足掌注射生理盐水。24小时后用精密卡尺测量双侧足垫的厚度，并以双侧足垫厚度的差值来表示。
五、巨噬细胞功能试验
巨噬细胞在免疫反应中具有很重要的作用，它不仅有非特异性吞噬功能，还参与细胞免疫和体液免疫。巨噬细胞有多种功能，例如吞噬作用、胞内杀伤、抗原摄取和处理、产生干扰素以及对感染细胞或恶变细胞的杀死和溶解作用等。
可通过测定体内对异物的清除率、体内和体外对细菌及细胞的吞噬作用、对肿瘤细胞的生长抑制能力来评价巨噬细胞的功能。
六,宿主抵抗力试验机体在接触化学物质后，可改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般认为，B细胞缺损，机体对细菌敏感性升高；T细胞缺损，则对病毒、寄生虫、肿瘤敏感性增高。这种试验是在动物身上进行的整体试验。
1．肿瘤细胞攻击试验 本试验用纯系小鼠观察机体对同系基因的肿瘤细胞的抵抗力。攻击所用的肿瘤细胞量是使10%～20%正常动物发生肿瘤的量。观察指标为肿瘤发生率、死亡率、发生肿瘤的平均潜伏期、肿瘤大小、结节数目以及平均死亡时间等。
2．对传染源的抵抗试验 在免疫毒性试验中常用的传染源有病毒、细菌、寄生虫。实验选用传染源时需考虑以下方面，它对人类或其它动物的危险性；动物是否易感；产生的病变是否有重复性；机体防御机制中是否需要T或B细胞参与；感染过程是否易于观察。最常用的指标是死亡率。接种剂量应相当于在正常小鼠产生死亡率为10%～20%的剂量。常用的病毒有：脑炎—心肌炎病毒（EMC病毒）、单纯疱疹性病毒（HSV）、流感A型病毒（FLU病毒）等。常用的细菌有李斯特菌和绿脓杆菌。常用的寄生虫有毛线虫和疟原虫。
第十单元 外来化合物的危险度评定及毒理学安全性评价程序第一节 概述
一、管理毒理学（regulatory toxicology）
管理毒理学是毒理学的一门新兴分支学科，其工作内容已超出了经典毒理学以及生命科学的范畴，成为具有一定综合性的科学。
在管理毒理学中，有一重要的概念与工作内容，即危险度评定（risk assessment）。危险度评定是卫生决策的主要依据。由于危险度评定使卫生决策具有充分的科学依据，因而可使卫生决策更为客观，从而减少工作中的失误。
在管理毒理学实际工作中，毒理学工作者的主要任务是提供有关化学品的毒理学资料以及危险度的评定。管理毒理学工作者则以此种资料以及化学品危险度的评定为依据，并结合其它有关因素和实际情况，制订有关管理毒理学的法规，对化学品进行卫生管理。
管理毒理学工作是一项新的工作，在我国以及其它国家都是如此，尚需在有关理论和实际工作方面，不断累积经验，充实提高。
二、国内有关有毒化学品的卫生管理法规
我国自1982年以来，也陆续制订了一些暂行规定或程序。例如，我国卫生部曾在1983年公布《食品安全性毒理学评价程序（试行）》,1985年又经修订，并正式公布[（85）卫防字第78号文件]。 1992年又对其进行修订。1982年农牧渔业部颁布《农药毒性试验方法暂行规定（试行）》，这一规定主要以《食品安全性毒理学评价程序》为基础，其中并包括《环境安全性毒理学评价程序》。中华人民共和国卫生部和农业部为了配合其它部门共同做好我国农药管理工作，于1991年6月颁布了新的《农药安全性毒理学评价程序》。该程序是在1982年颁布的《农药毒性试验方法暂行规定（试行）》和《食品安全性毒理学评价程序（试行）》的基础上，收集并参考了国内外有关农药和化学物品的管理经验和安全评价资料，较全面地考虑到农药安全性的各个方面，提出了符合农药特点的各项要求，协调了这些程序和国内现有法规的关系。在充分运用国内原有法规和经验的基础上，结合我国国情，引用国外资料制定的。在以上规定或管理法中，均要求对药品、农药、工业化学品以及用于食品接触的化学物质（如食品添加剂、食品污染物等）必须经过安全性评价，才能被允许投产、进入市场或进出口。
此外，1985年颁布的《新药审批办法》中，对药物的毒理学评价也作出了规定。1990年又公布了新药（西药）毒理研究指导原则（讨论稿）。1987年卫生部发布了《化妆品安全性评价程序和方法》规定于1987年10月1日实施，进一步加强了对化妆品的安全管理。
1990年我国国家环境保护局正式公布出版了《国家环境保护局化学品测试准则》，它是国家环境保护局对有毒化学品进行管理的标准文件。
关于工业毒物安全性评价，我国有关工业生产中新化学物质毒性鉴定规程以及工业化学物质毒性鉴定管理办法也正在制订中。
第二节 外来化合物危险度评定
一、基本概念
毒理学是研究外来化合物对生活机体的损害作用及其机理的一门科学，对所接触的外来化合物进行安全性评价是毒理学的一项重要任务。
外来化合物进行毒理学评价主要包括两部分内容。首先是在不同接触条件下，确定外来化合物对各种生物系统的毒性；然后是对人群在一定条件下接触该化学物的安全性或危险度进行评定。
外来化合物的毒性是指其自身具有的能导致机体损伤的能力。但如果接触的量低于一定水平，对机体可以不引起损害或不能观察到明显的损害作用。
外来化合物的安全性在理论上是指无危险或危险度极低，达到可以忽略的程度。但由于实验条件的限制和多种因素的影响，在毒理学安全性评定的实际工作中，不可能精确确定绝对安全的接触剂量。一般所指安全量是指在一定接触剂量和接触方式下，不致造成损害的剂量。
危险度是指从事某项活动而造成机体损伤、产生疾病或死亡的概率。
外来化合物的危险度是指化学物在一定接触条件下，对人体造成损害可能性的定量估计。此种可能性可以化学物对机体或人群造成损害程度，即发病率或死亡率进行定量地表示。
二、危险度的评定外来化合物危险度评定是以定量的概念，在人类接触环境危害因素后，对健康的潜在损害的程度进行估测或鉴定。危险度评定是对各种环境有害因素进行管理的重要依据，具有客观性、能定量及有预测性的特点。
危险度评定的内容包括四个部分：即明确外来化合物对机体损害作用的存在与否、定量评定接触剂量与损害程度关系、确定人类实际接触量和接触情况及在此接触情况下对人群危险度的估计。
外来化合物对机体损害作用的评定主要是从定性角度确定外来化合物是否可能对人类健康造成损害以及损害程度，并对损害表现的性质作出确定。确定损害作用的主要依据是通过动物毒性试验和有关人群流行病学调查的资料。
通过是否具有损害作用的确定，可以初步确定一种外来化合物对人体造成损害的可能性、损害具体表现，以及此种损害作用的性质及特点。
接触剂量与损害程度关系的确定
是从定量角度确定机体可能接触外来化合物的剂量与机体损害程度的关系。主要是利用外来化合物剂量—反应（效应）关系，进行评定，这是危险度评定中的重要部分。
通过剂量—反应（效应）关系的确定，主要是可以对在与人类可能接触的剂量下，人类可能受到损害的程度作出定量的估计。利用所求出的剂量—反应（效应）关系，可以掌握剂量—反应（效应）关系曲线的特点，是否存在阈剂量以及有关阈剂量的各种情况。
确定人类危险度中外来化合物剂量—反应（效应）关系的主要依据是在参照类似人类可能接触情况下进行动物毒性试验和有关人群流行病学调查的资料。人群流行病学调查资料较为可信，可直接运用于人群危险度的确定；动物毒性试验资料则必须进行外推处理，才能推论于人类。外推的方法多利用适当的数学模型。
3,人类实际接触量和接触情况的确定
在明确一种外来化合物对人体可能具有损害作用及其剂量—反应（效应）关系之后，必须进一步确定人类实际接触的剂量以及实际接触情况。为此应首先对人类实际接触此种化合物的总量进行测定与估算。人类实际接触量主要决定于此种化合物进入人类生活环境和生产环境的来源和数量，再根据化合物的理化性质进行估算。再有，还必须分别测定空气、水体、土壤和食物中此种化合物的含量，了解其在环境中分布的情况，有助于对人类实际接触量进行较精确估算。此外，还必须掌握全体人群的实际接触情况（包括可能接触的范围，可能受到损害的人数和程度）以及人群中各种不同群体的实际接触情况。例如职业性接触人群、日常生活接触人群、高度接触人群、老幼病弱等易感人群等的接触情况。
接触情况中包括剂量、频度（即多次接触的时间间隔）和接触的持续时间等。根据这些资料，才能全面掌握人类实际接触情况与剂量，才能对危险度作出较为准确的估计。
4,对外来化合物危险度的估计通过外来化合物对人体的损害作用及其剂量—反应（效应）关系和人类实际接触量与范围确定后，即可以上述各种参数为根据，对外来化合物的危险度，即外来化合物对人群健康损害的程度作出估计。在外来化合物危险度中应包括对接触人群总体的危险度和个体危险度。可以人群对此种外来化合物损害作用的反应率或死亡率表示，例如氯乙烯致癌作用危险度为死亡率增加41／100000，以死亡率表示的每日吸烟10支的危险度为1／400。
三、危险度评定在管理毒理学中的应用
危险度评定是对有毒化学品进行卫生管理的主要依据。在管理毒理学实际工作中，经常需要作出政策性的决定，而政策的决定主要根据危险度进行利弊权衡分析。例如，一种农药的生产使用，其有利方面是可以杀灭某些病虫害，使农作物增产；在弊的方面可由于农药的使用造成对环境的污染，引起中毒或使有关人群发病率增加。对某项政策的决定，必须权衡利害，综合考虑工农业生产需要、环境质量的保护和人民健康的保障等经济效益、社会效益以及卫生效益全面分析考虑，或利多弊少或利少弊多。如果使用一种农药可使农作物大量增产，虽有一定危险度，但不过高，即可认为利大于弊；反之，一种农药虽有杀虫效果，但不甚明显，危险度又较高，又有其它农药可以代替，则为弊大于利。据此可以决定取舍。但在实际工作中还有许多较为复杂的问题，故利和弊的权衡较为复杂，存在一定难度，并非都是如此简单明确。
外来化合物的危险度评定还可为有关卫生标准的制订提供主要依据。例如某种外来化合物在空气、水、食物中最高容许量等。通过危险度的评定还可以对环境保护和环境污染治理效果进行比较评定。
第三节 外来化合物毒理学安全性评价程序
一、基本概念
1．外来化合物安全性毒理学评价
外来化合物安全性毒理学评价是通过动物试验和对人群的观察，阐明某种外来化合物的毒性及其潜在危害，以便对人类使用这种外来化合物的安全性作出评价，并为制订预防措施和卫生标准提供理论依据。
2．外来化合物的安全性
外来化合物的安全性是指一种化合物在规定的使用方式和用量条件下，对人体健康不致产生任何损害，即不引起急性、慢性中毒，亦不致对接触者（包括老、弱、病、幼和孕妇）及其后代产生潜在危害。
对某种外来化合物进行安全性评定时，必须掌握该化合物的成分、理化性质等基本资料，动物实验资料，及对人群的直接观察资料，最后进行综合评定。所谓绝对的安全，实际上是不存在的。在掌握上述三方面资料的基础上，进行最终评价时，应全面权衡其利弊和实际的可能性，从确保发挥该物质的最大效益以及对人体健康和环境造成最小的危害的前提下作出结论。
二、安全性毒理学评价程序的原则
在实际工作中，对一种外来化合物进行毒性试验时，还须对各种毒性试验方法按一定顺序进行，即先进行何项试验，再进行何项试验，才能达到在最短的时间内，以最经济的办法，取得最可靠的结果。因此，在实际上作中采取分阶段进行的原则。即试验周期短、费用低、预测价值高的试验先安排。投产之前或登记之前，必须进行第一、二阶段的试验。凡属我国首创、产量较大、使用面广、接触机会较多、或化学结构提示有慢性毒性和／或致癌作用可能者，必须进行第四阶段的试验。
三、食品安全性毒理学评价程序程序包括四个阶段，即急性毒性试验；蓄积性毒性、致突变和代谢试验；亚慢性毒性（包括繁殖、致畸）试验；慢性毒性（包括致癌）试验。
1．第一阶段 急性毒性试验
（1）目的：①了解受试物的毒性强度和性质；②为蓄积性和亚慢性毒性试验的剂量选择提供依据。
（2）试验项目：①用霍恩氏法、机率单位法或寇氏法测定经口半数致死量（LD50）；② 7天喂养试验。
以上两个项目均分别用两种性别的小鼠和／或大鼠进行。
（3）结果判定：① LD50或7天喂养试验的最小有作用剂量小于人的可能摄入量的10倍者，则放弃不再继续试验；② 大于10倍者，可进入下一阶段试验。为慎重起见，凡LD50在1O倍左右时，应进行重复试验，或用另一种方法进行验证。
2．第二阶段 蓄积毒性、致突变和代谢试验
（1）蓄积毒性试验
① 目的：了解受试物在体内的蓄积情况。
② 试验项目：包括蓄积系数法和20天试验法。蓄积系数法是用两种性别的大鼠或小鼠，各20只。20天试验法是用两种性别的大鼠或小鼠，每个剂量组雌雄各10只。以上两种方法任选一种。
③ 结果判定：蓄积系数小于3，则放弃，不再继续试验；大于或等于3，则可进入以下的试验。如1/20 LD50组有死亡，且有剂量—效应关系，则认为有较强的蓄积作用，予以放弃；如1/20 LD50组无死亡，则可进入以下的试验。
（2）致突变试验
① 目的：对受试物是否具有致癌作用的可能性进行筛选。
② 试验项目：包括体外试验与整体试验。体外试验中Ames试验为必做项目。在整体试验中，可在微核试验和骨髓细胞染色体畸变分析试验中任选一项；在显性致死试验和睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验中任选一项。
③ 结果判定：
如三项试验均为阳性，则表示受试物很可能具有致癌作用，除非受试物具有十分重要的价值，一般应予以放弃；
如其中两项试验为阳性，则由有关专家进行评议，根据受试物的重要性和可能摄入量等，综合权衡利弊再作出决定；
如其中一项试验为阳性，则再选择两项其他致突变试验（包括体外培养淋巴细胞染色体畸变分析、DNA修复合成、DNA合成抑制、姐妹染色单体互换试验等）。如此两项均为阳性，则应予以放弃；如有一项为阳性，则可进入亚慢性毒性试验；
如此三项试验均为阴性，则可进入亚慢性试验。
（3）代谢试验 对于我国创制的化学物质，在进行最终评价时，至少应进行以下几项代谢方面的试验：①胃肠道吸收试验；② 测定血浓度，计算生物半减期和其他动力学指标；③ 主要器官和组织中的分布试验；④ 排泄（ 尿、粪、胆汁）试验。有条件时，可进一步进行代谢产物的分离、鉴定。对于国际上多数国家已批准使用和毒性评价资料比较齐全的化学物质，可暂不要求进行代谢试验。对于属于人体正常成份的物质可不必进行代谢研究。
3．第三阶段 亚慢性毒性试验
（1）目的
① 观察受试物以不同剂量水平较长期喂养，对动物的毒性作用性质和靶器官，并确定最大无作用剂量；
② 了解受试物对动物繁殖及对子代的致畸作用；
③ 为慢性毒性和致癌性试验的剂量选择提供依据；
④ 为评价受试物能否应用于食品提供依据。
（2）试验项目 包括下列4种试验：1）90天喂养试验；2）喂养繁殖试验；3）喂养致畸试验；4）传统致畸试验。
用两种性别大鼠和／或小鼠。前三项试验可用同一批动物进行。关于喂养致畸和传统致畸试验的选择，可根据受试物的性质而定。当对任何一种致畸试验的结果已能作出明确评价时，不要求作另一种致畸试验。但在结果不足以作出评价，或有关专家共同评议后认为需要时，再进行另一种致畸试验。
（3） 结果判定 如以上试验中任何一项的最敏感指标的最大无作用剂量（以mg/kg体重计）：
小于或等于人的可能摄入量的100倍者，表示毒性较强，应予以放弃；
大于100倍而小于300倍者，可进行慢性毒性试验；
大于300倍者，则不必进行慢性试验，可进行评价。
4．第四阶段 慢性毒性（包括致癌试验）试验
（1）目的 通过第四阶段试验可达到下列目的：
① 发现只有长期接触受试物后才出现的毒性作用，尤其是进行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用。
② 确定最大无作用剂量，对最终评价受试物能否应用于食品提供依据。
（2）试验项目 将两年慢性毒性试验和致癌试验结合在一个动物试验中进行。用两种性别的大鼠和/或小鼠。
（3）结果判定 如慢性毒性试验所得的最大无作用剂量（以mg/kg体重计）：
① 小于或等于人的可能摄入量的50倍者，表示毒性较强，应予以放弃；
② 大于50倍而小于100倍者，需由有关专家共同评议；
③ 大于或等于100倍者，则可考虑允许使用于食品，并制定日许量（ADI）。
如在任何一个剂量发现有致癌作用，且有剂量与效应关系，则需由有关专家共同评议，以作出评价。
一、概念
㈠ 毒理学 是从医学角度研究化学物质对生物机体的损害作用及其作用机理的科学。但近些年来，毒理学的研究范围已扩大到各种有害因素，如核素、微波等物理因素以及生物因素等，不只限于化学物质；但经典的毒理学主要研究内容仍然是化学物质对机体的生物学作用及其机理。
㈡ 卫生毒理学 是从预防医学的角度，研究人类在生产和生活过程中，可能接触的外来化合物对机体损害作用及其机理的学科。它是毒理学的一个重要分支，亦是预防医学的基础学科，为劳动卫生、环境卫生和食品卫生等学科提供毒理学理论和研究方法，是预防医学的重要组成部分。
㈢ 外来化合物 是存在于人类生活和外界环境中，可能与机体接触并进入机体的一些化学物质。外来化合物并非人体的组成成分，也非人体所需的营养物质，而且也不是维持机体正常生理功能和生命所必需的物质，但它们可由外界环境通过一定的环节和途径与机体接触并进入机体，在机体内呈现一定的生物学作用。常见的外来化合物有农用化学品、工业化学品、药物、食物添加剂、日用化学品、各种环境污染物及霉菌毒素等。
二、卫生毒理学研究任务
在预防医学领域中，卫生毒理学的研究任务主要有三，一是研究机体与外来化合物相互作用的规律即中毒机理；二是对外来化合物进行安全性评价；三是为制订有关卫生标准和管理方案提供科学依据。
三、卫生毒理学研究方法
㈠ 动物实验
１、体内实验法
通常在整体动物进行，使实验动物在一定时间内，按人体实际接触方式接触一定剂量的受试外来化合物，然后观察动物可能出现的形态或功能变化。实验多采用哺乳动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、仓鼠、狗和猴等。通常检测外来化合物一般毒性，例如急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验等。
２、体外实验法
大多利用游离器官、原代培养细胞、细胞系和细胞器等进行。利用器官灌流技术可对肝脏、肾脏、肺和脑等进行灌流，借此可使离体脏器在一定时间内保持生活状态，与受试外来化合物接触，观察脏器出现的形态和功能变化，同时还可观察受试物在脏器中的代谢情况；游离细胞和细胞器多用于外来化合物对机体各种损害作用的初步筛检、作用机理和代谢转化过程的深入研究，有许多优点。
上述整体、器官、细胞和亚细胞水平的研究，各自都有一定的特点和局限性，在实际工作中，应主要根据实验研究目的和要求，采用最适当的方法，并且相互验证。
㈡ 人群调查
为了将动物实验的结果，在人体上进行验证，有时需要进行人群调查。根据动物试验结果和外来化合物本身的性质，选用适当的观察指标，采用流行病学的方法进行人群调查。人群调查的特点是可以取得在人体直接观察的资料，但易受许多其他混杂因素的影响和干扰；结果和评定必须去伪存真，由表及里，并与动物实验结果进行综合考虑分析，才能得出较为符合实际的结论。
第二节 毒理学主要基本概念
一、毒性
毒性是一种物质对机体造成损害的能力。毒性较高的物质，只要相对较小的数量，则可对机体造成一定的损害；而毒性较低的物质，需要较多的数量，才呈现毒性。物质毒性的高低仅具有相对意义。在一定意义上，只要达到一定数量，任何物质对机体都具有毒性；在一般情况下，如果低于一定数量，任何物质都不具备毒性；关键是此种物质与机体接触的量。除物质与机体接触的数量外，还与物质本身的理化性质以及其与机体接触的途径有关。
二、剂量
剂量是决定外来化合物对机体损害作用的重要因素。剂量的概念较为广泛，可指给予机体的数量，或与机体接触的外来化合物的数量、外来化合物吸收进入机体数量、外来化合物在靶器官作用部位或体液中的浓度或含量。由于内剂量不易测定，所以一般剂量的概念，系指给予机体的外来化合物数量或机体接触的数量。剂量的单位是以每单位体重接触的外来化合物数量表示，例如mg/kg体重。
１、致死量
致死量即可以造成机体死亡的剂量。但在一群体中，死亡个体数目的多少有很大程度的差别，所需的剂量也不一致，因此，致死量又具有下列不同概念。
⑴、绝对致死量(LD100)系指能造成一群体全部死亡的最低剂量。
⑵、半数致死量(LD50)系指能引起一群个体50%死亡所需剂量，也称致死中量。表示LD50的单位mg/kg体重，LD50数值越小，表示外来化合物毒性越强；反之，LD50数值越大，则毒性越低。
２、最大无作用剂量(maximal no-effect level)
最大无作用剂量即在一定时间内，一种外来化合物按一定方式或途径与机体接触，根据现今的认识水平，用最灵敏的试验方法和观察指标，亦未能观察到任何对机体的损害作用的最高剂量。
最大无作用剂量的确定系根据亚慢性毒性或慢性毒性试验的结果，是评定外来化合物对机体损害作用的主要依据。以此为基础可制订一种外来化合物的每日容许摄入量(acceptable daily imtarie,intake,ADI)和最高容许浓度(maximal allowable concentration,MAC)。ADI系指人类终生每日摄入该外来化合物不致引起任何损害作用的剂量。MAC系指某一外来化合物可以在环境中存在而不致对人体造成任何损害作用的浓度。
３、最小有作用剂量(minmal effect level)
最小有作用剂量 即在一定时间内，一种外来化合物按一定方式或途径与机体接触，能使某项观察指标开始出现异常变化或使机体开始出现损害作用所需的最低剂量，也可称为中毒阈剂量，或中毒阈值。在理论上，最大无作用剂量和最小作用剂量应该相差极微，因为任何微小，甚至无限小的剂量增加，对机体损害作用，在理论上也应该有相应的增加。但由于对损害作用的观察指标受此种指标观测方法灵敏度的限制，可能检不出细微的变化。只有两种剂量的差别达到一定的程度，才能明显地观察到损害作用程度的不同。所以最大无作用剂量与最小有作用剂量之间仍然有一定的差距。
当外来化合物与机体接触的时间、方式或途径和观察指标发生改变时，最大无作用剂量和最小有作用剂量也将随之改变。所以表示一种外来化合物的最大无作用剂量和最小有作用剂量时，必须说明试验动物的物种品系、接触方式或途径、接触持续时间和观察指标。例如某种有机磷化合物在大鼠(wistar品系)经给予3个月，全血胆碱酯酶活力降低50%的最大无作用剂量为10mg/kg体重。
