酶酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。
1957巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1 分子Glc→2分子乙醇+2分子CO2 从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，生成乙醇。
1897 Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。
1913 Michaelis和Menten提出米氏学说—酶促动力学原理。
1926 Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。
1969 化学合成核糖核酸酶。
1967-1970 从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986 Cech发现四膜虫细胞大核期间26S rRNA前体具有自我剪接功能。
ribozyme, deoxyribozyme
E.coRI
5’——GAATTC——3’
3’——CTTAAG——5’
限制作用 修饰作用
5’——GAATTC——3’ 5’——GAATTC——3’
3’——CTTAAG——5’ 3’——CTTAAG——5’
酶学概论酶的生物学意义大肠杆菌生命周期20分钟，生物体内化学反应变得容易和迅速进行的根本原因是体内普通存在生物催化剂—酶。没有酶，生长、发育、运动等等生命活动就无法继续。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）
酶的概念及其作用特点酶是一种生物催化剂酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。
生物催化剂,酶(enzyme)，核（糖）酶(ribozyme)，脱氧核（糖）酶(deoxyribozyme)
酶催化反应的特点催化效率高酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反应速度几个数量级。
专一性高酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。
反应条件温和温度低于100℃，正常大气压，中性pH环境。
活性可调节根据据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子酶与非生物催化剂相比的几点共性：
①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
②不改变化学反应平衡点。
③降低反应活化能。
P234 图4-1 非催化过程及催化过程自由能的变化
④反应前后自身结构不变。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行，催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。
酶的化学本质酶的蛋白质本质经典概念：所有的酶都是蛋白质，酶是具有催化功能的蛋白质，因此酶具有蛋白质的一切共性。
酶的蛋白质组成有些酶仅由蛋白质组成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等有些酶不仅含有蛋白质（酶蛋白），还含有非蛋白质成分（辅助因子），只有酶蛋白与辅助因子结合形成复合物（全酶）才表现出酶活性，如超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）
酶的专一性由酶蛋白的结构决定，辅助因子传递电子或某些化学基团。
酶的辅助因子酶的辅助因子主要有金属离子（Fe2+、Fe3+,Cu+、Cu2+,Mn2+、、Mn3+、Zn2+、Mg2+,K+,Na+,Mo6+,Co2+等）和有机化合物。
辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基：与酶蛋白结合较紧。
酶 辅助因子
CuZn-SOD Cu2+ Zn2+
Mn-SOD Mn2+
过氧化物酶 Fe2+或Fe3+
II型限制性核酸内切酶 Mg2+
羧肽酶 Zn2+
P235 表4-1 一些酶的辅助因子（金属离子）
P237 表4-2 基团反应中的辅酶和辅基。
酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。比如，NAD+可与多种酶蛋白结合，构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。
生物体内酶种类很多，而辅助因子种类却很少，原因是一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。
ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）
1980以前，已知所有的生物催化剂，其化学本质都是蛋白质。
80年代初，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学Sidney Altman各自独立发现RNA具有生物催化功能，此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。
ribozyme种类：①自我剪接ribozyme ②自我剪切ribozyme ③催化分子间反应ribozyme
后边细讲按酶蛋白的亚基组成及结构特点分类单体酶由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子牛胰RNase 124a.a 单链鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链胰凝乳蛋白酶 三条肽链单体酶种类较少，一般多催化水解反应。
寡聚酶由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以相同或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合。
①含相同亚基的寡聚酶苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基
②含不同亚基的寡聚酶琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。
大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。
多酶复合体由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。如脂肪酸合成酶复合体。
例如：大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成
①丙酮酸脱氢酶（E1） 以二聚体存在2×9600
②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000
③二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 以二聚体存在2×56000
复合体：12个E1二聚体 24×96000
24个E2单体 24×70000
6个E3二聚体 12×56000
总分子量560万多酶融合体一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，这往往是基因融合的产物。
例如：天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双头酶）
该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶。
酶在细胞中的分布一个细胞内含有上千种酶，互相有关的酶往往组成一个酶体系，分布于特定的细胞组分中，因此某些调节因子可以比较特异地影响某细胞组分中的酶活性，而不使其它组分中的酶受影响。
1,分布于细胞核的酶核被膜 酸性磷酸酶染色质 三磷酸核苷酶核仁 核糖核酸酶核内可溶性部分 酵解酶系、乳酸脱氢酶
2,分布于细胞质的酶参与糖代谢的酶 酵解酶系
磷酸戊糖途径酶系参与脂代谢的酶 脂肪酸合成酶复合体参与a.a蛋白质的酶 Asp氨基转移酶参与核酸合成的酶 核苷激酶 核苷酸激酶
3,分布于内质网的酶
光滑内质网 胆固醇合成酶系
粗糙内质网 蛋白质合成酶系
（细胞质一侧）
4,分布于线粒体的酶外膜：酰基辅酶A合成酶内膜：NADH脱氢酶基质：三羧酸循环酶系
脂肪酸β-氧化酶系
5,分布于溶酶体的酶水解蛋白质的酶水解糖苷类的酶水解核酸的酶水解脂类的酶
6,标志酶有些酶只分布于细胞内某种特定的组分中，
核,尼克酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，功能：DNA、RNA生物合成线粒体：琥珀酸脱氢酶（电子转移、三羧酸循环）
溶酶体：酸性磷酸酶（细胞成分的水解）
微粒体：（核蛋白体、多核蛋白体、内质网）Glc-6-磷酸酶上清液：乳酸脱氢酶酶的国际分类及命名习惯命名
1961年6以前使用的酶沿用习惯命名
1.（绝大多数酶）依据底物来命名如：催化蛋白质水解的酶称蛋白酶。催化淀粉水解的酶称淀粉酶。
2,依据催化反应的性质命名如：水解酶、转氨酶
3 结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。
4,有时加上酶的来源如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶习惯命名较简单，但缺乏系统性。
国际系统命名系统名称应明确标明酶的底物及催化反应的性质。
如：草酸氧化酶（习惯名），系统名称,草酸：氧氧化酶又如：谷丙转氨酶（习惯名），系统名,丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶反应：丙氨酸+α--酮戊二酸→Glu+丙酮酸国际系统分类法及编号（EC编号）
原则：将所有酶促反应按性质分为六类，分别用1、2、3、4、5、6表示。
再根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3……，每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3……表示。
每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。
氧化还原酶类催化氧化还原反应,A·2H+B=A+B·2H
乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27）,习惯名：乳酸脱氢酶
图
转移酶类
AB+C=A+BC
Ala：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2）,习惯名,谷丙转氨酶
图水解酶类催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1）,习惯名,Ile氨肽酶。
裂合酶类（裂解酶）
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7）,习惯名：醛缩酶异构酶（EC5.3.1.9）
催化同分异构体相互转化，6-磷酸Glc异构酶合成酶（连接酶）
催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。
P241 表4-8 酶的国际分类——大类和亚类
举例：乙醇脱氢酶的分类编号是 EC1.1.1.1,乳酸脱氢酶EC1.1.1.27, 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37
第一个数字表示大类,氧化还原第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。
前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。
酶的物种和组织的差异来自不同物种或同一物种不同组织或不同细胞器的同一种酶，虽然它们催化同一个生化反应，但它们的一级结构可能不相同，有时反应机制也可能不同，可是无论是酶的系统命名法还是习惯命名法，对这些均不加以区别，而定为相同的名称，这是因为命名酶的根据是酶所催化的反应。
例如,SOD不管来源如何，均催化如下反应
2O2-+2H+→H2O2+O2 H2O2再由过氧化氢酶催化、分解它们有同一个名称和酶的编号EC1.15.1.1
实际此酶可分三类：
CuZn-SOD 真核生物细胞质中
Mn-SOD 真核生物线粒体中
Fe-SOD
即使同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。
因此，在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。
酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂、等。
酶的量度酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示酶活力与酶促反应速度酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。
酶量—酶活力一反应速度酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间
P243 图4-4 酶反应速度曲线
研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。
酶的活力单位（U）
国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25℃ pH及底物浓度采用最适条件（有时底物分子量不确定时，可用转化底物中1umol的有关基团的酶量表示）。
实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。
如,限制性核酸内切酶用粘度法测活性：定义为30℃,1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
转化率法：标准条件，5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
可见，同一种酶采用不同的测活方法，得到的酶活单位是不同的，即使是同一种测活法，实验条件稍有相同，测得的酶单位亦有差异。
如 淀粉酶，两种定义
A：1 g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。
B：l ml 2%可溶性starch,在1h内液化所需的enzyme量。
1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。
A：60/10×20×2%×1/0.5×1000=4800u/克enzyme制剂
B：60/10×20/0.5×1000=240000u/克enzyme制剂酶的比活力 Specific activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。
单位：U/mg蛋白质。
有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。
举例：一个酶的分离纯化分为4 步。
步骤 1 2 3 4
