家畜繁殖学实验指导 张忠诚 朱士恩 编 家畜繁殖学实验实习指导 第一部分 实验指导 实验一 公母畜生殖器官观察 目的要求 认识各种公母畜生殖器官的位置、形态、大小及解剖结构特点；了解生殖器官的结构与生理功能的关系。为学习家畜繁殖学及更好地掌握和应用繁殖技术奠定解剖学基础。 材料和方法 （一）材料 1．各种公母畜生殖器官浸制标本及挂图（或投影）。 2．大磁方盘、解剖刀、剪刀、镊子、金属探针、投影仪。 （二）方法 用投影与标本观察相结合；比较各种家畜生殖器官的异同。 三、内容 （一） 公畜生殖器官的观察 公畜生殖器官包括：睾丸（及阴囊和精索）、附睾、输精管、尿生殖道、副性及阴茎。 1．睾丸：家畜睾丸成对，分别位于阴囊的两个腔内。均为长卵圆形。一侧有附睾附着，为附睾缘；另一侧为游离缘。随畜种不同大小有差别。牛、羊、猪的睾丸相对比较大，以羊的睾丸为最大。马（驴）阴囊位于两股之间的腹股沟区，睾丸长轴与地面平行，附睾位于睾丸的背外缘，附睾头在前、尾在后。牛、羊阴囊较马阴囊稍靠前，位于前腹股沟区，睾丸长轴与地面垂直，附睾位于睾丸的后侧，附睾头在上、尾在下。猪的阴囊位于股部之后，睾丸长轴倾斜，前低后高，附睾位于睾丸的前上缘，附睾头在前下方、尾在后上方。 2．附睾：位于睾丸的附着缘。分头、体、尾三部分。头膨大，由睾丸输出管相连结。睾丸输出管汇合成一条较粗而长的附睾管盘曲成附睾体和附睾尾，最后过渡为输精管。 3．精索、输精管：输精管由附睾管延续而来，而后进入由睾丸系膜、血管、淋巴管、神经、睾内体提肌共同组成的精索（成锐三角形）。沿腹股沟管进入腹腔，此后即和精索内的其它部分分开。单独向后上方进入骨盆腔。至膀胱背面，两侧输精管都进入尿生殖皱襞内。在此处输精管变粗，形成输精管壶腹。马（尤其是驴）的输精管壶腹发达。猪的输精管壶腹不明显。牛、羊的输精管壶腹比较明显，粗细介于马和猪之间。输精管壶腹部的实质为分支管状腺体组织，有分泌物排出。 4．副性腺： （1）精囊腺：成对位于膀胱颈背面的两旁，输精管末端的两侧。与同侧的输精管形成射精管，共同开口于尿生殖起始部的精阜上。马的精囊腺呈梨形囊状，向后缩小成输出管。牛、羊、猪的精囊腺都是由致密的分叶腺体组织构成。牛、羊的精囊腺比马的小。而猪的精囊腺特别发达。 （2）前列腺：位于膀胱尿道开始处精囊腺之后。马的前列腺由两个侧叶和一个峡部所构成，形似蝴蝶，为复管状腺，有许多排出管开口于精阜的两旁。牛和猪的前列腺分为体部和扩散部两部分。体部位于膀胱颈与骨盆尿道交界处，牛的为棱形，猪的为纽扣形。猪的体部小，而扩散部很大，包在骨盆尿道部尿道粘膜外面尿道海绵体肌间，由体部向后延伸而来，其腺管成行开口于尿生殖道内。羊的前列腺最不发达，仅有扩散部，而且为尿道肌所包围，外观看不到。 （3）尿道球腺：成对位于尿生殖道骨盆部出口的外侧两旁，各有一个排出管（马有7～8个）开口于尿道内。猪的尿道球腺最为发达，为圆柱状，上面覆盖的尿道球肌很薄，所以能看出它的分叶。马的尿道球腺比猪的小，牛、羊的最小，均成球状，上面覆盖的尿道球肌较厚。 5．尿生殖道、精阜：尿生殖道是公畜尿和精液排出的共同管道。可分为骨盆部和阴茎部，以坐骨弓为界，在交界处管腔变窄，形成尿道峡部。阴茎部位于阴茎海绵体腹面的尿道沟内。在尿生殖道骨盆部的腹面正中线上作纵行切口，可以看到起始部尿道上壁有一圆形隆起的精阜，上有射精孔，是输精管和精囊腺的输出管共同形成的开口。前列腺的开口在其两侧，尿道球腺开口在其后。 6．阴茎：阴茎由阴茎根、阴茎体和龟头组成。阴茎借助于两个阴茎脚固定于坐骨弓，从这里开始，在两股之间沿着下腹壁走向脐部，龟头位于其末端。阴茎由两个阴茎海绵体和腹面的尿道海绵体组成，为阴茎的勃起组织。马的阴茎长而粗大呈扁圆柱状，龟头膨大，其前下侧有一龟头窝，内有尿道突。牛的阴茎在阴囊之后形成“S”形弯曲，并由阴茎伸缩肌固定于阴茎根上，交配时伸直。龟头上下较扁且前端有些扭转。羊的阴茎与牛的相似，但比牛的细小，尿道突细长，呈蚯蚓状，绵羊的较长，山羊的较短。猪的“S”状弯曲在阴囊之前。龟头呈螺旋状。其上有一包皮盲囊。 （二）母畜生殖器官的观察 母畜的生殖器官包括：卵巢、输卵管、子宫、阴道（以上四部分合称为“内生殖器官”）、尿生殖前庭、阴唇、和阴蒂（这三部分合称为“外生殖器官”）。位于腹腔合骨盆腔内，上面为小结肠和直肠，下面为膀胱。前下方为小结肠和大结肠。牛的左前侧为瘤胃，马的右前侧为盲肠。子宫颈以前的“内生殖器官”，靠子宫韧带连到腹腔背侧。子宫颈以后的各部分，靠结缔组织及脂肪固定在骨盆腔侧壁上。 