第十三章 生化药物和基因工程药物分析概论 [教学目的] 掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。 掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。 熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。 了解本类药物含量测定的其他方法。 [本章分配学时数] 2学时 [教学环节与教学内容] 在上节课，我们进行了药物制剂的分析，要求同学们掌握药物制剂中常见附加剂的干扰及其排除、熟悉片剂的常规检查以及复方制剂分析方法，并了解注射液的常规检查。那么，这节课我们就要进行生化药物和基因工程药物的分析，经过本章的学习后，要求掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型、HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用，熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点，了解本类药物含量测定的其他方法。 [复习引入] 2分钟 [教授新课] 概述 生化药物和基因工程药物的定义 物药物主要包括：生化药物、生物技术药物、生物制品以及相关的生物医药产品。 1．生化药物（Biomemical drugs）：是从动物、植物及微生物提取的，也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等。 2．生物技术药物（Biotechnology drugs）：生物技术是利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物（或生物工程药物）。 3．基因工程药物（Genetic engineering drugs）：属于生物技术药物范 畴，系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。 4．生物制品（Biological medicinal products）：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。 生化药物和基因工程药物的种类 1．生化药物的种类 1）氨基酸、多肽与蛋白质类药物：氨基酸及其衍生物 药用活性多肽 药用蛋白 2）酶类与辅酶类药物 3）多糖类药物 4）脂质类药物 5）核酸及其降解物和衍生物类药物 2．基因工程药物的种类 1）激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子 人胰岛素 人生长激素 2）细胞因子类药物：人干扰素 人白细胞介素 集落刺激因子 促红细胞生成素 3）酶类及凝血因子类药物 生化药物和基因工程药物的特点 共同特点 分子量大 结构确证难 全过程的质量控制 生物活性检查 安全性检查 效价（含量）测定 生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点。表13-1。 质量检验的基本程序与方法 生化药物和基因工程药物质量控制的项目：来源与种类、形状、鉴别、氨基酸组分分析、肽图、糖含量、纯度、干燥失重或水分、炽灼残渣、生物活性、热源试验、含量分析。 （一）鉴别方法 理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC法 生化鉴别法：酶法 电泳法 等电聚焦法 生物鉴别法：家兔惊厥试验 （二）杂质检查 一般杂质检查、特殊杂质检查。 （三）安全性试验 热原检查法和细菌内毒素检查法、异常毒性试验、过敏试验、降压物质试验、无菌试验、基因工程药物中可能杂质与污染物检查、致突变试验、生殖毒性试验 （四）含量测定 生化药物和基因工程药物的含量表示方法： 百分含量：适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位：适用于酶类、蛋白质类药物。 常用定量分析方法及其应用 生化药物和基因工程药物的含量测定方法： 理化分析法：化学分析法：重量测定法 滴定分析法 电化学分析法 光谱分析法：比色法 紫外分光光度法 荧光分光光度法 色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC HPIEC HPGFC 灌注色谱法 HPCE法 酶法：酶活力测定法 酶分析法 电泳法 生物检定法 1．HPLC法 方法 适用范围 示例 RP-HPLC法 广泛用于肽类、氨基酸、蛋白质 生白能的测定 和多糖的定量分析 重组人粒细胞集落刺激 因子的测定 HPIEC法 分析蛋白质、多肽 HPGFC法 用于多肽和蛋白质的分析与其分 重组人肿瘤坏死因子衍 子量的测定 生物的分子量测定 应用示例：中国药典（2000年版）重组人胰岛素的质量控制 1）鉴别： 法1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。 法2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别进行梯度洗脱，供试品的肽图谱与对照品的肽图谱一致。 2）检查：检查项目有：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌、和细菌内毒素。 有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超过3.0%。 高分子蛋白质：固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量为5000～ 6000的球状蛋白。 分离度的测定：用人胰岛素单体和二聚体对照品测定分 离度，以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高 与二聚体峰高之比作为分离度，不应大于0.6。 限量的测定：分别测定供试液（1mg/ml）和对照液（将 供试液稀释成0.01mg/ml），供试液显示的所有 分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之 和，应不得大于对照液主峰面积（限量1.0%）。 3）效价测定： 系统适用性试验：测定胰岛素主峰和A21脱氨胰岛素峰之间的 分离度与拖尾因子。 含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计算含 量。 2．酶活力测定法 1）基本原理 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应速度越快所表示的酶活力越高。通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。 酶反应进程曲线：纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线：纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量，因此，测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。 2）酶促反应的条件及影响因素 ⅰ.底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 ⅱ.pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 ⅲ.温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 ⅳ.辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要相应的辅酶。 ⅴ.空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。 3）测定方法：取样测定法、连续测定法 检测方法：紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、旋光法、酶偶联测定法、电化学测定法、离子选择性电极测定法等。 三、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 生物检定法的应用范围： 药物的效价测定 大分子结构的测定 微量生理活性物质的测定 [新课小结] 重点：生化药物和基因工程药物的定义、特点及其质量检验的基本程序与方法 难点：常用定量分析方法及其应用 [作业] [练习题与答案] 1．何谓：生化药物、生物技术药物、基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生物药物的分析有何特点？