总活力（U） 6 4 3 2
总蛋白质（mg） 20 10 5 2
比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2
酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。
酶的纯化倍数：
酶的回收率,×100%
酶的转换数和催化周期分子活性定义：每mol的 enzyme 在1秒内转化substrate的 mol数。
亚基或催化中心活性定义：每mol 的active subunit或 active center 在一秒内转化的substrate 的mol 数，称为转换数Kcat
P244图表4—4
转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。
如：乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒。
底物浓度对酶促反应速度的影响单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。
1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。
底物浓度对酶促反应速度的影响——米式学说的提出
1903 Henri 研究蔗糖水解反应。
sucrose +H2O acid glucose +fructose
sucrase
酸水解
V V
[sucrose]
酶水解
V
V
[enzyme]( substrate不变) [sucrose]
底物浓度与酶促反应速度的关系：
当底物浓度不断增大时，反应速度不再上升，趋向一个极限，酶被底物饱和（底物饱和现象）。
中间产物假说：酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。
证据：（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性（3）结晶ES复合物的获得。
米式学说：
1913年，Michaelis和Menten继承和发展了中间产物学说，在前人工作基础上提出酶促动力学的基本原理，并以数学公式表明了底物浓度与酶促反应速度的定量关系，称米式学说：
米式方程的导出：
基于快速平衡假说——早年的米式方程最初，Michaelis和Menten是根据“快速平衡假说”推出米式方程。
快速平衡假说：
在反应的初始阶段，底物浓度远远大于酶浓度，因此，底物浓度{S}可以认为不变。
游离的酶与底物形成ES的速度极快，E + S ES，而ES形成产物的速度极慢，ES分解成产物P对于[ES]浓度的动态平衡没有影响，不予考虑。
K1、K2》K3
因为研究的是初速度，P的量很小，由P ES可以忽略不记。
ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S]
ES的分解速度：K2[ES]
K1（[E] - [ES]）[S] = K2[ES]
反应速度：
KS现在称为底物常数
Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：
稳态平衡假说：
[ES]的的生成与分解处于动态平衡（稳态），有时必须考虑[ES]分解成产物P对于[ES]动态平衡的影响（[ES]分解速度）。或者说，[ES]的动态平衡（分解速度）不仅与ES E+S有关，还与ES P + E有关。
稳态平衡假说的贡献在于第②点。
用稳态假说推导米式方程：
ES生成速度：
k1（[E] - [ES]）[S]
ES分解速度：
k2[ES]+k3[ES]
以上两个速度相等。
k1（[E] - [ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES]
反应速度：
Vmax=k3 [E]
Km称米氏常数，当Km及Vmax已知时，即可确定酶反应速度与底物浓度的关系。
米式方程讨论快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别
当K1、K2＞＞K3时，即ES P是整个反应平衡中极慢的一步，那么
这就是早年提出的米式方程因此说，稳态平衡 = 快速平衡 + 慢速平衡，
当ES P（即K3/K1）极慢时，稳态平衡基本等于快速平衡
Km的物理意义当反应速度v=1/2 Vmax时,Km = [S]，
Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。
单位：与底物浓度的单位一致，mol·L-1或mmol·L-1
Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。
P248 表4-5 一些酶的Km值。
Km与天然底物如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V变化越灵敏底物。
Km、Ks与底物亲和力
Km称米式常数，Km=（K2+K3）／K1,从某种意义上讲，Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
Ks称为底物常数，Ks=K2／K1，它是ES的解离常数，只反映ES解离趋势，因此，1/Ks可以表示酶与底物的亲和力大小（ES形成趋势），不难看出，底物亲和力大不一定反应速度大（产物形成趋势，K3／K1）
只有当K2、K1＞＞K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。
问题：
Km越小，底物亲和力越大（X）
Ks越小，底物亲和力越大（√）
天然底物就是亲和力最大的底物（X）
天然底物就是Km值最小的底物（√）
Km与米式方程的实际用途已知V求[S]
已知[S]求V
相对速度（酶活性中心被占据分数Y）：
当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[Et]成正比。当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一半被占据。
设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有：[S]0.8=4Km
[S]0.7=2.33Km
[S]0.6=1.5Km
[S]0.5=1Km
[S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7/[S]0.1=21
Km和Vmax的求解方法双倒数作图法要从实验数据所得到的v-[S]曲线来直接决定Vmax是很困难的，也不易求出Km值。
由米式方程两边取倒数：
将实验所得的初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]值，将1/v对1/[S]作图，得
P250 图4-6
上图[S]范围在0.330—2.0Km，最适。
若[S]范围在3.3—20 Km,直线斜率太小。
若[S]范围在0.033––0.2 Km,直线斜率太大。
如当Km=1×10-5mol/L时，实验所取底物浓度范围应在0.33×10-5－2.0×10-5mol/L。
一般选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量。
如当选[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时
1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。
反之，若选[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，
1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。
V—V/[S]作图法
P250 图4-7
多底物的酶促反应前面讨论的米氏方程（推导米氏方程时用的是单底物），适用于单底物酶促反应，如异构、水解及大部分裂合反应，不适用于多底物反应。
A、B、C表示底物，按照底物与酶的结合顺序，产物则按它们从酶产复合物中释放次序分别用P、Q、R表示。
双底物酶促反应已知有三种机理有序顺序反应机理底物A、B与酶结合的顺序是一定的，产物P、Q的释放顺序也是一定的。
P251
举例：P251 乙醇脱氢酶随机顺序反应机理底物A、B与酶结合的顺序是随机的，产物P、Q的释放顺序也是随机的。
P252
如糖原磷酸化酶乒乓反应机理先结合第一个底物A，释放第一个产物P，酶的构象发生变化，结合第二个底物B，释放第二个产物Q。
P252
举例,谷丙转氨酶
pH对酶促反应速度的影响
1,pH影响酶活力的因素
①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。
②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。
③影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。
2．酶的最适pH和稳定性pH
最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。
酶在试管反应中的最适pH与它所在细胞中的生理pH不一定完全相同，为什么？
几种酶的最适pH，见P253表4—6。
稳定性pH：在一定pH范围内，酶不会变性失活，此范围称酶的稳定性pH。
图
A．最适pH曲线：最适pH=6.8
B．稳定性pH曲线：pH5~8
曲线B：将酶在不同pH下保温，再调回pH6.8，测定反应速度。
曲线B说明，在pH6.8~8及5~6.8范围内反应速度的降低，不是由于酶蛋白变性失活造成的，而是由于酶或底物形成了不正常的解离，而在pH ＞8和pH＜5范围，则是由两种因素共同作用的结果。
虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。
P254 图4-9 酶的pH—酶活曲线温度对酶促反应速度的影响。
1．最适温度及影响因素
温度对酶促反应速度的影响有两个方面：
①提高温度，加快反应速度。
②提高温度，酶变性失活。
这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。最适温度就是这两种因素综合作用的结果。
温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1~2。
温血动物的酶，最适温度35℃ —40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌Taq DNA聚合酶70℃。
2．酶的稳定性温度在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。
酶的稳定性温度有一定的时间限制。
稳定性温度范围的确定方法：将酶分别在不同温度下预保温一定时间，然后回到较低温度（即酶的热变性失活作用可忽略的温度），测酶活性。
图酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温（几个月）。
②干粉，可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中。
酶浓度对酶促反应速度的影响如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
Vmax = K3 [E]
[S]过量且不变时，v∝[E]。
激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。activator
激活剂作用包括两种情况：
一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。
另一种是激活酶原，无活性→有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。
无机离子的激活作用
（1）金属离子：K+,Na+、Mg2+,Zn2+、Fe 2+,Ca2+
（2）阴离子：cl-、Br -
（3）氢离子许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。
有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。
有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。
注意：
无机离子的激活作用具有选择性，不同的离子激活不同的酶。
不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+，但Mg+与Zn+常可替代。
激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM
简单有机分子的激活作用
①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。
②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。
抑制剂对酶促反应速度的影响酶是protein,凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。（不可逆抑制、可逆抑制）
抑制剂（inhibitor）：不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）发生变化，引起酶活性下降，甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。
研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：
药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药对生物体的代谢途径进行认为调控，代谢控制发酵研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础不可逆抑制作用（非专性必、专一性）
抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析法除去抑制剂。
非专一性不可逆抑制剂此类抑制剂可以和一类或几类基团反应。它们不但能和酶分子中的必需基团作用，同时也能和相应的非必需基团作用。
酰化剂二异丙基磷酰氟酯（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药都属于磷酰化剂，能与酶活性中心Ser的—OH结合，抑制某些蛋白酶及酯酶。这类化合物的作用机理是强烈地抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱。乙酰胆碱的堆积，引起一系列神经中毒症状。
Ｐ258 结构式：磷酰化剂与DFP
P259 反应式：磷酰化剂与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶
解毒剂：PAM（解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。
烷化剂许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化
P259 反应式：对氯汞苯甲酸与巯基酶的反应
有机汞、有机砷化合物和重金属还可以与还原型硫辛酸（人体重要的辅酶）反应解毒剂：二巯基丙醇氰化物与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。