1．卵巢：家畜的卵巢由卵巢系膜悬吊在腹腔的腰部、肾的后方。 马：卵巢似豆形或肾形。附着缘宽大，游离缘内陷形成排卵窝。根据发情周期的不同时期，卵巢的直径大小为3～7cm不等。由于卵泡发育，卵巢的外形也随之改变，带有黄体的卵巢体积虽然增大，但外形变化不明显。卵泡排卵后，首先形成红体（血凝块），在黄体组织初形成时，呈皱襞状包着红体。然后在黄体的形成过程中，红体逐渐被吸收。老黄体的体积缩小，一端指向排卵窝。 牛：卵巢为卵圆形。比马的卵巢小（约12～16g），中等大的母牛，卵巢平均长2～3cm，宽1.5～2cm，厚1～1.5cm。排卵后多不形成红体，黄体往往凸出于卵巢表面。卵巢位于两侧子宫角尖端的外侧下方，耻骨前缘附近。 羊：卵巢比牛的圆。体积也小些。其它特点同牛。 猪：有发达的卵巢囊，卵巢和输卵管有时包在卵巢囊内。卵巢体积和形状随着母体的成熟程度而有不同。初生仔猪卵巢形似肾脏，在接近性成熟时，由于卵巢上许多的小卵泡，体积增大，形状好似桑椹。达到性成熟时，卵巢上有许多大卵泡及黄体和红体，很象一串葡萄，在此期间卵巢体积最大。 2．输卵管：为成对的弯曲管道。从卵巢附近开始延伸到子宫角尖端。输卵管的前1/3段较粗，称输卵管壶腹，是精子和卵子结合受精的部位；后2/3段变细，称为输卵管峡部。两者的连接部称为壶峡连接部。输卵管的子宫端是与子宫角尖端相连接，成为宫管连接部。 马：输卵管有许多弯曲，输卵管的腹腔端扩大呈漏斗状，其边缘不整齐，形成许多皱襞，称为输卵管伞。输卵管伞附着在卵巢的排卵窝旁边。卵巢囊比较发达。宫管连接部界限明显。 牛、羊：输卵管弯曲较少。输卵管伞部发达。输卵管和子宫角之间的界限不明显。 猪：输卵管有许多小弯曲。输卵管伞比较大。其开口接近卵巢囊的底部。输卵管和子宫角之间界限明显。 3．子宫：大部分位于腹腔，少部分位于骨盆腔。前接输卵管，后接阴道。借助于子宫阔韧带悬于腰下。分子宫角、子宫体、子宫颈三部分。 马：整个子宫呈“Y”形。为双子宫。两个子宫角不如双角子宫那样长、那样明显。子宫角为扁带状。稍弯曲呈弓形，似香蕉。子宫角小弯在上，大弯在下，小弯上的浆膜和子宫阔韧带相连接。妊娠时，胎儿占据两个子宫角。子宫粘膜上有大量纵行皱褶。 子宫体接于两个子宫角联合处，子宫体的下部称为子宫底。马的子宫体较其它家畜的发达。 子宫颈前接子宫体，子宫颈外口突出于阴道腔2～4cm，构成明显的子宫颈阴道部。子宫颈管的粘膜形成许多高低不等的纵形皱襞。子宫颈通常是自然关闭的，但在发情或分娩以及发生某些疾病时松弛而张开。 牛、羊：子宫形状似弯曲的绵羊角。子宫角向前下方弯曲再向后上方。子宫角的大弯在上，小弯在下。两个子宫角在靠近子宫体的一段外表彼此粘连，在内部有纵隔将之分开，在粘连部分的上缘有一明显的纵沟（称为角间沟）。这类子宫为双角子宫。每个子宫角都是从基部开始向前逐渐变细。子宫粘膜上有突起的子宫阜（成为怀孕牛、羊母体胎盘）。牛和羊的子宫阜不同之点在于羊的子宫阜的中央有一凹陷。 牛、羊的子宫体均比较短。 牛、羊的子宫颈肌肉层发达，质地较马的坚硬，在牛的直肠检查时很容易摸到。牛的子宫颈管道内不仅有纵形皱襞，而且还有大而横行的皱襞，使子宫颈管关闭很紧。羊的这种皱襞更明显。子宫颈外口突出于阴道中，经产牛肥大，呈菜花状。 猪：子宫角在靠近子宫体5～10cm的部分也是彼此相连的。分开的两个子宫角形成许多弯曲，很似小肠。成熟母猪的子宫角长100～150cm。 猪的子宫体不明显。 猪的子宫颈长约10～18cm，子宫颈管内粘膜有两排交错的半圆形突起，呈连续性的放射状，中间的较大，两端的较小。子宫颈的前方与子宫体、后方与阴道均没有明显的界限，而是逐渐地过渡，因此没有子宫颈阴道部。人工授精时输精管很容易插入。 此外，还有双子宫型动物，如兔和大鼠，两个子宫角的每一个具有分开的子宫颈管道，通向阴道。 4．阴道：呈管状，壁薄，具有弹性。为母畜的交配器官。位于骨盆腔内，上为直肠，下为膀胱和尿道，前接子宫，后接尿生殖前庭。马、牛的阴道长约25～30cm；猪、羊约10～15cm。粘膜层为复层扁平上皮细胞，发情时发生角质化。无腺体。阴道前部子宫颈口周围形成一个环形隐窝称为阴道穹隆。猪无阴道穹隆。牛、羊交配时，精液射到阴道穹隆附近；马、猪精液则射到子宫颈或子宫内。 5．外生殖器官（也称外阴部）：包括尿生殖前庭、阴唇和阴蒂。 （1）尿生殖前庭：是指生殖系统和泌尿系统公共的雌性管道部分。即尿道外口至阴门裂的部分。马、牛的前庭较长；猪、羊的较短。于阴道交界处腹侧，马和羊有很明显的阴道瓣（一粘膜褶）；牛和猪不明显。 