基因芯片的制作
基因芯片技术流程
制备方法及点样仪器
?探针的制备,标记 方法
?杂交,杂交液、杂交温度、
洗涤条件的选择
扫描仪,激光
CCD
分析软件的开发
基因芯片的制备
杂交
检测
数据分析
芯片的制备
? 原位合成
–高密度（可达 40万点 /1.6平方厘米）
–<25bp
–ONA
–测序分析，寻找点突变 (Hyseq专利保护 )
? 微量点样（针点、喷墨 〕
–较高密度（可达 10万点 /6.5平方厘米）
–500~5000bp
–DNA、抗体抗原、受体药物等
–对比分析
数据分析、寻找差异表达的基因
靶基因
Cy3标记 A组织
Cy5标记 B组织
混合探针
以两种波长的激光扫描
杂交
A B
杂交实验条件
? 探针的制备
标记方法
PCR
逆转录
随机引物
缺口翻译
标记物
同位素
荧光染料
化学发光
? 杂交
杂交体积 (使核酸浓度增加
10万倍）
玻片, 2-200?l
滤膜,5-50ml
杂交液和杂交液的组份
杂交温度、时间
? 洗涤条件
洗涤液的组成
洗涤的温度、时间
（探针 A + 探针 B） 混合探针
95 ℃ 变性
95 ℃ 变性
42 ℃ 15hrs
杂交
洗片试剂 1,2,3
洗涤
543nm扫描 633nm扫描
检 测
? 扫描仪
– 激光共聚焦扫描
光源：特定波长的光
激发面积,<100平方微米
如,ScanArray 3000
– CCD 成像术
光源：连续波长的光（如弧光灯）
激发面积：同时激发多个 1平方厘米的面积
Detector
Confocal
pinhole
Filter
Laser
beam
Substrate
Objective
lens
Detector lens
激光共聚焦扫描仪的扫描原理
基因芯片杂交信号散点图基因芯片杂交信号散点图
注 意 事 项
1.整个试验过程建议戴乳胶手套操作,避免带入
荧光杂质 ;
2.染料储存应避光 储存 ;
3,用于标记的 总 RNA OD260/OD280在 1.8-2.0之
间,电泳 18s和 28s条带清晰,无 DNA杂带 ;
4.标记过程中尽量避免 RNA酶污染样品 ;
5.步骤（ 3）至（ 5）需在暗室中（可配有红灯
照明）进行 ;
6.杂交及预杂交过程加盖玻片时不能留气泡，杂
交体系不能干掉 ;
7.芯片上贴标签部分整个实验过程中避免碰到液
体 ;
8.用洗片试剂洗涤芯片并将盖玻片冲洗掉的过程
中尽量避免 直接 对基因点样区直接洗涤,应尽
可能让液体从其上方温和均匀地流过点样区。
9.洗片试剂 2如有沉淀,可 40° C 温浴至澄清后使
用 。
异常结果的几种可能性分析
现 象 可能原因
扫描图谱空白 ｍ RNA降解
反转录酶失效或标记效率低
背景过高或显色不均匀 mRNA不纯
杂交或预杂交时芯片干掉
洗片不彻底
冲洗时用力过大损及点样区
出现不规则的小点 空气或洗液中的杂质污染
（面积小于点样点）
影响实验结果的关键因素
Total RNA 的制备
mRNA 质与量
RNase free
避光
基因芯片技术流程
制备方法及点样仪器
?探针的制备,标记 方法
?杂交,杂交液、杂交温度、
洗涤条件的选择
扫描仪,激光
CCD
分析软件的开发
基因芯片的制备
杂交
检测
数据分析
芯片的制备
? 原位合成
–高密度（可达 40万点 /1.6平方厘米）
–<25bp
–ONA
–测序分析，寻找点突变 (Hyseq专利保护 )
? 微量点样（针点、喷墨 〕
–较高密度（可达 10万点 /6.5平方厘米）
–500~5000bp
–DNA、抗体抗原、受体药物等
–对比分析
数据分析、寻找差异表达的基因
靶基因
Cy3标记 A组织
Cy5标记 B组织
混合探针
以两种波长的激光扫描
杂交
A B
杂交实验条件
? 探针的制备
标记方法
PCR
逆转录
随机引物
缺口翻译
标记物
同位素
荧光染料
化学发光
? 杂交
杂交体积 (使核酸浓度增加
10万倍）
玻片, 2-200?l
滤膜,5-50ml
杂交液和杂交液的组份
杂交温度、时间
? 洗涤条件
洗涤液的组成
洗涤的温度、时间
（探针 A + 探针 B） 混合探针
95 ℃ 变性
95 ℃ 变性
42 ℃ 15hrs
杂交
洗片试剂 1,2,3
洗涤
543nm扫描 633nm扫描
检 测
? 扫描仪
– 激光共聚焦扫描
光源：特定波长的光
激发面积,<100平方微米
如,ScanArray 3000
– CCD 成像术
光源：连续波长的光（如弧光灯）
激发面积：同时激发多个 1平方厘米的面积
Detector
Confocal
pinhole
Filter
Laser
beam
Substrate
Objective
lens
Detector lens
激光共聚焦扫描仪的扫描原理
基因芯片杂交信号散点图基因芯片杂交信号散点图
注 意 事 项
1.整个试验过程建议戴乳胶手套操作,避免带入
荧光杂质 ;
2.染料储存应避光 储存 ;
3,用于标记的 总 RNA OD260/OD280在 1.8-2.0之
间,电泳 18s和 28s条带清晰,无 DNA杂带 ;
4.标记过程中尽量避免 RNA酶污染样品 ;
5.步骤（ 3）至（ 5）需在暗室中（可配有红灯
照明）进行 ;
6.杂交及预杂交过程加盖玻片时不能留气泡，杂
交体系不能干掉 ;
7.芯片上贴标签部分整个实验过程中避免碰到液
体 ;
8.用洗片试剂洗涤芯片并将盖玻片冲洗掉的过程
中尽量避免 直接 对基因点样区直接洗涤,应尽
可能让液体从其上方温和均匀地流过点样区。
9.洗片试剂 2如有沉淀,可 40° C 温浴至澄清后使
用 。
异常结果的几种可能性分析
现 象 可能原因
扫描图谱空白 ｍ RNA降解
反转录酶失效或标记效率低
背景过高或显色不均匀 mRNA不纯
杂交或预杂交时芯片干掉
洗片不彻底
冲洗时用力过大损及点样区
出现不规则的小点 空气或洗液中的杂质污染
（面积小于点样点）
影响实验结果的关键因素
Total RNA 的制备
mRNA 质与量
RNase free
避光