重金属
Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。
还原剂以二硫键为必需基团的酶，可以被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。
含活泼双键试剂（与—ＳＨ、—ＮＨ２反应）
Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺
图亲电试剂四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。
图专一性不可逆抑制此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。
Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂不仅具有与底物相似的、可与酶结合的基团，同时还有一个能与酶的其它基团反应的活泼基团。
专一性：抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。
举例：
胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。
《酶学》P119
最佳底物 TPCK
-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于远离-CH2-cl，则不被烷基化。
Kcat型专一性不可逆抑制剂这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latent reactive group），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。
举例1：
β-羟基癸酰硫酯脱水酶的Kcat型不可逆抑制剂：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R
此酶催化的反应：
P260反应式
当有Kcat抑制剂时，此抑制剂被催化生成连丙二烯结构，连丙二烯易与His咪唑反应，使酶失活。
P261反应式
举例2：
以FMN（黄素单核苷酸）、FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）为辅基的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂；炔类化合物。
迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，是治疗高血压的良药。
图
单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺）
图
由于迫降灵能抑制单胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，因而有降血压的作用。
Kcat型专一性不可逆抑制剂的专一性很强，近来已设计出多种酶的Kcat逆制剂，在医疗方面起到很大作用。
可逆抑制作用 Reversible Inhibition
此类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。
竞争性抑制（Competitive inhibition）
抑制剂与底物竞争酶的活性中心。
竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。
P258 图4-11 酶与底物及竞争性、非竞争性抑制剂结合的模型
举例1：丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶
举例2：磺胺类药物及其作用机理磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病。
磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶
P261 结构式：对氨基苯甲酸 对氨基苯磺酰胺 叶酸
磺胺类药物的药理（对氨基苯磺酰胺）：
嘌呤核苷酸的合成必需要由四氢叶酸（辅酶）提供一碳单位；四氢叶酸可由二氢叶酸或叶酸转化而成；二氢叶酸是在二氢叶酸合成酶作用下，利用蝶呤、对氨基苯甲酸及Glu合成。
动物体内的叶酸可从食物中获取，细菌体内的叶酸只能在二氢叶酸合成酶作用下，利用对氨基苯甲酸合成。
如果动物体内含有大量的对氨基苯磺酰胺，可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制细菌二氢叶酸合成。
非竞争性抑制特点：抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。
酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。显然，不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。
非竞争性抑制剂多是与酶活性中心之外的巯基可逆结合，包括某些含金属离子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+）和EDTA，。
反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I ≠ P
可逆抑制作用的动力学用书上P263-266的方法可推出三种抑制方程。
竞争性抑制,
动力学方程：
竞争性抑制曲线:
P263 图4-12竞争性抑制曲线
竞争性抑制作用小结：
Vmax不变，Km变大。要达到同一个给定的Vmax分数，必须要有比无抑制剂时大得多的底物浓度。
竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]、[S]、Km和Ki
A,[I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。
B,[S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加）。
C,Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大，Ki越大，抑制作用越小。
D,[I]=Ki时，所作双倒数图直线的斜率加倍。
E,在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。
非竞争性抑制动力学方程：
相对速度：
抑制分数：
非竞争抑制曲线：
P265 图4-13
非竞争性抑制剂可使酶促反应的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki），而对Km无影响。它对酶促反应的抑制程度决定于[I]和Ki,与酶的Km和[S]无关。
反竞争性抑制动力学方程：
相对速度：
抑制分数,
P265 图4-14 反竞争抑制曲线
在反竞争性抑制作用下，Km及Vmax都变小，且Km’<Km
P266 表4-7 小结,三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值有机介质中的酶促反应（只是一部分酶）
传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。
其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。
优点,①利于疏水性底物的反应。
②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。
③能催化在水中不能进行的反应。
④可改变反应平衡移动方向。
⑤可控制底物专一性。
⑥防止由水引起的副反应。
⑦可扩大pH值的适应性等等。
有机介质中酶促反应的条件必需水（结合水）
酶催化活性所必需的构象，是由水分子直接或间接地通过氢键等非共价相互作用来维持的，因此只有与酶分子紧密结合的单层水分子，对酶的催化活性才是至关重要的。
这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。
酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关，只要必需水不丢失，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍然保持其催化活性。
因此，可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。
一个干燥的酶水合,吸附水量：
酶分子表面电荷基团,0-0.07g/g (水/酶)
酶分子表面极性基团,0.07-0.25g/g
弱极性、非极性基团,0.25-0.28g/g
表面完全水化，被一层水分子包围。
酶的必需水含量因酶而异。
脂肪酶：几个水分子/每个酶分子胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子对酶的要求具有对抗有机介质变性的经能力。
合适的溶剂及反应体系合适的pH
保证有机介质中酶的微环境具有最适pH值。酶应从具有最适pH值的缓冲液中冻干或沉淀出来。
有机介质对酶性质的影响稳定性大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。
a,热稳定性提高例如：猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍
b,储存稳定性提高胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。
活性
有两类影响 升高活性
降低活性酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。
专一性某些有机溶剂会使某些酶的专一性发生变化，如脂肪酶在有机介质中有合成肽键的功能。星号活力（第二活力）。
反应平衡有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。
例如：水解酶类（蛋白水解酶）
在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向，
如在含水量极低的有机介质中，平衡向含成方向偏移。
实例：（酶） 合成）产物 溶剂 合成收率
枯草杆菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油90% 50%
无色杆菌蛋白酶 胰岛素 乙醇30% 80%
凝血酶 人生长素 甘油80% 20%
分子印迹和pH记忆酶在冻干前可用配体作印迹。
竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性构象，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
pH记忆：
酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。
酶的作用机理专一性的机理酶专一性类型一般说来，一种分子能成为某种酶的底物，必须具备两个条件：
分子上有被酶作用的化学键。
分子上有一个或多个结合基团能与酶活性中心结合。
结构专一性键专一性（对底物结构要求最低）
酶只对其作用的的键有要求，而对键两侧基因无特殊要求。
如：酯酶可催化酯键水解，R—CO—OR’,对R和R’无要求，但不同底物水解速度不同。又如：磷酸酯酶可水解各种磷酸酯分子。
基团专一性Group Specificity
酶不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。
如：α—D—Glc苷酶，不仅要求作用的键是α—糖苷键，且要求此键一端必须是Glc残基，对此键另一端基团无要求，如此酶可水解蔗糖和麦芽糖。
以上（1）、（2）两类称为相对专一性
P268 表4—9消化道中蛋白酶的专一性
绝对专一性酶只能作用于一个底物，或只催化一个反应。
如：大麦芽中的麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解。
立体异构专一性旋光异构专一性当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种异构体，它是酶促反应中相当普遍的现象。
如：Glu脱氢酶只作用L—Glu，乳酸脱氢酶只作用L —乳酸。
几何异构专一性顺式反式异构体。
如：反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸，对顺丁烯二酸无作用。
立体化学专一性还表现在酶能区分从有机化学观点看属于对称分子中的两个等同的基团，只催化其中一个，而对另一个无作用。
例如：a.甘油在甘油激酶的催化下只有一个CH2OH基能被磷酸化。
b.糖代谢中的顺一乌头酸酶作用于柠檬酸时，两个CH2COOH对酶来说是不同的。
图立体专一性在实践中的应用：（1）药物的构效关系（2）立体异构性药物和其它化合物的酶法不对称合成或拆分。
用乙酰化酶制备L—氨基酸：有机合成的D、L—a.a乙酸化，然后用乙酰化酶使L—a.a水解出来。
酶作用专一性的解释三点结合及锁钥模型（刚性模板学说）
底物结合部位由酶分子表面的凹槽或空穴组成，这是酶的活性中心，它的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，可专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物，同时酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。
三点结合学说指出，底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。
P270、图4—16、4—17
刚性模板学说较好地解释了立体专一性，但不能解释酶专一性中所有的现象，如既能催化正反应，又能催化逆反应；那么，酶的结构不可能既适合于底物又适合于产物。
诱导楔合模型酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。
P271 图4—18
高效性的机理邻近效应与定向效应酶把底物分子（一种或两种）从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
两种效应对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高甚至比溶液中高10万倍，提高反应速度。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用举例：酚羟基和羧基环化成内酸
图
3个CH3固定了-OH和-COOH的相对方位。
③酶使分子间反应转变成分子内反应反应速度提高：107
图
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用酶底复合物寿命比一般双分子相互碰撞的平均寿命长，前者10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了产物形成的机率。
扭曲变形和构象变化的催化效应酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。
P276 图4-20
环状反应物I水解开环，环扭曲能量大量释放，加速反应。
底物与酶蛋白接触，加速反应。