马的前庭小腺和前庭大腺分别开口于前庭底部和顶部的数个乳头上。 牛尿道腹侧有一粘膜形成的盲囊。前庭大腺开口于侧壁一小盲囊。 羊的前庭大腺似一小豆，开口于前庭侧壁。有时没有。 猪的前庭大腺开口于中线两旁的两条粘膜皱褶之间。前庭小腺开口于前庭底中部凹陷两旁的一对皱褶之间。 （2）阴唇、阴蒂：阴唇分左右两片而构成阴门，两片阴唇的上端及下端联合起来形成阴门上角和下角。马的阴门上角较尖，阴门下角较圆；牛、羊及猪的阴门相反，下角较尖，呈锐角，且垂至坐骨弓的下面。 在阴门下角内包含有球形凸起物即阴蒂，由勃起组织（海绵体）构成，有丰富的感觉神经分布。阴蒂与雄性龟头同源。 6．子宫动脉（子宫中动脉）： 牛的子宫动脉位于岬部之前、最后腰椎处，与脐动脉共同于髂内动脉，沿子宫阔韧带走向子宫角小弯进入子宫。 马的子宫动脉起于髂内动脉之前的髂外动脉，或者与髂外动脉共同起于腹主动脉，它沿子宫阔韧带的中部行走，到达子宫角小弯而进入子宫。 子宫动脉向前与卵巢动脉子宫支，向后与尿生殖动脉子宫支吻合。 四、作业 1．通过观察和比较，说明各种公、母畜生殖器官的形态、大小、相互关系和大体构造以及在活体上的位置有何特点。 2．绘出任一种公、母畜生殖器官的标本图。 实验二 公畜睾丸、母畜卵巢组织学及精子发生、卵泡发育过程的观察 一、目的和要求 通过家畜睾丸、卵巢组织切片观察，了解家畜睾丸、卵巢的组织结构及其形态。了解精子的发生和卵子的发生、卵泡的发育过程及其形态。 二、材料和方法 （一）材料、仪器 1．．公畜睾丸、母畜卵巢组织切片；公畜睾丸、母畜卵巢组织学及精子发生、卵泡发育过程的幻灯片、多媒体投影仪或胶片投影仪。 2．显微镜、幻灯机或投影仪。 （二）方法 教师先结合投影或挂图进行讲解，使学生对公畜睾丸、母畜卵巢组织学结构及精子发生、卵泡发育过程有了初步的了解。然后再用显微镜进行睾丸、卵巢组织切片的观察。 三、内容、观察步骤 （一）公畜睾丸的组织学观察 1．低倍镜观察： （1）被膜：由浆膜和白膜构成。外层浆膜为一较薄的固有鞘膜，从腹膜延伸而来。内层白膜为弹性结缔组织白色薄膜层，其中富有血管。白膜下为实质部分，即睾丸的功能层。 （2）睾丸纵隔和中隔：睾丸纵隔为睾丸的一端伸向睾丸实质的结缔组织素，并向四周发出许多放射状的结缔组织小梁，伸向白膜。这些结缔组织小梁称为睾丸中隔。猪的睾丸中隔较发达；牛、羊的薄而不完整。 （3）睾丸小叶：睾丸中隔将睾丸实质分成许多小叶，小叶的尖端朝向中央，小叶的基部朝向睾丸的表面。每个小叶由2～3条盘曲的曲精细管及血管和间质细胞组成。曲精细管直径约200μm。据估测，牛的曲精细管拉直，头对头相接，可长达几千米，占睾丸重量的80％。 曲精细管在各小叶的尖端先各自汇合成直精细管，穿入睾丸纵隔结缔组织内，形成弯曲的导管网，称为睾丸网（马无此结构），为精细管的收集管道。睾丸网又分出12～15条睾丸输出管，汇入附睾头，形成附睾管。 2．高倍镜观察： （1）睾丸小叶的结构：由曲精细管及其间质细胞构成。此外，还有血管、淋巴管等。 （2）间质细胞：又称Leydig细胞。体积较大，分布于曲精细管之间，近似卵圆形或多角形，胞质嗜酸性，核大而圆。具有分泌雄激素的功能。 （3）曲精细管的结构：曲精细管的管壁自外向内由同心圆状排列的结缔组织、基膜和复层上皮构成。上皮细胞成层地排列在基膜上，可分为足细胞核生精细胞两种。 （4）足细胞：又称Sertoli细胞、支持细胞、营养细胞。体积较大而细长。但数量较少。属体细胞。呈辐射状排列在曲精细管中，分散在各期生殖细胞之间，其底部附着在曲精细管的基膜上，游离端朝向管腔，常有许多各精子嵌在上面。该细胞高低不等，界限不清。细胞核较大，位于细胞的基部，着色较浅，具有明显的核仁，但不显示分裂现象。由于它的顶端有数个精子伸入胞浆内，故一般认为此种细胞是对生精细胞起着支持、营养、保护等作用。足细胞失去功能，精子便不能成熟。 （5）生精细胞（生殖细胞）：数量比较多，成群的分布在足细胞之间，大致排列成3～7层（同心圆排列）。根据不同发育阶段及其形态特点又可分为：精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精（子）细胞和精子。 精原细胞：位于最基层，紧贴基膜。细胞体积较小，呈圆形，常有分裂现象。是精子生成的干细胞。细胞质比较清亮。细胞核大而圆，富含染色质，因而着色较深。 初级精母细胞：位于精原细胞上面，排成几层，常显示有分裂现象。细胞体积较大，呈圆形。细胞核呈球形，富有染色质，故着色较深。