第二节 氨基酸生产工艺
? 氨基酸是构成蛋白成分
? 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有 20
多种。
氨基酸
? α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基
和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性
质不同。
氨基酸的用途
? 1.食品工业：
? 强化食品 (赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小
麦中 )
? 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸
? 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量
二肽甜味剂 (α-天冬酰苯丙氨酸甲酯 ),此产
品 1981年获 FDA批准,现在每年产量已达
数万吨。
? 2.饲料工业：
? 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料
? 3.医药工业：
? 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代
谢失调
? 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气
对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。
? 4.化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙
氨酸纤维。
氨基酸的生产方法
? 发酵法：
直接发酵法：野生菌株发酵、营养
缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物
突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变
株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型
回复突变株发酵。
添加前体法
? 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制
造氨基酸。
? 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨
酸、半胱氨酸和酪氨酸
? 合成法,DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙
氨酸。
? 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物
的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目
的。
? 生产氨基酸的大国为日本和德国。
? 日本的味之素、协和发酵及德国的德固
沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能
生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制
剂的生产。
? 日本在美国、法国等建立了合资的氨基
酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍
生物。
? 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,
湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产
品质量还难于与国外抗衡。
? 在 80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发
酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术
和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达
六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆
明康普莱特,但生产原料都依赖进口。
? 据专家估计,到 2000年,世界氨基酸产值可达 45亿
美元,占生物技术市场的 7%,国内的氨基酸产值可
达 40亿元,占全国发酵产业总产值的 12%。
氨基酸发酵生产发展的历史回顾
? 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主
要原料的培养基中培养微生物,积累特定
的氨基酸 。
? 这些方法成立的一个重要原因是使用选
育成的氨基酸生物合成高能力的菌株 。
菌株的育种
? 从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件,
? 在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制
的基础上发展为营养缺陷变异株, 抗药性菌株的育种 。
? 随着重组 DNA技术的发展,接合, 转导, 转染, 细胞融
合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方
法构建生产菌株的尝试 。
? 随着载体, 受体系统的构建及体外基因重组技术的日
益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展 。
? 苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生
产。
2.1 用野生株的方法
? 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵
生产的一种方法。
? 典型的例子就是谷氨酸发酵。
? 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵
离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷
氨酰胺和缬氨酸发酵
2.2 用营养缺陷变异株的方法
? 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合
成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，
使生物合成在中途停止，不让最终产物
起控制作用。
? 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨
酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发
酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发
酵。
2.3 类似物抗性变异株的方法
? 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类
似的化合物加入培养基内，使其发生控
制作用，从而抑制微生物的生长。这样，
就可以得到在这种培养基中能够生长的
变异株，而这种变异株正是解除了调控
机制的，能够生成过量的氨基酸。
? 利用此方法发酵的有,苏氨酸、赖氨酸、
异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。
2.4 体内及体外基因重组的方法
? 基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外
基因重组方法。
? 体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法
包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，
这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，
在两条 DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性
重组现象。
? 细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有
近缘关系的微生物之间进行并较难成功。
? 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础
上，应用重组 DNA技术可以改变代谢途径分支
点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代
谢网络。
? 其主要步骤为,
? 鉴定目标代谢途径涉及的酶 (特别是限速酶 );
? 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如
