第一章 工业微生物的分离与筛选
本章内容：
第一节 微生物的自然分布
第二节 产生抗生素菌株的来源
第三节 工业微生物的常规分离
第四节 有用微生物的筛选
第一节 微生物的自然分布
一 土壤中的微生物
二 水域中的微生物
三 空气中的微生物
四 极端环境中的微生物
一 土壤中的微生物
◆ 1 种类
依据在土壤中的数量多少：细菌、放线菌、真菌、
藻类、原生动物、病毒
◆ 2 数量
大约 107～ 108个 /克 —— 在固体培养基上生长发育的菌数。
用显微镜直接观察要高 3～ 4倍到 102～ 103倍
土壤中大量微生物已成为分离各种抗生素、生理
活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源
原因,可以培养的微生物未生长。
发育慢或要求特别营养。
因此需进行 特别培养纯种分离 研究其性质。
二 水域中的微生物
?水环境,地球的 70%左右由水覆盖，其中溶解
和悬浮有机、无机物，流动水有氧渗
入可供微生物生长。
?微生物种类,水中有机物含量多少决定微生物
种类。
?微生物数量,海水中菌数因深度不同有变化。
深度增加菌数减少。
?应用,从海水中分离产生新抗生素、生理活性
物质菌株。
污水中的活性污泥是重要有用微生物的
来源。
三 空气中的微生物
? 环境,不利于微生物生长，所以无固定种类。
? 种类分布,主要是真菌和细菌，在医院，公共场所
致病菌的数量多。
? 作用,可迅速全球传播, 对地球上生物繁衍有
一定意义 。
四 极端环境中的微生物
?极端环境,高等动植物不能生长，大多数微生物
不能生活的高温、低温、强碱、强酸
、高盐、高压、高辐射、等特殊环境。
◆ 1 种类, 极端嗜热菌,最适生长温度 90～ 105℃,高达 110℃
极端嗜冷菌,可在零下 70～ 80摄氏度度生长。
极端嗜盐菌,新疆盐湖中的可耐受 20～ 30％的 NaCl
极端嗜碱菌, PH 9～ 10
极端嗜压菌,在深海底，生活压力 7.1～ 8.1× 107Pa
◆ 3 应用
开采石油,嗜压菌产气增压降低原油粘度。
生产特殊酶制剂,嗜碱细菌产生的蛋白酶作为洗
涤剂的添加剂
环境保护,嗜碱芽孢杆菌产生的木聚糖酶能够水解
木聚糖产生木糖和寡聚糖，可用来处理人造纤维废物
遗传工程以及基因技术,从水生栖热菌中提取耐
热的 Taq DNA聚合酶
◆ 2 特性
都为古细菌。具有不同于一般微生物底遗传机制、
特殊底细胞结构和生理功能。
第二节 产生抗生素菌株的来源
?产生抗生素的菌株主要来源于土壤，可在不同
的环境（高山、平原、河川、深海、旱地）采集
挖掘样品分离筛选。
?放线菌
?细菌
?霉菌
?担子菌
一 放线菌
◆ 1 链霉菌
40年代 Waksman发现链霉素。从土壤简单分离。
在 5000个以上的抗生素菌种中，有 50％来
自放线菌。其中从土壤样品中分离出来的
放线菌中链霉菌属约占 90～ 95％。
是分离探索多种新抗生素、新生理活性物
质产生菌的主要来源
一 放线菌
◆ 2 稀有放线菌 Rareactinomycetes
稀有放线菌, 链霉菌以外 的放线菌。如小单胞菌、
诺卡氏菌、游动放线菌、链孢囊菌、
糖多孢菌。 不易形成孢子。少见 。
常规培养基不能分离 。需对不同来
源的样品做预处理。
如分离游动放线菌：
将混浊土壤水样倾入培养皿
中，后接入花粉进行培养。或采
用加温处理。
放线菌产生的主要抗生素
链霉菌 稀有放线菌
氨基糖苷类
氯霉素
链霉素
环丝氨酸
林可霉素
新生霉素
小单胞菌
氨基糖苷类
大环内酯类
肽类
游动放线菌
缩酚肽类
肽类
多烯类
诺卡氏菌
氨基糖苷类
氯霉素
链孢囊菌
氨基糖苷类
优胜霉素
普拉克托霉
素
二 细菌