分裂时，因染色体所处不同的活动时期而呈线状、棒状或粒状。在最初阶段与精原细胞不易区别。随着细胞离开基膜向管腔移动，同时胞浆不断增多，胞体不断变大，具有明显的胞核。 次级精母细胞：位于初级精母细胞的内侧。体积较小。细胞呈圆形。细胞核为球形，染色质细粒状。由于该细胞很快分裂为两个精子细胞，因而在切片上很难找到它。 精子细胞：位于精母细胞内侧，靠近曲精细管的管腔。常排列成数层。并且多密集在足细胞游离端的周围。细胞体积更小，胞浆少。胞核呈球形，着色深。 精子：位于或靠近曲精细管的管腔内。有明显的头和尾，呈蝌蚪状。头部含有核物质，染色很深，常深入足细胞的顶部胞浆中。尾部朝向管腔。精子发育成熟后脱离曲精细管的管壁，游离在管腔中，随后进入附睾。 精子是一种独特的细胞，不含细胞质。成熟后还有前进运动的能力。 3．精子发生过程（spermatogenesis）可分为两个明显的时期。第一时期：精细胞生成：精原细胞经一系列分裂形成精子细胞。第二时期：精子形成（spermiogenesis）：精子细胞变形成为精子。 原始生殖细胞在移向胚胎睾丸后，经一系列有丝分裂形成性原细胞。初情期前，性原细胞分化成A0型精原细胞，为所有其它精原细胞的干细胞。A0、A1和A2精原细胞均沿着曲精细管基膜排列。A2型精原细胞分裂形成一个休眠（A1型）精原细胞和一个活动的（A3型）精原细胞。牛和羊的活动型精原细胞经4次有丝分裂，最后形成16个初级精母细胞。 初级精母细胞不久进入成熟分裂的前期，经过中期、后期和末期逐渐完成第一次成熟分裂，产生两个较小的次级精母细胞。其核内染色体数目减半，这种分裂又称为减数分裂。 几个小时后，次级精母细胞进行第二次成熟分裂，形成两个精子细胞。 精子细胞不再进行分裂，经过一系列复杂的形态变化，即分化为精子。 对于绵羊，一个精原细胞的干细胞可以分裂为16个初级精母细胞或64个精子。 休眠的A1型精原细胞经有丝分裂，形成A2型精原细胞。这对于精子发生的持续进行非常重要。 随着精子发生的进行，生精细胞逐渐由曲精细管基膜移向管腔。 精子发生整个过程的完成，羊需要46～49d；猪稍短些（36～40d）；牛长些（56～63d）。 （二）母畜卵巢的组织学观察 1．低倍镜观察： 在低倍镜下找出卵巢表面上皮和白膜，区分卵巢的皮质部和髓质部。 （1）表面上皮：位于卵巢皮质的最外层，为单层立方上皮细胞所组成。马卵巢表面上皮仅分布于排卵窝。其余部分被浆膜覆盖。 （2）白膜：位于表面上皮的一薄层致密结缔组织。 （3）皮质部：位于白膜下面、卵巢的外周部分（马的则位于卵巢中央靠近排卵窝处）。由许多大小不等的发育卵泡和闭锁卵泡、少量黄体以及较致密的结缔组织所构成。占卵巢的大部分，与髓质无明显界限。由于皮质部含有卵泡和产生卵巢激素的细胞，故也称“功能层”。 （4）髓质部：位于卵巢中央（马则在卵巢周围）。内含有许多细小的血管、神经和富有弹性纤维的疏松结缔组织。 2．高倍镜观察： （1）卵泡发育的观察： 每个卵泡都由位于中央的卵母细胞和围绕在卵母细胞周围的卵泡细胞所组成。有的卵泡在发育过程中可能退化而形成闭锁卵泡。卵泡可根据发育程度不同而分成下列各期。 1）原始卵泡：卵泡呈球形。卵原细胞有丝分裂增殖停止，形成初级卵母细胞。初级卵母细胞进入第一次减数分裂，然后休止在前期的双线期。初级卵母细胞位于中央，周围包有一单层扁平的卵泡（颗粒）细胞。卵母细胞的体积比较大，中央有一圆形的泡状核，核内染色质稀少，着色较浅，核仁明显。卵泡细胞体积小，核扁圆形，着色深。所有的原始卵泡在出生前就形成了。它处于贮备状态未进入生长。常常在皮质外周成群的出现，称作“卵窝”。据估计，一头出生牛犊卵巢中央有大约75，000个原始卵泡。 2）初级卵泡：初级卵母细胞迅速生长，外有一层立方形的颗粒细胞包围。此时，卵母细胞已有透明带形成。并由卵泡颗粒细胞长出绒毛渗透到透明带内，为卵母细胞提供营养。 3）次级卵泡：初级卵泡经过发育和生长，即成为次级卵泡。卵母细胞体积基本不变，但外围的卵泡颗粒细胞生长。卵母细胞由多层颗细胞所包围。其外有卵泡膜形成。 4）三级卵泡：卵泡体积增大。颗粒细胞之间有液体形成并将它们分开，形成卵泡腔。小卵泡腔合并成为大卵泡腔。初级卵母细胞逐渐发育增大，胞浆中卵黄颗粒增多。透明带为较均一的厚层蛋白质膜。卵泡细胞层增厚。 5）成熟卵泡：也叫Graafian卵泡。三级卵泡进一步成熟，形成充满卵泡液的水泡，卵泡突出于卵巢表面。卵泡体积很大。卵泡腔扩大。此时初级卵母细胞长大成熟，核呈空泡状，染色质很少，核仁明显。