三、效应和反应
㈠ 效应表示一定剂量外来化合物与机体接触后可引起的生物学变化。此种变化的程度用计量单位来表示，例如若干个、毫克、单位等。
㈡ 反应是一定剂量的外来化合物与机体接触后，呈现某种效应并达到一定程度的比率，或者产生效应的个体数在某一群体中所占的比率，一般以%或比值表示。
四、剂量效应关系和剂量反应关系
剂量与效应关系或剂量与反应关系是毒理学的重要概念。机体内出现的某种损害作用，如果肯定是某种外来化合物所引起，则必须存在明确的剂量效应或剂量反应关系，否则不能肯定。
剂量效应和剂量反应关系都可以用曲线表示，即以表示效应强度的计量单位或表示反应的百分率或比值为纵座标，以剂量为横座标，绘制散点图，可得出一条曲线。不同外来化合物在不同具体条件下，所引起的效应或反应类型不同，主要是效应或反应与剂量的相关关系不一致，可呈现不同类型的曲线。在一般情况下，剂量效应或剂量反应曲线有下列基本类型：
１、直线型 效应或反应强度与剂量呈直线关系；随着剂量的增加，效应或反应的强度也随着增加，并成正比关系。但在生物机体内，此种直线关系较少出现，仅在某些体外实验中，在一定的剂量范围内存在。
２、抛物线型 剂量与效应或反应呈非线性关系，即随着剂量的增加，效应或反应的强度也增加，但最初增高急速，然后变为缓慢，以致曲线先陡峭，然后平缓，成抛物线型。如将剂量换成对数值，则成直线。剂量与效应或反应关系，换成直线，可便于在低剂量与高剂量，或低反应强度与高反应强度之间进行互相推算。
３、Ｓ－状曲线 此种曲线的特点是在低剂量范围内，随着剂量增加，反应或效应强度增高较为缓慢，然后剂量较高时，反应或效应强度也随之急速增加，但当剂量继续增加时，反应或效应强度增高又趋向缓慢。曲线开始平缓，继之陡嵴，然后又趋平缓，成不甚规则的Ｓ－状。曲线的中间部分，即反应率50%左右，斜率最大，剂量略有变动，反应即有较大增减。在剂量与反应关系中较为常见，一部分剂量与效应关系也有出现。Ｓ－状曲线分为对称或非对称两种。非对称Ｓ－状曲线两端不对称，一端较长，另一端较短。如将非对称Ｓ－状曲线横座标(剂量)以对数表示，则成为一对称Ｓ－状曲线；如再将反应率换成概率单位，即成一直线。
五、损害作用与非损害作用
㈠ 非损害作用 一般认为非损害作用不引起机体机能形态、生长发育和寿命的改变；不引起机体某种功能容量的降低，也不引起机体对额外应激状态代偿能力的损伤。机体发生的一切生物学变化应在机体代偿能力范围之内，当机体停止接触该种外毒化合物后，机体维持体内稳态的能力不应有所降低，机体对其他外界不利因素影响的易感性也不应增高。稳态是机体保持内在环境稳定不变的一种倾向或能力。
㈡ 损害作用 损害作用与非损害作用相反，应具有下列特点：
１、机体的正常形态、生长发育过程受到严重影响，寿命亦将缩短。
２、机体功能容量或额外应激状态代偿能力降低。
３、机体维持稳定能力下降。
４、机体对其它某些因素不利影响的易感性增高。
应该指出，损害作用与非损害作用都属于外来化合物在机体内引起的生物学作用，而在生物学作用中，量的变化往往引起质的变化，所以损害作用与非损害作用仅具有一定的相对意义。此外确定损害作用与非损害作用的观察指标也不断的发展。
六、正常值 损害作用和非损害作用的确定，往往涉及机体许多指标的正常值范围，有时需要对正常值进行测定。首先必须明确“正常值”仅具有相对意义。在实际工作中，按目前认识水平，认为“健康”或“正常”的个体，对其进行某项观察指标测定，以其平均值±2个标准差作为正常值范围。可采用统计学方法，确定此项指标变化是否偏离正常值范围，凡某种观察指标符合下列情况之一者，即可认为已偏离正常值范围，属于损害作用或非损害作用。
1.与对照组相比，具有统计学显著性差异(P<0.05)，并且其数值不在正常值范围内。
2.与对照组相比，具有统计学显著性差异(P<0.05)，而其数值却在一般公认“正常值”范围内；但如在停止接触后，此种差异仍然持续一段时间，则属于损害作用。
3.与对照组相比，具有统计学显著性差异(P<0.05)，而其数值却在一般公认的“正常值”范围内；但如机体处于功能或生物化学应激状态下，此种差异更为明显，则属于损害作用。
第二单元 外来化合物的生物转运和生物转化
第一节 生物转运
一、生物转运的概念
外来化合物在机体的吸收、分布和代谢过程，统称为生物转运。
二、生物转运机理
外来化合物在体内的生物转运主要通过下列机理：
㈠ 简单扩散 外来化合物在体内的扩散是依其浓度梯度差决定物质的扩散方向，即由生物膜的分子浓度较高的一侧向浓度较低的一侧扩散，当两侧达到动态平衡时，扩散即中止。简单扩散过程，不需要消耗能量，外来化合物与膜不发生化学反应，生物膜不具有主动性，只相当于物理过程，故称为简单扩散。简单扩散是外来化合物在体内生物转运的主要机理。在一般情况下，大部分外来化合物通过简单扩散进行生物转运。除生物膜两则浓度梯度差可以影响简单扩散外，还有其他因素亦可对简单扩散过程发生影响。
１、外来化合物在脂质中的溶解度，可以脂水分配系数来表示，即外来化合物在脂相中的浓度与在水相中浓度的比值(脂相中的浓度/水相中的浓度)。脂水分配系数越大，越容易透过生物膜而进行扩散。但外来化合物在生物转运过程中，除经过脂相外，还要通过水相，因为生物膜的构造包括脂相和水相，所以一种外来化合物如在水中溶解度过低，即使脂水分配系数很大，也不容易透过生物膜进行扩散，只有既易溶于脂肪又易溶于水的外来化合物，才最容易透过生物膜进行扩散。
２、外来化合物的电离或离解状态。呈离子状态的外来化合物不易通过生物膜；反之，非离解状态的外来化合物则容易透过。外来化合物的离解程度决定于本身的离解常数(pK)和所处介质中的酸碱度(pH)。除上述两种主要因素外，还有许多其他因素也可对简单扩散发生影响。
㈡ 滤过
滤过是外来化合物透过生物膜上亲水性孔道的过程。大量的水可借助渗透压梯度和液体静压作用通过孔道进入细胞。外来化合物可以水作为载体，随之而被动转运。
㈢ 主动转运
外来化合物透过生物膜由低浓度处向高浓度处移动的过程。其主要特点是：①可逆浓度梯度转运，故消耗一定的代谢能量；②转运过程需要载体参加。载体往往是生物膜上的蛋白质，可与被转运的外来化合物形成复合物而转运至膜的另一侧，然后释放外来化合物，载体又回到原处，并继续进行第二次转运；③载体既然是生物膜的组成成分，所以有一定的容量；当化合物浓度达到一定程度时，载体可以饱和，转运即达到极限；④主动转运有一定的选择性。即化合物必须具有一定基本结构才能被转运；结构稍有改变，则可影响转运的进行；⑤如果两种化合物基本结构相似，在生物转运过程中又需要同一转运系统，两种化合物之间可出现竞争，并产生竞争抑制。
㈣ 载体扩散
不易溶于脂质的外来化合物，利用载体由高浓度向低浓度处移动的过程。由于不能逆浓度递度由低浓度处向高浓度处移动，所以不消耗代谢能量。由于利用载体，生物膜具有一定主动性或选择性，但又不能逆浓度梯度，故又属于扩散性质，也可称为易化扩散或促进扩散。水溶性葡萄糖由胃肠道进入血液、由血浆进入红细胞并由血液进入神经组织都是通过载体扩散。
㈤ 胞饮和吞噬
液体或固体外来化合物被伸出的生物膜包围，然后将被包围的液滴或较大颗粒并入细胞内，达到转运的目的，前者称为胞饮，后者称为吞噬。机体内外来异物的消除，例如白细胞吞噬微生物，肝脏网状内皮细胞对有毒异物的消除都与此有关。
三、吸收的概念及吸收途径
㈠ 吸收的概念
吸收是外来化合物经过各种途径透过机体的生物膜进入血液的过程。
㈡ 吸收途径
１、经胃肠道吸收
胃肠道是外来化合物最主要吸收途径。许多外来化合物可随同食物或饮水进入消化道并在胃肠道中吸收。一般外来化合物在胃肠道中的吸收过程，主要是通过简单扩散，仅有极少种类外来化合物的吸收是通过吸收营养素和内源性化合物的专用主动转运系统。
外来化合物在胃肠道的吸收可在任何部位进行，但主要在小肠。外来化合物在胃内吸收主要通过简单扩散过程。由于胃液酸度极高(pH 1.0)，弱有机酸类物质多以未能解离形式存在，所以容易吸收；但弱有机碱类物质，在胃中离解度较高，一般不易吸收。
小肠内的吸收主要也是通过简单扩散。小肠内酸碱度相对趋向中性(pH 6.6)，化合物离解情况与胃内不同。例如，弱有机碱类在小肠主要呈非离解状态，因此易被吸收。弱有机酸与此机反，例如苯甲酸在小肠中不易被吸收。但事实上由于小肠具有极大表面积，绒毛和微绒毛可使其表面积增加600倍左右，因此小肠也可吸收相当数量的苯甲酸。此外，小肠粘膜还可以通过滤过过程吸收分子量为100～200以下的小分子，胃肠道上皮细胞亦可通过胞饮或吞噬过程吸收一些颗粒状物质。
２、经呼吸道吸收
肺是呼吸道中主要吸收器官，肺泡上皮细胞层极薄，而且血管丰富，所以气体、挥发性液体的蒸气和细小的气溶胶在肺部吸收迅速完全。吸收最快的是气体、小颗粒气溶胶和脂水分配系数较高的物质。经肺吸收的外来化合物与经胃肠道吸收者不同，前者不随同门静脉血流进入肝脏，未经肝脏中的生物转化过程，即直接进入体循环并分布全身。气体、易挥发液体和气溶胶在呼吸道中的吸收主要通过简单扩散，并受许多因素影响，主要是在肺泡气与血浆中浓度差。一种气体在肺泡气中的浓度，可以其在肺泡中的分压表示，一种气体的分压即为其肺泡气总压力中所占的百分率。分压越高，机体接触的量越大，也越容易吸收。随着吸收过程的进行，血液中该气体的分压将逐渐增高，分压差则相应降低。该气体在血液中的分压将逐渐接近在肺泡气的分压，最后达到平衡，呈饱和状态。在饱和状态时，气体在血液中的浓度(mg/L)与在肺泡气中浓度(mg/L)之比，称为血/气分配系数，即气体在血液的浓度/气体在肺泡中的浓度比值。血/气分配系数越大，即溶解度越高，表示该气体越易被吸收。
气体在呼吸道内的吸收速度与其溶解度和分子量也有关。在一般情况下，吸收速度与溶解度成正比。非脂溶性的物质被吸收时通过亲水性孔道，其吸收速度主要受分子量大小的影响；分子量大的物质，相对吸收较慢，反之亦然。溶于生物膜脂质的物质，吸收速度与分子量大小关系不大，而主要决定于其脂/水分配系数，脂/水分配系数大者吸收速度相对较高。
影响化学物质经呼吸道吸收的因素还有肺泡的通气量和血流量，肺泡通气量与血流量的比值称为通气/血流比值，特别是与肺泡通气量与血流量两者的比值有关。
３、经皮肤吸收
外来化合物经皮肤吸收，一般可分为两个阶段，第一阶段是外来化合物透过皮肤表皮，即角质层的过程，为穿透阶段。第二阶段即由角质层进入乳头层和真皮，并被吸收入血，为吸收阶段。
经皮肤吸收主要机理是简单扩散，扩散速度与很多因素有关。在穿透阶段主要有关因素是外来化合物分子量的大小、角质层厚度和外来化合物的脂溶性。脂溶性的非极性化合物通过表皮的速度与脂溶性高低，即脂/水分配系数的大小成正比，脂溶性高者穿透速度快，但与分子量成反比。
在吸收阶段，外来化合物必须具有一定的水溶性才易被吸收，因为血浆水是一种水溶液。目前认为脂/水分配系数接近于1，即同时具有一定的脂溶性和水溶性的化合物易被吸收进入血液。
此外，气温、湿度及皮肤损伤也可影响皮肤的吸收。
四、分布的概念及影响分布的主要因素
㈠ 分布概念
分布是外来化合物通过吸收进入血液或其它体液后，随着血液或淋巴液的流动分散到全身各组织细胞的过程。
㈡ 影响分布的主要因素
１、外来化合物与血浆蛋白结合 外来化合物进入血液之后往往与血浆蛋白，尤其是血浆白蛋白结合。这种结合是可逆的，它可以视为外来化合物在体内分布运输的一个过程。与血浆白蛋白结合的外来化合物与未结合的游离化学物质呈动态平衡，又由于血浆白蛋白与化学物质结合的专一性不强，所以当有另一种外来化合物或药物或生理代谢产物存在时，可以发生竞争现象。例如DDE(DDT代谢物)就可竞争性置换已与白蛋白结合的胆红素，使其在血中游离。
２、外来化合物与其他组织成分结合 外来化合物还可与其它组织成分结合，如多种蛋白质、粘多糖、核蛋白、磷脂等。这些结合有分布意义，有的也有毒理意义。例如一氧化碳与血红蛋白具有高度亲合力，导致缺氧而中毒。又如除草剂百草枯不论何种途径接触，均可浓集分布于肺引起损伤。
３、外来化合物在脂肪组织和骨骼中贮存沉积 脂溶性外来化合物可贮存于脂肪组织中，并不呈现生物学活性。只有在脂肪被动用、外来化合物重新成为游离状态时，才出现生物学作用。DDT在脂肪组织中的贮存即如此。
骨骼也可作为许多外来化合物的贮存沉积场所。例如铅可取代骨骼中的钙，被机体吸收的铅有40%可沉积于骨骼中，对机体危害相对较小。但在一定条件下，可游离释放，进入全身循环，对机体造成损害。
４、体内各种屏障的影响 机体内有若干膜屏障，对保护一些器官有重要意义。研究外来化合物在机体内的分布是否可以透过这些屏障，具有重要的毒理学意义。
⑴ 血脑屏障
由毛细血管内皮细胞和聚集包围毛细血管的星形胶质细胞的软脑膜组成的一种特殊的功能结构((血脑屏障。血脑屏障的重要性，在于保障血液和脑组织之间的正常代谢物质的交换，阻止非需要物质的进入，从而维持脑的正常功能。一般外来化合物只有分子量小，脂溶性高的才能穿透。而电离的、离子型的、水溶性大的化学物质则难于透过血脑屏障。如无机汞就不容易进入脑组织，而甲基汞则易于透过血脑屏障，造成中枢神经系统功能损伤。
⑵ 胎盘屏障
胎盘除在母体与胎儿之间进行营养素、氧、二氧化碳和代谢产物的交换外，还有阻止一些外来化合物由母体透过胎盘进入胚胎、保障胎儿正常生长发育的功能。胎盘屏障的解剖学基础是位于母体血液循环系统和胚胎之间的几层细胞构成。不同物种动物和同一物种的不同妊娠阶段胎盘细胞层数并不一样。例如猪和马有6层，大鼠、豚鼠只有一层；家兔在妊娠初期有6层，到妊娠末期仅有一层。较薄的胎盘，即细胞层数较少者，外来化合物相对容易透过，例如大鼠胎盘较人类为薄，外来化合物容易透过，故用受孕大鼠进行致畸试验可能更为繁感。
大部分外来化合物透过胎盘的机理是简单扩散，而胚胎发育所必需的营养物质，则通过主动转运而进入胚胎。
五、排泄概念和主要途径
㈠ 排泄的概念 排泄是外来化合物及其代谢产物向机体外转运的过程，是机体物质代谢全部过程中的最后一个环节。
㈡ 排泄的主要途径
１、随同尿液经肾脏排泄 肾脏排泄外来化合物的效率极高，也是最重要的排泄器官，其主要排泄机理有三：即肾小球滤过、肾小球简单扩散和肾小管主动转运，其中简单扩散和主动转运更为重要。
肾小球过滤是一种被动转运，肾小球毛细管具有孔道，直径约40(A左右，分子量在7万以下的物质皆可滤过。因此大部分外来化合物或其代谢产物均可滤出，只有与血浆蛋白结合的化学物质因分子量过大，不易透过孔道。但需指出，凡是脂/水分配系数大的化学物质或其代谢产物，则又可被肾小管上皮细胞以简单扩散方式重吸收入血。只有水溶性物质或离子型物质等才进入尿液。
肾小管主动转运实际上是肾小管主动分泌，此种主动转运可分为两种系统，一为供有机阴离子化学物质转运；一为供有机阳离子化学物质转运。此两个系统均位于肾小管的近曲小管。这两种转运系统均可以转运与蛋白质结合的物质，且存在两种化学物质通过同一转运系统时的竞争作用。
２、经肝脏随同胆汁排泄
经过肝脏随同胆汁排出体外是外来化合物在体内消除仅次于肾脏的另一种排泄途径。来自胃肠的血液携带着所吸收的外来化合物先通过门静脉进入肝脏，然后流经肝脏再进入全身循环。外来化合物在肝脏中先经过生物转化，生物转化过程中形成的一部分代谢产物，可被肝细胞直接排泌入胆汁，再混入粪便排出体外。
外来化合物随同胆汁进入小肠后，可能有二种去路：① 一部分易被吸收的外来化合物及其代谢产物，可在小肠中重新被吸收，再经门静脉系统返回肝脏，再随同胆汁排泄，即进行肠肝循环。肠肝循环具有重要生理学意义，可使一些机体需要的化合物被重新利用，例如各种胆汁酸平均有95%被小肠壁重吸收，并再被利用。在毒理学方面则由于有些外来化合物再次吸收，使其在体内停留时间延长，毒性作用也将增强。② 再有一部分外来化合物在生物转化过程中形成结合物，并以结合物的形式出现在胆汁中；肠内存在的肠菌群以及葡萄糖苷酸酶，可将一部分结合物水解，则外来化合物可重新被吸收并进入肠肝循环。
３、经肺随同呼出气排泄
许多气态外来化合物可经呼吸道排出体外。如一氧化碳、某些醇类和挥发性有机化合物都可经肺排泄。其经肺排泄的主要机理是简单扩散，排泄的速度主要决定于气体在血液中的溶解度、呼吸速度和流经肺部的血液速度。在血液中溶解度较低的气体，例如一氧化二氮排泄较快；而血液中溶解度高的物质，例如乙醇经肺排出较慢，呼吸速度的影响，在不同化合物略有不同。例如，乙醚在血液中溶解度高，过度通气时，经肺排出极为迅速。而有些不易溶于血液的气体(例如六氟化硫)的排出几乎不受过度通气的影响。
溶解于呼吸道分泌液的外来化合物和巨噬细胞摄入的颗粒物质，将随同呼吸道表面的分泌液排出。
４、其它排泄途径
外来化合物还可经其它途径排出体外。例如经胃肠道排泄、随同汗液和唾液排泄，随同乳汁排泄。此种排泄途径虽然在整个排泄过程中所占比例并不重要，但有些却具有特殊的毒理学意义。例如随同乳汁排泄。许多外来化合物可通过简单扩散进入乳汁。有机氯杀虫剂、乙醚、多卤联苯类、咖啡碱和某些金属都可随同乳汁排出。如果某种物质与母体长期反复多次接触，则容易在乳汁中浓集，重要的意义在于对婴儿的损害作用；因为按单位体重计算，婴儿通过乳汁摄入的外来化合物往往大于一般人群。
第二节 生物转化
一、生物转化的概念
外来化合物在体内经过一系列化学变化并形成其衍生物以及分解产物的过程称为生物转化，或称为代谢转化。所形成的衍生物即代谢物。外来化合物经过生物转化，有的可以达到解毒，毒性减低。但有的可使其毒性增强，甚至可产生致畸、致癌效应。所以，不应把代谢转化只看作解毒过程，而是代谢过程对外来化合物的毒性有二重性。
二、生物转化的反应类型
(一) 氧化
氧化可分为由微粒体混合功能氧化酶催化和非微粒体混合功能氧化酶催化的两种氧化反应。
微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。内质网可分为粗面和滑面二种，因而所形成的微粒体也有粗面和滑面两种，但都含有混合功能氧化酶，后者活力更强。
1.微粒体混合功能氧化酶(micrososmal mixed function oxidase,MFO)，又称为混合功能氧化酶或微粒体单加氧酶，可简称为单氧酶。在这一过程中还需要NADPH提供电子，使细胞色素P-450还原，并与底物形成复合物，才能完成这一反应过程。
混合功能氧化酶是细胞内质网膜上的一个酶系，组成较为复杂，现在已经知道的主要有细胞色素P-450氧化酶，也称为细胞色素P-450依赖性单加氧酶，还有还原型辅酶Ⅱ－细胞色素P-450还原酶。此外，还含有微粒体FDA－单加氧酶，此酶特点是不含有细胞色素P-450，而含有黄素腺嘌呤二核苷酸，代替细胞色素P-450参与单加氧酶反应。在FAD单加氧酶催化的外来化合物氧化过程中，同样需要NADPH和氧分子。
许多外来化合物都可经混合功能氧化酶催化，加氧形成各种羟化物。羟化物将进一步分解，形成各种产物，因此氧化反应可能有下列各种类型：
(1) 脂肪族羟化：亦称脂肪族氧化，是脂肪族化合物侧链(R)末端倒数第一个或第二个碳原子发生氧化，并形成羟基。
(2) 芳香族羟化：芳香环上的氢被氧化，例如苯可形成苯酚，苯胺可形成对氨基酚或邻氨基酚。在微粒体混合功能氧化酶活力测定中，可利用这一反应，即以苯胺为底物经MFO羟化后，形成对氨基酚，测定其含量，用以表示苯胺羟化酶活力。羟化过程中，也可形成邻氨基酚。
(3) 环氧化反应：外来化合物的二个碳原子之间形成桥式结构，即环氧化物。一般环氧化物仅为中间产物，将继续分解。但在多环芳烃类化合物，例如苯并(a)芘形成环氧化物后，可与细胞生物大分子发生共价结合，诱发突变以及癌肿形成。
(4) N－脱烷基反应：胺类化合物氧基N上的烷基被氧化脱去一个烷基，形成醛类或酮类。氨基甲酸酯类杀虫剂，例如西维因、致癌物偶氮色素奶油黄和二甲基亚硝胺皆可发生此种反应。二甲基亚硝胺也可在进行N－脱烷基后，形成自由甲基[CH3+]，可使细胞核内核酸分子上的鸟嘌呤甲基化（或称烷基化）诱发突变或致癌。
(5) O－脱烷基和S－脱烷基反应：与N－脱烷基反应相似，但氧化后脱去氧原子或硫原子相连的烷基。
O－脱烷基可发生于对硝基茴香醚，后者经微粒体混合功能氧化酶催化后，测定所形成对硝基酚含量，可代表混合功能氧化酶活力。
(6) N－羟化反应：羟化在N原子上进行，例如苯胺、致癌物2－乙酰氨基芴都可发生。苯胺经N－羟化反应形成N－羟基苯胺，可使血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白。
(7) 烷基金属脱烷基反应：四乙基铅可在混合功能氧化酶催化下，脱去一个烷基，形成三乙基铅。借此，四乙基铅可在机体内表现毒作用。
(8) 脱硫反应：在许多有机磷化合物经常发生脱硫反应，在这一反应中，硫原子被氧化成硫酸根脱落。如对硫磷氧化脱硫成对氧磷,毒性增强。
2.非微粒体混合功能氧化酶催化的氧化反应 肝组织胞液、血浆和线粒体中，有一些专一性不太强的酶，可催化某些外来化合物的氧化与还原，例如醇脱氢酶，醛脱氢酶、过氧化氢酶、黄嘌呤氧化酶等。
肝细胞胞液中含有单胺氧化酶和双胺氧化酶，可催化胺类氧化，形成醛类和氨，双胺氧化酶催化的氧化反应主要涉及体内生物胺类的形成，与外来化合物代谢转化关系较少。
3.前列腺素生物合成过程中共氧化反应 在外来化合物的氧化反应中，除前述微粒体混合功能氧化酶和非微粒体混合功能氧化酶催化的氧化反应外，近年来又观察到一种氧化反应，是在前列腺素生物合成过程中有一些外来化合物可同时被氧化，称为共氧化反应。
(二) 还原反应
含有硝基、偶氮基和羰基的外来化合物以及二硫化物、亚砜化合物，在体内可被还原，例如硝基苯和偶氮苯都可被还原形成苯胺。四氯化碳在体内可被NADPH－细胞色素P－450还原酶催化还原，形成三氯甲烷自由基（CCl3+ ）以致破坏肝细胞膜脂质结构，引起肝脂肪变性以及坏死等。五价砷化合物中的砷也可被还原成三价砷，三价砷化合物在水中溶解度较高，故毒性较五价砷化合物为强。
(三) 水解作用
许多外来化合物，例如酯类、酰胺类和含有酯式键的磷酸盐取代物极易水解。血浆、肝、肾、肠粘膜、肌肉和神组织中有许多水解酶，微粒体中也存在。酯酶是广泛存在的水解酶，酯酶和酰胺酶可分别水解酯类和胺类。