◆ 1 细菌种类,芽孢杆菌属，假单胞菌属
◆ 3 提取的优缺点
培养时间短，对生产有利。
但,※ 易受到噬菌体的侵袭
※ 易产生粘性强的多糖类
◆ 2 产生的抗生素种类,
杆菌肽、短杆菌肽、泰乐菌素、
粘菌素、多粘菌素 E,多肽类
10多种已在临床应用。
—— 防治污染
—— 采用变异菌株
三 霉菌
1 产生的抗生素
青霉素 G,青霉素 O,青霉素 V,头孢菌素、
灰黄霉素、赤霉素、烟曲霉素、黄青霉素等。
可作为筛选放线菌代谢产物的补充。
2 产生的其它物质
生理活性物质 —— 木霉生产免疫抑制剂环孢菌素
维生素 —— 棉病囊霉生产核黄素
三顶孢霉生产维生素甲原。
四 担子菌
分离的抗生素能 抗肿瘤、加强免疫 ——
革兰菌素、小奥得酮、
优灵多糖、云芝多糖、
竹黄多糖
第三节 工业微生物的常规分离
?对工业微生物的基本要求及其分离途径
?从自然界分离微生物的常规方法
一 对工业微生物的基本要求
微生物菌株是发酵生产成败的关键 。
1 菌株应为“纯种培养”。镜检无其它微生物。且
无
噬菌体感染。
2 菌种具稳定的遗传性。
3 必须能生长出可再生的单位 —— 营养细胞
孢子
4 种子质量好 —— 各级种子罐的扩大培养要生长迅
速、强健。
?有用微生物必须具备的特性
5 在短时间内可获得目的产物 —— 3天或更短。
6 菌株的自我保护及采取措施 —— 降低 PH
高温生长
加入选择性抑制剂 。
7 目的产物多，且在多组分中易分离。
?有用微生物必须具备的特性
二 从自然界分离微生物的常规方法
?1 分离培养微生物的常规操作
?2 采样分离方法
?3 微生物的接种培养方法
?4 纯化分离菌种的方法
?5 原生动物和藻类的分离培养
1 分离培养微生物的常规操作
分离 —— 从存在于自然界的混合菌群里分离出一种
微生物，并加以培养。
分离研究微生物要在 无菌条件 下进行。 防杂菌污染
包括：（ 1）操作在无菌室、无菌箱、超净工作台上进行。
使用前用 70～ 75％酒精棉球擦拭。
（ 2）培养容器（试管、培养皿）要事先灭菌。培
养时要加盖。以防污染。
（ 3）接种用具（吸管、接种环）要灭菌
（ 4）接种时塞子或盖要在火焰上过一下。
2 采样分离方法
（ 1）从自然界采样分离
培养分离
挖土
稀释
接种
—— 表面向下 5cm,编号记录
—— 1000～ 100万倍
—— 取 0.1～ 0.2ml稀释液
—— 选用易生长发育的培养基
2 采样分离方法
（ 2）从检样分离
从检样直接分离菌株时，可采取下列方法的任何一种。
A 把检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培养。
B 取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。
C 把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体
培养基。
D 将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接入固
体培养基中分离。
3 微生物的接种培养方法
（ 3）稀释平板培养法（定性、定量）
加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养
对绝对厌氧菌的辅助措施
培养用培养箱要预先 去除氧并密闭
3 微生物的接种培养方法
（ 4）厌氧菌的稀释转动分离培养法
将琼脂试管加热溶解冷却至
50℃ （保持 液态 ）,接种 一支
试管,转动混合 后取出 1/10接
入第二支试管，转动混合后再
取出 1/10接入第三支试管,依
次类推,连续接种 6～ 10支 。