①酶从低活性形式转变为高活性形式
②底物扭曲、变形
③底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。
共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。
①亲核共价催化丝氨酸羟基、Cys的-SH、His的咪唑基。
举例：咪唑基催化对硝基苯乙酸酯水解。
图
②亲电共价催化
亲电基团攻击底物的富电子基团例：Asp转氨酶催化Asp 转氨反应
图
P278 表4-13 形成共价ES复合物的某些酶酸碱催化酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
参与酸碱催化的基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。
P279 表4-14 酶分子中可作为广义酸碱的功能基团
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度，咪唑基在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快
①酸催化酯、酰胺和肽的水解
图
过程：共轭酸与＞C=0氧形成氢键，使＞C=0碳带更多正电荷，更易吸引H2O分子上的氧，降低＞C=0碳与H2O氧形成共价键的活化能；接着，共轭酸将H+转移给＞C=0氧，自己成为共轭碱，并从H2O分子吸引一个H+,回复原状。
②碱催化酯、酰胺水解
图
过程：共轭碱先与H2O中H形成氢键，使H2O中氧的电负性增强，更易对＞C=0碳进行亲核进攻，降低碳氧键生成的活化能。
活性中心的微环境
⑴ 疏水环境酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。如溶菌酶Asp52带负电荷，可以稳定过渡态的正离子。
酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。
某些酶的活性中心及其作用机理酶的活性中心活性中心的概念对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团，它们在一级结构上相距可能很远，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。
对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。
一般认为，活性中心有两个功能部位：底物结合部位，催化部位活性中心外的部位为活性中心的形成提供了结构基础 。
活性中心的氨基酸残基有七种a.a在酶活性中心出现的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的a.a残基往往分散在相互较远的a.a顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，如α-胰凝乳蛋白酶活性中心的几个a.a残基，分别位于B、C两个肽链上，靠分子空间结构的形成，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
酶分子a.a残基分类
（1）接触残基它们与底物接触，参与底物的化学转变，此类a.a残基的一个或几个原子与底物分子中一个或几个原子的距离都在一个键距离之内（1.5-2A）。
它们的侧链起与底物结合作用的称为结合基团，起催化作用的称为催化基团。
（2）辅助残基它不与底物接触，而是在使酶与底物结合及协助接触残基发挥作用方面起作用。
上述两类残基构成酶活性中心。
（3）结构残基在维持酶分子正常三维构象方面起重要作用，它们与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基上述三类残基统称酶的必需基团，若被其它a.a取代，往往造成酶失活。
（4）非贡献残基（非必需基团）
它们对酶活性的显示不起作用，可由其它a.a代替，且在酶分子中占很大比例。
它们可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。
结合底物作用（结合残基）
接触残基
活性中心 催化作用（催化基团）
必需基团 辅助残基
活性中心外（结构残基）
酶蛋白
非必需基团活性中心区域的一级结构由于一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理极其相似，可把它们归为一族。
蛋白水解酶就有几个族：
（1）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）
（2）锌蛋白酶（羧肽酶等）
（3）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶等）
（4）羧基蛋白酶（胃蛋白酶等）
在同一族酶中，活性中心一级结构的a.a顺序极相似。
酶 a.a顺序胰蛋白酶（牛） Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys
胰凝乳蛋白酶（牛） Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn
弹性蛋白酶（猪） Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn
凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro
这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽：
…Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro…
同源的趋异进化来自胰脏的胰凝乳蛋白酶（Phe,Tyr,Trp、）、胰蛋白酶（Lys、Arg ）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的a.a顺序相同，且分子一级结构中有40%a.a顺序相同，三维结构也相同，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同。
这种来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。
异源的趋同进化来自枯草杆菌的Ser蛋白酶的结构与上述三种酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a顺序也不同（-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser）。
电荷中继网的位置也不同：
Asp102-His57-Ser195（胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶）
Asp32-His64-Ser221（枯草杆菌蛋白酶）
这表明枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶等三个酶来源不同，但它们的电荷中继网相同，功能相同，这种情况称异源的趋同进化。
判断和研究活性中心的主要方法
（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法酶作用机理举例胰凝乳蛋白酶的作用机理：
专一性
图
该酶需要底物有一个疏水基团结合于酶上的疏水部位，这个结合起定位作用，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
催化机理
① 活性中心：Ser195—His57—Asp102，三者构成一个氢键体系，His57的咪唑基是Ser195的羟基和Asp102的羧基之间的桥梁，这个氢键体系称为电荷中继网（harge relay network）。通过电荷中继网，进行酸碱催化及共价催化。Ser195由于His57和Asp102的影响而成为很强的亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。
ＰP285 图4-27，P287 图4-30 胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网
② 胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程
P288 图4—31胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程
第一阶段 酰化
Ser195 --OH 中的氧攻击肽键的羰基碳，形成四联体过渡态（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑），敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段 脱酰电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，结果底物中的酸成分从Ser195上释放。
除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser电荷中继网的还有胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶等，但它们的底物结合部位不同，底物专一性也不同。
P288 图4-32三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部位
胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 弹性蛋白酶可供芳香环及大 可供带电荷的 只能让Ala等小分子的非极性侧链伸入 Lys.、Arg进入 进入多酶体系与酶活性的调节控制多酶体系多酶体系及其分类细胞中的许多酶，常常在一个连续的反应链中起作用，前一个反应的产物是后一个反应的底物。
多酶体系：multienzyme system在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。
可分为三种类型：可溶性的（分散性的），结构化的（多酶复合体），在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）。
P297 图4—42（分散性的多酶体系） 图4-43 （多酶复合体）
多酶体系的自我调节
（1）大部分具有自我调节能力的多酶体系，第一步反应就是限速步骤，它控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有时则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活
P299 图4-45反馈抑制与底物激活
正调节物：一般是别构酶的底物，可以激活别构酶。
负调节物：可以抑制别构酶，一般是代谢序列的最终产物。
通过多酶体系的自我调节（反馈抑制和底物激活），可使代谢过程得以协调地、有条不紊地合理进行。
下面讨论具体到每个酶是怎样调节的酶活性的调节控制和调节酶调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价调节酶。
别构效应的调控别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。
别构酶的结构特点和性质已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。
别构酶的动力学曲线
① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线
P303 图4-46 4-47
这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1=3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。
当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。
② 同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线
P304图4-48
负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感别构酶调节活性的机理
① 序变模型：
酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。
② 齐变模型：
别构酶的鉴定
S型曲线是必要但不充分条件脱敏作用
[S]0.9／[S]0.1
Rs=81 米氏酶
Rs＜81 正协同
Rs＞81 负协同
④ Hill系数法可逆共价修饰的调控（共价调节酶）
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶
P313 图4-57
信号的级联放大：
1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a
1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G
共价调节酶的两种常见类型
①磷酸化 去磷酸化 -OH ATP
②腺苷酰化 脱腺苷酰化 腺苷酰基由ATP提供酶原的激活具有不可逆性。属于此类的有消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）
P314 图4-58
胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活
肠激酶
胰蛋白酶原 胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶原 弹性蛋白酶原
胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶
羧肽酶原 羧肽酶专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特异的酶活性酶与抗体——抗体酶 abzyme(antibody enzyme)
参阅 P293
又称催化性抗体（catalytic antibody），是一种具有催化功能的抗体分子。
过渡态理论：酶与底物不是在基态，而是在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
而抗体与抗原是基态结合。
同工酶、诱导酶同工酶能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构不同的一组酶，存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。
哺乳动物乳酸脱氢酶有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+ LDH CH3COCOO-+NADH+H+
均由4个亚基组成
HHHH 在心肌中占优势
HHHM
HHMM
HMMM
MMMM 在骨骼肌中占优势诱导酶酶可相对地区分为结构酶和诱导酶。
结构酶：指正常细胞内存在的酶，它的含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
如：大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
E.coli在含Glc的培养基中