胞浆内富有卵黄颗粒。排卵前即恢复并完成第一次减数分裂，结果形成大小不等的两个细胞，大的细胞为次级卵母细胞，小的叫第一极体。透明带变厚。极体呈卵圆形，位于透明带与次级卵母细胞之间的卵黄周隙，只要由核质构成，以后逐渐退化。 Graafian卵泡的卵泡壁由几个功能细胞层构成。最外层，为有较多纤维细胞层的外膜；向内为内膜层。这两种细胞层由毛细血管网提供血液。外膜与内膜层分界明显，常合称为卵泡膜。内膜增厚，内膜细胞肥大，呈圆形或多角形，类脂质颗粒增多，细胞核为椭圆形。在内膜层下面有一层基膜，将内膜与最内层细胞即颗粒细胞层分开。基膜阻止血管系统进入颗粒细胞层。随着卵泡腔扩大，颗粒细胞层变薄，包围卵泡腔。颗粒细胞排列整齐。有时可见到细胞分裂。 此外，卵丘（颗粒细胞形成的小丘）位于卵泡腔的一侧。卵丘和其它颗粒细胞包裹卵母细胞。与卵母细胞直接接触的颗粒细胞呈辐射状排列，称作放射冠。排卵开始时。放射冠细胞与周围的卵泡壁颗粒细胞之间开始出现裂隙，彼此的联系疏松。 牛、羊、猪的卵泡在排卵前（马排卵后）完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞。随即开始第二次减数分裂，然后休止在中期（M）。受精过程才使第二次减数分裂恢复并完成。结果产生合子（受精卵）及第二极体。因而，牛、羊、猪、马等家畜没有真正的卵子存在。 6）闭锁卵泡：初级卵泡退化后，一般不留痕迹。但生长卵泡退化时，卵母细胞萎缩，透明带皱缩塌陷，卵泡液被吸收，卵泡壁凹陷，以后结缔组织侵入泡内。 （2）黄体：是排卵后的卵泡转变成的富于血管的内分泌器官。牛、羊、猪的黄体位于卵巢皮质浅层突出于表面。马的黄体则完全埋藏在卵巢深部。根据黄体发育阶段而分成下列各期。 1）血体期：卵泡破裂后，血液流入卵泡腔内，形成血凝块，也叫红体期。 2）增生期：当破裂卵泡伤口愈合，黄体细胞增生，外观呈黄色。黄体细胞分下列两种： A、粒黄体细胞：来源于卵泡颗粒细胞。多分布于黄体中心，着色浅，呈多角形，体积较大，胞质出现类脂质颗粒，球形细胞核明显。 B、膜黄体细胞：来源于内膜细胞。多分布在黄体边缘或粒黄体细胞之间，体积小，核及胞质着色较深。 3）血管盛开期：血管与结缔组织伸入黄体中心，形成花彩状，黄体细胞清晰可见。 4）成熟期：黄体增大到最高峰，黄体内各种结构明显。 5）白体期：黄体退化、萎缩，变成白色的痕迹。 3．输卵管组织学 输卵管从外向内由浆膜、肌层和粘膜三层不同细胞层构成。 （1）粘膜：由上皮和固有膜构成。粘膜形成若干初级纵襞，在壶腹内又分出许多次级纵襞。 上皮：为单层柱状纤毛上皮。其中央为无纤毛的分泌上皮细胞。在漏斗和壶腹部的的上皮纤毛较高，向子宫逐渐变低。纤毛向子宫端颤动，有助于卵的运送。分泌细胞的分泌物可供卵的营养。 固有膜：由致密的纤维性结缔组织构成。但在壶腹部组织较疏松，伸入皱褶内构成支柱。 （2）肌层：分内环肌和外纵肌两层。两侧之间无明显界限。靠近子宫端的肌层较厚。伞部的外纵肌消失，仅含有分散的肌细胞。 （3）浆膜：为输卵管壁最外层。浆膜基本上为结缔组织。在肌层和浆膜之间有很宽的一层疏松结缔组织，叫浆膜下层，其中含有卵巢和子宫血管的分支、淋巴管、神经和纵行平滑肌。 4．子宫组织学 子宫壁分为三层：内膜、肌层和外膜。 （1）内膜：由上皮和固有膜构成。 上皮：为单层的柱状上皮。细胞有时有纤毛。无纤毛的细胞有分泌性质。上皮陷入固有膜内，形成子宫腺。 固有膜：又叫内膜基质。为环形的结缔组织，纤维较细，还有网状纤维和网状细胞，之间有各种白细胞和巨噬细胞、淋巴管、血管和子宫腺。 子宫腺是弯曲的分支管状腺。管壁由单层柱状上皮构成，多为分泌粘液的细胞，纤毛细胞较少。管壁外有分层的结缔组织鞘。 （2）肌层：分厚的内环肌和薄的外纵肌，在内外肌层之间为血管层，其中有神经分布。 （3）外膜：为浆膜，由疏松结缔组织和间皮组成。 四、作业： 1．绘出并注明睾丸曲精细管及其所含细胞的构造图。 2．绘出并注明卵巢组织结构及卵泡发育各阶段示意图。 实验三 孕马血清促性腺激素（PMSG）效价的生物测定 一、目的和要求 PMSG是由马（驴）的子宫内膜杯状细胞所分泌的一种糖蛋白激素。兼有促卵泡素（FSH）和促黄体（LH）双重生物学活性，但以FSH活性为主。母马在怀孕40天左右在血液中出现。170天左右消失。本实验的目的在于：1）用生物学方法测定妊娠母马血清中的PMSG的含量，用生物学单位来判定其效价。2）校验商品PMSG生物制剂的生物效价。 