冷却凝固。在琼脂培养基表面
倾注一层 无菌石蜡,防止空气
中的氧气进入。
4 纯化分离菌种的方法
挑取首批菌落
菌悬液
无菌稀释液稀释
接种到培养皿培养
重复上述步骤 单孢子分离稀释转动培养
—— 挑取一个菌落
—— 取一部分
—— 观察。必要时
所有操作
在无菌条
件下进行
5 原生动物和藻类的分离培养
单细胞分离, 用显微镜或解剖镜观察控制，从微
生物群体中分离出单一种类的微生
物个体。
方法,在无菌 液体培养基 中采用 稀释法 分离。
取细长吸液管，从菌群中吸取个体原生动物或藻类
要求,熟练的操作技术
第四节 有用微生物的筛选
筛选,从自然界某些含有菌群的材料中，用 特定 的
操作程序分离并发现有用的微生物。
筛选有用微生物是工业生产过程的第一步。
一 供筛选分离样品（采样）的来源
二 初筛
三 复筛
四 抗菌谱的测定
一 供筛选分离样品（采样）的来源
? 1 自然资源分离筛选
土壤采样分离。
最理想是 山野、农田、沼泽、湖泊、海洋
考虑不同民俗、动植物生态。
? 2 已有菌株
包括保藏的菌株。变异处理得到新的菌株。
二 初筛
?（一）目的,得到具有 潜在应用价值 的目的微生物。
初筛 一次或多次从现有菌群中把 多数无用的
微生物淘汰,把少量有用的微生物筛选
出来。
?（二） 要求,
快速 —— 有预测或预见
敏捷 —— 迅速处理好众多的样品。
经济 —— 得到有广泛目标的有用微生物。
二 初筛
?（三）筛选方法
琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛 。
1 用 PH指示剂检测有无有机酸或胺类。
中性麝香草酚蓝,PH＜ 6.0黄,PH ＞ 7.6蓝,PH6.0~7.0绿
2 在培养基中加入碳酸钙检测有机酸。
可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。
3 在培养基中加入底物检测细胞外酶、酶抑制剂等
特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应
对特定底物形成溶解或沉淀。
?（三）筛选方法
4 各种抗生素产生菌的初筛
（ 1）有代表性的常用试验菌（一部分是病原菌） 。
细菌 真菌 原虫
革兰氏
阴性菌
革兰氏
阳性菌
金
黄
色
葡
萄
球
菌
枯
草
杆
菌
八
叠
球
菌
肺
炎
双
球
菌
产
气
杆
菌
大
肠
杆
菌
痢
疾
杆
菌
普
通
变
形
杆
菌
黑
曲
霉
产
黄
青
霉
烟
曲
霉
菌
白
色
念
珠
痢
疾
阿
米
巴
球
虫
4 各种抗生素产生菌的初筛
（ 2）各种抗生素产生菌的初筛
采用 抑菌圈法，亦称平板扩散法。杯碟法
方法 培养菌液 溶化的琼脂 48℃
混合
倒平板
放检样杯碟
培养
无菌操作
有抑菌圈为
阳性反应
三 复筛
1 微生物初筛鉴定
2 发酵培养基的选择
3 培养与发酵
4 抽提试验
三 复筛
1 微生物初筛鉴定
对初筛菌株进行分类 —— 何属？何种？
目的：预知微生物对人、动物或植物是否有
致病性。
但分类复杂。轻易不作。
三 复筛
2 发酵培养条件及培养基的选择
（ 1）寻找产生目的代谢产物时的培养条件
适合微生物生长的条件，不一定是目的代谢产物
的高产条件 。温度,PH,渗透压等进行一系列试验后，
找出最适合的条件。
（ 2）确定菌株生长发育、产生代谢产物时培养
基的组分。菌种不同，发酵培养基不同。
2 发酵培养条件及培养基的选择
放线菌,碳源以葡萄糖、淀粉为主
氮源采用黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏
无机盐氯化物、硫酸镁、碳酸钙。
