PCR 及分子标记
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps,denaturation,
primer annealing,
polymerization.
Peoples Choice Reaction
The PCR cycle
95C step to denature the duplex DNA,
An annealing step of around 55C to allow
the primers to bind,
72C polymerization step.
Mg2+,dNTPs are required in addition to
template,primers,buffer and enzyme
历史
60s-70s：基因的体外分离技术。
Khorana（ 1971）：美国 MIT教授,1968年诺贝尔医学奖得主,经过 DNA变性，与合适引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA基因,。
核酸体外扩增最早设想遗忘,
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；
当时 (1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能
Kary Mullis(1985)
发明过程
Mullis 在,偶然想出的聚合酶链反应,一文中写到,
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下,即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的,。
发展过程：
开始使用大肠杆菌 DNA聚合酶 Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性 DNA后都要重新补加。耗时、
费力、易出错。耐热 DNA聚合酶的应用使得自动化。
专利官司
1987年美国专利局专利授权
1989年,DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。 DuPont理由是,1971年 PCR 的雏形已由 Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学 Kornberg（研究 DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从 Khorana等的文章中推知如何操作 PCR。
美国专利局驳回 DuPont异议，地方法院判属 Cetus
Cetus获胜后马上反诉，指出 DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与 PCR
有关试剂和仪器
PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛
1993 年度诺贝尔化学奖,Mullis，与开创了,寡核苷酸基因定点诱变,加拿大籍英国科学家 Michael Smith共获原理类似于 DNA的体内复制。首先待扩增 DNA 模板加热 变性 解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。 这种热变性 -复性 -延伸的过程就是一个 PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
procedures
template(DNA or
RNA),
primers,
Taq enzyme,
10× PCR buffer,
Mg++,
5mmol/L dNTPs
pre-denaturation--
denature
completely
Denaturation
annealing
Elongation
cycles:25-30
Primer design
Most imp.
(1)length,20～ 30bp
(2)G+C contents:ATCG random distributed
(3)primers,no complementary sequence
(4)3‘end of the primer,no modification
(5)5‘end of the primer:product length,can be
modified
(6) specificity:less than 70% homology with non-
specific amplification sequence,or 8bp
continuous complementary base
Primer designed with
the help of computer
DNA database
conservative region comparision
primers or blast
PCR reaction components and their
functions
template,ssDNA,dsDNA
mRNA needed to be RT as cDNA
samples,from blood,sperm or any other
tissue,from older forensic specimens,from
ancient biological samples or in the lab,From
bacterial colonies or phage plaques.
DNA,very stable
primes
If the PCR product is to be cloned,it is
sensible to include the sequence of unique
restriction enzyme sites within the 5’-ends of
the primers.
Can amplify fragments over 10kb in length
Store:纯化引物在 25％乙腈溶液中 4℃ ；
冻干引物于 -20℃ 可保存 1-2年，液体状态于 -20℃ 可保存 6个月。不用时应 -20℃
保存。
buffer
10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20℃ )。
Mg2+,for Taq polymerase activity
conc.:Low:low activity
high,non-specific amplification
dNTPs：
贮备 dNTP液,1 mol/L NaOH 调 pH至中性。
贮备浓度为 5-10mmol/L，终浓度为 20-200umol/L，分装 -20℃ 保存。
4种 dNTP浓度应相同。
Taq DNA polymerase：
from thermophilic bacteria,
Taq polymerase from Thermus aquaticus.
other thermostable DNA polymerase with
greater accuracy used for certain
applications.