水解反应是许多有机磷杀虫剂在体内的主要代谢方式，例如敌敌畏、对硫磷、乐果和马拉硫磷等水解后毒性降低或消失。有些昆虫对马拉硫磷有抗药性，即由于其体内羧酸酯酶活力较高，极易使马拉硫磷失去活性。此外，拟除虫菊酯类杀虫剂也通过水解酶催化降解而解毒。
(四) 结合反应
结合反应是进入机体的外来化合物在代谢过程中与某些其它内源性化合物或基团发生的生物合成反应。特别是外来有机化合物及其含有羟基、氨基、羰基以及环氧基的代谢物最易发生。外来化合物及其代谢物与体内某些内源性化合物或基团结合所形成的产物称为结合物。在结合反应中需要有辅酶与转移酶并消耗代谢能量。所谓内源性化合物或基团的来源是体内正常代谢过程中的产物，参加结合反应的必须为内源性化合物，直接由体外输入者不能进行。
外来化合物在代谢过程中可以直接发生结合反应，也可先经过上述氧化、还原或水解等第一阶段生物转化反应(第一相反应)，然后再进行结合反应(第二相反应)，在一般情况下，通过结合反应，一方面可使外来化合物分子上某些功能基团失去活性以及丧失毒性；另一方面，大多数外来化合物通过结合反应，可使其极性增强，脂溶性降低，加速由体内的排泄过程。
根据结合反应的机理，可将结合反应分成以下几种类型：
1.葡萄糖醛酸结合 葡萄糖醛酸结合可能是最常见的结合反应，主要是外来化合物及其代谢物与葡萄糖醛酸结合。葡萄糖醛酸的来源是在糖类代谢过程中生成尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)，UDPG再被氧化生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸；UCPGA是葡萄糖醛酸的供体，在葡萄糖醛酸基转移酶的作用下与外来化合物及其代谢物的羟基、氨基和羧基等基团结合，反应产物是β－葡萄糖醛酸苷。葡萄糖醛酸必须为内源性代谢产物，直接由体外输入者不能进行结合反应。
葡萄糖醛酸结合作用主要是在肝微粒体中进行，此外肾、肠粘膜和皮肤中也可发生，外来化合物在肝脏中经结合反应后，随同胆汁排出。但有时一部分在肠道下段，可在肠菌群中的β－葡萄糖苷酸酶作用下，发生水解，则此种外来化合物可重被吸收，进行肠肝循环，使其在体内停留时间延长。
2.硫酸结合 外来化合物及其代谢物中的醇类、酚类或胺类化合物可与硫酸结合，形成硫酸酯。内源性硫酸的来源是含硫氨基酸的代谢产物，但必须先经三磷酸腺苷活化，成为3'－磷酸腺苷－5'－磷酸硫酸(PAPS)，再在磺基转移酶的作用下与酚类、醇类或胺类结合为硫酸酯。苯酚与硫酸结合较为常见。
硫酸结合反应多在肝、肾、胃肠等组织中进行；由于体内硫酸来源所限，不能充分提供，故较葡萄糖醛酸结合反应为少。
在一般情况下，通过硫酸结合反应可使外来化合物原有毒性降低丧失。但有些外来化合物经硫酸结合反应后，其毒性反而较高。例如属于芳香胺类的一种致癌物2－乙酰氨基芴（简称FAA或AAF）在体内经N－羟化反应，形成N－羟基－2－乙酰氨基芴后，其羟基可与硫酸结合，形成硫酸酯。此种AAF硫酸酯具有强致癌性，较AAF本身致癌性强。在大鼠、小鼠和狗都有此种反应发生。但有些动物肝内缺乏硫酸转移酶，无法形成硫酸酯。
3.谷胱甘肽结合 机体内有毒金属和环氧化物能与谷胱甘肽结合而被解毒。谷胱甘肽结合反应是由谷胱甘肽转移酶催化进行。谷胱转移酶在肝、肾中都含有，肝细胞胞液含量较多，近年来发现肝微粒体上亦有存在。微粒体的谷胱甘肽转移酶直接与外来化合物接触，可能在谷胱甘肽结合反应的意义更为重要。
谷胱甘肽与环氧化物结合反应非常重要。许多外来化合物，例如许多致癌物和肝脏毒物在体内可形成环氧化物，此种环氧化物大都对细胞具有较强的损害作用。例如溴化苯经代谢转化为环氧化物，溴苯环氧化物为一强肝脏毒物，可引起肝脏坏死；但与谷胱甘肽结合后，将被解毒并排出体外。谷胱甘肽在体内生成与储备有一定限度，如大量环氧化物在短时间内形成，可出现谷胱甘肽耗竭，仍可引起严重损害。
4.甘氨酸结合 有些含有羧基的外来化合物，例如有机酸可与氨基酸结合。此种结合反应的本质是一种肽式结合，与甘氨酸结合最为常见，事实上其它氨基酸也可进行这种结合。例如甲苯在体内代谢，生成苯甲酸，苯甲酸可与甘氨酸结合，形成马尿酸而排出体外。氰氢酸可经半胱氨酸结合，由唾液和尿液排泄。
5.乙酰结合 外来化合物中的芳香胺类，例如苯胺可通过其氨基与乙酰辅酶A反应，经乙酰转移酶催化使芳香胺类形成其乙酰衍生物。此外，脂族胺类药物也有类似反应。乙酰酶A的来源是糖、脂肪以及蛋白质的代谢产物。
6.甲基结合 生物胺类在体内与甲基结合的反应，也称甲基化。甲基来自蛋氨酸，蛋氨酸的甲基经ATP活化，成为S－腺苷蛋氨酸，再经甲基转移酶催化，使生物胺类与甲基结合而被解毒排泄。在外来化合物解毒中，甲基结合并不占重要地位。
二、影响生物转化因素
(一) 物种差异和个体差异
同一外来化合物生物转化的速度在不同动物可以有较大差异，例如苯胺在小鼠体内生物半减期为35分钟，狗为167分钟。同一外来化合物在不同物种动物体内的代谢情况可以完全不同。如前所述，N-2-乙酰氨基芴在大鼠、小鼠和狗体内可进行N－羟化并再与硫酸结合成为硫酸酯，呈现强烈致癌作用；而在豚鼠体内一般不发生N－羟化，因此不能结合成为硫酸酯，也无致癌作用或致癌作用极弱。
外来化合物在体内生物转化过程的个体差异还表现在某些参与代谢的酶类在各个体中的活力。例如芳烃羟化酶(arylhydrocarbon hydroxylase,AHH)可使芳香烃类化合物羟化，并产生致癌活性，其活力在个体之间存在明显差异。在吸烟量相同的情况下，AHH活力较高的人，患肺癌的危险度比活力低的人高36倍；体内AHH具有中等活力的人，患肺癌的危险度比活力低者高16倍。
(二) 外来化合物代谢酶的抑制和诱导
1.抑制 一种外来化合物的生物转化可受到另一种化合物的抑制，此种抑制与催化生物转化的酶类有关。参与生物转化的酶系统一般并不具有较高的底物专一性，几种不同化合物都可做为同一酶系的底物，即几种外来化合物的生物转化过程都受同一酶系的催化。因此，当一种外来化合物在机体内出现或数量增多时，可影响某种酶对另一种外来化合物的催化作用，即两种化合物出现竞争性抑制。
2.诱导 有些外来化合物可使某些代谢过程催化酶系活力增强或酶的含量增加，此种现象称为酶的诱导，凡具有诱导效应的化合物称为诱导物，诱导的结果可促进其它外来化合物的生物转化过程，使其增强或加速。在微粒体混合功能氧化酶诱导过程中，还观察到滑面内质网增生；酶活力增强以及对其它化合物代谢转化的促进等均与此有关。
(三) 代谢饱和状态
一种外来化合物在机体代谢的饱和状态对其代谢情况有相当的影响，并因此影响其毒性作用。例如溴化苯在体内首先转化成为具有肝脏毒作用的溴化苯环氧化物；如果输入剂量较小，约有75%的溴化苯环氧化物可转变成为谷胱甘肽结合物，并以溴苯基硫醚氨酸的形式排出；但如输入较大剂量，侧仅有45%可按上述形式排泄。当剂量过大时，因谷胱甘肽的量不足，甚至出现谷胱甘肽耗竭，结合反应有所降低，因而未经结合的溴苯环氧化物与DNA或RNA以及蛋白质的反应增强，呈现毒性作用。
(四) 其它影响因素
主要表现在年龄与性别和营养状况。蛋白质、抗坏血酸、核黄素、维生素A和维生素E的营养状况都可影响微粒体混合功能氧化酶的活力。在动物试验中如蛋白质供给不足，则微粒体酶活力降低。当抗坏血酸缺乏时，苯胺的羟化反应减弱。缺乏核黄素，可使偶氮类化合物还原酶活力降低，增强致癌物奶油黄的的致癌作用。上述酶活力降低，可能造成外来化合物转化过程减弱或减慢。
年龄对外来化合物代谢转化过程的影响，表现在肝微粒体酶功能在初出生和未成年机体尚未发育成熟，老年后又开始衰退，其功能皆低于成年，对外来化合物的代谢以及解毒能力较弱。例如大鼠出生后30天，肝微粒体混合功能氧化酶才达到成年水平，250天后又开始下降。葡萄糖醛酸结合反应在老年动物减弱，但大鼠的单胺氧化酶活力随年龄而增强。在一般情况下，幼年及老年机体对外来化合物代谢转化能力较成年为弱，所以外来化合物的损害作用也较强。
第三节 毒物动力学
一、概念
(一) 毒物动力学
是利用数学方法研究外来化合物进入机体的生物转化和生物转运随时间变化的规律和过程，称为毒物动力学，它是毒理学的一个新的分支。
(二) 室
室又称房室，它就是毒物动力学的数学模型，其含义是假设机体是由一个或多个室组成，室为有界的空间，外来化合物随时间变化在其中运动。室不代表解剖学的部位或器官或生理学的功能单位，而是理论的机体容积。
(三) 一室模型
一室模型或称单室模型，是将机体视为单一的室。外来化合物进入机体后，能迅速均匀地分布于全室之中。
(四) 二室模型
外来化合物在机体内随时间变化的规律呈一室模型较为少见，即外来化合物进入机体后，并非迅速和均匀地分布到全身，而是从血浆(包括体液)到组织脏器间有一个逐步分布与逐步达到平衡的过程。对化合物这种动力过程应用多室模型来表达，而其中以二室模型为多。二室模型是以“Ｉ室”表示血浆(或包括体液)，而以“Ⅱ室”表示组织脏器。“Ｉ室”也可称之为中心室，“Ⅱ室”也称为周边室。
(五) 速率过程
外来化合物在机体内随时间进程而发生的浓度(量)的变化，必然有其速率过程。由于化合物的化学结构，理化性质及在体内不同部位的生物环境和脏器的不同，其速率过程有两种。
1.一级速率过程 表明化合物在机体内随时间变化速率过程与化合物的浓度成正比。
2.零级速率过程 表明化合物在机体内随时间变化速率过程与化合物浓度无关。
二、主要参数
(一) 生物半减期 是表达与衡量一个外来化合物从体内清除速度的尺度，即化合物从机体减少一半所需的时间。单位min或h。公式为：
(2-1)
(二) 血浓度－时间曲线下面积，指血液中化合物浓度与时间作图，其曲线下的面积(单位μg·min·ml-1)。可用梯形或积分法求出。一室模型的积分法公式为：
(2-2)
式(2-2)中CO－零时血中化合物浓度。
(三) 表观分布容积 其意义为外来化合物在机体的分布相当于血浆浓度时所占体液的容积。它不是机体的生理真实容积，而是依据化合物在血浆水中的浓度推测而来。单位为ml/kg或L/kg。公式为：
(2-3)
式(2-3)中D给予机体化合物剂量。
(四) 总廓清率 其定义为单位时间内从机体内清除的表观分布容积，或视为机体对化合物的代谢廓清率加肾廓清率的总和。其公式为：
(2-4)
(五) 高峰时间 血浆中化合物达到高峰的时间(单位min或h)，其公式为：
(2-5)
式(2-5)中ka－化合物吸收速率常数。
(六) 生物利用度 或称生物有效度，是指外来化合物被吸收时入机体的量或吸收的程度，也就是化合物的吸收率。利用此参数可以比较外来化合物不同染毒途径吸收进入机体的吸收率。一般讲生物利用度较高者，对机体的损害效应也较强，其公式为：
(2-6)
第三单元 外来化合物毒性作用影响因素和联合作用
第一节 外来化合物毒性作用的影响因素
一、外来化合物的结构、理化性质及毒性效应
(一) 化学结构和毒性效应
研究外来化合物化学结构和毒性效应之间的关系，找出其规律，在毒理学研究中具有重要意义。现就已知举例介绍如下：
1.以直链饱和烃为例，这类脂肪族化合物为非电解质化合物，其毒性为具有麻醉作用。从丙烷(甲烷、乙烷例外，为惰性气体)起，随着碳原子数增多，麻醉作用增强。但达到9个碳原子之后，却又随着碳原子数增多，麻醉作用反而减弱。这是由于这类非电解化合物伴随碳原子数增加而脂溶性增大，水溶性相应减小，即脂水分配系数增大。极亲脂性化合物，由于不利于经水相转运，其在机体内易被阻滞于脂肪组织中，反而不易穿透生物膜达到靶器官。
2.有机磷化合物 均有亲电子的磷，它以共价键结合于乙酰胆碱酯酶的酯解部位。但有机磷化合物的一些取代基不同，可以影响磷原子上的电荷密度，使其毒性发生变化。保棉磷的R1与R2基团为二乙氧基，其P原子电荷为+1.041e，大鼠经LD50为16mg/kg。而当用二乙基取代二乙氧基，形成保棉磷时，P原子电荷为+0.940e，则其毒性大为下降，大鼠经LD50为1000mg/kg，二者毒性相差达60倍。
(二) 外来化合物的理化性质与毒性效应
外来化合物理化性质，如分子量、熔点、折射率、键能等等均与其毒性或毒性效应有关。现就目前讨论较多的几项介绍如下。
1.脂水分配系数 是指化合物在脂(油)相和水相的溶解分配率，即化合物的水溶性与脂溶性间达到平衡时，其平衡常数称为脂水分配系数。一种化合物的脂/水分配系数较大，表明它易溶于脂，反之表明易溶于水，而呈现出化合物的亲脂性或疏脂性。
化合物的脂/水分配系数大小与其毒性密切相关，它涉及化合物的吸收、分布、转运、代谢和排泄。
2.电离度 即化合物的pKa值，对于弱酸性或弱碱性的有机化合物，只有在pH条件适宜，使其维持最大限度成为非离子型时，才易于吸收，包括透过生物膜，发挥毒性效应。若化合物在一定pH条件下呈离子型的比例越高，虽易溶于水，但难于吸收，且易随尿排出。
3.挥发度和蒸气压 凡是化合物在常温下容易挥发，就易形成较大蒸气压，易于经呼吸道吸收。
有些有机溶剂的LD50值相似，即其绝对毒性相当，但由于其各自的挥发度不同，所以实际毒性可以相差较大。如苯与苯乙烯的LC50值均为45mg/L，即其绝对毒性相同。但苯很易挥发，而苯乙烯的挥发度仅及苯的1/11，所以苯乙烯形成空气中高浓度就较困难，实际上比苯的危害性为低。
4.分散度 粉尘、烟、雾等状态物质，其毒性与分散度有关。颗粒小分散度越大，表面积越大，生物活性也越强。分散度还与颗粒在呼吸道的阻留有关。大于10μm颗粒在上呼吸道被阻，5μm以下的颗粒可达呼吸道深部，小于0.5μm的颗粒易经呼吸道再排出，小于0.1μm的颗粒因弥散作用易沉积于肺泡壁。
(三) 外来化合物的纯度和异构体与毒性效应
论述一个外来化合物的毒性，一般是指其纯品的毒性，但在卫生毒理学实际工作中更经常的是阐明其工业品或商品的毒性。工业品往往混有溶剂，未参加合成反应的原料、原料中杂质、合成副产品等。商品中往往还含有赋形剂或添加剂。这些杂质有可能影响、加强、甚至改变原化合物的毒性或毒性效应。
有机化合物往往存在同分异构体，如二甲苯就有间位、邻位、对位三种，而且毒性也有差别。内吸磷含有硫联型和硫离型二种同分异构体，二者比重不同，溶解度可相差30倍，大鼠经LD50也相差3倍。三邻甲苯磷酸酯，即TOCP，是致迟发性神经病化合物，但当其甲基转至对位，则失去致迟发性神经病毒性。
二、实验动物物种和个体因素
(一) 实验动物的物种、品系及毒性效应
不同物种、品系的动物由于其遗传因素决定了对外来化合物代谢转化方式和转化速率的差异。转化方式不同可能因某些物种动物体内代谢反应类型有缺陷，从而产生不同的代谢产物，表现出不同的毒作用。例如2-乙酰氨基芴在大鼠、小鼠和狗体内可进行N－羟化，并与硫酸结合形成硫酸酯而呈现强致癌作用，而在豚鼠体内则不发生N－羟化，故不致癌。
同一物种动物品系不同，在遗传、生理学上的差异也表现对外来化合物毒性的差异。例如stock小鼠腹腔注射丙烯腈的LD50为15mg/kg，而NR小鼠则为40mg/kg。
(二) 实验动物个体因素与毒性效应
同一物种同一品系的不同群体动物，在相同条件下，接触一种外来化合物均有不同的剂量反应关系，说明实验动物存在个体差异。其个体差异的原因极为复杂，主要有如下几方面：
1.性别与年龄 品系相同的动物对外来化合物在毒性反应上表现出性别差异。在一般情况下，成年雌性动物比雄性动物对化学物毒性敏感，但也有例外。如马拉硫磷和甲基对硫磷对雄性大鼠毒性敏感性高于雌鼠。而对性别差异可能主要与性激素功能和代谢转化有关。
品系与性别相同的动物，年龄不同对外来化合物毒性的敏感性常不同。有人分析百余种化合物对不同年龄动物的致死量，结果表明新生动物对毒性的反应比青年或成年动物敏感，敏感性平均高3倍，出现年龄差异的原因可能是不同年龄动物酶活力、解毒能力、代谢速度、皮肤和粘膜的通透性以及肾脏清除率等方面的差别造成的。新生动物血脑屏障未发育完善，因此对某些神经毒物较敏感。
2.机体因素
人和哺乳动物的许多正常生理功能、疾病病理变化及营养与习惯往往也会影响外来化合物的毒性作用。
三、气象因素
1.气温 在正常生理情况下，高气温使机体皮肤毛细血管扩张、血循环加快、呼吸加速。凡可经皮肤或经呼吸道吸收的化合物，吸收速度将加快。如对硫磷经皮肤接触，吸收量随环境气温升高增加，尤其在30℃以上。另一方面，高温时多汗，随汗液排出氯化钠等物质增多，胃液分泌减少、胃酸降低，影响化合物经胃肠吸收。同时排汗增多，尿量减少，易于造成经肾脏随尿排出的化合物或其代谢产物在体内存留时间延长。
2.气湿 高气湿，尤其是伴随高气温的高气湿环境，可使经皮肤接触吸收的化合物吸收速度加快。因为高气湿环境汗液蒸发困难，皮肤角质层的水合作用加强，脂水分配系数较低的化合物也易吸收。此外化合物也易于粘着皮肤表面，延长接触时间。
3.气压 高气压与低气压环境条件下，接触外来化合物可以引起外来化合物的毒性改变。例如在低气压(如高原)士的宁的毒性降低，但氨基丙苯毒性增强。
四、接触途径和媒介
1.接触途径 实验动物接触外来化合物的途径不同，其首先到达的器官将有差别，中毒效应也不尽相同。在相同化合物剂量下，接触途径不同，其吸收速度、吸收率也不尽相同。一般认为，接触化合物吸收速度和毒性大小的顺序是：静脉注射>腹腔注射肌肉注射(经口>经皮。
2.溶剂和助溶剂 受试化合物常需先用溶剂溶解或稀释，有时还要用助溶剂。选择溶剂与助溶剂必须慎重，因有的溶剂或助溶剂可改变化合物的理化性质和生物活性。为此，所选用的溶剂或助溶剂应是无毒的，与受试化合物不起反应，受试化合物在溶液中应稳定。
3.化合物的稀释度 有的外来化合物经溶液稀释，由于稀释度不同(浓度不同)毒性也会受影响。一般在同等剂量情况下，浓溶液比稀溶液毒作用为强。
4.交叉接触 在毒理试验中，尤其是经皮肤接触与经呼吸道接触外来化合物的过程中，要注意防止化合物的交叉接触吸收问题。
第二节 外来化合物联合作用
一、联合作用的概念
外来化合物在机体中往往呈现十分复杂的交互作用。或彼此影响代谢动力学过程，或引起毒性效应变化，最终可以影响各自的毒性或综合毒性。毒理学把两种或两种以上的外来化合物对机体的交互作用称为联合作用。
二、联合作用的类型：
(一) 相加作用 交互作用的各种化合物在化学结构上如为同系物，或其毒作用的靶器官相同，则其对机体产生的总效应等于各个化合物成分单独效应的总和，这种现象即是化合物的相加作用。已知有些化合物的交互作用呈相加作用，如大部分刺激性气体的刺激作用一般呈相加作用；具有麻醉作用的化合物，一般也呈相加作用。
(二) 协同作用 各化合物交互作用结果引起毒性增强，即其联合作用所发生的总效应大于各个化合物单独效应的总和，这种现象即为化合物的协同作用。多个化合物之间发生协同作用的机理复杂而多样。可能与化合物之间影响吸收速率,促使吸收加快、排出延缓、干扰体内降解过程和在体内的代谢动力学过程的改变等有关。如马拉硫磷与苯硫磷的联合作用为协同作用，其机理是由于苯硫磷抑制肝脏降解马拉硫磷的酯酶之故。
(三) 拮抗作用 各化合物在体内交互作用的总效应，低于各化合物单独效应的总和，这一现象称为拮抗作用。化合物在体内产生拮抗作用可能有几种形式，一种是化合物之间的竞争作用，如肟类化合物和有机磷化合物竞争与胆碱酯酶结合，致使有机磷化合物毒性效应减弱。一种化合物间引起体内代谢过程的变化，1,2,4,－三溴苯和1,2,4.三氯苯等一些卤代苯类化合物能明显地引起某些有机磷化合物的代谢诱导，使其毒性减弱。一种是功能性或效应性拮抗，如一些中毒治疗药物，阿托品对抗有机磷化合物引起的毒覃碱症状，即为明显实例。
(四) 独立作用 两种或两种以上的化合物作用于机体，由于其各自作用的受体、部位、靶细胞或靶器官等不同，所引发的生物效应也不相互干扰，从而其交互作用表现为化合物的各自的毒性效应，对此称为独立作用。
当化合物的联合作用表现为独立作用时，如以LD50为观察指标，则往往不易与相加作用相区别，必须深入探讨才能确定其独立作用。例如酒精与氯乙烯的联合作用，当大鼠接触上述两种化合物之后的一定时间，肝匀浆脂质过氧化增加，且呈明确的相加作用。但在亚细胞水平研究，就显现出酒精引起的是线粒体脂质过氧化，而氯乙烯引起的是微粒体脂质过氧化，两化合物在一定剂量下，无明显的交互作用，而为独立作用。
第四单元 急性毒性作用及其试验方法
第一节 急性毒性试验概述及染毒方法
一、概念和试验目的
(一) 急性毒性概念
急性毒性是指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。
但须指出化合物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化合物的质与量不同而异。有的化合物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。而有的化合物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。此外，实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以“一次”含有时间因素。
(二) 实验目的
1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。
2.阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关系与中毒特征。
3.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。也可用于研究急救治疗措施。
二、实验动物和染毒方法
(一) 实验动物选择
在卫生毒理学领域中，体内试验以实验动物为研究对象，最终是为了阐明受试外来化合物对人的急性危害性质和危害强度。所以选择实验动物时，要求在其接触化合物之后的毒性反应，应当与人接触该化合物的毒性反应基本一致，虽然利用任何一种或几种实验动物的急性毒性结果向人外推都必须十分慎重，但这一选择实验动物的原则仍非常重要。
1.物种选择 以选择哺乳动物为主。目前实际应用中以大鼠和小鼠为主，尤以大鼠使用很多。需指出大鼠并非对外来化合物都最敏感。家兔常用于研究化合物的皮肤毒性，包括对粘膜的刺激。猫、狗也用于急性毒性试验，但因价贵不易于大量使用。猪为杂食动物，对一些化合物的生物效应表现与人有相似之处，尤其是皮肤结构与人较近似。但因体大、价贵，不便大量使用。