E.coli在只含乳糖的培养基中：Glc-β(1→4)Gal苷酶工程
计划：8学时
1957巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1 分子Glc→2分子乙醇+2分子CO2 从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，生成乙醇。
1897 Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。
1913 Michaelis和Menten提出米氏学说—酶促动力学原理。
1926 Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。
1969 化学合成核糖核酸酶。
1967-1970 从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986 Cech发现四膜虫细胞大核期间26S rRNA前体具有自我剪接功能。
ribozyme, deoxyribozyme
E.coRI
5’——GAATTC——3’
3’——CTTAAG——5’
限制作用 修饰作用
5’——GAATTC——3’ 5’——GAATTC——3’
3’——CTTAAG——5’ 3’——CTTAAG——5’
酶学概论酶的生物学意义大肠杆菌生命周期20分钟，生物体内化学反应变得容易和迅速进行的根本原因是体内普通存在生物催化剂—酶。没有酶，生长、发育、运动等等生命活动就无法继续。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）
酶的概念及其作用特点酶是一种生物催化剂酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。
生物催化剂,酶(enzyme)，核（糖）酶(ribozyme)，脱氧核（糖）酶(deoxyribozyme)
酶催化反应的特点催化效率高酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反应速度几个数量级。
专一性高酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。
反应条件温和温度低于100℃，正常大气压，中性pH环境。
活性可调节根据据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子酶与非生物催化剂相比的几点共性：
①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
②不改变化学反应平衡点。
③降低反应活化能。
P234 图4-1 非催化过程及催化过程自由能的变化
④反应前后自身结构不变。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行，催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。
酶的化学本质酶的蛋白质本质经典概念：所有的酶都是蛋白质，酶是具有催化功能的蛋白质，因此酶具有蛋白质的一切共性。
酶的蛋白质组成有些酶仅由蛋白质组成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等有些酶不仅含有蛋白质（酶蛋白），还含有非蛋白质成分（辅助因子），只有酶蛋白与辅助因子结合形成复合物（全酶）才表现出酶活性，如超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）
酶的专一性由酶蛋白的结构决定，辅助因子传递电子或某些化学基团。
酶的辅助因子酶的辅助因子主要有金属离子（Fe2+、Fe3+,Cu+、Cu2+,Mn2+、、Mn3+、Zn2+、Mg2+,K+,Na+,Mo6+,Co2+等）和有机化合物。
辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基：与酶蛋白结合较紧。
酶 辅助因子
CuZn-SOD Cu2+ Zn2+
Mn-SOD Mn2+
过氧化物酶 Fe2+或Fe3+
II型限制性核酸内切酶 Mg2+
羧肽酶 Zn2+
P235 表4-1 一些酶的辅助因子（金属离子）
P237 表4-2 基团反应中的辅酶和辅基。
酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。比如，NAD+可与多种酶蛋白结合，构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。
生物体内酶种类很多，而辅助因子种类却很少，原因是一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。
ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）
1980以前，已知所有的生物催化剂，其化学本质都是蛋白质。
80年代初，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学Sidney Altman各自独立发现RNA具有生物催化功能，此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。
ribozyme种类：①自我剪接ribozyme ②自我剪切ribozyme ③催化分子间反应ribozyme
后边细讲按酶蛋白的亚基组成及结构特点分类单体酶由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子牛胰RNase 124a.a 单链鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链胰凝乳蛋白酶 三条肽链单体酶种类较少，一般多催化水解反应。
寡聚酶由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以相同或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合。
①含相同亚基的寡聚酶苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基
②含不同亚基的寡聚酶琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。
大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。
多酶复合体由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。如脂肪酸合成酶复合体。
例如：大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成
①丙酮酸脱氢酶（E1） 以二聚体存在2×9600
②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000
③二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 以二聚体存在2×56000
复合体：12个E1二聚体 24×96000
24个E2单体 24×70000
6个E3二聚体 12×56000
总分子量560万多酶融合体一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，这往往是基因融合的产物。
例如：天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双头酶）
该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶。
酶在细胞中的分布一个细胞内含有上千种酶，互相有关的酶往往组成一个酶体系，分布于特定的细胞组分中，因此某些调节因子可以比较特异地影响某细胞组分中的酶活性，而不使其它组分中的酶受影响。
1,分布于细胞核的酶核被膜 酸性磷酸酶染色质 三磷酸核苷酶核仁 核糖核酸酶核内可溶性部分 酵解酶系、乳酸脱氢酶
2,分布于细胞质的酶参与糖代谢的酶 酵解酶系
磷酸戊糖途径酶系参与脂代谢的酶 脂肪酸合成酶复合体参与a.a蛋白质的酶 Asp氨基转移酶参与核酸合成的酶 核苷激酶 核苷酸激酶
3,分布于内质网的酶
光滑内质网 胆固醇合成酶系
粗糙内质网 蛋白质合成酶系
（细胞质一侧）
4,分布于线粒体的酶外膜：酰基辅酶A合成酶内膜：NADH脱氢酶基质：三羧酸循环酶系
脂肪酸β-氧化酶系
5,分布于溶酶体的酶水解蛋白质的酶水解糖苷类的酶水解核酸的酶水解脂类的酶
6,标志酶有些酶只分布于细胞内某种特定的组分中，
核,尼克酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，功能：DNA、RNA生物合成线粒体：琥珀酸脱氢酶（电子转移、三羧酸循环）
溶酶体：酸性磷酸酶（细胞成分的水解）
微粒体：（核蛋白体、多核蛋白体、内质网）Glc-6-磷酸酶上清液：乳酸脱氢酶酶的国际分类及命名习惯命名
1961年6以前使用的酶沿用习惯命名
1.（绝大多数酶）依据底物来命名如：催化蛋白质水解的酶称蛋白酶。催化淀粉水解的酶称淀粉酶。
2,依据催化反应的性质命名如：水解酶、转氨酶
3 结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。
4,有时加上酶的来源如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶习惯命名较简单，但缺乏系统性。
国际系统命名系统名称应明确标明酶的底物及催化反应的性质。
如：草酸氧化酶（习惯名），系统名称,草酸：氧氧化酶又如：谷丙转氨酶（习惯名），系统名,丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶反应：丙氨酸+α--酮戊二酸→Glu+丙酮酸国际系统分类法及编号（EC编号）
原则：将所有酶促反应按性质分为六类，分别用1、2、3、4、5、6表示。
再根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3……，每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3……表示。
每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。
氧化还原酶类催化氧化还原反应,A·2H+B=A+B·2H
乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27）,习惯名：乳酸脱氢酶
图
转移酶类
AB+C=A+BC
Ala：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2）,习惯名,谷丙转氨酶
图水解酶类催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1）,习惯名,Ile氨肽酶。
裂合酶类（裂解酶）
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7）,习惯名：醛缩酶异构酶（EC5.3.1.9）
催化同分异构体相互转化，6-磷酸Glc异构酶合成酶（连接酶）
催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。
P241 表4-8 酶的国际分类——大类和亚类
举例：乙醇脱氢酶的分类编号是 EC1.1.1.1,乳酸脱氢酶EC1.1.1.27, 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37
第一个数字表示大类,氧化还原第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。
前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。
酶的物种和组织的差异来自不同物种或同一物种不同组织或不同细胞器的同一种酶，虽然它们催化同一个生化反应，但它们的一级结构可能不相同，有时反应机制也可能不同，可是无论是酶的系统命名法还是习惯命名法，对这些均不加以区别，而定为相同的名称，这是因为命名酶的根据是酶所催化的反应。
例如,SOD不管来源如何，均催化如下反应
2O2-+2H+→H2O2+O2 H2O2再由过氧化氢酶催化、分解它们有同一个名称和酶的编号EC1.15.1.1
实际此酶可分三类：
CuZn-SOD 真核生物细胞质中
Mn-SOD 真核生物线粒体中
Fe-SOD
即使同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。
因此，在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。
酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂、等。
酶的量度酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示酶活力与酶促反应速度酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。
酶量—酶活力一反应速度酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间
P243 图4-4 酶反应速度曲线
研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。
酶的活力单位（U）
国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25℃ pH及底物浓度采用最适条件（有时底物分子量不确定时，可用转化底物中1umol的有关基团的酶量表示）。
实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。
如,限制性核酸内切酶用粘度法测活性：定义为30℃,1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
转化率法：标准条件，5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
可见，同一种酶采用不同的测活方法，得到的酶活单位是不同的，即使是同一种测活法，实验条件稍有相同，测得的酶单位亦有差异。
如 淀粉酶，两种定义
A：1 g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。
B：l ml 2%可溶性starch,在1h内液化所需的enzyme量。
1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。
A：60/10×20×2%×1/0.5×1000=4800u/克enzyme制剂
B：60/10×20/0.5×1000=240000u/克enzyme制剂酶的比活力 Specific activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。
单位：U/mg蛋白质。
有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。
举例：一个酶的分离纯化分为4 步。
步骤 1 2 3 4
总活力（U） 6 4 3 2