mineral oil
Selection for DNA polymerase
Klenow酶早期采用该酶不耐热，缺点有
①温度要求低 (37℃),受热即失活；
②产物特异性不高；
③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；
④扩增的最长序列约 400bp（ Taq酶则能扩增 10kb）
thermostable DNA polymerases
① Taq DNA polymerase
② Tth DNA polymerase— from T.thermophilus
③ VENT DNA polymerase— from T.litoralis
④ Sac polymerase
⑤ pfu polymerase
Taq DNA聚合酶
分离,1969年，美国黄石国家公园温泉
分子量,94KDa
活性,在几种水生栖热菌中活性最高,200 000U/mg
Taq DNA聚合酶离子需要,对 Mg2+,单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为 50mmol/L。
忠实性,没有校正单核苷酸错配功能 --致命弱点。一般出错率为 2× 10-4核苷酸 /每轮循环，利用 PCR克隆、测序时尤应注意。
Taq DNA聚合酶抑制剂,尿素、乙醇,DMSO,DMF、甲酰胺、
SDS 及许多其他化学药剂。
内源 DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌 DNA或 PCR产物的污染而含有不明来源的 DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。
保存,在 -20℃ 至少 6个月。
PCR optimization
变性温度和时间
92-95℃,富含 G和 C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。
退火温度与时间引物中 G,C含量高,长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常 37-55℃,
1-2分钟。
延伸温度和时间温度,72℃,接近 Taq酶的最适 75℃
时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。
循环次数循环过多，非特异性产物大量增加
PCR污染及其对策强大扩增能力 +检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性污染源的追踪
①点样器和加样器 ;② 离心机 ;③ 微解剖刀 ;④ 浓缩用具、真空瓶 ;⑤ 电泳装臵 ;⑥ 紫外灯箱 ;⑦ 乙醇或水浴锅 ;⑧ 冰箱门把手、实验台面等污染的预防
(1)隔离不同操作区
(2)分装试剂
(3)改进实验操作
(4)专用加样器
(5)结果的重演
PCR技术的应用遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症传染性疾病肝炎性病肿瘤法医学个人识别、亲子鉴定
1985年，英国遗传学家 Jeffreys采用 DNA
指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。
有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA
指纹分析,PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上 认证罪犯,亲子鉴定 以及 人的性别鉴定 中 PCR技术被普遍采用。
植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、
基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化畜 牧畜禽病诊断,猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定,牛、绵羊 Y染色体上特异
DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达,转基因鱼植物保护杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，
采用反转录 PCR（ RT-PCR）可准确快速区分其他
①考古学
②植物分类学
③群体生态学
Molecular marker
Introduction
形态标记、细胞学标记、生化标记数十种技术问世。
万变不离其宗：分子杂交,PCR扩增第一类,电泳、分子杂交为核心代表,RFLP,DNA指纹第二类,电泳,PCR为核心代表,RAPD,SSR,AFLP
第三类,DNA序列为核心代表,ITS测序分析优点
数量丰富、信息量大；
与生长发育无关，取材不受限制；
较多共显性，信息量完整
在真核生物中,基因组 DNA多态性要远远多于各种 基因 的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的 DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约
Applications
种质资源研究
品质纯度鉴定（包括 DNA指纹鉴定）
构建遗传连锁图
基因定位（ QTL）
标记辅助选择
比较基因组研究
基因克隆（图位克隆）
生物起源、进化、医学及法医学
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)
by Botstein(1980)
基本原理,物种的基因组 DNA在限制性 内切酶 作用下，
产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的 DNA作 探针,把与被标记 DNA相关的片段检测出来，
从而构建出多态性图谱。
优点,共显性，非常稳定缺点,检测步骤多，周期长，费时、费钱；
用作探针的 DNA克隆制备、保存不方便；
放射性同位素自从人的 RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、
大豆、小麦、水稻等多种生物的 RFLP图谱。
RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)
1990:
Williams(Du Pont),RAPD;
Welsh(Cal.Biology Inst.),AP-PCR(Arbitrary
Primer-PCR)
=Random Primer-PCR
=Oligo Primer-PCR
=SODA(Small Oligo DNA Analysis）
Rapid and simple
Random primer:9-10bp
与常规 PCR的不同
A.引物长度短常规 PCR中需要两个引物，长度
20-30个核苷酸。 RAPD只需一个引物，长度 9-10个核苷酸，而且是随机引物。
B.退火温度低
RAPD引物短，因此退火温度要低，
一般为 35-37℃ 。
通用性
--实验步骤少，省工、省力、进度快
--不需先知道基因组的任何分子信息
--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体 DNA研究中也可使用；
--引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有 广泛性和 通用性 。
植物分子生物学中的应用用于种属特异性鉴定外源导入基因的追踪遗传作图
RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出 RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。
鉴定染色体上特异的 DNA片段，进行基因定位和分离
RAPD易发现多态性，敏感性高。可找出与靶基因连锁的 RAPD标记，进行基因定位。
AFLP(Amplified Restriction fragment
polymorphism)
瑞士 Zabeau等 1992年发明结合了 RFLP和 PCR技术的特点,具有 RFLP技术的可靠性和 PCR 技术高效性。
基本原理,对基因组 DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。
它将 RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。
三个步骤
(1)DNA 酶切及人工接头连接，对提取 DNA质量要求较高，需避免其它 DNA 污染和抑制物质的存在；
(2) 扩增反应；
(3) 通常在 4％ -6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离特点
--理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是 无限的 。
--每次谱带在 50-100条之间，多态性检测非常有用
--呈典型的孟德尔方式遗传
--可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。
--可用于分析基因组 DNA、克隆的 DNA大片段，
— 对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，
也会得到强度一致的谱带。
缺点专利技术，试剂盒价格贵需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备基因组的不完全酶切会影响实验结果，
所以实验对 DNA纯度和内切酶的质量要求较高。
SSR（ Simple sequence Repeat ）
=(microsatellite)
=(Short Tandem Repeat,STR)
Satellite DNA,真核生物基因组酶切、离心后，在 主带附近会出现（ AT）含量很高的简单高度重复序列。
Microsatellite DNA,一类由几个核苷酸（一般 1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的 DNA序列。
继 RFLP之后的第二代分子标记多态性好、重复好、共显性标记特点微卫星 DNA广泛存在：人和动物（ TG） n，
植物（ AT） n
微卫星 DNA长度的多态性微卫星 DNA两端多是高度保守的单拷贝序列原理根据两端序列的保守性，设计引物；进行
PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性 。
applications
构建遗传连锁图种质资源鉴定标记辅助育种基因诊断与治疗：一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关。
其他
简单序列重复区间（ Inter-simple Sequence
Repeat,ISSR)
序列标记位点（ Sequence-Tagged Sites,STS)
小卫星 DNA（ Minisatellite DNA)
单链构型多态性（ Single-strand
Comformation Polymorphism,SSCP)
变性梯度凝胶电泳（ Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis,DGGE)
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps,denaturation,
primer annealing,
polymerization.
Peoples Choice Reaction
The PCR cycle
95C step to denature the duplex DNA,
An annealing step of around 55C to allow
the primers to bind,
72C polymerization step.
Mg2+,dNTPs are required in addition to
template,primers,buffer and enzyme
历史
60s-70s：基因的体外分离技术。
Khorana（ 1971）：美国 MIT教授,1968年诺贝尔医学奖得主,经过 DNA变性，与合适引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA基因,。
核酸体外扩增最早设想遗忘,
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；
当时 (1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能
Kary Mullis(1985)
发明过程
Mullis 在,偶然想出的聚合酶链反应,一文中写到,
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下,即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的,。
发展过程：
开始使用大肠杆菌 DNA聚合酶 Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性 DNA后都要重新补加。耗时、
费力、易出错。耐热 DNA聚合酶的应用使得自动化。
专利官司
1987年美国专利局专利授权
1989年,DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。 DuPont理由是,1971年 PCR 的雏形已由 Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学 Kornberg（研究 DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从 Khorana等的文章中推知如何操作 PCR。
美国专利局驳回 DuPont异议，地方法院判属 Cetus
Cetus获胜后马上反诉，指出 DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与 PCR
有关试剂和仪器
PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛
1993 年度诺贝尔化学奖,Mullis，与开创了,寡核苷酸基因定点诱变,加拿大籍英国科学家 Michael Smith共获原理类似于 DNA的体内复制。首先待扩增 DNA 模板加热 变性 解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。 这种热变性 -复性 -延伸的过程就是一个 PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
procedures
template(DNA or
RNA),
primers,
Taq enzyme,
10× PCR buffer,
Mg++,
5mmol/L dNTPs
pre-denaturation--
denature
completely
Denaturation
annealing
Elongation
cycles:25-30
Primer design
Most imp.