通过实验要求学生熟练掌握PMSG生物测定方法。为将来进行家畜繁殖方面的科研、教学和畜牧生产实践应用打下基础。 二、实验原理 某一激素对靶器官起作用，靶器官产生特定的生理反应。PMSG能促进动物卵泡发育成熟，引起发情和排卵，也能引起卵巢和子宫的发育。以小白鼠子宫发育增大为测定活性的根据，测得该激素引起小白鼠子宫阳性反应的最低有效浓度，从而计算样品的活性效价，即为该样品的PMSG的小白鼠单位／毫升（MU/ml）。 三、材料 （一）实验动物：选择同品系的、20～21日龄（未到性成熟，阴门未开张）、体重未10～12g的雌性健康小白鼠90只。小白鼠只数可因人多少而变动。 （二）测试样品：PMSG生物制剂或孕马血清。 （三）器械及药品：1ml注射器、4号针头、10ml注射器及9号针头、1ml和2ml吸管、酒精棉球、碘酒棉球、生理盐水、大小镊子、外科剪、鼠解剖板、搪瓷盘、试管架、10或20ml试管或试剂瓶。 四、方法和步骤 1．测试组的确定：为使效价的测定精确，应先将各测试样品浓度组距加大进行粗测，以测得样品较为精确的效价。 2．小白鼠分组：将小白鼠随机分成六组，每组10只。分别编号。其中一组为对照。其余小鼠为备用。根据学生人数分成相应的组进行实验。 3．PMSG的稀释：用生理盐水先将PMSG制剂稀释20倍，作为工作液。然后再用生理盐水将工作液稀释成含PMSG不同的浓度组（见附表1）。 该浓度使根据预测样品中激素效价的大致范围而设计的组间距离。 4．注射：每组学生分别就其中一种浓度的PMSG给本组的10只小白鼠进行注射。其中5只小白鼠做颈背部皮下注射，另外5只做腹腔内注射，剂量为0.2ml／只。对照组用相同方法注射等量的生理盐水。 注射方法：1）颈部皮下注射法。用手指捏住小鼠的头及尾部进行固定。用酒精棉球消毒其颈背部。提起皮肤，将连在1ml注射器上的4号针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起但不露出针尖，再注入药物。随着药物的推入，在皮下可见到鼓起一个小泡，表明药物已注入皮下部位。凡注射部位有外渗的小鼠必须淘汰，换鼠重新注射。2）腹腔内注射法。操作者一只手固定小鼠，另一只手注射。用酒精棉球消毒腹部，然后在阴部前方平行进针，再与腹中线呈45度角刺入腹部，缓缓注入药物，注射后针头应逐步退出。注射完毕，小鼠放置在相同条件下饲养。 5．剖检：注射药物后72 ～76h，采用颈椎脱臼法处死小白鼠。然后将小鼠固定在解剖板上，用外科剪剪开腹腔。找到子宫，拨开其它器官，直接观察子宫增大情况。也可将子宫卵巢剥离取出，观察子宫增大情况。凡比对照组子宫增大一倍或一倍以上者为阳性反应。并做好记录，记下每组反应的只数。 6．效价确定：某一浓度使5只小白鼠子宫为阴性反应时，表明该样品所含的实际效价低于该组的小白鼠单位。某一浓度使5只小白鼠子宫全部呈阳性反应时，表明该样品所含的实际效价高于该组的小白鼠单位。当阳性反应数递减到只有3只小白鼠的一组，定为最低有效浓度组。将该组稀释浓度的分母乘以5（因为每只小白鼠注射0.2ml，计算1ml样品中的小白鼠单位即乘以5），其乘积即为待测PMSG的活性效价，以MU/ml表示。 五、实验注意事项 1．进行生物测定时，应选纯系小白鼠（至少时纯种小白鼠）。 2．剂量要准确。稀释时一定要摇匀。 3．所用试管、鼠笼摇及时作好标记。 4．对照组小白鼠子宫粗细不一时，应选择平均粗度的子宫进行比较。 5．按要求进行小白鼠的饲养管理。 六、作业： 根据解剖结果，计算出测定样品中每毫升所含的PMSG小白鼠单位。 附表1 PMSG稀释浓度换算小白鼠单位表 组别 每毫升PMSG工作液 加入生理盐水量（ml） 稀释后PMSG浓度 注射量（ml/只） PMSG的小白鼠单位（MU/ml）  1 2 3 4 5 对照 7 9 10 11 13 生理盐水 1/160 1/200 1/220 1/240 1/280  0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 800 1000 1100 1200 1400   附表2 孕马血清稀释倍数换算小白鼠单位表 组别 每0.1ml血清中加入 生理盐水量（ml） 稀释后PMSG浓度 注射量（ml/只） PMSG的小白鼠单位（MU/ml）  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.1 1.5 1.9 2.3 2.7 3.1 3.3 3.9 4.3 4.7 1/12 1/16 1/20 1/24 1/28 1/32 1/36 1/40 1/44 1/48 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240   实验四 兔的超数排卵、胚胎移植及早期胚胎观察 一、目的和要求 通过实验了解促卵泡素（FSH），孕马血清促性腺激素（PMSG），人绒毛膜促性腺激素(hCG)的作用。