归纳起来，在进行化合物急性毒性研究中，选择实验动物的原则是：尽量选择对化合物毒性反应与人近似的动物；易于饲养管理，试验操作方便；易于获得、品系纯化，且价格较低的动物。为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。
一般研究外来化合物急性毒性，需雌雄两性动物同时分别进行，每个剂量组两性动物数相等。急性毒性使用小鼠体重以18(25g、大鼠180(240g、豚鼠200(250g、家兔2(2.5kg、猫1.5(2.0kg左右为宜。
(二) 实验动物喂养环境
实验动物喂养室室温应控制在22(3℃，家兔可控制在20(3℃，相对湿度30%～73%，无对流风。每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时需单笼饲养。饲养室采用人工昼夜为好，早6点至晚6点进行12小时光照，其余12小时黑暗，一般食用常规试验室饲料，自由饮水。
(三) 实验动物染毒方法
1.经口(胃肠道)接触 目的是研究外来化合物能否经胃肠道吸收及求出经口接触的致死剂量(LD50)等。由于外来化合物可以污染饮水及食物，因此，此种染毒方式在卫生毒理学中占有重要地位。
(1) 灌胃 是将液态受试化合物或固态、气态化合物溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。
在每一试验系列中，同物种实验动物灌胃体积最好一致，即以单位体重计算所给予的毫升数应一致，即ml/kg或ml/g计。这是因为成年实验动物的胃容量与体重之间有一定的比例。按单位体重计算灌胃液的体积，受试化合物的吸收速度相对较为稳定。小鼠一次灌胃体积在0.2(1.0ml/只或0.1(0.5ml/10g体重较合适，大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只(通常用0.5(1.0ml/100g体重)，家兔不超过10ml/2kg体重，狗不超过50ml/10kg体重。
(2) 吞咽胶囊 将一定剂量受试化合物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后后咽部迫使动物咽下。此种方式剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异味的化合物。家兔及猫、狗等大动物可用此法。
2.经呼吸道接触
例如CO、CO2等在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生活过程中以蒸气态、气溶胶、烟、尘状态污染生产与生活环境空气，此时就有可能经呼吸道吸入。研究外来化合物在上述物理性状下能否被吸入机体，且造成损害，在卫生毒理学中也占有重要位置。
实施经口接触时，实验动物在接触受试化合物前应禁食，以防止胃纳充盈影响化合物的吸收和毒性。大鼠、小鼠因主要在夜间进食，应采用隔夜禁食。接触受试化合物之后应继续禁食3(4小时。
(1) 吸入接触 分为两种方式，一是静式吸入，一是动式吸入。
① 静式吸入：系将实验动物置于一个有一定体积的密闭容器内，加入定量的易挥发的液态化合物或一定体积的气态化合物，在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境。这种接触方式，虽然有许多不足之处，但由于其设备简单、操作方便、消耗受试化合物较少，还有其使用价值；尤其是适用于小动物接触易挥发液态化合物的急性毒性研究。为保障试验顺利进行，染毒柜体积、放置动物种类和数量及放置时间相互关系见表4-1。
表4-1 实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系
动物种属
呼吸通气量
(L/小时)
最低需气量
(L/小时)
不同容积染毒柜放置动物数(只)
25L
50L
100L
300L
小 鼠大 鼠
1.45
10.18
2.45
30.5
3~5
6~10
12~15
1~2
36~40
5~6
② 动式吸入：是指实验动物处于空气流动的染毒柜中，染毒柜装置备有新鲜空气补入与含受试化合物空气排出的动力系统和随时补充受试化合物的配气系统。动式吸入接触方式一般来讲优于静式吸入接触，但其装置复杂，消耗受试化合物的量大，易于污染操作室环境。
3.经皮肤接触 液态、粉尘态和气态外来化合物匀有接触皮肤的机会。有的化合物不仅能与外露皮肤接触并吸收，还有的化合物可以穿透衣服而经皮肤吸收。
(1) 经皮肤吸收 研究外来化合物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠。但由于研究化合物经皮肤吸收的毒性(求经皮LD50)所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替。
定性试验：为考察一个外来化合物能否经皮吸收引起中毒，可先进行定性试验。小鼠或大鼠的浸尾试验是常用的定性试验方法。
定量试验：是在实验动物已脱好毛的部位定量涂布受试化合物，以求该化合物经皮吸收的剂量－反应关系，求经皮LD50。
(2) 局部作用试验 不少外来化合物可以引起皮肤接触部位的局部损伤。研究化合物局部毒性作用常用皮肤斑贴法或兔耳法。
4.注射途径接触受试物 采用注射途径进行外来化合物的急性毒性试验，主要用于比较毒性研究，以及化合物的代谢、毒物动力学和急救药物筛选等研究。
表4-2 几种动物不同注射途径注射量(ml)范围注射途径
小鼠
大鼠
豚鼠
兔
狗
静脉肌肉皮下腹腔
0.2~0.5
0.1~0.2
0.1~0.5
0.2~1.0
1.0~2.0
0.2~0.5
0.5~1.0
1.0~3.0
1.0~5.0
0.2~0.5
0.5~1.0
2.0~5.0
3.0~10
0.5~1.0
1.0~3.0
5.0~10.0
5.0~15.0
2.0~5.0
3.0~10.0
－
第二节 急性毒性试验程序与急性毒性评价
一、急性毒性试验程序
(一) 急性试验剂量分组
探讨外来化合物急性毒性应首先测定其半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)。对一个未知毒性的外来化合物求其LD50(LC50)，应先做预试验。做预试验方法很多，这里仅介绍其中一种。首先了解分析受试化合物的化学结构和其理化性质，确定其所属已知化合物或其衍生物的种类，有何特殊基团及其分子量、熔点、沸点、比重、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组，再上下各推一到两个剂量组做预试验。每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。
初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log4＝0.6)来划分各组剂量。
求外来化合物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定。一般设置5(7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6(8只、家兔4(6只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异，则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。
(二) 观察持续时间
测定外来化合物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化合物之后两周内的总死亡数。对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。也可仅计算24小时的死亡率，有些速杀性化合物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。
在观察期间应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。
(三) 症状观察
观察实验动物接触外来化合物的中毒症状是了解该化合物急性毒性的十分重要的一环，是补充LD50这个参数不足的重要方面。故应详细地观察动物的中毒症状、发生和发展过程及规律，死亡前症状特点、死亡时间等等。这有助于揭示化合物甚至同类化合物的不同衍生物的急性毒性特征。
很多化合物在实验动物接触的初期往往先出现兴奋现象，有的化合物在动物接触的初期首先表现为抑制现象，在观察期间应注意观察其体重变化。这有助于了解受试化合物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应。此外，不少化合物还可以引起受试实验动物粘膜刺激症状，如出汗、流涎，甚至有血性分泌物，瞳孔改变等。
(四) 病理学检查和其它指标观察
二、急性毒性评价
应当重视病理组织学检查。凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查。对存活动物于观察期结束后应做病理学检查。
外来化合物的急性毒性分级标准用于对急性毒性进行评价。但各种分级标准还没有完全统一。我国目前除参考使用国际上几种分级标准外，又提出了相应的暂行标准。不论我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。
表4-3 工业毒物急性毒性分级标准毒性分级
小鼠一次经口
LD50(mg/kg)
小鼠吸入2小时
LC50(ppm)
兔 经 皮
LD50(mg/kg)
剧 毒高 毒中 等 毒低 毒微 毒
<10
11~1000
101~1000
1001~10000
>10000
<50
51~500
501~5000
5001~50000
>50000
<10
11~50
51~500
501~5000
>5000
表4-4 化合物经口急性毒性分级标准毒性分级
小鼠一次经口
LD50(mg/kg)
大约相当体重70kg人的致死剂量
6级，极毒
5级，剧毒
4级，中等毒
3级，低毒
2级，实际无毒
1级，无毒
<1
1~50
51~500
501~5000
5001~15000
>15000
稍尝，<7滴
7滴~1茶匙
1茶匙~35g
35~350g
350~1050g
>1050g
表4-5 外来化合物急性毒性分级(WHO)
毒性分级
大鼠一次经口LD50(mg/kg)
6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)
LD50
(mg/kg)
兔经皮对人可能致死的估计量
总 量
g/kg (g/60kg)
剧 毒高 毒中 等 毒低 毒微 毒
<1
1~
50~
500~
5000~
<10
10~
100~
1000~
10000~
<5
5~
44~
350~
2180~
<0.05
0.05~
0.5~
5~
>15
0.1
3
30
250
>1000
联合国世界卫生组织推荐了一个五级标准(表4-5)。
总之，从表4-3到表4-5可见各种分级标准有相同之处，也有相异之点，但都有不完善的地方。
第五单元 亚慢性和慢性毒性作用及其试验方法
第一节 亚慢性毒性作用及其试验方法
一、概念和试验目的
(一) 概念
亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。
(二) 试验目的
亚慢性毒性试验的目的，主要是探讨亚慢性毒性的阈剂量或阈浓度和在亚慢性试验期间未观察到毒效应的剂量水平，且为慢性试验寻找接触剂量及观察指标。
二、亚慢性毒性试验设计
(一) 亚慢性试验期限
亚慢性毒性试验的期限“多日”的确切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为3～6个月，而在工业毒理学中认为1～3月即可。这是考虑到人类接触大气、水和食品污染物的持续时间一般较久，而在工业生产过程中接触化合物仅限于人一生中的工作年龄阶段，且每日工作不超过8小时之故。
现有学者主张进行实验动物90天喂饲试验为亚慢性毒性试验，即将受试物混合物饲料或饮水中，动物自然摄取连续90天。这是由于有研究报道认为动物连续接触外来化合物3个月，其毒性效应往往与再延长接触时间所表现的毒性效应基本相同，故不必再延长接触期限。相应地主张呼吸道接触可进行30天或90天试验，每天6小时，每周5天。经皮肤试验进行30天。
（二）实验动物和染毒途径
1、实验动物的选择
亚慢性毒性作用研究一般要求选拔两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性特征。
由于亚慢性毒性试验期较长，所以选择被动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右。
2、染毒途径
亚慢性毒性试验接触外来化合物途径的选择，应考虑两点：一是尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式，二是应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种。
（三）剂量选择与剂量分组
亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型的损伤。此剂量的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此化合物LD50的1/20(1/5为最高剂量。
化合物亚慢性毒性试验应求出其剂量－反应关系，只有求出剂量－反应关系才能阐明受试化合物的亚慢性毒作用特征，并为慢性毒性试验打下基础。为此，亚慢性试验至少应设计三个染毒剂量组及一个正常动物对照组，必要时再加一个受试化合物的溶剂对照组。最低剂量组的剂量应相当于亚慢性的阈剂量水平或未观察到作用水平，中间剂量组动物以出现轻微中毒效应为度。组内动物个体体重相差应不超过平均体重的10%，组间平均体重相差不超过5%。小动物每组不应少于20只，大动物不少于6(8只。
（四）观察指标
1、一般性指标
1）.一般综合性观察指标 这类指标是非特异性观察指标，它是外来化合物对机体毒性作用的综合性总体反映。
① 动物体重 实验动物在亚慢性方式接触外来化合物过程中，有多种因素均可影响动物体重的增长，包括食欲变化、消化功能变化、代谢和能量消耗变化等。体重变化的表示方式，可将接触组与对照组同期体重绝对增长的重量加以比较和统计学处理。也可将接触组与对照组同期体重百分增长率(以接触化合物开始时动物体重为100%)进行统计和比较。
② 食物利用率 亚慢性试验期间必须注意观察并记录动物的饮食情况，在此基础上计算食物利用率，即动物每食入100g饲料所增长的体重克数。分析比较接触组与对照组食物利用率，有助于分析受试化合物对实验动物的生物学效应。
③ 症状 实验动物在接触外来化合物过程中所出现的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间均应记录和分析。
④ 脏器系数 或称脏/体比值，是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100g体重计。如肝/体比，即(全肝湿重/体重)(100。此指标的意义是实验动物在不同年龄期，其各脏器与体重之间重量比值有一定规律；若受试化合物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变，可以增大或缩小，因此，脏/体比值是一个灵敏、有效和经济的指标。
2）.一般化验指标 主要指血象和肝、肾功能的检测，在亚慢性试验中研究外来化合物对实验动物的毒性作用，使用这类指标，一般为筛检性和探讨性。通常血象检测包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量等。肝、肾功能也是一种常规指标，如SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣镜检等。
2、病理学检查 亚慢毒性试验中应重视病理学检查。凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。必要时作组织化学或电镜镜检。
第二节 蓄 积 作 用
一、蓄积作用的概念
外来化合物一次性进入机体之后，可经代谢或原型排出体外，但当化合物与机体发生亚慢性接触，将反复进入机体，而且当进入的速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化合物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化合物的蓄积作用。
二、蓄积作用的研究方法
现仍认为外来化合物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础。一种外来化合物有无蓄积作用是评定该化合物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据。
依蓄积作用的概念，实验动物亚慢性或亚急性接触外来化合物之后,当用化学分析方法能够测得机体内存在该化合物或其代谢产物时，称之为物质蓄积。但是有的化合物在机体内虽不能被测出，却在长期接触下出现了慢性中毒现象，此时习惯上称之为功能(机能)蓄积。功能蓄积可能是由于贮存体内的化合物或其代谢产物的数量极微，不能检出物质的蓄积或者是由于每次机体接触化合物之后所引起的损害累积所致。
蓄积作用的研究方法有多种，现仅介绍两种常用的方法。
(一) 蓄积系数法
此种方法的原理是在一定期限之内以低于致死剂量(小于LD50剂量)，每日给予实验动物，直至出现预计的毒性效应(或死亡)为止，计算达到预计效应的总累积剂量，求出此累积剂量与一次接触该化合物产生相同效应的剂量的比值，此比值即为蓄积系数(K值)。在卫生毒理学实际工作中，蓄积作用试验多用小鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标，其K值计算公式如下：
(5-1)
式(5-1)中LD50(n)表示引起一半动物死亡的累积总剂量；LD50(1)表示引起一半动物死亡的一次剂量。
如果有多次接触中，实验动物对受试化合物发生过敏现象，则可能出现K<1。一个化合物的蓄积作用较弱，由K>1。一般认为K>5时，此化合物的蓄积作用极弱，蓄积系数评价标准见表5-1。
表5-1 蓄积系数评价标准蓄积系数(K)
蓄积作用分级
<1
1~
3~
5~
高 度 蓄 积明 显 蓄 积中 等 蓄 积轻 度 蓄 积
虽然蓄积系数法具有一定使用价值，但是某些外来化合物的慢性中毒效应，无法用K值表示。例如多数有机磷化合物是属于轻度蓄积(K>5)，但当小剂量反复与机体接触后，红细胞与脑组织的乙酰胆碱酯酶可以持续降低，而且伴有一定程度的中枢神经系统症候。
(二) 生物半减期法
生物半减期法是用毒物动力学原理阐明外来化合物在机体内的蓄积作用特征。
外来化合物在机体内蓄积的速度和量与单位时间内吸收该化合物的速度和量以及清除速度和量有关。任何化合物如果以相等的时间间距恒速地吸收入血液，则化合物一定剂量范围内在机体中的蓄积量不是直线地无限增加，而是有一定的极限。这是因为受试化合物在吸收进入机体的同时存在着该化合物在体内代谢转化与清除的过程。当受试化合物的吸收过程与代谢转化、清除过程达到动态平衡时，化合物的蓄积量就基本上不再增加。T1/2较短的化合物达到蓄积极限所需的时间也短，但是一旦机体停止接触该化合物，也易于很快从机体内清除完毕。
第三节 慢性毒性作用及其试验方法
一、概念和试验目的
(一) 慢性毒性概念
慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。
(二) 试验目的
慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。
二、慢性毒性试验设计
（一）慢性毒性试验期限
一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；而环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。
但是，也有学者认为大鼠为进行慢性毒性试验动物，接触受试化合物1年以上不一定必要。多次经验证明延长接触1年以上，大鼠也不再出现新的毒性效应(致癌试验除外)。例如有报道在122种化合物中，大鼠连续接触3个月之后才出现毒性效应的只有3种(占2.46%)，其它化合物均在3个月内已出现毒性效应。因此认为以大鼠为试验对象时连续接触外来化合物90天，即可确定受试化合物的长期无作用水平。但是，这种观点还存有争论。因此在食品及环境毒理学中进行慢性毒性试验，接触外来化合物的时间仍以2年为好。
（二）实验动物与饲养环境
1、实验动物
慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢性毒性试验相同。但实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组。
实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重10(12g；大鼠出生后3(4周，体重50(70g。性别要雌雄各半。
2、动物饲养环境
慢性毒性试验实验动物的饲养条件和饲养环境与亚慢性毒性试验相同。
（三）接触途径
慢性毒性试验多为经口与经呼吸道接触。经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定。工业毒物的试验通常每日吸入4～6小时。环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。
（四）剂量的选择与分组
为制定外来化合物卫生标准而进行慢性毒性试验时，一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组)。以求出明确的剂量－反应关系。