(1)length,20～ 30bp
(2)G+C contents:ATCG random distributed
(3)primers,no complementary sequence
(4)3‘end of the primer,no modification
(5)5‘end of the primer:product length,can be
modified
(6) specificity:less than 70% homology with non-
specific amplification sequence,or 8bp
continuous complementary base
Primer designed with
the help of computer
DNA database
conservative region comparision
primers or blast
PCR reaction components and their
functions
template,ssDNA,dsDNA
mRNA needed to be RT as cDNA
samples,from blood,sperm or any other
tissue,from older forensic specimens,from
ancient biological samples or in the lab,From
bacterial colonies or phage plaques.
DNA,very stable
primes
If the PCR product is to be cloned,it is
sensible to include the sequence of unique
restriction enzyme sites within the 5’-ends of
the primers.
Can amplify fragments over 10kb in length
Store:纯化引物在 25％乙腈溶液中 4℃ ；
冻干引物于 -20℃ 可保存 1-2年，液体状态于 -20℃ 可保存 6个月。不用时应 -20℃
保存。
buffer
10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20℃ )。
Mg2+,for Taq polymerase activity
conc.:Low:low activity
high,non-specific amplification
dNTPs：
贮备 dNTP液,1 mol/L NaOH 调 pH至中性。
贮备浓度为 5-10mmol/L，终浓度为 20-200umol/L，分装 -20℃ 保存。
4种 dNTP浓度应相同。
Taq DNA polymerase：
from thermophilic bacteria,
Taq polymerase from Thermus aquaticus.
other thermostable DNA polymerase with
greater accuracy used for certain
applications.
mineral oil
Selection for DNA polymerase
Klenow酶早期采用该酶不耐热，缺点有
①温度要求低 (37℃),受热即失活；
②产物特异性不高；
③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；
④扩增的最长序列约 400bp（ Taq酶则能扩增 10kb）
thermostable DNA polymerases
① Taq DNA polymerase
② Tth DNA polymerase— from T.thermophilus
③ VENT DNA polymerase— from T.litoralis
④ Sac polymerase
⑤ pfu polymerase
Taq DNA聚合酶
分离,1969年，美国黄石国家公园温泉
分子量,94KDa
活性,在几种水生栖热菌中活性最高,200 000U/mg
Taq DNA聚合酶离子需要,对 Mg2+,单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为 50mmol/L。
忠实性,没有校正单核苷酸错配功能 --致命弱点。一般出错率为 2× 10-4核苷酸 /每轮循环，利用 PCR克隆、测序时尤应注意。
Taq DNA聚合酶抑制剂,尿素、乙醇,DMSO,DMF、甲酰胺、
SDS 及许多其他化学药剂。
内源 DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌 DNA或 PCR产物的污染而含有不明来源的 DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。
保存,在 -20℃ 至少 6个月。
PCR optimization
变性温度和时间
92-95℃,富含 G和 C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。
退火温度与时间引物中 G,C含量高,长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常 37-55℃,
1-2分钟。
延伸温度和时间温度,72℃,接近 Taq酶的最适 75℃
时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。
循环次数循环过多，非特异性产物大量增加
PCR污染及其对策强大扩增能力 +检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性污染源的追踪
①点样器和加样器 ;② 离心机 ;③ 微解剖刀 ;④ 浓缩用具、真空瓶 ;⑤ 电泳装臵 ;⑥ 紫外灯箱 ;⑦ 乙醇或水浴锅 ;⑧ 冰箱门把手、实验台面等污染的预防
(1)隔离不同操作区
(2)分装试剂
(3)改进实验操作
(4)专用加样器
(5)结果的重演
PCR技术的应用遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症传染性疾病肝炎性病肿瘤法医学个人识别、亲子鉴定
1985年，英国遗传学家 Jeffreys采用 DNA
指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。
有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA
指纹分析,PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上 认证罪犯,亲子鉴定 以及 人的性别鉴定 中 PCR技术被普遍采用。
植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、
基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化畜 牧畜禽病诊断,猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定,牛、绵羊 Y染色体上特异
DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达,转基因鱼植物保护杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，
采用反转录 PCR（ RT-PCR）可准确快速区分其他
①考古学
②植物分类学
③群体生态学
Molecular marker
Introduction
形态标记、细胞学标记、生化标记数十种技术问世。
万变不离其宗：分子杂交,PCR扩增第一类,电泳、分子杂交为核心代表,RFLP,DNA指纹第二类,电泳,PCR为核心代表,RAPD,SSR,AFLP
第三类,DNA序列为核心代表,ITS测序分析优点
数量丰富、信息量大；
与生长发育无关，取材不受限制；
较多共显性，信息量完整
在真核生物中,基因组 DNA多态性要远远多于各种 基因 的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的 DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约
Applications
种质资源研究
品质纯度鉴定（包括 DNA指纹鉴定）
构建遗传连锁图
基因定位（ QTL）
标记辅助选择
比较基因组研究
基因克隆（图位克隆）
生物起源、进化、医学及法医学
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)
by Botstein(1980)
基本原理,物种的基因组 DNA在限制性 内切酶 作用下，
产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的 DNA作 探针,把与被标记 DNA相关的片段检测出来，
从而构建出多态性图谱。
优点,共显性，非常稳定缺点,检测步骤多，周期长，费时、费钱；
用作探针的 DNA克隆制备、保存不方便；
放射性同位素自从人的 RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、
大豆、小麦、水稻等多种生物的 RFLP图谱。
RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)
1990:
Williams(Du Pont),RAPD;
Welsh(Cal.Biology Inst.),AP-PCR(Arbitrary
Primer-PCR)
=Random Primer-PCR
=Oligo Primer-PCR
=SODA(Small Oligo DNA Analysis）
Rapid and simple
Random primer:9-10bp
与常规 PCR的不同
A.引物长度短常规 PCR中需要两个引物，长度
20-30个核苷酸。 RAPD只需一个引物，长度 9-10个核苷酸，而且是随机引物。
B.退火温度低
RAPD引物短，因此退火温度要低，
一般为 35-37℃ 。
通用性
--实验步骤少，省工、省力、进度快
--不需先知道基因组的任何分子信息
--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体 DNA研究中也可使用；
--引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有 广泛性和 通用性 。
植物分子生物学中的应用用于种属特异性鉴定外源导入基因的追踪遗传作图
RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出 RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。
鉴定染色体上特异的 DNA片段，进行基因定位和分离
RAPD易发现多态性，敏感性高。可找出与靶基因连锁的 RAPD标记，进行基因定位。
AFLP(Amplified Restriction fragment
polymorphism)
瑞士 Zabeau等 1992年发明结合了 RFLP和 PCR技术的特点,具有 RFLP技术的可靠性和 PCR 技术高效性。
基本原理,对基因组 DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。
它将 RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。
三个步骤
(1)DNA 酶切及人工接头连接，对提取 DNA质量要求较高，需避免其它 DNA 污染和抑制物质的存在；
(2) 扩增反应；
(3) 通常在 4％ -6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离特点
--理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是 无限的 。
--每次谱带在 50-100条之间，多态性检测非常有用
--呈典型的孟德尔方式遗传
--可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。
--可用于分析基因组 DNA、克隆的 DNA大片段，
— 对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，
也会得到强度一致的谱带。
缺点专利技术，试剂盒价格贵需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备基因组的不完全酶切会影响实验结果，
所以实验对 DNA纯度和内切酶的质量要求较高。
SSR（ Simple sequence Repeat ）
=(microsatellite)
=(Short Tandem Repeat,STR)
Satellite DNA,真核生物基因组酶切、离心后，在 主带附近会出现（ AT）含量很高的简单高度重复序列。
Microsatellite DNA,一类由几个核苷酸（一般 1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的 DNA序列。
继 RFLP之后的第二代分子标记多态性好、重复好、共显性标记特点微卫星 DNA广泛存在：人和动物（ TG） n，
植物（ AT） n
微卫星 DNA长度的多态性微卫星 DNA两端多是高度保守的单拷贝序列原理根据两端序列的保守性，设计引物；进行
PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性 。
applications
构建遗传连锁图种质资源鉴定标记辅助育种基因诊断与治疗：一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关。
其他
简单序列重复区间（ Inter-simple Sequence
Repeat,ISSR)
序列标记位点（ Sequence-Tagged Sites,STS)
小卫星 DNA（ Minisatellite DNA)
单链构型多态性（ Single-strand
Comformation Polymorphism,SSCP)
变性梯度凝胶电泳（ Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis,DGGE)