细菌,碳源以葡萄糖、柠檬酸钠为主
氮源肉汤、蛋白胨、豆饼粉、酵母膏
无机盐氯化钠、磷酸二氢钾，铁、锰、镁
霉菌,碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖
氮源玉米浆、蛋白胨
无机盐磷酸二氢钾、磷酸氢钾、镁、铁
液体培养基常用组分表
放线菌 细菌 霉菌 植物病原菌
碳源：葡萄糖、淀粉、
糊精、蔗糖、麦芽糖
葡萄糖、柠檬
酸钠
乳糖、葡萄
糖、蔗糖
葡萄糖、蔗糖
氮源：大豆粉、蛋白
胨、牛肉膏、玉米浆、
硝酸铵
肉汤、蛋白胨、
豆饼粉、酵母
膏、硫酸铵
玉米浆、蛋
白胨
蛋白胨
无机盐：氯化钠、碳
酸钙、磷酸氢二钾
氯化钠、磷酸
氢二钾、锰、
铁
磷酸氢二钾、
锰、铁
磷酸二氢钾癌、
磷酸氢钾、锰、
铁
三 复筛
3 培养与发酵
（ 1）试管培养
试管摇床培养。常用。
目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。
（ 2）摇瓶培养（摇瓶发酵）
250或 500ml锥形瓶再 200rpm摇床上培养。
目的：培养基和培养条件的初筛。
3 培养与发酵
（ 3）玻璃自控发酵罐
容量 5～ 50L。 是摇床向发酵罐的过渡阶段。
目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。
（ 4）试验罐培养
中间工业试验阶段
目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规
律和发酵参数。为工业规模生产打基础
3 培养与发酵
（ 5）发酵试验的三个阶段
三 复筛
4 抽提试验
采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提出来。
有四种方法：
（ 1）溶媒抽提
（ 2）用活性炭抽提
（ 3）用树脂吸附洗脱
（ 4）从菌丝体浸出抽提
（ 1）溶媒抽提
方法, 选三个不同的且与水不能混合的溶媒,如
苯、醋酸乙酯、丁醇。把培养滤液的 PH调整到 2
或 8,加入等量的上述溶媒,振荡抽提。蒸去溶
媒，用少量甲醇溶解，以缓冲液稀释后检定。
（ 2）用活性炭吸附
方法,把发酵滤液 PH调到 2,加入 1％的活性
炭,搅拌 30分钟后过滤，滤液 PH调到 8,加入
80％的丙酮 水溶液，搅拌抽提 30min,分离丙
酮提取液,蒸去丙酮，检定残余液体。
（ 3）用树脂吸附洗脱
方法,用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂或用
强碱性或弱碱性阴离子交换树脂进行吸附
（ 4）从菌丝体浸出抽提
方法,将分离的菌丝体用 甲醇抽提 后,过滤、蒸
发 得到的 甲醇溶液 为检定用试液。
或将分离的菌丝体 用水抽提后过滤的水
浸液 用于检定
新抗生素的抽提试验
发酵液
过滤、分离（离心）
4 菌丝体
浸出抽提
水抽提 甲醇抽提
过滤 过滤、蒸发
抗菌活性试验
甲醇浓缩液
清液（滤液）
1 在不同 PH条件下向溶媒转移
2 活性炭吸附洗脱
溶出洗脱
3 树脂吸附洗脱
酸碱溶媒洗脱
抗性活性试验
四 抗菌谱的测定
是筛选程序中的一环。检测抗生素对各种微
生物的最小抑菌能力。
方法,
用加入 1％甘油的普通琼脂培养基 倒平板（ A皿、
B皿）,A皿 不添加抗生素做 对照, B皿加入抗生素 。
将 试验菌分区涂 于琼脂培养基平板上并做记号 （ A,B
按同样的序号涂板）。培养一定时间，观察菌体生长情况。
例如,
检测 阿沙霉素 。试验菌用 米曲霉、新型隐球菌、点青霉、白
色念珠菌、指间发癣菌、酿酒酵母 六种菌株。
谢
谢
！
本章内容：
第一节 微生物的自然分布