总蛋白质（mg） 20 10 5 2
比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2
酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。
酶的纯化倍数：
酶的回收率,×100%
酶的转换数和催化周期分子活性定义：每mol的 enzyme 在1秒内转化substrate的 mol数。
亚基或催化中心活性定义：每mol 的active subunit或 active center 在一秒内转化的substrate 的mol 数，称为转换数Kcat
P244图表4—4
转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。
如：乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒。
底物浓度对酶促反应速度的影响单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。
1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。
底物浓度对酶促反应速度的影响——米式学说的提出
1903 Henri 研究蔗糖水解反应。
sucrose +H2O acid glucose +fructose
sucrase
酸水解
V V
[sucrose]
酶水解
V
V
[enzyme]( substrate不变) [sucrose]
底物浓度与酶促反应速度的关系：
当底物浓度不断增大时，反应速度不再上升，趋向一个极限，酶被底物饱和（底物饱和现象）。
中间产物假说：酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。
证据：（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性（3）结晶ES复合物的获得。
米式学说：
1913年，Michaelis和Menten继承和发展了中间产物学说，在前人工作基础上提出酶促动力学的基本原理，并以数学公式表明了底物浓度与酶促反应速度的定量关系，称米式学说：
米式方程的导出：
基于快速平衡假说——早年的米式方程最初，Michaelis和Menten是根据“快速平衡假说”推出米式方程。
快速平衡假说：
在反应的初始阶段，底物浓度远远大于酶浓度，因此，底物浓度{S}可以认为不变。
游离的酶与底物形成ES的速度极快，E + S ES，而ES形成产物的速度极慢，ES分解成产物P对于[ES]浓度的动态平衡没有影响，不予考虑。
K1、K2》K3
因为研究的是初速度，P的量很小，由P ES可以忽略不记。
ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S]
ES的分解速度：K2[ES]
K1（[E] - [ES]）[S] = K2[ES]
反应速度：
KS现在称为底物常数
Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：
稳态平衡假说：
[ES]的的生成与分解处于动态平衡（稳态），有时必须考虑[ES]分解成产物P对于[ES]动态平衡的影响（[ES]分解速度）。或者说，[ES]的动态平衡（分解速度）不仅与ES E+S有关，还与ES P + E有关。
稳态平衡假说的贡献在于第②点。
用稳态假说推导米式方程：
ES生成速度：
k1（[E] - [ES]）[S]
ES分解速度：
k2[ES]+k3[ES]
以上两个速度相等。
k1（[E] - [ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES]
反应速度：
Vmax=k3 [E]
Km称米氏常数，当Km及Vmax已知时，即可确定酶反应速度与底物浓度的关系。
米式方程讨论快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别
当K1、K2＞＞K3时，即ES P是整个反应平衡中极慢的一步，那么
这就是早年提出的米式方程因此说，稳态平衡 = 快速平衡 + 慢速平衡，
当ES P（即K3/K1）极慢时，稳态平衡基本等于快速平衡
Km的物理意义当反应速度v=1/2 Vmax时,Km = [S]，
Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。
单位：与底物浓度的单位一致，mol·L-1或mmol·L-1
Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。
P248 表4-5 一些酶的Km值。
Km与天然底物如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V变化越灵敏底物。
Km、Ks与底物亲和力
Km称米式常数，Km=（K2+K3）／K1,从某种意义上讲，Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
Ks称为底物常数，Ks=K2／K1，它是ES的解离常数，只反映ES解离趋势，因此，1/Ks可以表示酶与底物的亲和力大小（ES形成趋势），不难看出，底物亲和力大不一定反应速度大（产物形成趋势，K3／K1）
只有当K2、K1＞＞K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。
问题：
Km越小，底物亲和力越大（X）
Ks越小，底物亲和力越大（√）
天然底物就是亲和力最大的底物（X）
天然底物就是Km值最小的底物（√）
Km与米式方程的实际用途已知V求[S]
已知[S]求V
相对速度（酶活性中心被占据分数Y）：
当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[Et]成正比。当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一半被占据。
设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有：[S]0.8=4Km
[S]0.7=2.33Km
[S]0.6=1.5Km
[S]0.5=1Km
[S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7/[S]0.1=21
Km和Vmax的求解方法双倒数作图法要从实验数据所得到的v-[S]曲线来直接决定Vmax是很困难的，也不易求出Km值。
由米式方程两边取倒数：
将实验所得的初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]值，将1/v对1/[S]作图，得
P250 图4-6
上图[S]范围在0.330—2.0Km，最适。
若[S]范围在3.3—20 Km,直线斜率太小。
若[S]范围在0.033––0.2 Km,直线斜率太大。
如当Km=1×10-5mol/L时，实验所取底物浓度范围应在0.33×10-5－2.0×10-5mol/L。
一般选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量。
如当选[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时
1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。
反之，若选[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，
1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。
V—V/[S]作图法
P250 图4-7
多底物的酶促反应前面讨论的米氏方程（推导米氏方程时用的是单底物），适用于单底物酶促反应，如异构、水解及大部分裂合反应，不适用于多底物反应。
A、B、C表示底物，按照底物与酶的结合顺序，产物则按它们从酶产复合物中释放次序分别用P、Q、R表示。
双底物酶促反应已知有三种机理有序顺序反应机理底物A、B与酶结合的顺序是一定的，产物P、Q的释放顺序也是一定的。
P251
举例：P251 乙醇脱氢酶随机顺序反应机理底物A、B与酶结合的顺序是随机的，产物P、Q的释放顺序也是随机的。
P252
如糖原磷酸化酶乒乓反应机理先结合第一个底物A，释放第一个产物P，酶的构象发生变化，结合第二个底物B，释放第二个产物Q。
P252
举例,谷丙转氨酶
pH对酶促反应速度的影响
1,pH影响酶活力的因素
①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。
②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。
③影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。
2．酶的最适pH和稳定性pH
最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。
酶在试管反应中的最适pH与它所在细胞中的生理pH不一定完全相同，为什么？
几种酶的最适pH，见P253表4—6。
稳定性pH：在一定pH范围内，酶不会变性失活，此范围称酶的稳定性pH。
图
A．最适pH曲线：最适pH=6.8
B．稳定性pH曲线：pH5~8
曲线B：将酶在不同pH下保温，再调回pH6.8，测定反应速度。
曲线B说明，在pH6.8~8及5~6.8范围内反应速度的降低，不是由于酶蛋白变性失活造成的，而是由于酶或底物形成了不正常的解离，而在pH ＞8和pH＜5范围，则是由两种因素共同作用的结果。
虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。
P254 图4-9 酶的pH—酶活曲线温度对酶促反应速度的影响。
1．最适温度及影响因素
温度对酶促反应速度的影响有两个方面：
①提高温度，加快反应速度。
②提高温度，酶变性失活。
这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。最适温度就是这两种因素综合作用的结果。
温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1~2。
温血动物的酶，最适温度35℃ —40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌Taq DNA聚合酶70℃。
2．酶的稳定性温度在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。
酶的稳定性温度有一定的时间限制。
稳定性温度范围的确定方法：将酶分别在不同温度下预保温一定时间，然后回到较低温度（即酶的热变性失活作用可忽略的温度），测酶活性。
图酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温（几个月）。
②干粉，可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中。
酶浓度对酶促反应速度的影响如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
Vmax = K3 [E]
[S]过量且不变时，v∝[E]。
激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。activator
激活剂作用包括两种情况：
一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。
另一种是激活酶原，无活性→有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。
无机离子的激活作用
（1）金属离子：K+,Na+、Mg2+,Zn2+、Fe 2+,Ca2+
（2）阴离子：cl-、Br -
（3）氢离子许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。
有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。
有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。
注意：
无机离子的激活作用具有选择性，不同的离子激活不同的酶。
不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+，但Mg+与Zn+常可替代。
激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM
简单有机分子的激活作用
①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。
②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。
抑制剂对酶促反应速度的影响酶是protein,凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。（不可逆抑制、可逆抑制）
抑制剂（inhibitor）：不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）发生变化，引起酶活性下降，甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。
研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：
药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药对生物体的代谢途径进行认为调控，代谢控制发酵研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础不可逆抑制作用（非专性必、专一性）
抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析法除去抑制剂。
非专一性不可逆抑制剂此类抑制剂可以和一类或几类基团反应。它们不但能和酶分子中的必需基团作用，同时也能和相应的非必需基团作用。
酰化剂二异丙基磷酰氟酯（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药都属于磷酰化剂，能与酶活性中心Ser的—OH结合，抑制某些蛋白酶及酯酶。这类化合物的作用机理是强烈地抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱。乙酰胆碱的堆积，引起一系列神经中毒症状。
Ｐ258 结构式：磷酰化剂与DFP
P259 反应式：磷酰化剂与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶
解毒剂：PAM（解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。
烷化剂许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化
P259 反应式：对氯汞苯甲酸与巯基酶的反应
有机汞、有机砷化合物和重金属还可以与还原型硫辛酸（人体重要的辅酶）反应解毒剂：二巯基丙醇氰化物与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。