了解卵子的正常和异常形态结构，认识受精卵和未受精卵之区别，初步掌握冲卵、检卵技术，为掌握胚胎移植技术打下基础。 二、材料和仪器设备 1．动物：选择健康的成年未孕母兔。分组后，用作超排处理的供体。另外，准备两只母兔，作胚胎移植受体。实验母兔最好用产过仔的母兔，效果较好。需公兔2～3只。 2．药品：FSH、PMSG、hCG、0.9％NaCl、75％酒精、碘酒、新洁而灭、冲卵液、846麻醉药。 3．器材：玻璃注射器（20ml、10ml、1ml），兔用手术台、创巾、止血纱布、药棉、缝针、缝线、消炎粉、青霉素、链霉素、剪毛剪、止血钳、镊子、手术刀、剪、塑料细管（冲卵管）、表面皿、移卵管、连续变倍实体显微镜。 三、供体兔超排分组及操作步骤 FSH处理组：先用碘酒棉球消毒母兔颈部皮肤，每只颈部皮下注射FSH10～15IU或0.15mg（动物所产品）。连续注射6次，每次相隔10～14h。总量为0.9mg/只。最后一次注射FSH后12h，从耳静脉注射hCG75IU（先用酒精棉球消毒耳朵边缘）。随即放置于公兔笼中，观察是否配种。一般来说，超排处理后，母兔阴部表现出发情症状，能成功地配种。 PMSG处理组：母兔颈部皮肤消毒同上。于颈部皮下一次注射PMSG150IU。之后48～72h时，同上述方法注射同量hCG。即同公兔交配。 对照组：颈部皮下注射生理盐水。其它处理同上。 四、手术冲胚方法 于注射hCG并与公兔交配后24、36或48h，进行冲胚。 1．耳静脉注射10ml空气，处死母兔。如做活体手术，则用846麻醉药麻醉（耳静脉注射0.3ml/只）后再按外科手术要求打开腹腔。 2．将母兔背朝下方固定于兔手术台上。 3．在母兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后分别用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。然后盖上创巾并固定好。 4．用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。活体冲卵时，要注意止血，随时用温生理盐水纱布保温术部。 5．打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。仔细观察卵巢的变化。记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。 6．先在卵巢附近找到输卵管伞，从伞部插入冲卵管并用手指或夹子固定，另一端接表面皿。另一人用10ml注射器配上9号针头，吸一管冲卵液（也可用生理盐水代替）。从子宫向输卵管方向，于子宫角末端和输卵管交界的无血管处插入针头，使针头伸入输卵管内并用手指固定。然后慢慢的推动注射器，将冲卵液注入输卵管，使冲卵液由伞部收集到表面皿内。一般每次5ml即可。注意冲卵液不得流失。 五、胚胎观察 将接有冲卵液的表面皿置于实体显微镜下，检查胚胎的数量和发育形态。 正常兔受精卵为卵圆形，直径约140μm，在透明带外围有一厚层粘蛋白层（为兔胚胎特有结构）。卵黄颗粒很细，分布很均匀。容易看到核的变化。在卵黄周隙内可见两个极体。而未受精的卵母细胞中，粗细不一的卵黄颗粒清楚可见，且分布不均。不能看到细胞核。在卵黄周隙内只有一个极体。一般在交配后24h，受精卵已发育成2-细胞胚胎。48h即发育成16-细胞胚胎（早期桑椹胚）。 六、胚胎移植 1．受体的选择：选择与供体发情时间一致（相差不超过一天）的受体（自然发情或超排处理诱发发情）。 2．麻醉、保定及开腹手术：参照供体处理方法。 3．胚胎分装：先向移卵管内吸进少量PBS，接着吸入一点空气，然后再将胚胎连同少量PBS吸入，接着再吸入一点空气和PBS, 在移卵管尖端需保留一端空隙。这样就可防止胚胎丢失。 4．移植部位：将胚胎移入排卵侧的生长道内。凡从供体输卵管内得到的胚胎应移植到受体输卵管内。从输卵管伞部插入2～3cm深，轻轻地注入胚胎，然后慢慢地抽出移卵管。一般一侧输卵管可移植5～10枚胚胎。