第二节 产生抗生素菌株的来源
第三节 工业微生物的常规分离
第四节 有用微生物的筛选
第一节 微生物的自然分布
一 土壤中的微生物
二 水域中的微生物
三 空气中的微生物
四 极端环境中的微生物
一 土壤中的微生物
◆ 1 种类
依据在土壤中的数量多少：细菌、放线菌、真菌、
藻类、原生动物、病毒
◆ 2 数量
大约 107～ 108个 /克 —— 在固体培养基上生长发育的菌数。
用显微镜直接观察要高 3～ 4倍到 102～ 103倍
土壤中大量微生物已成为分离各种抗生素、生理
活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源
原因,可以培养的微生物未生长。
发育慢或要求特别营养。
因此需进行 特别培养纯种分离 研究其性质。
二 水域中的微生物
?水环境,地球的 70%左右由水覆盖，其中溶解
和悬浮有机、无机物，流动水有氧渗
入可供微生物生长。
?微生物种类,水中有机物含量多少决定微生物
种类。
?微生物数量,海水中菌数因深度不同有变化。
深度增加菌数减少。
?应用,从海水中分离产生新抗生素、生理活性
物质菌株。
污水中的活性污泥是重要有用微生物的
来源。
三 空气中的微生物
? 环境,不利于微生物生长，所以无固定种类。
? 种类分布,主要是真菌和细菌，在医院，公共场所
致病菌的数量多。
? 作用,可迅速全球传播, 对地球上生物繁衍有
一定意义 。
四 极端环境中的微生物
?极端环境,高等动植物不能生长，大多数微生物
不能生活的高温、低温、强碱、强酸
、高盐、高压、高辐射、等特殊环境。
◆ 1 种类, 极端嗜热菌,最适生长温度 90～ 105℃,高达 110℃
极端嗜冷菌,可在零下 70～ 80摄氏度度生长。
极端嗜盐菌,新疆盐湖中的可耐受 20～ 30％的 NaCl
极端嗜碱菌, PH 9～ 10
极端嗜压菌,在深海底，生活压力 7.1～ 8.1× 107Pa
◆ 3 应用
开采石油,嗜压菌产气增压降低原油粘度。
生产特殊酶制剂,嗜碱细菌产生的蛋白酶作为洗
涤剂的添加剂
环境保护,嗜碱芽孢杆菌产生的木聚糖酶能够水解
木聚糖产生木糖和寡聚糖，可用来处理人造纤维废物
遗传工程以及基因技术,从水生栖热菌中提取耐
热的 Taq DNA聚合酶
◆ 2 特性
都为古细菌。具有不同于一般微生物底遗传机制、
特殊底细胞结构和生理功能。
第二节 产生抗生素菌株的来源
?产生抗生素的菌株主要来源于土壤，可在不同
的环境（高山、平原、河川、深海、旱地）采集
挖掘样品分离筛选。
?放线菌
?细菌
?霉菌
?担子菌
一 放线菌
◆ 1 链霉菌
40年代 Waksman发现链霉素。从土壤简单分离。
在 5000个以上的抗生素菌种中，有 50％来
自放线菌。其中从土壤样品中分离出来的
放线菌中链霉菌属约占 90～ 95％。
是分离探索多种新抗生素、新生理活性物
质产生菌的主要来源
一 放线菌
◆ 2 稀有放线菌 Rareactinomycetes
稀有放线菌, 链霉菌以外 的放线菌。如小单胞菌、
诺卡氏菌、游动放线菌、链孢囊菌、
糖多孢菌。 不易形成孢子。少见 。
常规培养基不能分离 。需对不同来
源的样品做预处理。
如分离游动放线菌：
将混浊土壤水样倾入培养皿
中，后接入花粉进行培养。或采
用加温处理。
放线菌产生的主要抗生素
链霉菌 稀有放线菌
氨基糖苷类
氯霉素
链霉素
环丝氨酸
林可霉素
新生霉素
小单胞菌
氨基糖苷类
大环内酯类
肽类
游动放线菌
缩酚肽类
肽类
多烯类
诺卡氏菌
氨基糖苷类
氯霉素
链孢囊菌
氨基糖苷类
优胜霉素
普拉克托霉
素
二 细菌
◆ 1 细菌种类,芽孢杆菌属，假单胞菌属
◆ 3 提取的优缺点