重金属
Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。
还原剂以二硫键为必需基团的酶，可以被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。
含活泼双键试剂（与—ＳＨ、—ＮＨ２反应）
Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺
图亲电试剂四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。
图专一性不可逆抑制此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。
Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂不仅具有与底物相似的、可与酶结合的基团，同时还有一个能与酶的其它基团反应的活泼基团。
专一性：抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。
举例：
胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。
《酶学》P119
最佳底物 TPCK
-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于远离-CH2-cl，则不被烷基化。
Kcat型专一性不可逆抑制剂这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latent reactive group），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。
举例1：
β-羟基癸酰硫酯脱水酶的Kcat型不可逆抑制剂：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R
此酶催化的反应：
P260反应式
当有Kcat抑制剂时，此抑制剂被催化生成连丙二烯结构，连丙二烯易与His咪唑反应，使酶失活。
P261反应式
举例2：
以FMN（黄素单核苷酸）、FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）为辅基的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂；炔类化合物。
迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，是治疗高血压的良药。
图
单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺）
图
由于迫降灵能抑制单胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，因而有降血压的作用。
Kcat型专一性不可逆抑制剂的专一性很强，近来已设计出多种酶的Kcat逆制剂，在医疗方面起到很大作用。
可逆抑制作用 Reversible Inhibition
此类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。
竞争性抑制（Competitive inhibition）
抑制剂与底物竞争酶的活性中心。
竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。
P258 图4-11 酶与底物及竞争性、非竞争性抑制剂结合的模型
举例1：丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶
举例2：磺胺类药物及其作用机理磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病。
磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶
P261 结构式：对氨基苯甲酸 对氨基苯磺酰胺 叶酸
磺胺类药物的药理（对氨基苯磺酰胺）：
嘌呤核苷酸的合成必需要由四氢叶酸（辅酶）提供一碳单位；四氢叶酸可由二氢叶酸或叶酸转化而成；二氢叶酸是在二氢叶酸合成酶作用下，利用蝶呤、对氨基苯甲酸及Glu合成。
动物体内的叶酸可从食物中获取，细菌体内的叶酸只能在二氢叶酸合成酶作用下，利用对氨基苯甲酸合成。
如果动物体内含有大量的对氨基苯磺酰胺，可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制细菌二氢叶酸合成。
非竞争性抑制特点：抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。
酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。显然，不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。
非竞争性抑制剂多是与酶活性中心之外的巯基可逆结合，包括某些含金属离子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+）和EDTA，。
反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I ≠ P
可逆抑制作用的动力学用书上P263-266的方法可推出三种抑制方程。
竞争性抑制,
动力学方程：
竞争性抑制曲线:
P263 图4-12竞争性抑制曲线
竞争性抑制作用小结：
Vmax不变，Km变大。要达到同一个给定的Vmax分数，必须要有比无抑制剂时大得多的底物浓度。
竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]、[S]、Km和Ki
A,[I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。
B,[S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加）。
C,Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大，Ki越大，抑制作用越小。
D,[I]=Ki时，所作双倒数图直线的斜率加倍。
E,在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。
非竞争性抑制动力学方程：
相对速度：
抑制分数：
非竞争抑制曲线：
P265 图4-13
非竞争性抑制剂可使酶促反应的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki），而对Km无影响。它对酶促反应的抑制程度决定于[I]和Ki,与酶的Km和[S]无关。
反竞争性抑制动力学方程：
相对速度：
抑制分数,
P265 图4-14 反竞争抑制曲线
在反竞争性抑制作用下，Km及Vmax都变小，且Km’<Km
P266 表4-7 小结,三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值有机介质中的酶促反应（只是一部分酶）
传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。
其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。
优点,①利于疏水性底物的反应。
②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。
③能催化在水中不能进行的反应。
④可改变反应平衡移动方向。
⑤可控制底物专一性。
⑥防止由水引起的副反应。
⑦可扩大pH值的适应性等等。
有机介质中酶促反应的条件必需水（结合水）
酶催化活性所必需的构象，是由水分子直接或间接地通过氢键等非共价相互作用来维持的，因此只有与酶分子紧密结合的单层水分子，对酶的催化活性才是至关重要的。
这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。
酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关，只要必需水不丢失，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍然保持其催化活性。
因此，可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。
一个干燥的酶水合,吸附水量：
酶分子表面电荷基团,0-0.07g/g (水/酶)
酶分子表面极性基团,0.07-0.25g/g
弱极性、非极性基团,0.25-0.28g/g
表面完全水化，被一层水分子包围。
酶的必需水含量因酶而异。
脂肪酶：几个水分子/每个酶分子胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子对酶的要求具有对抗有机介质变性的经能力。
合适的溶剂及反应体系合适的pH
保证有机介质中酶的微环境具有最适pH值。酶应从具有最适pH值的缓冲液中冻干或沉淀出来。
有机介质对酶性质的影响稳定性大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。
a,热稳定性提高例如：猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍
b,储存稳定性提高胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。
活性
有两类影响 升高活性
降低活性酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。
专一性某些有机溶剂会使某些酶的专一性发生变化，如脂肪酶在有机介质中有合成肽键的功能。星号活力（第二活力）。
反应平衡有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。
例如：水解酶类（蛋白水解酶）
在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向，
如在含水量极低的有机介质中，平衡向含成方向偏移。
实例：（酶） 合成）产物 溶剂 合成收率
枯草杆菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油90% 50%
无色杆菌蛋白酶 胰岛素 乙醇30% 80%
凝血酶 人生长素 甘油80% 20%
分子印迹和pH记忆酶在冻干前可用配体作印迹。
竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性构象，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
pH记忆：
酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。
酶的作用机理专一性的机理酶专一性类型一般说来，一种分子能成为某种酶的底物，必须具备两个条件：
分子上有被酶作用的化学键。
分子上有一个或多个结合基团能与酶活性中心结合。
结构专一性键专一性（对底物结构要求最低）
酶只对其作用的的键有要求，而对键两侧基因无特殊要求。
如：酯酶可催化酯键水解，R—CO—OR’,对R和R’无要求，但不同底物水解速度不同。又如：磷酸酯酶可水解各种磷酸酯分子。
基团专一性Group Specificity
酶不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。
如：α—D—Glc苷酶，不仅要求作用的键是α—糖苷键，且要求此键一端必须是Glc残基，对此键另一端基团无要求，如此酶可水解蔗糖和麦芽糖。
以上（1）、（2）两类称为相对专一性
P268 表4—9消化道中蛋白酶的专一性
绝对专一性酶只能作用于一个底物，或只催化一个反应。
如：大麦芽中的麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解。
立体异构专一性旋光异构专一性当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种异构体，它是酶促反应中相当普遍的现象。
如：Glu脱氢酶只作用L—Glu，乳酸脱氢酶只作用L —乳酸。
几何异构专一性顺式反式异构体。
如：反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸，对顺丁烯二酸无作用。
立体化学专一性还表现在酶能区分从有机化学观点看属于对称分子中的两个等同的基团，只催化其中一个，而对另一个无作用。
例如：a.甘油在甘油激酶的催化下只有一个CH2OH基能被磷酸化。
b.糖代谢中的顺一乌头酸酶作用于柠檬酸时，两个CH2COOH对酶来说是不同的。
图立体专一性在实践中的应用：（1）药物的构效关系（2）立体异构性药物和其它化合物的酶法不对称合成或拆分。
用乙酰化酶制备L—氨基酸：有机合成的D、L—a.a乙酸化，然后用乙酰化酶使L—a.a水解出来。
酶作用专一性的解释三点结合及锁钥模型（刚性模板学说）
底物结合部位由酶分子表面的凹槽或空穴组成，这是酶的活性中心，它的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，可专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物，同时酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。
三点结合学说指出，底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。
P270、图4—16、4—17
刚性模板学说较好地解释了立体专一性，但不能解释酶专一性中所有的现象，如既能催化正反应，又能催化逆反应；那么，酶的结构不可能既适合于底物又适合于产物。
诱导楔合模型酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。
P271 图4—18
高效性的机理邻近效应与定向效应酶把底物分子（一种或两种）从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
两种效应对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高甚至比溶液中高10万倍，提高反应速度。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用举例：酚羟基和羧基环化成内酸
图
3个CH3固定了-OH和-COOH的相对方位。
③酶使分子间反应转变成分子内反应反应速度提高：107
图
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用酶底复合物寿命比一般双分子相互碰撞的平均寿命长，前者10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了产物形成的机率。
扭曲变形和构象变化的催化效应酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。
P276 图4-20
环状反应物I水解开环，环扭曲能量大量释放，加速反应。
底物与酶蛋白接触，加速反应。
①酶从低活性形式转变为高活性形式
②底物扭曲、变形