染毒组剂量的选择可参考三组数据。一是以亚慢性阈剂量为出发点，即以亚慢性阈剂量或其1/5 (1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/50(1/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组；一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50 的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实验动物个体敏感性差异。组间剂量差一般以5(10倍为宜，最低不小于两倍。
（五）观察指标
观察指标的选择，应以亚慢性毒性试验的观察指标为基础。其中包括体重、食物摄取、临床症状、行为、血象和血液化学、尿的性状及生化成分以及重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。一些观察指标变化甚微，为此应注意三点：一是试验前应对一些预计观察指标，尤其是血、尿常规及重点测定的生化指标进行正常值测定，废弃个体差异过大的动物；二是在接触外来化合物期间进行动态观察的各项指标，应与对照组同步测定；三是各化验测定方法应精确、可靠、且进行质量控制。
应重视病理组织学的检查。凡试验期间死亡的动物，都应做病理组织学检查。
第六单元 外来化合物致突变作用及其评价
第一节 诱发突变的类型
一、基因突变
基因突变即遗传物质在分子水平上的改变，有碱基置换、移码和大段损伤。
(一) 碱基置换
碱基置换是某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变。此时首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。原来的嘌呤被另一种嘌呤置换，或原来的嘧啶被另一种嘧啶置换，都称为转换；原来的的嘌呤被任一种嘧啶置换，或与此相反，原来的嘧啶被任一种嘌呤置换，都称为颠换。无论是转换还是颠换都只涉及一对碱基，是名符其实的点突变，其结果可造成一个三联体密码子的改变；此时可能出现同义密码、错义密码或终止密码。由于错义密码所编码的氨基酸不同，于是基因表达产物的蛋白质有可能受到某种影响，终止密码可使所编码的蛋白质肽链缩短。
(二) 移码
移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变，故称移码。其结果是从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列完全改变；也可能使读码框架改变其中某一点形成无义密码，于是产生一个无功能的肽链片段，移码较易成为致死性突变。
(三) 大段损伤
大段损伤是DNA链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，涉及数以千计的核苷酸。 缺失的片段远远小于光学显微镜可观察到的染色体缺失，故称小缺失。它往往是DNA断裂的结果，有时在减数分裂过程中发生错误联合和不等交换也可造成小缺失。小缺失通常可引起突变。
小缺失游离出来的DNA片段可整合到另一染色体某一位置而形成插入。每次整合都可发生突变。小缺失的片段也可倒转后仍插入原来位置而造成基因重排。
二、染色体畸变
染色体畸变包括染色体结构异常和数目异常。
(一) 染色体结构异常
染色体结构异常是染色体或染色体单体受损而发生断裂，且断端不发生重接或虽重接却不在原处。能使染色体或染色单体发生断裂的物质称为断裂剂，这种作用的发生及其过程称为断裂作用。断裂作用的关键是诱发DNA链断裂。大多数化学断裂剂像紫外线一样，只能诱发DNA单链断裂，故称为拟紫外线断裂剂。这种断裂需要经过S期的复制，才能在中期相细胞出现染色单体型畸变。少数化学断裂剂与电离辐射一样，可诱发DNA双链断裂，故称为拟放射性断裂剂。所以如在S期已发生复制之后或G2期发生作用，在中期相呈现染色单体型畸变，而在G0期和G1期作用，则经S期复制，就会在中期相呈染色体型畸变。由于拟放射性断裂剂能在细胞周期任一时期发生作用,并在立即到来的中期相观察到染色体结构改变，故称S期不依赖断裂剂。
在任何情况下见到的染色单体型畸变都将在下一次细胞分裂时衍生为染色体型畸变。
1.染色体畸变 是染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的结构异常，可分为下列类型：
(1) 裂隙和断裂：都是指染色体上狭窄的非染色带。过去以带宽超过染色单体宽度为断裂，不超过者为裂隙。此种线状连接多排列成直线或圆滑弧形。无线状连接者为断裂，保持线状连接者为裂隙。一般认为裂隙属于非染色质损伤。裂隙一向不计入畸变范围。
(2) 无着丝粒断片和缺失：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，就会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体，后者称为带着丝粒断片。常将无着丝粒断片简称为断片，在下一次细胞分裂时断片因无着丝粒，故不能进入分裂的核中而滞留在细胞质中，称为微核。如断片很小，小于染色单体宽度，则称为微小体。
(3) 环状染色体：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体；如果是一条较长的无着丝粒断片的两端连接，就形成无着丝粒环。
(4) 倒位：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180(再重接，称为倒位。
(5) 插入和重复：当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。如此时有缺失的染色体和有插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。
(6) 易位：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。
2.染色体单体畸变 指某一位点的损伤只涉及姐妹染色单体中的一条。
(1) 染色单体裂隙、断裂和缺失：含义与染色体型畸变的裂隙、断裂和缺失基本相同，不同的是染色体中一条染色单体的结构改变。染色单体断片在下一次细胞分裂中也可滞留于细胞质而成为微核。
(2) 染色单体交换：是两条或多条染色单体断裂后变位重接的结果。在同一染色体内的染色单体交换称为内换，在不同染色体之间的染色单体交换称为互换。
(3) 姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange,SCE)：当使用差示染色法时，可见到染色体的两条姐妹染色单体染色一深一浅。如某一染色体在姐妹染色单体间发生同源节段的内换，就会使两条姐妹染色单体都出现深浅相同的染色，但同源节段仍然是一深一浅。这种现象称为SCE。1978年ISCN(人类细胞遗传学命名国际体制)将SCE列入染色单体型畸变的范围，但其发生机理目前倾向于与染色单体断裂无关。
(二) 染色体数目异常
各种生物都有其固定的染色体数目和核型。以动物正常体细胞染色体数目2n为标准，染色体数目异常可能表现为整倍性畸变和非整倍性畸变。整倍性畸变可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变系指比二倍体多或少一条或多条染色体。例如：缺体是指缺少一对同源染色体，单体或三体系指某一对同源染色体相应地少或多一个，四体则指其比同源染色体多一对；于是在染色体数目上相应为2n-2、2n-1，2n+1和2n+2。
第二节 化学诱变的分子机理
一、直接以DNA为靶的诱变
(一) 碱基类似物取代
有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物。它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置。例如5－溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶，2－氨基嘌呤(2-AP）能取代鸟嘌呤。
(二) 烷化剂的影响
烷化剂是对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用的物质。烷化剂的种类很多，最常见的有烷基硫酸酯、N－亚硝基化合物、氮芥和硫芥等环状烷化剂和卤代亚硝基脲等。各类烷化剂其分子上的烷基各不相同，因而烷化活性有别，有一般情况下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。
目前认为最常受到烷化的是鸟嘌呤的N－7位，其次是O－6位。而腺嘌呤的N－1、N－3和N－7也易烷化。
认为鸟嘌呤的N－7位发生烷化后可导致鸟嘌呤从DNA链上脱落，称为脱嘌呤作用。致使在该位点上出现空缺，即碱基缺失，其结果是移码突变。
(三) 致突变物改变或破坏碱基的化学结构
有些化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，有时还引起链断裂。
例如，亚硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应变为次黄嘌呤和尿嘧啶。羟胺能使胞嘧啶C－6位的氨基变成羟氨基。这些改变都会造成转换型碱基置换。但是亚硝酸虽然也能使鸟嘌呤变为黄嘌呤，但是由于黄嘌呤的配对性能与鸟嘌呤一致，故并不发生碱基置换。
还有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂。
(四) 平面大分子嵌入DNA链
有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称为嵌入剂，它们多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8(102nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。如果嵌入到新合成的互补链上，就会使之缺失一个碱基；如果嵌入到模板链的两碱基之间，就会使互补链插入一个碱基。无论多或少一个碱基都造成移码突变。
二、不以DNA 为靶的间接诱变
化学物的间接诱变可能是通过对纺锤体作用或干扰与DNA合成和修复有关的酶系统。
(一) 纺锤体抑制
一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程。诱发这种作用的物质称为有丝分裂毒物，又称干扰剂。无论纺锤体是部份或完全受抑制，都称为有丝分裂效应。完全抑制时细胞分裂完全抑制，细胞停滞于分裂中期。秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，因此这种效应又称秋水仙碱效应或C－有丝分裂。有些干扰剂仅使细胞群体的有丝分裂数减少，被称之为抗有丝分裂剂。
干扰剂不直接作用于遗传物质，故严格说来并非真正的致突变物，但它同样可诱发突变，特别是诱发与遗传性疾病有密切关系的非整倍体，故引起密切注意，并作为致突变物的一个特殊类型来看待。
(二) 对酶促过程的作用
对DNA合成和复制有关的酶系统作用也可间接影响遗传物质。例如，一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏从而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸在DNA合成时的不平衡也可诱发突变。再有，铍和锰除可直接与DNA相互作用外，还可与酶促防错修复系统相作用而产生突变。
第三节 突变后果
一、体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，其次，胚胎体细胞突变可能导致畸胎，当然畸胎的发生还与亲代生殖细胞突变有关。据报道人类妊娠最初3个月自然流产中有60%有染色体畸变，在一定程度上,这是致突变物透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代的生殖细胞突变的后果。
二、生殖细胞突变的后果
如果突变发生在生殖细胞，无论是在其发育周期的任何阶段，都存在对下一代影响的可能性，其影响可分为致死性和非致死性两类。致死性影响可能是显性致死或隐性致死。显性致死即突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死需要纯合子或半合子才能出现死亡效应。
如果生殖细胞突变为非致死性，则可能出现显性或隐性遗传性疾病，包括先天性畸形。在遗传性疾病频率与种类增多的同时，突变的基因，以及染色体损伤，将使基因库的遗传负荷增加。基因库是指一种物种的群体中在生殖细胞内具有，并能传给下一代的全部基因的总和。
第四节 化学致突变物的检测
一、致突变试验
(一) 基因突变试验
1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
又称Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性。
试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。在掺入试验中，受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少有五个剂量点，并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中，混匀后铺在最低营养平皿上，37℃培养48小时，计数可见菌落数。判断阳性结果的标准是，如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并有剂量－反应关系，即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等辅助因子，作为代谢活化系统。如不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物；加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
2.哺乳动物细胞基因突变试验
哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞，OUA位点突变仅适用于CHO细胞，HGRPT和TK可分别使6－硫代鸟嘌呤(6－TG)转移上磷酸核糖及使5－溴脱氧尿苷磷酰化，它们的代谢产物可掺入DNA引起细胞死亡，因此正常细胞在含有这些硷基类似物的培养基中不能生长，在致突变物作用下此两个位点发生突变的细胞对这些硷基类似物具有抗药性，可以增殖成为克隆(细胞集落)。Na+/K+ATP酶是细胞膜上的Na+/K泵，鸟本苷可抑制此酶活性引起细胞死亡，当致突变物引起该位点突变后，Na+/K+ATP酶对鸟本苷的亲和力下降，而酶活性不变，故对培养基中的鸟本苷产生抗药性，并可增殖为克隆。
(二) 染色体畸变试验
1.染色体分析
观察染色体形态结构和数目改变称为染色体分析。在国外常称为细胞遗传学检验，但这一名称有时广义地包括微核试验和SCE试验，因为这两个试验同样也是在显微镜下观察细胞染色体的改变。
对于结构畸变，一般只观察到裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、粉碎、双或多着丝粒染色体和射体。对于缺失，除染色单体缺失外，需作核型分析。即染色体摄影拍片后，再排列进行细微观察或用电子计算机进行图象分析。对于相互易位，除生殖细胞非同源性染色体相互易位外，倒位、插入、重复等均需显带染色才能发现。
对于数目畸变，需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。但是经过一次有丝分裂后，一些结构畸变可能因遗传物质的丢失而致细胞死亡，因此不能发现。所以应安排多次收获时间，以便分别检查断裂剂的作用。收获时间的安排还应考虑外来化合物可能在细胞周期的不同时期产生作用，以及延长细胞周期的作用。
体细胞的染色体分析可作体内或体外试验，体内试验多观察骨髓细胞，体外试验常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞，例如人外周淋巴细胞。体内试验与人体实际接触情况相似，但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验由于受试物与细胞直接接触，故往往比体内试验灵敏。
2.微核试验
经致突变物作用后，染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核，称为微核。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。常用小鼠，至少设两个处理组，最高剂量为LD50/7的80%(LD50/7为在7天内使半数动物死亡的剂量)，另一组为LD50/7的40%，灌胃或腹腔注射，同时设阴性和阳性对照组，每组至少8只动物，雌雄各半。给毒方案有多种，如连续四天，每天一次。第五天处死，取骨髓，涂片，固定，染色。每鼠计数1,000个PCE的微核出现率。当经适当的统计学分析，处理组微核率显著高于阴性对照组，并呈现剂量－反应关系时，可认为受试物对该试验动物的骨髓细胞有致染色体损伤的作用。
(三) DNA损伤试验
1.姐妹染色单体交换(SCE)试验
SCE是染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换，SCE可能与DNA的断裂和重接有关，提示DNA损伤。SCE试验可分为体外试验、体内试验和体内、体外结合试验。体外SCE试验可采用贴壁生长的细胞，如CHO、V79、CHL等，也可用悬浮生长的细胞，如人外周血淋巴细胞。细胞在含5-溴脱氧尿苷(BrdU)的培养液中生长两个周期。由于Brdu是嘧啶类似物，可于合成期中掺入DNA互补链，所以在下一个中期所见染色体姐妹染色单体之间各有一条互补链掺入了Brdu，于是Brdu对称姐妹染色单体造成同等的干扰，其染色并无区别。但到了第二个周期中期相，每个染色体中只有一条染色单体保留了原来不带Brdu的模板链，而另一条染色单体则是上一周期带Brdu的互补链成为模板链。于是经两个周期的Brdu掺入互补链可使两姐妹染色单体所含Brdu量不相等，从而出现染色差别。如果Brdu仅在第1周期掺入，第2周期不掺入，则第2中期相似可见姐妹染色单体染色有差别。如果DNA单链发生了断裂，而且在修复过程中发生重排，就在第2周期可见姐妹染色单体同位节段的相互交换。经差别染色后，可观察到两条明暗不同的染色单体。若两条染色单体间发生等位交换，可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段进行识别和计数。
2.程序外DNA合成试验
基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量，这一掺入量可反映DNA损伤后修复合成的量。由于此种合成发生在DNA正常复制合成主要时期以外，故称为程序外DNA合成(unschedule DNA synthesis UDS)试验或DNA修复合成试验。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则就需要人为地将细胞阻断于G1期，使增殖同步化。然后在药物的抑制下使残存的半保留DNA复制降低到最低限度，才能避免掺入水平很高的半保留复制对掺入水平很低的程序外DNA合成的观察。
二、试验结果的评定
各种致突变试验都有其特定的观察终点，但实验结束后都面临一个共同的问题，即所取得的数据表示阳性结果或表示阴性结果。
在评定阳性或阴性之前，应首先检查实验的质量控制情况。致突变试验的质量控制是通过：① 盲法观察和② 阴性对照和阳性对照的设立。盲法观察是观察人员不了解所观察的标本的染毒剂量或组别，可免除观察人员对实验数据产生主观影响。阴性对照指不加受试物的空白对照，有时则是加入为了溶解受试物所用溶剂的溶剂对照。阳性对照是加入已知突变物的对照，对于体外试验应包括需活化的和不需活化的两种已知致突变物。空白对照应和溶剂对照的结果一致，如有显著差异则可能表明有实验误差，如溶剂对照结果显著高于空白对照则可能溶剂具有致突变性。阴性对照和阳性对照结果都应与文献报告或本实验室的历史资料一致。如差异较大也说明可能有实验误差。发现这些质量控制指标存在任何疑问时，均应查清存在的问题，并加以解决后，重新进行实验。
阳性结果应当具有剂量反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异。如果低剂量组或低、中两剂量组与对照组之间的差异有显著性，而高剂量组差异无显著性，则阳性结果不可信或无意义。此时应检查影响实验的因素，在排除影响因素后，应考虑是否为剂量反应关系曲线的特殊形式所致，即曲线上升至一定程度后下降。如怀疑及此，应当在零剂量与最高观察值的剂量之间重新设计染毒剂量。
阴性结果的判定条件是：① 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量，使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大，毒性低的化学物，在细菌试验中往往以5mg/皿作为最高剂量。② 各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外来化合物。
无论阳性还是阴性结果都要求有重现性，即重复试验能得到相同结果。
第七单元 外来化合物致癌作用及其评价第一节 概念一、直接致癌物有些致癌物可以不经过代谢活化就具有活性，称为直接致癌物。
二、前致癌物