培养时间短，对生产有利。
但,※ 易受到噬菌体的侵袭
※ 易产生粘性强的多糖类
◆ 2 产生的抗生素种类,
杆菌肽、短杆菌肽、泰乐菌素、
粘菌素、多粘菌素 E,多肽类
10多种已在临床应用。
—— 防治污染
—— 采用变异菌株
三 霉菌
1 产生的抗生素
青霉素 G,青霉素 O,青霉素 V,头孢菌素、
灰黄霉素、赤霉素、烟曲霉素、黄青霉素等。
可作为筛选放线菌代谢产物的补充。
2 产生的其它物质
生理活性物质 —— 木霉生产免疫抑制剂环孢菌素
维生素 —— 棉病囊霉生产核黄素
三顶孢霉生产维生素甲原。
四 担子菌
分离的抗生素能 抗肿瘤、加强免疫 ——
革兰菌素、小奥得酮、
优灵多糖、云芝多糖、
竹黄多糖
第三节 工业微生物的常规分离
?对工业微生物的基本要求及其分离途径
?从自然界分离微生物的常规方法
一 对工业微生物的基本要求
微生物菌株是发酵生产成败的关键 。
1 菌株应为“纯种培养”。镜检无其它微生物。且
无
噬菌体感染。
2 菌种具稳定的遗传性。
3 必须能生长出可再生的单位 —— 营养细胞
孢子
4 种子质量好 —— 各级种子罐的扩大培养要生长迅
速、强健。
?有用微生物必须具备的特性
5 在短时间内可获得目的产物 —— 3天或更短。
6 菌株的自我保护及采取措施 —— 降低 PH
高温生长
加入选择性抑制剂 。
7 目的产物多，且在多组分中易分离。
?有用微生物必须具备的特性
二 从自然界分离微生物的常规方法
?1 分离培养微生物的常规操作
?2 采样分离方法
?3 微生物的接种培养方法
?4 纯化分离菌种的方法
?5 原生动物和藻类的分离培养
1 分离培养微生物的常规操作
分离 —— 从存在于自然界的混合菌群里分离出一种
微生物，并加以培养。
分离研究微生物要在 无菌条件 下进行。 防杂菌污染
包括：（ 1）操作在无菌室、无菌箱、超净工作台上进行。
使用前用 70～ 75％酒精棉球擦拭。
（ 2）培养容器（试管、培养皿）要事先灭菌。培
养时要加盖。以防污染。
（ 3）接种用具（吸管、接种环）要灭菌
（ 4）接种时塞子或盖要在火焰上过一下。
2 采样分离方法
（ 1）从自然界采样分离
培养分离
挖土
稀释
接种
—— 表面向下 5cm,编号记录
—— 1000～ 100万倍
—— 取 0.1～ 0.2ml稀释液
—— 选用易生长发育的培养基
2 采样分离方法
（ 2）从检样分离
从检样直接分离菌株时，可采取下列方法的任何一种。
A 把检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培养。
B 取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。
C 把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体
培养基。
D 将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接入固
体培养基中分离。
3 微生物的接种培养方法
（ 3）稀释平板培养法（定性、定量）
加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养
对绝对厌氧菌的辅助措施
培养用培养箱要预先 去除氧并密闭
3 微生物的接种培养方法
（ 4）厌氧菌的稀释转动分离培养法
将琼脂试管加热溶解冷却至
50℃ （保持 液态 ）,接种 一支
试管,转动混合 后取出 1/10接
入第二支试管，转动混合后再
取出 1/10接入第三支试管,依
次类推,连续接种 6～ 10支 。
冷却凝固。在琼脂培养基表面
倾注一层 无菌石蜡,防止空气
中的氧气进入。