③底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。
共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。
①亲核共价催化丝氨酸羟基、Cys的-SH、His的咪唑基。
举例：咪唑基催化对硝基苯乙酸酯水解。
图
②亲电共价催化
亲电基团攻击底物的富电子基团例：Asp转氨酶催化Asp 转氨反应
图
P278 表4-13 形成共价ES复合物的某些酶酸碱催化酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
参与酸碱催化的基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。
P279 表4-14 酶分子中可作为广义酸碱的功能基团
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度，咪唑基在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快
①酸催化酯、酰胺和肽的水解
图
过程：共轭酸与＞C=0氧形成氢键，使＞C=0碳带更多正电荷，更易吸引H2O分子上的氧，降低＞C=0碳与H2O氧形成共价键的活化能；接着，共轭酸将H+转移给＞C=0氧，自己成为共轭碱，并从H2O分子吸引一个H+,回复原状。
②碱催化酯、酰胺水解
图
过程：共轭碱先与H2O中H形成氢键，使H2O中氧的电负性增强，更易对＞C=0碳进行亲核进攻，降低碳氧键生成的活化能。
活性中心的微环境
⑴ 疏水环境酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。如溶菌酶Asp52带负电荷，可以稳定过渡态的正离子。
酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。
某些酶的活性中心及其作用机理酶的活性中心活性中心的概念对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团，它们在一级结构上相距可能很远，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。
对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。
一般认为，活性中心有两个功能部位：底物结合部位，催化部位活性中心外的部位为活性中心的形成提供了结构基础 。
活性中心的氨基酸残基有七种a.a在酶活性中心出现的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的a.a残基往往分散在相互较远的a.a顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，如α-胰凝乳蛋白酶活性中心的几个a.a残基，分别位于B、C两个肽链上，靠分子空间结构的形成，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
酶分子a.a残基分类
（1）接触残基它们与底物接触，参与底物的化学转变，此类a.a残基的一个或几个原子与底物分子中一个或几个原子的距离都在一个键距离之内（1.5-2A）。
它们的侧链起与底物结合作用的称为结合基团，起催化作用的称为催化基团。
（2）辅助残基它不与底物接触，而是在使酶与底物结合及协助接触残基发挥作用方面起作用。
上述两类残基构成酶活性中心。
（3）结构残基在维持酶分子正常三维构象方面起重要作用，它们与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基上述三类残基统称酶的必需基团，若被其它a.a取代，往往造成酶失活。
（4）非贡献残基（非必需基团）
它们对酶活性的显示不起作用，可由其它a.a代替，且在酶分子中占很大比例。
它们可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。
结合底物作用（结合残基）
接触残基
活性中心 催化作用（催化基团）
必需基团 辅助残基
活性中心外（结构残基）
酶蛋白
非必需基团活性中心区域的一级结构由于一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理极其相似，可把它们归为一族。
蛋白水解酶就有几个族：
（1）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）
（2）锌蛋白酶（羧肽酶等）
（3）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶等）
（4）羧基蛋白酶（胃蛋白酶等）
在同一族酶中，活性中心一级结构的a.a顺序极相似。
酶 a.a顺序胰蛋白酶（牛） Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys
胰凝乳蛋白酶（牛） Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn
弹性蛋白酶（猪） Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn
凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro
这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽：
…Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro…
同源的趋异进化来自胰脏的胰凝乳蛋白酶（Phe,Tyr,Trp、）、胰蛋白酶（Lys、Arg ）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的a.a顺序相同，且分子一级结构中有40%a.a顺序相同，三维结构也相同，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同。
这种来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。
异源的趋同进化来自枯草杆菌的Ser蛋白酶的结构与上述三种酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a顺序也不同（-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser）。
电荷中继网的位置也不同：
Asp102-His57-Ser195（胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶）
Asp32-His64-Ser221（枯草杆菌蛋白酶）
这表明枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶等三个酶来源不同，但它们的电荷中继网相同，功能相同，这种情况称异源的趋同进化。
判断和研究活性中心的主要方法
（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法酶作用机理举例胰凝乳蛋白酶的作用机理：
专一性
图
该酶需要底物有一个疏水基团结合于酶上的疏水部位，这个结合起定位作用，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
催化机理
① 活性中心：Ser195—His57—Asp102，三者构成一个氢键体系，His57的咪唑基是Ser195的羟基和Asp102的羧基之间的桥梁，这个氢键体系称为电荷中继网（harge relay network）。通过电荷中继网，进行酸碱催化及共价催化。Ser195由于His57和Asp102的影响而成为很强的亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。
ＰP285 图4-27，P287 图4-30 胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网
② 胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程
P288 图4—31胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程
第一阶段 酰化
Ser195 --OH 中的氧攻击肽键的羰基碳，形成四联体过渡态（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑），敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段 脱酰电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，结果底物中的酸成分从Ser195上释放。
除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser电荷中继网的还有胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶等，但它们的底物结合部位不同，底物专一性也不同。
P288 图4-32三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部位
胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 弹性蛋白酶可供芳香环及大 可供带电荷的 只能让Ala等小分子的非极性侧链伸入 Lys.、Arg进入 进入多酶体系与酶活性的调节控制多酶体系多酶体系及其分类细胞中的许多酶，常常在一个连续的反应链中起作用，前一个反应的产物是后一个反应的底物。
多酶体系：multienzyme system在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。
可分为三种类型：可溶性的（分散性的），结构化的（多酶复合体），在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）。
P297 图4—42（分散性的多酶体系） 图4-43 （多酶复合体）
多酶体系的自我调节
（1）大部分具有自我调节能力的多酶体系，第一步反应就是限速步骤，它控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有时则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活
P299 图4-45反馈抑制与底物激活
正调节物：一般是别构酶的底物，可以激活别构酶。
负调节物：可以抑制别构酶，一般是代谢序列的最终产物。
通过多酶体系的自我调节（反馈抑制和底物激活），可使代谢过程得以协调地、有条不紊地合理进行。
下面讨论具体到每个酶是怎样调节的酶活性的调节控制和调节酶调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价调节酶。
别构效应的调控别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。
别构酶的结构特点和性质已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。
别构酶的动力学曲线
① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线
P303 图4-46 4-47
这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1=3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。
当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。
② 同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线
P304图4-48
负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感别构酶调节活性的机理
① 序变模型：
酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。
② 齐变模型：
别构酶的鉴定
S型曲线是必要但不充分条件脱敏作用
[S]0.9／[S]0.1
Rs=81 米氏酶
Rs＜81 正协同
Rs＞81 负协同
④ Hill系数法可逆共价修饰的调控（共价调节酶）
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶
P313 图4-57
信号的级联放大：
1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a
1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G
共价调节酶的两种常见类型
①磷酸化 去磷酸化 -OH ATP
②腺苷酰化 脱腺苷酰化 腺苷酰基由ATP提供酶原的激活具有不可逆性。属于此类的有消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）
P314 图4-58
胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活
肠激酶
胰蛋白酶原 胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶原 弹性蛋白酶原
胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶
羧肽酶原 羧肽酶专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特异的酶活性酶与抗体——抗体酶 abzyme(antibody enzyme)
参阅 P293
又称催化性抗体（catalytic antibody），是一种具有催化功能的抗体分子。
过渡态理论：酶与底物不是在基态，而是在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
而抗体与抗原是基态结合。
同工酶、诱导酶同工酶能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构不同的一组酶，存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。
哺乳动物乳酸脱氢酶有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+ LDH CH3COCOO-+NADH+H+
均由4个亚基组成
HHHH 在心肌中占优势
HHHM
HHMM
HMMM
MMMM 在骨骼肌中占优势诱导酶酶可相对地区分为结构酶和诱导酶。
结构酶：指正常细胞内存在的酶，它的含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
如：大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
E.coli在含Glc的培养基中
E.coli在只含乳糖的培养基中：Glc-β(1→4)Gal苷酶工程
计划：8学时