大多数致癌物必须经过代谢活化才具有致癌活性，这些致癌物称为前致癌物。
三、近致癌物在活化过程中接近终致癌物的中间产物称为近致癌物。
四、终致癌物经过代谢转化最后产生的活性代谢产物称为终致癌物。
第二节 化学致癌物及其分类
一、化学致癌物
是指具有诱发肿瘤形成能力的化学物。
二、化学致癌物分类
致癌物可分为三大类：
遗传毒性致癌物直接致癌物
这类物质绝大多数是合成的有机物。包括有内酯类如β-丙烯内酯等；烯化环氧化物如1，2，3，4-丁二烯环氧化物；亚胺类；硫酸酯类；芥子气和氮芥；活性卤代烃类等等。
前致癌物前致癌物分为天然和人工合成两大类。
人工合成的主要有：多环或杂环芳烃类如苯并（a）芘、3-甲基胆蒽等；单环芳香胺类如邻甲苯胺等；双环或多环芳香胺类如联苯胺等；喹啉类；硝基呋喃类；硝基杂环类；烷基肼类等等。
天然物质主要有黄曲霉毒素、环孢素A、烟草和烟气、槟榔及酒精性饮料。
无机致癌物铀、镭、氡等可能由于其放射性致癌。镍、铬、钛、锰等金属及其盐类可在一定条件下致癌。
在无机致癌物中，有些能损伤DNA，但有些可能通过改变DNA聚合酶而致癌。
非遗传毒性致癌物这一类致癌物经过致突变试验证明，不能与DNA发生反应。
促癌剂如TPA是小鼠皮肤癌诱发试验的促癌剂；苯巴比妥对大鼠肝癌有促癌作用；色氨酸和糖精对膀胱癌有促癌作用；丁基羟甲苯、DDT、多卤联苯、氯丹、七氯和四氯二苯并对二恶英（TCDD）等。
细胞毒物能导致细胞死亡的物质可引起代偿性增生，以至发生肿瘤。如氮川三乙酸使锌进入肾脏，由于锌的毒性，造成细胞死亡，结果引起增生和肾肿瘤。
3．激素雌性激素和干扰内分泌器官功能的物质可引起动物肿瘤或使这些器官的肿瘤形成增多。
如孕妇使用雌性激素（已烯雌酚）保胎可能使其女儿在青春期发生阴道透明细胞癌。有些物质不是激素，但干扰内分泌系统而致癌，如3-氨基三唑诱发大鼠甲状腺肿瘤与干扰甲状腺素合成有关。
4．免疫抑制剂如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等免疫抑制剂或免疫血清均能使动物和人发生白血病或淋巴瘤，但很少发生实体肿瘤。
5．固态物质动物皮下包埋塑料后，经过较长的潜伏期，可导致肉瘤形成。石棉在人和动物的胸膜表面可引起胸膜间皮瘤。石棉和其他矿物粉尘，如铀矿或赤铁矿粉尘，可增强吸烟致肺癌的作用。
6．过氧化物酶体增生剂能使啮齿动物肝脏中的过氧化物酶体增生的各种物质都可诱发肝肿瘤。如降血脂药安妥明、降脂异丙酯、增塑剂二-苯二甲酸酯和有机溶剂1，1，2-三氯乙烯。
（三）暂未确定遗传毒性的致癌物有不少致癌物未能证明损伤DNA，但又对其作用所知有限，不足以归入非遗传毒性致癌物一类。如四氯化碳、氯仿、某些多氯烷烃和烯烃等。另外，硫脲、硫乙酰胺、硫脲嘧啶和噻吡二胺等都有致癌性。
第三节 致癌作用的影响因素联合作用
（—）致癌性的增强除促癌剂可增强致癌作用外，还有助癌剂也有这种作用。助癌剂是在接触致癌物之前或同时接触的情况下增强整个致癌过程。机理可能有：
增强致癌物的吸收；
增强遗传毒性致癌物的代谢活化或使其解毒减弱；
抑制DNA修复；
选择性增强DNA受损细胞的增殖。
同时接触或先后接触两种或多种致癌物，致癌作用有时可增强，表现为相加或协同作用，被称为共致癌作用或协同致癌作用。如二乙亚硝胺和偶氮染料都可分别诱发肝癌，同时接触则肝癌发生率相对增高。
（二）致癌性的抑制
在许多动物试验中发现非致癌物与致癌物同时存在，可出现拮抗现象。多发生于非致癌物的化学结构与致癌物相似的情况下，特别是前者的剂量远较后者为高时尤易发生。如多环芳烃经部分羟化后失去致癌活性，再与原先完整的芳烃结构物质同时存在时，将抑制后者的致癌性。拮抗作用的机理可能是：
在靶器官中发生竞争性的取代；
活化作用酶系统活力发生改变；
全身作用使解毒效果和受体比例发生改变。
营养因素蛋白质
如蛋白质含量增高，高于50%时，可减少肿瘤发生；如低于正常，对偶氮染料致癌性的易感程度增高；完全缺乏蛋白质可减少某些致癌物诱发特异器官肿瘤的可能性。
脂肪许多化学致癌物，尤其是当靶器官为大肠或激素敏感器官如乳腺、子宫内膜和前列腺等时，在动物试验中高脂肪饲料可使致癌作用增强。
碳水化合物人类结肠癌的发生与低渣易消化食物有关。动物试验证实麦麸、米糠和果胶能降低某些大肠致癌物的致癌性。高溶解度的碳水化合物可增加饲料中致癌物的吸收。
矿物质与维生素许多矿物质与维生素是体内一些酶的辅酶或辅因子，缺乏可对机体的产生影响，使之对致癌物反应异常。 如核黄素对偶氮染料诱发大鼠肝癌有影响，还与口腔的肿瘤诱发过程有关。 维生素A摄入不足使人类易患宫颈癌或膀胱癌。维生素E和其它合成抗氧化剂可减轻某些致癌物对一些靶器官诱发肿瘤。硒也有抗氧化作用，似乎也能降低肿瘤发生率。维生素C和E能防止亚硝胺和亚硝酰胺形成，可降低肝、呼吸道和上消化道的肿瘤形成。
宿主因素物种、品系和器官特异性在人和动物，肿瘤发生常存在物种差异。此种差异与生物转化的差异有关。如豚鼠对芳香胺2-AAF有抗性，其原因是该致癌物仅能小量转化为近致癌物N-羟化衍生物，而大量转化为不致癌的7-羟化衍生物。再如2-萘胺可诱导人、犬、猴和仓鼠膀胱癌，但对小鼠仅诱发肝癌和肺癌，在大鼠和兔几乎对各器官均不能诱发肿瘤。
年龄新生动物幼仔对某些致癌物比年龄较大者易感。如多环芳烃类在新生大鼠或小鼠能很快诱发肝脏肿瘤，但在初成年者则不易诱发。同样，黄曲霉毒素B1可对新生小鼠诱发肝脏肿瘤，对断奶小鼠则不能诱发。
3．性别和内分泌平衡流行病学调查发现某些肿瘤在某一性别发生较多,试验研究也同样证实这一现象。如2-AAF主要在雄性大鼠诱发肝癌；邻氨基偶氮甲苯对雌性小鼠比雄性更易诱发肝癌。
内分泌平衡的保持极为复杂，一种激素含量的改变往往引起全面重新调节，直至达到新的平衡。对于胚胎、新生儿和性成熟前期，无论动物或人，外来化合物都可对内分泌器官的分化造成永久影响，以后由于内分泌平衡失调或组织受体反应的改变而致癌。如孕妇用大量的二乙基已烯雌酚可使其女儿青春期前的阴道癌危险性增高。
第四节 化学致癌物危险评价化学致癌物危险评价包括两方面：一是定性的，即该化学物能否致癌；二是定量的，即进行剂量反应关系分析，以推算可接受的危险度的剂量，或人体实际可能接触剂量下的危险度。
由于致癌是一种后果严重的毒性效应，因此致癌性评定的工作极其复杂。需要严密设计的人群流行病调查才能判定对人的致癌性；动物试验只有长期终生试验才被公认为确切证据。这些调查和试验都不容易进行，因此先进行致突变试验，可对受试物的致癌性进行初步推测。对非遗传毒性致癌物则需要进行体外恶性转化试验和短期动物致癌试验。
构效关系分析致癌物的化学结构种类繁多，分析从一种同系物着手，找出该系物质化学结构中与致癌性关系最密切的构份，以及其他构份改变时所产生的影响。如对数百种多环芳烃类化合物的小鼠皮肤癌诱发试验结果做的构效关系分析表明，不仅化学结构的微小变化都关系着致癌性的强弱，而且与其立体结构性的变化也有密切关系。
通过致突变试验进行致癌物筛检此筛检又称为短期致癌物筛检试验。首先应明确，致突变试验是依据大多数致癌物具有致突变性而大多数非致癌物无致突变性来对受试物进行致突变检测。筛检阳性的受试物可能是具有遗传毒性的致癌物，也可能是具有遗传毒性的非致癌物；阴性的受试物可能是非遗传毒性的非致癌物，还有可能是非遗传毒性的致癌物。
试验组合根据目前对致癌机理的认识，遗传毒性致癌物可能有多种致癌机理，因此要求试验组合尽可能反映较多的遗传学终点。
致突变试验观察到的现象所反映的事件称为遗传学终点。国际环境致突变物致癌物防护委员会（ICPEMC）1983年提出把致突变试验所反映的遗传学终点分为5类：
DNA完整性的改变（形成加合物、断裂、交联）；
DNA重排或交换；
DNA碱基序列改变；
染色体完整性改变；
染色体分离改变。
其中第3实际指基因突变，而第4和第5依次指染色体结构改变和数目改变。
试验组合应反映3种或5种终点。有一种试验阳性，即可认为该受试物为致突变物，因而就可能是遗传毒性致癌物。组合中出现阳性越多，受试物致癌可能性就越大。
一般在试验组合中，每一遗传学终点只选一个试验即可。在终点相同的各种试验中应优先选择体内试验。
我国食品安全性毒理学评价程序中的致突变试验组合有体外试验和整体试验。体外试验中Ames试验为必做项目。在整体试验中，可在微核试验和骨髓细胞染色体畸变中任选一项；在显性致死试验和睾丸生殖细胞染色体畸变分析中任选一项。
（二）筛检试验的可靠性
对各种致突变试验可靠性的验证，常用一定数量的已知致癌物和已知非致癌物进行，并以灵敏度和专一性来衡量。灵敏度又称阳性符合率，即在试验中已知致癌物呈现阳性结果的比例；专一性又称阴性符合率，是在试验中已知非致癌物呈现阴性结果的比例。此外，还有准确度和预报价值来表示筛检的可靠性。
恶性转化试验又称细胞转化试验，是指对培养细胞诱发与肿瘤形成有关的表型改变。此种表型改变是因致癌物所致核型改变的结果，其改变包括细胞形态、细胞生长能力、生化表型等变化，以及移植于动物体内能形成肿瘤的能力。本试验的观察终点是恶性变的细胞，如将此种细胞移植于动物体内可形成肿瘤。
哺乳动物长期致癌试验哺乳动物长期致癌试验又称哺乳动物终生试验，是目前公认的确证动物致癌物的经典方法，较为可靠。化学致癌的一个最大特点是潜伏期长，在啮齿动物进行1至2年的试验即相当于人类大半生时间。如果用流行病学调查方法确证一种新化学物的致癌性，一般需要人类接触受试物20年后才能进行。
（一）动物选择在致癌试验中选择动物最重要的依据是对诱发肿瘤的易感性。因此，要考虑物种、品系、年龄和性别。
物种的选择对受试物有特定的靶器官时尤为重要。如大鼠对诱发肝癌敏感，小鼠对诱发肺肿瘤敏感。
品系也不同。如同是小鼠,A系及亚系诱发肺肿瘤敏感。
还应考虑自发肿瘤，应选自发率较低者。
年龄多使用断乳或断乳不久的动物，性别一般是雌雄各半。
（二）动物数量
为避免假阴性，每组动物数较一般毒性试验为多。如当对照肿瘤自发率为1%，而染毒组肿瘤发生率为20%时，每组动物需要40只才能有90%的把握度为阳性；如自发率上升为10%，或肿瘤发生率下降为10%，则每组动物需214只或114只。所以一般提出每组最少50只动物是指当对照组肿瘤自发率为1、5、10、20或30%时，染毒组肿瘤发生率应相应为20、30、40、50或60%才有0.9以上的把握度获得阳性结果。
（三）剂量设计
一般使用三个剂量。较低剂量为前一级较高剂量的1/3至1/4，最低剂量最好相当于或低于人类实际可能接触的剂量。最高剂量应为最大耐受量。理想的最大耐受量不应致死，也不引起可能缩短寿命的毒性表现和病理改变，与对照组相比体重下降不大于10%。
（四）试验期限与染毒时间
原则上试验期限要求长期或终生。一般情况下小鼠最少1.5年，大鼠2年；可能时分别延长至2年和2.5年。
一般主张一直染毒至试验结束。但也有人认为，为减少中途非肿瘤死亡，应在9至12月后即停止染毒，以便使动物可由中毒或亚中毒状态恢复，存活时间较长和存活动物也较多。对于完全致癌物无较多影响，对于促癌剂有可能出现可逆过程，以至肿瘤发生率下降。
（五）结果的观察、分析和评定
主要分析指标有：
肿瘤发生率多发性 多发性是指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。
潜伏期致癌物剂量越大潜伏期越短。可以用各组第一个肿瘤出现的时间作为该组的潜伏期。这种办法只适用于能在体表观察的肿瘤。对内脏的肿瘤，则需分批剖杀，计算平均潜伏期。
分析结果应注意有无剂量反应关系。染毒组应与对照组作显著性检验。存在剂量反应关系，并与对照组差异显著时，为阳性结果。
哺乳动物短期致癌试验是指在有限的短时间内完成而不是终生，又指观察的靶器官限定为一个而不是全部器官和组织。
小鼠肺肿瘤诱发试验一次或多次给予受试物后，或一次给予受试物一至两周后持续多次给予促癌剂，16至30周左右结束试验，如受试物具有诱发肿瘤作用，可在肺组织发现肿瘤。
大鼠肝转变灶诱发试验肝癌发生过程有几种明显的肝细胞病灶。较早发现的是转变灶，进一步发展成为瘤性结节。用酶组织化学和免疫组织化学方法将转变灶和结节中的谷氨酰转肽酶和胚胎型谷胱甘肽转移酶染色，显色表明有肝癌细胞生化表型的癌前细胞。
小鼠皮肤肿瘤诱发试验
小鼠皮肤表面涂抹某些致癌物能诱发乳头状瘤或癌，皮下注射可诱发肉瘤。一般9个月左右结束试验，如在启动后加用佛波醇酯，则缩短至20周左右。
雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验多环烃芳香胺、氯烷、亚硝基脲等能在9个月以内诱发乳腺癌。
由于肺和肝是最常见的发生肿瘤器官，也是许多致癌物的靶器官，因此小鼠肺肿瘤和大鼠肝转变灶试验的应用价值较高。
六、致癌物的最终确定
人类致癌物的确定主要根据：
流行病学调查结果能够重复；
有剂量反应关系；
有动物致癌试验阳性结果支持。
对动物致癌物的确定有的认为只有一种试验动物结果为阳性，甚至是哺乳动物短期致癌试验阳性，即可认为致癌；有的则要求在多种或多品系动物试验中，或在几个不同实验中，特别是不同剂量或不同染毒途径见恶性肿瘤发生率增高；或在肿瘤发生率、出现肿瘤部位、肿瘤类型或出现肿瘤的年龄提前等各方面极为明显突出，才能确定为动物致癌物。
第八单元 外来化合物的生殖发育毒性及其评价第一节 概念
一、生殖发育
生殖发育是哺乳动物衍繁种族的生理过程，其中包括生殖细胞（或称配子，即精子和卵细胞）发生、卵细胞受精、着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称为繁殖过程。
二、生殖毒性
外来化合物对生殖过程的损害作用，即生殖毒性。
三、发育毒性
外来化合物对发育过程的损害作用，即发育毒性。
四、生殖毒理学
主要研究外来化合物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验。
五、发育毒理学
主要研究外来化合物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。
六、外来化合物对生殖发育损害作用特点
外来化合物对生殖发育的影响以及损害作用具有一定的特点。一方面生殖发育过程较为敏感。一定剂量的外来化合物对机体其它系统或功能尚未造成损害作用，但生殖发育过程的某些环节可能己经出现障碍。另一方面外来化合物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。一般毒性作用仅表现在直接接触某种外来化合物的个体并造成损害，而外来化合物对生殖发育过程的损害，不仅直接涉及雌雄两性个体，同时还可在其第二代个体也可造成损害，而且此种损害作用甚至在第二代以后世代的个体还有所表现。
第二节 生殖毒性及其评定
一、生殖毒性表现
外来化合物对生殖过程的损害作用可以表现为性淡漠、性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变、月经失调或闭经、卵巢萎缩、受孕减少、胚胎死亡、生殖力降低、不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死、精子数目减少等。
二、生殖毒性作用的评定外来化合物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行，过去也称为繁殖试验。生殖毒性试验可以全面反映外来化合物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断奶后生长发育可能发生的影响。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育情况（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。此外还可同时观察出生幼仔是否有畸形出现，但畸形观察主要在发育毒性评定中进行。
（一）试验方法原则生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。
一般设三个剂量组，另设对照组。最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。
最高剂量组轻度中毒的概念是进食量显著减少，体重明显下降。要求最高剂量组出现轻度中毒的目的是表明在已能引起中毒剂量下，如仍不致影响正常生殖过程，则表示该受试物确实不具有生殖毒性作用。反之，如剂量过低，则难于确定受试物是否确实不具有生殖毒性，有可能因剂量不足，未达到最小有作用剂量。
剂量的确定可用少数动物进行预试，如已进行过亚慢性和急性毒性试验，则最高剂量也可略高于亚慢性毒性试验中最大无作用剂量，或相当于LD50的1/10左右。最低剂量可相当于最高剂量的1/30。如经多次试验确实证实1 000mg／kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其它剂量试验。
动物接触受试物的方式应参照人类实际接触途径。一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取；也可采用灌胃或胶囊法。试验期间每周应根据动物体重并参照进食量（大鼠可按每日15～20g，小鼠每日5～10g计算）和要求的摄入剂量（mg/kg体重／日）调整饲料中应混入受试物的数量。应始终保持达到动物应摄入的剂量。
利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各16～20只，或雌性16～20只，雄性8～10只。
（二）试验方法
现以大鼠为例，介绍三代两窝生殖试验法和两代一窝生殖试验法：
1,三代两窝生殖试验大鼠断奶或出生8周后，开始喂受试物或以其它方式与受试物接触，共进行8～12周，即直到性发育成熟，相当出生后4个月左右。每周至少称体重一次，记录进食量并观察有无中毒症状或死亡。将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比例为1：1或2：1，直到受孕或进行3周为止。雌鼠受孕后即单笼饲养，继续接触受试物。交配3周后，如仍未受孕，则停止交配，并进行生殖器官病理学检查。
确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片，检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。
亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共生出仔鼠两窝，分别为F1a 和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8 ～12周，直到性发育成熟，选出雌雄各16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a，F2a 断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b 断奶后，将F1b 淘汰。F2b 交配处理方法与F1b 相同。但F2b 也可只交配一次，所产仔鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。
2．两代一窝和一代一窝生殖试验近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一窝试验法，我国国家环境保护局《化学品测试准则（1990年）》即采用两代生殖试验或一代生殖试验。两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同，但只进行到第二代F2，每代只交配一窝。
（三）观察指标在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部生育繁殖过程，可观察下列4个指标：
1．受孕率 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况。
妊娠雌性动物数
受孕率= ———————— × 100%
交配雌性动物数
2．正常分娩率 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响。
正常分娩雌性动物数
正常分娩率= ————————× 100%
妊娠动物数
3．幼仔出生存活率 反映雌性动物分娩过程是否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在出生4天内死亡。
出生后4天存活幼仔数
幼仔出生存活率= ———————————× 100%
分娩时出生幼仔数
4．幼仔哺乳成活率 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力。
21天断奶幼仔存活数
幼仔哺乳成活率= ———————————× 100%
出生后4天幼仔存活数
第三节 发育毒性及其评定
一,基本概念
（一）发育毒性某些外来化合物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体表现可分为：
1．生长迟缓。即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下，较正常的发育过程缓慢。
2．致畸作用。由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。
3．功能不全或异常。即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。
4．胚胎或胎仔致死作用。某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增加。在一般情况下，引起胚胎或胎仔死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作用剂量，但高于致畸作用的剂量。
致畸作用是外来化合物发育毒性的一种具体表现，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程。有些文献中将致畸作用称为发育毒性，可以理解为发育毒性的侠义概念。