定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点
(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等 );
? 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节
元件一起克隆进目标生物 ;
? 使调节元件的作用及培育条件最优化。
3.1 载体 -受体系统及克隆表
达的研究
? 3.1.1 受体的获得
? 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌
K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出
的基础产率较高的菌株。
? 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，
利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将
蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。
? 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统
研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得
利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体
菌是尚待解决的问题。
3.1.2 载体的构建
? 有效的载体需要有在受体菌中可启动的
复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内
源小质粒中获得 ;
? 载体所需的筛选标记及外源基因插入的
多克隆位点，可从常用的克隆载体中获
得。
3.1.3 基因转移手段
? 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌,CaCl2转化法对它
不适用。
? 通常采用的方法有,原生质体转化、转导，电转化，
接合转移。
? 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受
到原生质体再生条件的局限，效率不高 ;
? 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它
的转化效率可达到原生质体转化法的 100～ 1000倍。
? 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的
转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于
稳定遗传。
氨基酸发酵的代谢控制
? 控制发酵的条件
? 控制细胞渗透性
? 控制旁路代谢
? 降低反馈作用物的浓度
? 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
? 促进 ATP的积累，以利氨基酸的生物合
成
控制发酵的条件
? 专性需氧菌，控制环境条件可
改变代谢途径和产物。
控制细胞渗透性
?生物素、油酸和表面活性剂，
引起细胞膜的脂肪酸成分的
改变。
?青霉素：抑制细胞壁的合成，
由于细胞面内外的渗透压而
泄露出来。
控制旁路代谢
降低反馈作用物的浓度
? 利用营养缺陷型突变株进行氨基酸
发酵必须限制所要求的氨基酸的量。
限制精氨酸的浓度可解除
反馈抑制，实现鸟氨酸的
生物合成。
消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
? 使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。
促进 ATP的积累，以利氨基酸的生物合成
? ATP的积累可促进氨基酸的生物合成
氨基酸发酵的工艺控制
? 培养基
? pH
? 温度
? 氧
培养基
? 1、碳源,淀粉水解糖、糖蜜,醋酸、乙
醇、烷烃
碳源浓度过高时，对菌体生长不利，
氨基酸的转化率降低。
菌种性质、生产氨基酸种类和所采用
的发酵操作决定碳源种类
2、氮源：铵盐、尿素、氨水；
? 同时调整 pH值。
? 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加
有机氮源水解液。
? 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。
? 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭
菌。可分批流加。
? 氨水用 pH自动控制连续流加
? 3、合适 C/N
? 氮源用于调整 pH。
? 合成菌体
? 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的
C/N高。
? 4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时
糖代谢受抑制。
? 5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶
和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖 -6-磷
酸脱氢酶活力。
? 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多
利于产酸，钾少利于菌体生长。
? 7、钠：调节渗透压作用，一般在调节 pH
值时加入。
? 8、锰：是许多酶的激活剂。
? 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和
过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进
谷氨酸产生菌的生长。
? 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害
作用。
? 生长因子：生物素
作用：影响细胞膜透性和代谢途径。
浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。
过少菌体生长缓慢，发酵周期长。
与其它培养条件的关系：氧供给不足，
生物素过量时，发酵向其它途径转化。
种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和
甜菜糖蜜为来源。
pH对氨基酸发酵的影响及其控制
? 作用机理：主要影响酶的活性和菌
的代谢。
? 控制 pH方法：流加尿素和氨水
? 流加方式：根据菌体生长,pH变
化、糖耗情况和发酵阶段等因素决
定。
? 控制：
? （ 1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，
避免 pH过高
? （ 2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，
以抑制菌体生长。
? （ 3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或
不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。
? （ 4）氨水对 pH影响大，应采取连续流加。
温度对氨基酸发酵的影响及其控制
? 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基
酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合
成的最适温度是不同的。
? 菌体生长温度过高，则菌体易衰老,pH
高，糖耗慢，周期长，酸产量低。
? 采取措施：少量多次流加尿素，维持最
适生长温度，减少风量等，促进菌体生
长。
氧对氨基酸发酵的影响及其控制
? 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：
生物合成与 TCA循环有关。
? 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙
氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产
量最大。
? 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸
族氨基酸发酵
谷氨酸生产工艺
? 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质
而制取。
? 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投
入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业
的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶
段。
? 目前世界产谷氨酸钠 30吨 /年，占氨基酸总量的
2/3。
? 我国现已有 200余家生产，年产量达 15万吨，居
世界首位。
? 产生菌株特点：
? 革兰氏阳性
? 不形成芽胞
? 没有鞭毛，不能运动
? 需要生物素作为生长因子
? 在通气条件下才能产生谷氨酸。
? 谷氨酸生物合成机理：
? 由三羧酸循环中产生的 a-酮戊二酸，在谷
氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性
氨化作用而得到。
? 一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解
? 1、调浆：干淀粉用水调成 10-11Bx的淀粉乳，
加盐酸 0.5-0.8％至 pH1.5。
? 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化 25min。冷却至
80℃ 下中和。
? 3、中和：烧碱中和，至 pH4.0-5.0
? 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用
量为 0.6-0.8％，在 70度及酸性条件下搅拌后过
滤。
? 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用
? 大米进行浸泡磨浆，再调成 15Bx，调
pH6.0，加细菌 a-淀粉酶进行液化,85
℃ 30min，加糖化酶 60 ℃ 糖化 24h，过滤
后可供配制培养基。
? 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发
酵的碳源，因含丰富的生物素。
? 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和
亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在
发酵液中加入表面活性剂吐温 60或添加
中青霉素。
? 二、菌种扩大培养
? 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短
杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。
? 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆
菌和北京棒杆菌及各种诱变株。
? 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物
素为生长因子。
? 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成
的 pH7.0-7.2琼脂培养基,32℃ 培养 18-24h。
? 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、
磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。
pH6.5-6.8。 1000ml装 200-250ml振荡,32℃ 培
养 12h。
? 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为
发酵罐投料体积的 1％，用水解糖代替葡萄糖，
于 32℃ 进行通气搅拌 7-10h。种子质量要求：
二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，
菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为
108-109 /ml。
三、谷氨酸发酵
? 1、适应期：尿素分解出氨使 pH上升。糖不利用。
2-4h。
? 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。
? 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使 pH上
升，氨被利用 pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维
持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为
排列整齐的八字形。不产酸。 12h。
? 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节
pH，在 pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度 30- 32℃
? 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。
? 措施：提供必须的氨及 pH维持在 7.2-7.4。
大量通气，控制温度 34-37 ℃ 。
? 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。
? 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时
放罐。
? 发酵周期一般为 30h。
谷氨酸发酵控制
? （ 1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初
反应的关键酶乙酰 CoA的辅酶，参与脂肪酸的
生物合在，进而影响磷酯的合成。
? 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞
发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发
酵液中。
? 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产
或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显
增多。
? （ 2）种龄和种量的控制
? 一级种子控制在 11-12h，二级控制在 7-8h。
? 种量为 1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰
老自溶，后期产酸量不高。
? （ 3） pH。
? 发酵前期，幼龄细胞对 pH较敏感,pH过低，菌
体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵
慢，长菌不长酸。
? 谷氨酸脱氢酶最适 pH为 7.0-7.2，转氨酶最适 pH
7.2-7.4。在发酵中后期，保持 pH不变。过高转
为谷氨酰胺，过低氨离子不足。
? （ 4）通风：不同种龄、种量，培养基成
分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量
不同。
? 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺
乏，抑制菌体生长。
? 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，
以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通
风，则大量积累 a-酮戊二酸。
? 防止噬菌体和杂菌的污染
? 从空气过滤、培养基、设备、环境等环
节严格把关。
四、谷氨酸的提取
1、等电点法：操作简单，收率 60
％。周期长，占地面积大。
? 2、离子交换法：用阳离子交换树脂
提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再
用热碱洗脱，收集相应流分，再加
盐酸结晶。
谷氨酸发酵研究新进展
? 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或
可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。
提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工
艺。
? 生物工程新技术的应用：体外 DNA重组的基因
工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使
产量提高近 1倍。
? 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通
过电子计算机控制发酵条件。
非糖质原料的谷氨酸发酵
? 醋酸发酵谷氨酸
? 机理：醋酸形成乙酰 CoA，再进入 TCA，
因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作
为醋酸发酵谷氨酸的菌株。
? 以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原
料，且浓度不超过 4％。发酵过程中也需