4 纯化分离菌种的方法
挑取首批菌落
菌悬液
无菌稀释液稀释
接种到培养皿培养
重复上述步骤 单孢子分离稀释转动培养
—— 挑取一个菌落
—— 取一部分
—— 观察。必要时
所有操作
在无菌条
件下进行
5 原生动物和藻类的分离培养
单细胞分离, 用显微镜或解剖镜观察控制，从微
生物群体中分离出单一种类的微生
物个体。
方法,在无菌 液体培养基 中采用 稀释法 分离。
取细长吸液管，从菌群中吸取个体原生动物或藻类
要求,熟练的操作技术
第四节 有用微生物的筛选
筛选,从自然界某些含有菌群的材料中，用 特定 的
操作程序分离并发现有用的微生物。
筛选有用微生物是工业生产过程的第一步。
一 供筛选分离样品（采样）的来源
二 初筛
三 复筛
四 抗菌谱的测定
一 供筛选分离样品（采样）的来源
? 1 自然资源分离筛选
土壤采样分离。
最理想是 山野、农田、沼泽、湖泊、海洋
考虑不同民俗、动植物生态。
? 2 已有菌株
包括保藏的菌株。变异处理得到新的菌株。
二 初筛
?（一）目的,得到具有 潜在应用价值 的目的微生物。
初筛 一次或多次从现有菌群中把 多数无用的
微生物淘汰,把少量有用的微生物筛选
出来。
?（二） 要求,
快速 —— 有预测或预见
敏捷 —— 迅速处理好众多的样品。
经济 —— 得到有广泛目标的有用微生物。
二 初筛
?（三）筛选方法
琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛 。
1 用 PH指示剂检测有无有机酸或胺类。
中性麝香草酚蓝,PH＜ 6.0黄,PH ＞ 7.6蓝,PH6.0~7.0绿
2 在培养基中加入碳酸钙检测有机酸。
可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。
3 在培养基中加入底物检测细胞外酶、酶抑制剂等
特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应
对特定底物形成溶解或沉淀。
?（三）筛选方法
4 各种抗生素产生菌的初筛
（ 1）有代表性的常用试验菌（一部分是病原菌） 。
细菌 真菌 原虫
革兰氏
阴性菌
革兰氏
阳性菌
金
黄
色
葡
萄
球
菌
枯
草
杆
菌
八
叠
球
菌
肺
炎
双
球
菌
产
气
杆
菌
大
肠
杆
菌
痢
疾
杆
菌
普
通
变
形
杆
菌
黑
曲
霉
产
黄
青
霉
烟
曲
霉
菌
白
色
念
珠
痢
疾
阿
米
巴
球
虫
4 各种抗生素产生菌的初筛
（ 2）各种抗生素产生菌的初筛
采用 抑菌圈法，亦称平板扩散法。杯碟法
方法 培养菌液 溶化的琼脂 48℃
混合
倒平板
放检样杯碟
培养
无菌操作
有抑菌圈为
阳性反应
三 复筛
1 微生物初筛鉴定
2 发酵培养基的选择
3 培养与发酵
4 抽提试验
三 复筛
1 微生物初筛鉴定
对初筛菌株进行分类 —— 何属？何种？
目的：预知微生物对人、动物或植物是否有
致病性。
但分类复杂。轻易不作。
三 复筛
2 发酵培养条件及培养基的选择
（ 1）寻找产生目的代谢产物时的培养条件
适合微生物生长的条件，不一定是目的代谢产物
的高产条件 。温度,PH,渗透压等进行一系列试验后，
找出最适合的条件。
（ 2）确定菌株生长发育、产生代谢产物时培养
基的组分。菌种不同，发酵培养基不同。
2 发酵培养条件及培养基的选择
放线菌,碳源以葡萄糖、淀粉为主
氮源采用黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏
无机盐氯化物、硫酸镁、碳酸钙。
细菌,碳源以葡萄糖、柠檬酸钠为主
氮源肉汤、蛋白胨、豆饼粉、酵母膏