（二）畸形、畸胎和致畸物
器官形态的异常称为畸形。
具有畸形的胚胎或胎仔，称为畸胎。
凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物称为致畸物或致畸原。
（三）胚胎毒性作用
外来化合物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。
（四）母体毒性作用
母体毒性作用是指外来化合物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常；严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。
（五）母体毒性作用与致畸作用关系外来化合物的母体毒性作用与致畸作用的关系有下列几种：
1,具有致畸作用，但无母体毒性出现。表明此种外来化合物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意。
2．出现致畸作用的同时也表现母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系。
3．不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。
4．仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。
5．在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。此种情况并不能确定受试物确实不具致畸作用。可能是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不具有致畸作用。在对一种外来化合物进行致畸试验时，如未观察到致畸作用，也无母体毒性表现，应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论。
母体毒性与致畸作用的剂量关系之间，并无固定比值；一般情况下，致畸作用剂量较母体毒性作用剂量为低。
二、致畸作用的毒理学特点
（一）器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感
具有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。有性生殖动物由受精卵发育成为成熟个体的过程，可概括为胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育以及新生儿发育等阶段。着床前的胚胎对胚胎致死作用较为易感，对致畸作用并不如此。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易表现的发育毒性是生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生。
在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期。在常用试验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17天，小鼠器官发生期为7.5～16天，家兔为11～20天。在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常，但如在着床前胚泡形成阶段接触致畸物，则往往出现胚胎死亡，畸形极少。大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4天，开始着床日约为5.5～6天；小鼠分别为3～4天和4.5～5天；家兔分别为3～4天和7天。
同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如，以20mg/kg体重剂量环磷酰胺在受精后第8～12天期间，每日分别给予小鼠，虽然畸形多出现于前肢趾部，但畸形种类，则可因给予的日期不同而分别为多趾，并趾，缺趾和无趾。如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂。同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。
发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间。大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天之间，脑约为10天，头与脊椎骨约为11天，腭为12～13天，泌尿生殖器官约为15天。
（二）剂量与效应关系较为复杂剂量效应关系复杂的表现及原因是：
（1）机体在器官形成期间，与具有发育毒性的化合物接触，可以出现畸形，但也可引起胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但二者增强程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更较明显，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。
（2）某种致畸物可以引起一定的畸形，但在同一条件下，给予更高的剂量，并不出现同一类型畸形。可能由于较高剂量往往造成较为严重的畸形，较低剂量一般引起的轻度畸形，而严重畸形有时可将轻度畸形掩盖。例如一种致畸物在低剂量时，可以诱发多趾，中等剂量时则诱发肢长骨缩短，高剂量时可造成缺肢或无肢。
（3）许多致畸物除具有致畸作用外，还有可能同时出现胚胎死亡和生长迟缓；而且不同表现还可以相互影响，又无一定规律。
2．致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭 最大无作用剂量与100%致畸剂量之间距离较小，一般相差1倍，曲线斜率也较大。往往100%致畸剂量即可出现胚胎死亡，剂量再增加，即引起母体死亡。还有人观察到致畸作用最大无作用剂量与引起100%胚胎死亡的最低剂量仅相差2～3倍。例如剂量为5～10mg/kg体重的环磷酰胺给予受孕小鼠不表现致畸作用，但增加到40mg／kg体重，可引起100%胚胎死亡。
过低剂量不足以显示确实存在的致畸作用，可得出错误的结论；剂量过高可使大量胚胎死亡或对母体毒性作用过强，都可影响结果的正确性。另外，评定一种致畸物对人体危害时，应充分考虑人体可能实际接触的剂量。
（三）物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显
任何外来化合物的损害作用都存在物种以及个体差异，但在致畸作用中更较突出。同一致畸物在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。例如，杀虫剂西维因对豚鼠具有致畸作用，对家兔和仓鼠并不致畸。农药二嗪农和除草剂草完隆对豚鼠与家兔致畸，但对仓鼠未见致畸作用。反应停对人类以及其它灵长类动物具有强烈致畸作用，但对小鼠和家兔即使接触较大剂量，其致畸作用仍极为轻微。
种间差异既同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大。例如，脱氢皮质酮和生物染料锥虫蓝以及反应停都有这种现象。
物种及种间差异，可能由于同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异；再由于致畸物主要是通过母体胎盘作用于胚胎或胎仔，而不同物种动物胎盘构造也不相同。这些差异可能是由于遗传因素，既基因型差异。
三、外来化合物发育毒性的评价致畸作用是发育毒性中最重要的一种表现，所以外来化合物发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死。传统常规致畸试验是评定外来化合物是否具有致畸作用的标准方法，多年来很多国家和机构都采用和推荐这一方法。
（一）传统常规致畸试验（致畸试验）
1．动物选择致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。
根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数；而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。但大鼠对一般外来化合物代谢速度，往往高于小鼠和家兔，以致对化学致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性。大鼠在器官发生期初期，其胎盘具有卵黄囊，称为卵黄囊胎盘，在器官发生期后期，将转变为绒膜尿囊胎盘，有些外来化合物，例如锥虫蓝可以干扰通过卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程，并因此致畸，出现阳性结果；而人类胎盘不具有卵黄囊胎盘阶段，不存在同样问题，所以有时此种结果对人类为假阳性。
小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。
2．剂量分组
由于致畸作用的剂量效应（反应）关系曲线较为陡峭，斜率较大，最大无作用剂量与引起胚胎大量死亡以及母体中毒死亡的剂量极为接近。因此在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡；较多母体死亡也应避免。
一般应先进行预试，预试的目的是找出引起母体中毒的剂量。
根据预试结果可以确定正式试验剂量。应最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。
一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为1／100～1／30。这一原则在预试中也可试用。如已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。也有人以亚慢性毒性试验的最大无作用剂量为高剂量，并以其1／30为低剂量，可供参考。
每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。在一般常规试验中，除设有3个剂量组和一个对照组外，如受试物溶于某种溶剂或介质中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果，另设阳性对照组，按大鼠每kg体重15 000IU维生素A剂量，或将每ml含50 000IU维生素A的浓鱼肝油，按每100g体重1 ml剂量给大鼠灌胃。此外敌枯双、五氯酚钠等也可采用。
3．动物交配处理
将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涂片精子检查。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。准确确定受孕日对精确掌握动物接触受试物时间、最后处死动物及确定进行检查的日期非常重要。
由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。
大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始给予受试物，每日一次，持续到第15天。如拟深入研究何种器官对受试物更为易感，则应在上述期间将受试物每日分别给予一批动物，每批动物只接触受试物一次，最后可以根据畸形出现的情况，确定受试物的主要靶器官。
接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。
试验期间每2～3天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。
4．胎仔检查自然分娩前1～2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。
活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。
以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。
5．结果评定在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一个畸形；如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。计算时还要对剂量效应（反应）关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照组结果进行比较。
（1）活产幼仔平均畸形出现数,即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。
畸形总数
活产幼仔平均畸形出现数= ———————————
活产幼仔总数
（2）畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。
出现畸形的胎仔总数
畸胎出现率= ——————————— × 100%
活产胎仔总数
（3）母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算。
出现畸胎的母体数
母体畸胎出现率= ———————————× 100%
妊娠母体数
6．致畸物以及发育毒性作用物危险度评定
（1）欧共体（EEC）和经济合作与发展组织（OECD）建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：
1级，已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷；
2A级,对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系；
2B级,动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料；
3 级，尚无结论性肯定致畸证据或资料不足；
4级,动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸
（2）致畸指数,母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比，即母体LD50／胎仔最小致畸作用剂量。这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。
（3）相对致畸指数（RTI）：成年动物最小致死剂量（LD01）与引起5%活产胎仔出现畸形的剂量（tD05）之比值，即LD01／tD05。
（4）母体毒性与发育毒性比值：或称成年毒性与发育毒性比值，即对母体最低损害作用剂量（A）与胎仔最低损害作用剂景（D）之比（A／D）。一般认为A／D比值为3或3以上者，则具有发育毒性危险性。比值越大，危险性越高，3以下者，相对危险性较低或不具危险性。在一般情况下，大多数化合物A／D比值均在3以下，以及1～2范围内。关于母体和胎仔最低损害作用的具体表现，在母体主要为体重增长减少，出现某些临床症状以及死亡，对胎仔则为致畸以及其它发育毒性表现。
第九单元 外来化合物的免疫毒性作用及其试验方法第一节 外来化合物对免疫功能的影响
一、免疫毒理学概念
免疫毒理学（immunotoxico1ogy）是毒理学与免疫学间的边缘学科，也是毒理学的一个新分支。它主要研究外来化合物和物理因素对人和实验动物免疫系统产生的不良影响及其机理。免疫毒理学是在免疫学和毒理学的基础上发展起来的，是一门十分年轻的学科。
很多外来化合物、各种化疗药物及物理因素都会引起免疫功能产生一定的变化，而且这种变化往往在其它毒性症状之前发生。因此研究外来化合物对免疫功能的影响，一方面可对它们的毒性作出全面的评价，另外还可从免疫功能的检查中寻求外来化合物对机体损伤的早期检测指标。
很多外来化合物是一些小分子的物质，特别是金属，它们本身的分子量很小，不能引起免疫应答，但在进入机体的过程中能与某种蛋白结合形成完全抗原；抗原刺激机体产生免疫反应。这些化学物质所引起的毒性反应并不一定遵循剂量—反应关系。研究外来化合物对免疫功能的影响，有助于对其造成损害的临床表现及病理过程有进一步的了解。
二、影响免疫功能的外来化合物
许多外来化合物（药物、食品添加剂）及物理因素（电离辐射、微波、高温）等，都会引起免疫功能改变。
1,具有免疫抑制的外来化合物
（1)多卤代芳香族：多氯联苯（PCB）、多溴联苯、四氯二苯对—二恶英、六氯苯等。
（2)多环芳烃类：苯蒽、7，12—二甲基苯蒽、三甲基胆蒽、苯并(a)芘等。
（3)有机氯和有机磷农药,DDT、敌百虫、甲基对硫磷等。
（4)金属：铅、镉、砷、汞、锌、铜、甲基汞等。
（5)其它：二氧化氮、二氧化硫、一氧化碳、臭氧、氯乙烯、苯、苯乙烯等。
2,引起自身免疫的外来化合物
（1)各种药物：抗高血压剂、抗心律失常剂、抗惊厥剂、抗菌剂。
（2)各种金属：锂、金、汞、镉等。
（3)其它化学物：乙醇、氯乙烯、甲基胆蒽、苯尿噻唑等。
3,引起过敏反应的外来化合物
有抗氧化剂、抗生素（新霉素、先锋霉素、青霉素等）,氯胺T,二异氰酸酯、二氯酚、乙二胺、甲醛、金属（铂、镍、铍、汞）等。
三、外来化合物对免疫系统作用的特点反应的灵敏性
很多外来化合物对免疫系统造成不良反应的剂量往往低于它们的一般毒性作用剂量。如小鼠长期接触低剂量的甲基汞、四乙基铅和砷酸钠在表现出明显中毒反应之前，却出现免疫功能改变。又如原苏联学者研究大气和水体中化学污染物的毒性时，发现许多污染物引起变态反应的浓度比出现一般毒性作用的浓度低若干数量级。
2．反应的复杂性主要表现在免疫反应的双重性和作用的选择性。一种外来化合物对机体可产生免疫增强或免疫抑制两种效应，它取决于化学物质剂量大小、进入机体途径以及检测时间。如给抗原前给动物腹腔注射镉，可观察到动物抗体生成细胞（PFC）增加；但在给抗原后2天给镉，则PFC明显减少。氨基硫羰基咪唑啉酮在一定剂量下具有免疫抑制作用，但当剂量加大时抑制作用反而不明显。
很多外来化合物可选择性地损伤免疫反应的一个方面或是某个免疫细胞的亚类。例如皮质类固醇损伤辅助T细胞，而环孢菌素对各类T细胞均有损伤作用。环磷酰胺主要对活化增殖的细胞有毒性，而且对B细胞的毒性比T细胞大。
四、外来化合物对免疫功能影响的表现
（一）使免疫功能受到抑制或免疫缺损
很多外来化合物可对机体的免疫功能产生抑制作用，包括体液免疫功能和细胞免疫功能，抑制程度取决于接触的剂量。如苯并(a)芘、多氯联苯（PCB）、多溴联苯等。
（二）改变宿主的防御机制、降低机体抵抗力机体在接触外来化合物后，可以改变其对细菌、病毒、寄生虫以及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力，通常由于细胞介导免疫或体液免疫严重抑制而造成宿主对一些感染因子敏感性增加，抵抗力下降。
如动物接触臭氧、二氧化硫、二氧化氮、光化学烟雾、汽车废气、铅尘、氧化镍等外来化合物会造成肺部防御能力受损，表现在死亡率和杀死细菌率、细菌的繁殖及侵入血循环等方面的变化。
（三）产生变态反应
变态反应是病理性免疫反应。机体受抗原刺激后，产生异常的体液或细胞免疫反应导致生理功能紊乱或组织损伤，称为变态反应。
引起变态反应性病变的抗原物质称为变应原或过敏原。变应原可能是完全抗原，如异种血清蛋白质、微生物、霉菌、植物、花粉、皮片、尘螨等；也可是半抗原，即许多分子量较小的外来化合物如三硝基氯苯、氯化苦、镍和铂等某些金属、工业化学物氯乙烯等，它们本身没有抗原性，但当它们与某些蛋白质结合后就能起到抗原作用，毒物与蛋白结合的能力与该物质化学结构中的某些活性基团有密切关系。
化学物质引起的过敏反应有以下几个特点：①反应表现不同于该物质的一般毒性反应，组织病变不同于该物质的中毒变化，而是变态反应性炎症；②初次接触某种化学物质后经过1～2周，再次接触同一物质，反应即可出现；③不完全遵循毒理学的剂量—反应规律，很小的剂量进入机体即可致敏，再接触小量即可出现症状。
根据过敏反应出现的快慢和抗体是否存在，可将变态反应分为四型：一型是抗原进入机体后，反应即刻出现，称为速发型变态反应；另一型是抗原进入机体后1～2天反应才出现，称为迟发型变态反应，此种类型反应与致敏的淋巴细胞有关。另外还有两个中间型。
1．第Ⅰ型：速发型或反应素型 Ⅰ型变态反应是IgE介导的变态反应。其发生过程是当过敏体质的机体，初次接触过敏原后，可产生IgE 抗体，凭籍IgE Fc段，抗体结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面，使机体产生致敏状态，可维持半年至数年。当致敏的机体再次接触相同的过敏原时，过敏原即与细胞表面的IgE 结合，使细胞脱颗粒，并释放多种药理活性物质，引起毛细血管扩张、通透性增加、腺体分泌增多及平滑肌收缩为特点的病理变化。如果这种作用发生在支气管则产生支气管哮喘；如作用于皮肤可出现红肿、寻麻疹等；如作用于胃肠道则出现呕吐、腹痛、腹泻等症状。
引起Ⅰ型变态反应的过敏原很多，除常见的花粉、霉菌、动物皮片、灰尘和食物外，许多化学物质如间苯二酚、甲醛、甲苯二氰酸酯、氯化苦、某些有机氯的化合物（如六六六、DDT）和铂盐、镍盐等金属化合物。
2．第Ⅱ 型：细胞毒型或溶细胞型 Ⅱ 型变态反应是抗体（IgG或IgM）引起带抗原的组织细胞的损伤或功能障碍。IgG或IgM抗体与机体细胞（靶细胞）表面的抗原结合，通过活化补体、巨噬细胞吞噬或K细胞的抗体依赖细胞毒作用引起细胞的破坏死亡。
常见的靶细胞有红细胞、粒细胞、血小板、肾小球血管基底膜、肝细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞以及一些内分泌细胞等。长期接触铅的工人以及慢性苯中毒患者和苯接触工人可发生溶血性贫血、白细胞减少症或血小板减少性紫癜。