流加以保持 pH。
? 氨基酸是构成蛋白成分
? 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有 20
多种。
氨基酸
? α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基
和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性
质不同。
氨基酸的用途
? 1.食品工业：
? 强化食品 (赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小
麦中 )
? 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸
? 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量
二肽甜味剂 (α-天冬酰苯丙氨酸甲酯 ),此产
品 1981年获 FDA批准,现在每年产量已达
数万吨。
? 2.饲料工业：
? 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料
? 3.医药工业：
? 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代
谢失调
? 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气
对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。
? 4.化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙
氨酸纤维。
氨基酸的生产方法
? 发酵法：
直接发酵法：野生菌株发酵、营养
缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物
突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变
株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型
回复突变株发酵。
添加前体法
? 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制
造氨基酸。
? 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨
酸、半胱氨酸和酪氨酸
? 合成法,DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙
氨酸。
? 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物
的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目
的。
? 生产氨基酸的大国为日本和德国。
? 日本的味之素、协和发酵及德国的德固
沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能
生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制
剂的生产。
? 日本在美国、法国等建立了合资的氨基
酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍
生物。
? 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,
湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产
品质量还难于与国外抗衡。
? 在 80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发
酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术
和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达
六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆
明康普莱特,但生产原料都依赖进口。
? 据专家估计,到 2000年,世界氨基酸产值可达 45亿
美元,占生物技术市场的 7%,国内的氨基酸产值可
达 40亿元,占全国发酵产业总产值的 12%。
氨基酸发酵生产发展的历史回顾
? 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主
要原料的培养基中培养微生物,积累特定
的氨基酸 。
? 这些方法成立的一个重要原因是使用选
育成的氨基酸生物合成高能力的菌株 。
菌株的育种
? 从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件,
? 在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制
的基础上发展为营养缺陷变异株, 抗药性菌株的育种 。
? 随着重组 DNA技术的发展,接合, 转导, 转染, 细胞融
合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方
法构建生产菌株的尝试 。
? 随着载体, 受体系统的构建及体外基因重组技术的日
益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展 。
? 苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生
产。
2.1 用野生株的方法
? 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵
生产的一种方法。
? 典型的例子就是谷氨酸发酵。
? 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵
离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷
氨酰胺和缬氨酸发酵
2.2 用营养缺陷变异株的方法
? 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合
成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，
使生物合成在中途停止，不让最终产物
起控制作用。
? 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨
酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发
酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发
酵。
2.3 类似物抗性变异株的方法
? 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类
似的化合物加入培养基内，使其发生控
制作用，从而抑制微生物的生长。这样，
就可以得到在这种培养基中能够生长的
变异株，而这种变异株正是解除了调控
机制的，能够生成过量的氨基酸。
? 利用此方法发酵的有,苏氨酸、赖氨酸、
异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。
2.4 体内及体外基因重组的方法
? 基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外
基因重组方法。
? 体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法
包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，
这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，
在两条 DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性
重组现象。
? 细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有
近缘关系的微生物之间进行并较难成功。
? 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础
上，应用重组 DNA技术可以改变代谢途径分支
点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代
谢网络。
? 其主要步骤为,
? 鉴定目标代谢途径涉及的酶 (特别是限速酶 );
? 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如