无机盐氯化钠、磷酸二氢钾，铁、锰、镁
霉菌,碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖
氮源玉米浆、蛋白胨
无机盐磷酸二氢钾、磷酸氢钾、镁、铁
液体培养基常用组分表
放线菌 细菌 霉菌 植物病原菌
碳源：葡萄糖、淀粉、
糊精、蔗糖、麦芽糖
葡萄糖、柠檬
酸钠
乳糖、葡萄
糖、蔗糖
葡萄糖、蔗糖
氮源：大豆粉、蛋白
胨、牛肉膏、玉米浆、
硝酸铵
肉汤、蛋白胨、
豆饼粉、酵母
膏、硫酸铵
玉米浆、蛋
白胨
蛋白胨
无机盐：氯化钠、碳
酸钙、磷酸氢二钾
氯化钠、磷酸
氢二钾、锰、
铁
磷酸氢二钾、
锰、铁
磷酸二氢钾癌、
磷酸氢钾、锰、
铁
三 复筛
3 培养与发酵
（ 1）试管培养
试管摇床培养。常用。
目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。
（ 2）摇瓶培养（摇瓶发酵）
250或 500ml锥形瓶再 200rpm摇床上培养。
目的：培养基和培养条件的初筛。
3 培养与发酵
（ 3）玻璃自控发酵罐
容量 5～ 50L。 是摇床向发酵罐的过渡阶段。
目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。
（ 4）试验罐培养
中间工业试验阶段
目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规
律和发酵参数。为工业规模生产打基础
3 培养与发酵
（ 5）发酵试验的三个阶段
三 复筛
4 抽提试验
采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提出来。
有四种方法：
（ 1）溶媒抽提
（ 2）用活性炭抽提
（ 3）用树脂吸附洗脱
（ 4）从菌丝体浸出抽提
（ 1）溶媒抽提
方法, 选三个不同的且与水不能混合的溶媒,如
苯、醋酸乙酯、丁醇。把培养滤液的 PH调整到 2
或 8,加入等量的上述溶媒,振荡抽提。蒸去溶
媒，用少量甲醇溶解，以缓冲液稀释后检定。
（ 2）用活性炭吸附
方法,把发酵滤液 PH调到 2,加入 1％的活性
炭,搅拌 30分钟后过滤，滤液 PH调到 8,加入
80％的丙酮 水溶液，搅拌抽提 30min,分离丙
酮提取液,蒸去丙酮，检定残余液体。
（ 3）用树脂吸附洗脱
方法,用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂或用
强碱性或弱碱性阴离子交换树脂进行吸附
（ 4）从菌丝体浸出抽提
方法,将分离的菌丝体用 甲醇抽提 后,过滤、蒸
发 得到的 甲醇溶液 为检定用试液。
或将分离的菌丝体 用水抽提后过滤的水
浸液 用于检定
新抗生素的抽提试验
发酵液
过滤、分离（离心）
4 菌丝体
浸出抽提
水抽提 甲醇抽提
过滤 过滤、蒸发
抗菌活性试验
甲醇浓缩液
清液（滤液）
1 在不同 PH条件下向溶媒转移
2 活性炭吸附洗脱
溶出洗脱
3 树脂吸附洗脱
酸碱溶媒洗脱
抗性活性试验
四 抗菌谱的测定
是筛选程序中的一环。检测抗生素对各种微
生物的最小抑菌能力。
方法,
用加入 1％甘油的普通琼脂培养基 倒平板（ A皿、
B皿）,A皿 不添加抗生素做 对照, B皿加入抗生素 。
将 试验菌分区涂 于琼脂培养基平板上并做记号 （ A,B
按同样的序号涂板）。培养一定时间，观察菌体生长情况。
例如,
检测 阿沙霉素 。试验菌用 米曲霉、新型隐球菌、点青霉、白
色念珠菌、指间发癣菌、酿酒酵母 六种菌株。
谢
谢
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