3．第Ⅲ型：免疫复合物型 Ⅲ型变态反应是由于抗原抗体复合物在组织中沉积而引起的炎症反应。炎症反应涉及补体的活化和嗜中性粒细胞的浸润，释放出许多水解酶并造成组织损伤。
目前有资料表明，一些毒物如汞、铅、铋、铀、金等化合物可使肾细胞发生改变，引起免疫反应，造成过敏性肾病综合征。接触高浓度氯乙烯工人也可以产生免疫复合物，这些免疫复合物可能是氯乙烯产生毒性反应的机理。
有些超敏性肺炎如“农民肺”也属于这一类型。患者死亡后肺组织免疫荧光研究表明，有免疫球蛋白的沉积和补体的沉积，因此可被视为免疫复合物病。根据不同的工作种类和不同的有机粉尘尚可发生一系列类似的肺部疾患，如“蔗糖肺”,“蘑菇工人肺”,“麦芽工人肺”,“纸浆工人肺”等。临床表现为咳喘，主要在小支气管肺泡壁形成免疫复合物，吞噬细胞对复合物吞噬并有水解酶释出，引起组织水肿、出血、坏死，形成肉芽肿。
4．第Ⅳ型：迟发型或细胞免疫型 Ⅳ型变态反应是由免疫的TD细胞与特异抗原的反应而引起组织损伤。表面具有特异性受体的致敏淋巴细胞再次与抗原相遇，引起细胞增殖，并释放淋巴因子，吸引和激活非特异性的巨噬细胞。由于细胞的增殖和浸润，可诱发迟发型变态反应。
有许多化学物质引起的迟发型变态反应，表现为接触性皮炎与湿疹，这类职业性皮炎约占整个职业性皮炎的60%。引起这类皮肤病的化学物质有镍、铬、砷、汞、松节油、润滑油、硝基萘及苯胺染料、甲醛、鞣酸、二硝基氯苯、重铬酸盐、环氧树脂、酚醛树脂等。
这类皮炎发生的机理是这些化学物质与表皮角质蛋白结合后，皮肤脂质作佐剂，使T淋巴细胞母细胞化，并在淋巴结和脾脏中增殖，这些致敏的淋巴细胞再回到血循环中，当再次接触相同致敏原，经过24小时后，可发生急性皮炎，48至96小时达到高峰。临床表现为局部皮肤发红、出现硬结和水泡。转为慢性时，局部出现湿疹及明显的苔癣样变。
铍病可出现慢性肺部肉芽肿、间质性肺炎、过敏性皮炎。接触少量铍即可发病，其临床表现与剂量无明显关系。铍中毒时可见血清丙种球蛋白含量增高，皮肤斑贴试验阳性，说明发生了迟发型变态反应。
（四）产生自身免疫反应自身免疫是指机体对自身组织成分或细胞抗原失去免疫耐受性，导致自身免疫效应细胞和／或自身抗体产生，并造成自身损伤的病理过程。自身免疫病理反应占优势导致的疾病，即自身免疫病。自身免疫病的本质属于超敏反应，与超敏反应的区别在于诱发自身免疫病的抗原来源于自身细胞或组织，并有明显的遗传倾向。
关于外来化合物引起自身免疫反应和自身免疾病，其基本病理特征为化学物质作为自身抗原，刺激机体免疫活性细胞，特别是辅助T细胞，进而激活B细胞，产生一种或多种抗自身抗体，与靶部位的自身抗原结合，形成抗原抗体复合物，导致相应的组织或器官发生结构改变和功能障碍。如氯化汞引起的自身免疫性肾炎，可见染毒鼠血清IgE 和IgG浓度显著升高，T细胞依赖性淋巴结（PLN）明显增大，脾脏 IgG 分泌细胞增多，血清抗核抗体（ANA）、抗DNA抗体和抗肾小球基底膜（GBM）抗体阳性，病理切片可见肾小球基底膜和外周血管有线状或颗粒状免疫复合物沉积。
第二节 免疫毒理试验中常用的方法
为鉴定外来化合物对免疫系统的毒性，必须建立一系列灵敏、特异、简便、快速的检测方法，大多数免疫毒理学家认为，要建立一组实验方法来评价免疫毒性。
一、病理学常规检查
病理学检查对于评价外来化合物对免疫功能的影响十分有用。外来化合物接触实验动物后，对免疫系统的毒性作用可表现为淋巴器官重量或组织学的变化、淋巴组织及骨髓的细胞量或质的变化和外周血淋巴细胞数改变。因此为了观察化学物质对免疫功能的影响，首先可对免疫器官进行大体解剖观察，如果发现胸腺重量下降和胸腺发生萎缩，就应着重检查细胞免疫功能；有人观察到动物接触已烯雌酚、TCDD或环磷酰胺，胸腺重量与细胞免疫功能状况呈很好的正相关。
二、淋巴细胞增殖反应试验
淋巴细胞增殖反应试验是测定T细胞和B细胞功能活性的简便方法，重复性也较好。
检测方法有形态学方法、同位素掺入法和颜色反应法。颜色反应法测定活细胞及增殖细胞转化程度简单、快速，在对一定数量细胞测定时，具有与同位素掺入法同样的灵敏度，是一种常用的方法。
三、体液免疫功能检测
有许多方法可用来检测体液免疫功能，包括抗体滴度、抗体形成细胞（PFC）及B细胞受体试验等。
抗体形成细胞试验是一种敏感而且常用的方法。通常用的抗原有绵羊红细胞（SRBC）、牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（0valbumin）、脂多糖（LPS）等。
用琼脂单向扩散法测定人血清免疫球蛋白的含量，虽不很敏感，但却是很常用的方法。
四、细胞免疫功能检测
细胞免疫功能主要由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。
用来测定细胞免疫功能的方法有体内法（迟发型变态反应、移植物抗宿主反应、皮肤移植排斥反应）和体外法（淋巴细胞增殖、T细胞毒性及淋巴因子的产生）。
体内检测迟发型变态反应的方法应用较广，在一般情况下迟发型变态反应可以反映机体细胞免疫状况。原理是当致敏的T细胞再次接触相应的抗原后，就能引起局部的致敏淋巴细胞释放出多种淋巴因子，导致以单核细胞浸润为主的炎症反应，表现为皮肤红肿硬结。这种反应一般在抗原注射后24～48小时可以见到。
在人体检测迟发型变态反应可采用皮试法。皮试法中所用的抗原有特异性病原微生物性抗原，如结核菌素（OT）、白喉病毒、腮腺炎病毒等；还有非特异性抗原，如二硝基氯苯、二硝基氟苯及植物血凝素等。结果判定是根据硬结的纵横直径平均值，一般在5mm以上为阳性反应。
动物迟发型变态反应检测常用绵羊红细胞（SRBC）、牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（0valbumin）等。在用绵羊红细胞作为抗原时，一般致敏剂量为l x 108个细胞，致敏注射部位可在背部皮下注射或腹腔注射，经过5天后用l x 108个／20ul的SRBC注射一侧足掌，另一侧足掌注射生理盐水。24小时后用精密卡尺测量双侧足垫的厚度，并以双侧足垫厚度的差值来表示。
五、巨噬细胞功能试验
巨噬细胞在免疫反应中具有很重要的作用，它不仅有非特异性吞噬功能，还参与细胞免疫和体液免疫。巨噬细胞有多种功能，例如吞噬作用、胞内杀伤、抗原摄取和处理、产生干扰素以及对感染细胞或恶变细胞的杀死和溶解作用等。
可通过测定体内对异物的清除率、体内和体外对细菌及细胞的吞噬作用、对肿瘤细胞的生长抑制能力来评价巨噬细胞的功能。
六,宿主抵抗力试验机体在接触化学物质后，可改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般认为，B细胞缺损，机体对细菌敏感性升高；T细胞缺损，则对病毒、寄生虫、肿瘤敏感性增高。这种试验是在动物身上进行的整体试验。
1．肿瘤细胞攻击试验 本试验用纯系小鼠观察机体对同系基因的肿瘤细胞的抵抗力。攻击所用的肿瘤细胞量是使10%～20%正常动物发生肿瘤的量。观察指标为肿瘤发生率、死亡率、发生肿瘤的平均潜伏期、肿瘤大小、结节数目以及平均死亡时间等。
2．对传染源的抵抗试验 在免疫毒性试验中常用的传染源有病毒、细菌、寄生虫。实验选用传染源时需考虑以下方面，它对人类或其它动物的危险性；动物是否易感；产生的病变是否有重复性；机体防御机制中是否需要T或B细胞参与；感染过程是否易于观察。最常用的指标是死亡率。接种剂量应相当于在正常小鼠产生死亡率为10%～20%的剂量。常用的病毒有：脑炎—心肌炎病毒（EMC病毒）、单纯疱疹性病毒（HSV）、流感A型病毒（FLU病毒）等。常用的细菌有李斯特菌和绿脓杆菌。常用的寄生虫有毛线虫和疟原虫。
第十单元 外来化合物的危险度评定及毒理学安全性评价程序第一节 概述
一、管理毒理学（regulatory toxicology）
管理毒理学是毒理学的一门新兴分支学科，其工作内容已超出了经典毒理学以及生命科学的范畴，成为具有一定综合性的科学。
在管理毒理学中，有一重要的概念与工作内容，即危险度评定（risk assessment）。危险度评定是卫生决策的主要依据。由于危险度评定使卫生决策具有充分的科学依据，因而可使卫生决策更为客观，从而减少工作中的失误。
在管理毒理学实际工作中，毒理学工作者的主要任务是提供有关化学品的毒理学资料以及危险度的评定。管理毒理学工作者则以此种资料以及化学品危险度的评定为依据，并结合其它有关因素和实际情况，制订有关管理毒理学的法规，对化学品进行卫生管理。
管理毒理学工作是一项新的工作，在我国以及其它国家都是如此，尚需在有关理论和实际工作方面，不断累积经验，充实提高。
二、国内有关有毒化学品的卫生管理法规
我国自1982年以来，也陆续制订了一些暂行规定或程序。例如，我国卫生部曾在1983年公布《食品安全性毒理学评价程序（试行）》,1985年又经修订，并正式公布[（85）卫防字第78号文件]。 1992年又对其进行修订。1982年农牧渔业部颁布《农药毒性试验方法暂行规定（试行）》，这一规定主要以《食品安全性毒理学评价程序》为基础，其中并包括《环境安全性毒理学评价程序》。中华人民共和国卫生部和农业部为了配合其它部门共同做好我国农药管理工作，于1991年6月颁布了新的《农药安全性毒理学评价程序》。该程序是在1982年颁布的《农药毒性试验方法暂行规定（试行）》和《食品安全性毒理学评价程序（试行）》的基础上，收集并参考了国内外有关农药和化学物品的管理经验和安全评价资料，较全面地考虑到农药安全性的各个方面，提出了符合农药特点的各项要求，协调了这些程序和国内现有法规的关系。在充分运用国内原有法规和经验的基础上，结合我国国情，引用国外资料制定的。在以上规定或管理法中，均要求对药品、农药、工业化学品以及用于食品接触的化学物质（如食品添加剂、食品污染物等）必须经过安全性评价，才能被允许投产、进入市场或进出口。
此外，1985年颁布的《新药审批办法》中，对药物的毒理学评价也作出了规定。1990年又公布了新药（西药）毒理研究指导原则（讨论稿）。1987年卫生部发布了《化妆品安全性评价程序和方法》规定于1987年10月1日实施，进一步加强了对化妆品的安全管理。
1990年我国国家环境保护局正式公布出版了《国家环境保护局化学品测试准则》，它是国家环境保护局对有毒化学品进行管理的标准文件。
关于工业毒物安全性评价，我国有关工业生产中新化学物质毒性鉴定规程以及工业化学物质毒性鉴定管理办法也正在制订中。
第二节 外来化合物危险度评定
一、基本概念
毒理学是研究外来化合物对生活机体的损害作用及其机理的一门科学，对所接触的外来化合物进行安全性评价是毒理学的一项重要任务。
外来化合物进行毒理学评价主要包括两部分内容。首先是在不同接触条件下，确定外来化合物对各种生物系统的毒性；然后是对人群在一定条件下接触该化学物的安全性或危险度进行评定。
外来化合物的毒性是指其自身具有的能导致机体损伤的能力。但如果接触的量低于一定水平，对机体可以不引起损害或不能观察到明显的损害作用。
外来化合物的安全性在理论上是指无危险或危险度极低，达到可以忽略的程度。但由于实验条件的限制和多种因素的影响，在毒理学安全性评定的实际工作中，不可能精确确定绝对安全的接触剂量。一般所指安全量是指在一定接触剂量和接触方式下，不致造成损害的剂量。
危险度是指从事某项活动而造成机体损伤、产生疾病或死亡的概率。
外来化合物的危险度是指化学物在一定接触条件下，对人体造成损害可能性的定量估计。此种可能性可以化学物对机体或人群造成损害程度，即发病率或死亡率进行定量地表示。
二、危险度的评定外来化合物危险度评定是以定量的概念，在人类接触环境危害因素后，对健康的潜在损害的程度进行估测或鉴定。危险度评定是对各种环境有害因素进行管理的重要依据，具有客观性、能定量及有预测性的特点。
危险度评定的内容包括四个部分：即明确外来化合物对机体损害作用的存在与否、定量评定接触剂量与损害程度关系、确定人类实际接触量和接触情况及在此接触情况下对人群危险度的估计。
外来化合物对机体损害作用的评定主要是从定性角度确定外来化合物是否可能对人类健康造成损害以及损害程度，并对损害表现的性质作出确定。确定损害作用的主要依据是通过动物毒性试验和有关人群流行病学调查的资料。
通过是否具有损害作用的确定，可以初步确定一种外来化合物对人体造成损害的可能性、损害具体表现，以及此种损害作用的性质及特点。
接触剂量与损害程度关系的确定
是从定量角度确定机体可能接触外来化合物的剂量与机体损害程度的关系。主要是利用外来化合物剂量—反应（效应）关系，进行评定，这是危险度评定中的重要部分。
通过剂量—反应（效应）关系的确定，主要是可以对在与人类可能接触的剂量下，人类可能受到损害的程度作出定量的估计。利用所求出的剂量—反应（效应）关系，可以掌握剂量—反应（效应）关系曲线的特点，是否存在阈剂量以及有关阈剂量的各种情况。
确定人类危险度中外来化合物剂量—反应（效应）关系的主要依据是在参照类似人类可能接触情况下进行动物毒性试验和有关人群流行病学调查的资料。人群流行病学调查资料较为可信，可直接运用于人群危险度的确定；动物毒性试验资料则必须进行外推处理，才能推论于人类。外推的方法多利用适当的数学模型。
3,人类实际接触量和接触情况的确定
在明确一种外来化合物对人体可能具有损害作用及其剂量—反应（效应）关系之后，必须进一步确定人类实际接触的剂量以及实际接触情况。为此应首先对人类实际接触此种化合物的总量进行测定与估算。人类实际接触量主要决定于此种化合物进入人类生活环境和生产环境的来源和数量，再根据化合物的理化性质进行估算。再有，还必须分别测定空气、水体、土壤和食物中此种化合物的含量，了解其在环境中分布的情况，有助于对人类实际接触量进行较精确估算。此外，还必须掌握全体人群的实际接触情况（包括可能接触的范围，可能受到损害的人数和程度）以及人群中各种不同群体的实际接触情况。例如职业性接触人群、日常生活接触人群、高度接触人群、老幼病弱等易感人群等的接触情况。
接触情况中包括剂量、频度（即多次接触的时间间隔）和接触的持续时间等。根据这些资料，才能全面掌握人类实际接触情况与剂量，才能对危险度作出较为准确的估计。
4,对外来化合物危险度的估计通过外来化合物对人体的损害作用及其剂量—反应（效应）关系和人类实际接触量与范围确定后，即可以上述各种参数为根据，对外来化合物的危险度，即外来化合物对人群健康损害的程度作出估计。在外来化合物危险度中应包括对接触人群总体的危险度和个体危险度。可以人群对此种外来化合物损害作用的反应率或死亡率表示，例如氯乙烯致癌作用危险度为死亡率增加41／100000，以死亡率表示的每日吸烟10支的危险度为1／400。
三、危险度评定在管理毒理学中的应用
危险度评定是对有毒化学品进行卫生管理的主要依据。在管理毒理学实际工作中，经常需要作出政策性的决定，而政策的决定主要根据危险度进行利弊权衡分析。例如，一种农药的生产使用，其有利方面是可以杀灭某些病虫害，使农作物增产；在弊的方面可由于农药的使用造成对环境的污染，引起中毒或使有关人群发病率增加。对某项政策的决定，必须权衡利害，综合考虑工农业生产需要、环境质量的保护和人民健康的保障等经济效益、社会效益以及卫生效益全面分析考虑，或利多弊少或利少弊多。如果使用一种农药可使农作物大量增产，虽有一定危险度，但不过高，即可认为利大于弊；反之，一种农药虽有杀虫效果，但不甚明显，危险度又较高，又有其它农药可以代替，则为弊大于利。据此可以决定取舍。但在实际工作中还有许多较为复杂的问题，故利和弊的权衡较为复杂，存在一定难度，并非都是如此简单明确。
外来化合物的危险度评定还可为有关卫生标准的制订提供主要依据。例如某种外来化合物在空气、水、食物中最高容许量等。通过危险度的评定还可以对环境保护和环境污染治理效果进行比较评定。
第三节 外来化合物毒理学安全性评价程序
一、基本概念
1．外来化合物安全性毒理学评价
外来化合物安全性毒理学评价是通过动物试验和对人群的观察，阐明某种外来化合物的毒性及其潜在危害，以便对人类使用这种外来化合物的安全性作出评价，并为制订预防措施和卫生标准提供理论依据。
2．外来化合物的安全性
外来化合物的安全性是指一种化合物在规定的使用方式和用量条件下，对人体健康不致产生任何损害，即不引起急性、慢性中毒，亦不致对接触者（包括老、弱、病、幼和孕妇）及其后代产生潜在危害。
对某种外来化合物进行安全性评定时，必须掌握该化合物的成分、理化性质等基本资料，动物实验资料，及对人群的直接观察资料，最后进行综合评定。所谓绝对的安全，实际上是不存在的。在掌握上述三方面资料的基础上，进行最终评价时，应全面权衡其利弊和实际的可能性，从确保发挥该物质的最大效益以及对人体健康和环境造成最小的危害的前提下作出结论。
二、安全性毒理学评价程序的原则
在实际工作中，对一种外来化合物进行毒性试验时，还须对各种毒性试验方法按一定顺序进行，即先进行何项试验，再进行何项试验，才能达到在最短的时间内，以最经济的办法，取得最可靠的结果。因此，在实际上作中采取分阶段进行的原则。即试验周期短、费用低、预测价值高的试验先安排。投产之前或登记之前，必须进行第一、二阶段的试验。凡属我国首创、产量较大、使用面广、接触机会较多、或化学结构提示有慢性毒性和／或致癌作用可能者，必须进行第四阶段的试验。
三、食品安全性毒理学评价程序程序包括四个阶段，即急性毒性试验；蓄积性毒性、致突变和代谢试验；亚慢性毒性（包括繁殖、致畸）试验；慢性毒性（包括致癌）试验。
1．第一阶段 急性毒性试验
（1）目的：①了解受试物的毒性强度和性质；②为蓄积性和亚慢性毒性试验的剂量选择提供依据。
（2）试验项目：①用霍恩氏法、机率单位法或寇氏法测定经口半数致死量（LD50）；② 7天喂养试验。
以上两个项目均分别用两种性别的小鼠和／或大鼠进行。
（3）结果判定：① LD50或7天喂养试验的最小有作用剂量小于人的可能摄入量的10倍者，则放弃不再继续试验；② 大于10倍者，可进入下一阶段试验。为慎重起见，凡LD50在1O倍左右时，应进行重复试验，或用另一种方法进行验证。
2．第二阶段 蓄积毒性、致突变和代谢试验
（1）蓄积毒性试验
① 目的：了解受试物在体内的蓄积情况。
② 试验项目：包括蓄积系数法和20天试验法。蓄积系数法是用两种性别的大鼠或小鼠，各20只。20天试验法是用两种性别的大鼠或小鼠，每个剂量组雌雄各10只。以上两种方法任选一种。
③ 结果判定：蓄积系数小于3，则放弃，不再继续试验；大于或等于3，则可进入以下的试验。如1/20 LD50组有死亡，且有剂量—效应关系，则认为有较强的蓄积作用，予以放弃；如1/20 LD50组无死亡，则可进入以下的试验。
（2）致突变试验
① 目的：对受试物是否具有致癌作用的可能性进行筛选。
② 试验项目：包括体外试验与整体试验。体外试验中Ames试验为必做项目。在整体试验中，可在微核试验和骨髓细胞染色体畸变分析试验中任选一项；在显性致死试验和睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验中任选一项。
③ 结果判定：
如三项试验均为阳性，则表示受试物很可能具有致癌作用，除非受试物具有十分重要的价值，一般应予以放弃；
如其中两项试验为阳性，则由有关专家进行评议，根据受试物的重要性和可能摄入量等，综合权衡利弊再作出决定；
如其中一项试验为阳性，则再选择两项其他致突变试验（包括体外培养淋巴细胞染色体畸变分析、DNA修复合成、DNA合成抑制、姐妹染色单体互换试验等）。如此两项均为阳性，则应予以放弃；如有一项为阳性，则可进入亚慢性毒性试验；
如此三项试验均为阴性，则可进入亚慢性试验。
（3）代谢试验 对于我国创制的化学物质，在进行最终评价时，至少应进行以下几项代谢方面的试验：①胃肠道吸收试验；② 测定血浓度，计算生物半减期和其他动力学指标；③ 主要器官和组织中的分布试验；④ 排泄（ 尿、粪、胆汁）试验。有条件时，可进一步进行代谢产物的分离、鉴定。对于国际上多数国家已批准使用和毒性评价资料比较齐全的化学物质，可暂不要求进行代谢试验。对于属于人体正常成份的物质可不必进行代谢研究。
3．第三阶段 亚慢性毒性试验
（1）目的
① 观察受试物以不同剂量水平较长期喂养，对动物的毒性作用性质和靶器官，并确定最大无作用剂量；
② 了解受试物对动物繁殖及对子代的致畸作用；
③ 为慢性毒性和致癌性试验的剂量选择提供依据；
④ 为评价受试物能否应用于食品提供依据。
（2）试验项目 包括下列4种试验：1）90天喂养试验；2）喂养繁殖试验；3）喂养致畸试验；4）传统致畸试验。
用两种性别大鼠和／或小鼠。前三项试验可用同一批动物进行。关于喂养致畸和传统致畸试验的选择，可根据受试物的性质而定。当对任何一种致畸试验的结果已能作出明确评价时，不要求作另一种致畸试验。但在结果不足以作出评价，或有关专家共同评议后认为需要时，再进行另一种致畸试验。
（3） 结果判定 如以上试验中任何一项的最敏感指标的最大无作用剂量（以mg/kg体重计）：
小于或等于人的可能摄入量的100倍者，表示毒性较强，应予以放弃；
大于100倍而小于300倍者，可进行慢性毒性试验；
大于300倍者，则不必进行慢性试验，可进行评价。
4．第四阶段 慢性毒性（包括致癌试验）试验
（1）目的 通过第四阶段试验可达到下列目的：
① 发现只有长期接触受试物后才出现的毒性作用，尤其是进行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用。
② 确定最大无作用剂量，对最终评价受试物能否应用于食品提供依据。
（2）试验项目 将两年慢性毒性试验和致癌试验结合在一个动物试验中进行。用两种性别的大鼠和/或小鼠。
（3）结果判定 如慢性毒性试验所得的最大无作用剂量（以mg/kg体重计）：
① 小于或等于人的可能摄入量的50倍者，表示毒性较强，应予以放弃；
② 大于50倍而小于100倍者，需由有关专家共同评议；
③ 大于或等于100倍者，则可考虑允许使用于食品，并制定日许量（ADI）。
如在任何一个剂量发现有致癌作用，且有剂量与效应关系，则需由有关专家共同评议，以作出评价。