定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点
(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等 );
? 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节
元件一起克隆进目标生物 ;
? 使调节元件的作用及培育条件最优化。
3.1 载体 -受体系统及克隆表
达的研究
? 3.1.1 受体的获得
? 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌
K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出
的基础产率较高的菌株。
? 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，
利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将
蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。
? 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统
研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得
利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体
菌是尚待解决的问题。
3.1.2 载体的构建
? 有效的载体需要有在受体菌中可启动的
复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内
源小质粒中获得 ;
? 载体所需的筛选标记及外源基因插入的
多克隆位点，可从常用的克隆载体中获
得。
3.1.3 基因转移手段
? 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌,CaCl2转化法对它
不适用。
? 通常采用的方法有,原生质体转化、转导，电转化，
接合转移。
? 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受
到原生质体再生条件的局限，效率不高 ;
? 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它
的转化效率可达到原生质体转化法的 100～ 1000倍。
? 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的
转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于
稳定遗传。
氨基酸发酵的代谢控制
? 控制发酵的条件
? 控制细胞渗透性
? 控制旁路代谢
? 降低反馈作用物的浓度
? 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
? 促进 ATP的积累，以利氨基酸的生物合
成
控制发酵的条件
? 专性需氧菌，控制环境条件可
改变代谢途径和产物。
控制细胞渗透性
?生物素、油酸和表面活性剂，
引起细胞膜的脂肪酸成分的
改变。
?青霉素：抑制细胞壁的合成，
由于细胞面内外的渗透压而
泄露出来。
控制旁路代谢
降低反馈作用物的浓度
? 利用营养缺陷型突变株进行氨基酸
发酵必须限制所要求的氨基酸的量。
限制精氨酸的浓度可解除
反馈抑制，实现鸟氨酸的
生物合成。
消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
? 使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。
促进 ATP的积累，以利氨基酸的生物合成
? ATP的积累可促进氨基酸的生物合成
氨基酸发酵的工艺控制
? 培养基
? pH
? 温度
? 氧
培养基
? 1、碳源,淀粉水解糖、糖蜜,醋酸、乙
醇、烷烃
碳源浓度过高时，对菌体生长不利，
氨基酸的转化率降低。
菌种性质、生产氨基酸种类和所采用
的发酵操作决定碳源种类
2、氮源：铵盐、尿素、氨水；
? 同时调整 pH值。
? 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加
有机氮源水解液。
? 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。
? 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭
菌。可分批流加。
? 氨水用 pH自动控制连续流加
? 3、合适 C/N
? 氮源用于调整 pH。
? 合成菌体
? 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的
C/N高。
? 4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时
糖代谢受抑制。
? 5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶
和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖 -6-磷
酸脱氢酶活力。
? 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多
利于产酸，钾少利于菌体生长。
? 7、钠：调节渗透压作用，一般在调节 pH
值时加入。
? 8、锰：是许多酶的激活剂。
? 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和
过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进
谷氨酸产生菌的生长。
? 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害
作用。
? 生长因子：生物素
作用：影响细胞膜透性和代谢途径。
浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。
过少菌体生长缓慢，发酵周期长。
与其它培养条件的关系：氧供给不足，
生物素过量时，发酵向其它途径转化。
种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和
甜菜糖蜜为来源。
pH对氨基酸发酵的影响及其控制
? 作用机理：主要影响酶的活性和菌
的代谢。
? 控制 pH方法：流加尿素和氨水
? 流加方式：根据菌体生长,pH变
化、糖耗情况和发酵阶段等因素决
定。
? 控制：
? （ 1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，
避免 pH过高
? （ 2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，
以抑制菌体生长。
? （ 3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或
不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。
? （ 4）氨水对 pH影响大，应采取连续流加。
温度对氨基酸发酵的影响及其控制
? 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基
酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合
成的最适温度是不同的。
? 菌体生长温度过高，则菌体易衰老,pH
高，糖耗慢，周期长，酸产量低。
? 采取措施：少量多次流加尿素，维持最
适生长温度，减少风量等，促进菌体生
长。
氧对氨基酸发酵的影响及其控制
? 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：
生物合成与 TCA循环有关。
? 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙
氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产
量最大。
? 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸
族氨基酸发酵
谷氨酸生产工艺
? 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质
而制取。
? 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投
入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业
的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶
段。
? 目前世界产谷氨酸钠 30吨 /年，占氨基酸总量的
2/3。
? 我国现已有 200余家生产，年产量达 15万吨，居
世界首位。
? 产生菌株特点：
? 革兰氏阳性
? 不形成芽胞
? 没有鞭毛，不能运动
? 需要生物素作为生长因子
? 在通气条件下才能产生谷氨酸。
? 谷氨酸生物合成机理：
? 由三羧酸循环中产生的 a-酮戊二酸，在谷
氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性
氨化作用而得到。
? 一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解
? 1、调浆：干淀粉用水调成 10-11Bx的淀粉乳，
加盐酸 0.5-0.8％至 pH1.5。
? 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化 25min。冷却至
80℃ 下中和。
? 3、中和：烧碱中和，至 pH4.0-5.0
? 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用
量为 0.6-0.8％，在 70度及酸性条件下搅拌后过
滤。
? 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用
? 大米进行浸泡磨浆，再调成 15Bx，调
pH6.0，加细菌 a-淀粉酶进行液化,85
℃ 30min，加糖化酶 60 ℃ 糖化 24h，过滤
后可供配制培养基。
? 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发
酵的碳源，因含丰富的生物素。
? 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和
亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在
发酵液中加入表面活性剂吐温 60或添加
中青霉素。
? 二、菌种扩大培养
? 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短
杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。
? 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆
菌和北京棒杆菌及各种诱变株。
? 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物
素为生长因子。
? 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成
的 pH7.0-7.2琼脂培养基,32℃ 培养 18-24h。
? 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、
磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。
pH6.5-6.8。 1000ml装 200-250ml振荡,32℃ 培
养 12h。
? 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为
发酵罐投料体积的 1％，用水解糖代替葡萄糖，
于 32℃ 进行通气搅拌 7-10h。种子质量要求：
二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，
菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为
108-109 /ml。
三、谷氨酸发酵
? 1、适应期：尿素分解出氨使 pH上升。糖不利用。
2-4h。
? 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。
? 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使 pH上
升，氨被利用 pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维
持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为
排列整齐的八字形。不产酸。 12h。
? 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节
pH，在 pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度 30- 32℃
? 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。
? 措施：提供必须的氨及 pH维持在 7.2-7.4。
大量通气，控制温度 34-37 ℃ 。
? 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。
? 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时
放罐。
? 发酵周期一般为 30h。
谷氨酸发酵控制
? （ 1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初
反应的关键酶乙酰 CoA的辅酶，参与脂肪酸的
生物合在，进而影响磷酯的合成。
? 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞
发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发
酵液中。
? 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产
或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显
增多。
? （ 2）种龄和种量的控制
? 一级种子控制在 11-12h，二级控制在 7-8h。
? 种量为 1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰
老自溶，后期产酸量不高。
? （ 3） pH。
? 发酵前期，幼龄细胞对 pH较敏感,pH过低，菌
体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵
慢，长菌不长酸。
? 谷氨酸脱氢酶最适 pH为 7.0-7.2，转氨酶最适 pH
7.2-7.4。在发酵中后期，保持 pH不变。过高转
为谷氨酰胺，过低氨离子不足。
? （ 4）通风：不同种龄、种量，培养基成
分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量
不同。
? 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺
乏，抑制菌体生长。
? 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，
以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通
风，则大量积累 a-酮戊二酸。
? 防止噬菌体和杂菌的污染
? 从空气过滤、培养基、设备、环境等环
节严格把关。
四、谷氨酸的提取
1、等电点法：操作简单，收率 60
％。周期长，占地面积大。
? 2、离子交换法：用阳离子交换树脂
提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再
用热碱洗脱，收集相应流分，再加
盐酸结晶。
谷氨酸发酵研究新进展
? 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或
可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。
提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工
艺。
? 生物工程新技术的应用：体外 DNA重组的基因
工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使
产量提高近 1倍。
? 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通
过电子计算机控制发酵条件。
非糖质原料的谷氨酸发酵
? 醋酸发酵谷氨酸
? 机理：醋酸形成乙酰 CoA，再进入 TCA，
因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作
为醋酸发酵谷氨酸的菌株。
? 以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原
料，且浓度不超过 4％。发酵过程中也需
流加以保持 pH。