如从供体子宫内收集的胚胎也应移植到受体母兔相应的部位。 5．按外科手术要求分别缝合肌层和皮肤。并进行消毒。注意术后护理。 七、作业 简述实验过程和结果，根据结果进行分析。 附： 杜氏PBS冲卵液（配制100ml）： NaCl 0.8g   KCl 0.02g   MgCl2·6H2O 0.01g   KH2PO4 0.02g   Na2HPO4·12H2O 0.2903g （Na2HPO4, 0.1150g）  葡萄糖 0.10g   丙酮酸钠 0.0036g   CaCl2 0.01g （CaCl2·2H2O 0.01325g）  （单独用少量蒸馏水溶解后,加入）    BSA 0.40g    实验五 小鼠超数排卵及早期胚胎的质量鉴定 一、目的和要求 通过实验及操作，使学生了解孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）对卵巢机能的生理作用，掌握超数排卵方法和早期胚胎的质量鉴定，充分认识正常与异常胚胎的形态结构及等级划分标准，为大家畜超数排卵和胚胎移植打下良好的基础。 二、材料 1．实验动物：5～6周龄昆明白系雌性小鼠为超数排卵的供体，成年同系公鼠与之1:1配比。 2．药物与试剂：PMSG、hCG、75％酒精、冲胚液（mPBS）、矿物油。 3．器材：一次性1ml注射器、镊子、剪刀、表面皿、巴氏吸管、Ф直径35mm培养皿、实体显微镜等。 三、超数排卵方法及胚胎采集 取5～6周龄昆明白系雌性小鼠，间隔48h分别腹腔注射10IU PMSG和hCG，hCG注射后与性成熟公鼠合笼，次日检查阴道栓，有栓雌鼠在注射hCG后78～84h处死、摘取子宫，在实体显微镜下，用含有mPBS液的1ml注射器将子宫置于表面皿中冲洗3遍，以回收桑椹胚及早期囊胚。操作液和胚胎置于37℃恒温台上保存。 四、胚胎质量鉴定 将回收的胚胎用mPBS洗净后，移入新鲜的覆盖有矿物油的100μl mPBS液滴中，在4×10倍以上实体显微镜下进行胚胎质量鉴定。 （一）胚胎的级别划分 目前对胚胎的质量鉴定基本上采用形态学的方法，将胚胎分为A级（1级）、B级（2级）、C级（3级）和D级（4级）四个级别。其中A级和B级胚胎为移植可利用胚胎。 A级 胚胎发育形态正常，轮廓清晰，卵裂球大小均匀、致密、整齐、清晰，色泽和透明度适中，发育速度与胚龄相一致。 B级 轮廓清晰，色泽适中，卵裂球密度和大小良好、但稍有不均，有个别卵裂球游离，发育速度与胚龄相一致。 C级 轮廓不清晰，色泽发暗，卵裂球不十分匀称，结构松散，变形，发育较慢。 D级 卵裂球多数变形、异常，发育缓慢。 （二）异常胚胎 异常胚胎指胚胎体积过小、过大、呈椭圆形、扁形、带有大型极体，细胞内有大空泡，透明带破裂、收缩，卵裂球色泽发暗、界限不清、个别萎缩、边缘变得粗糙，空透明带，在透明带内无一定结构的变性胚胎等。 （三）未受精卵 呈圆球形，外周有一圈折光性强且发亮的透明带，中央为质地均匀色泽较暗的细胞质，透明带和卵黄膜之间的空隙很小甚至看不到。 五、作业 将观察到的不同发育阶段的正常胚胎、异常胚胎或未受精卵绘图并加以说明。 实验六 哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存 一、目的和要求 目的是使同学了解哺乳动物胚胎的玻璃化冷冻保存的基本操作程序，初步掌握冷冻与解冻的基本方法。 二、材料 小白鼠、玻璃化溶液、解冻液（0.5mol/L 蔗糖液）、mPBS、液氮、液氮罐、表面皿、定时钟、0.25ml塑料细管、注射器、封口粉、保温杯、巴氏吸管、记号笔、温度计、剪刀、金属推杆、镊子、水浴锅、实体显微镜。 三、胚胎的采集 方法同实验五 四、玻璃化溶液的配制（见下表） 各种预处理液和玻璃化溶液的组成（v/v） 溶液 (Solution) EG DMSO mPBS FS  预处理液（Pretreating solutions）  10％EG 10％ — 90％ —  20％EG 20％ — 80％ —  5％E+5％D 5％ 5％ 90％ —  10％E+10％D 10％ 10％ 80％ —  冷冻液 (Vitrification solutions)  EFS30 30％ — — 70％  EFS40 40％ — — 60％  EDFS30 15％ 15％ — 70％  EDFS40 20％ 20％ — 60％  EG or E: ethylene glycol；DMSO or D: dimethyl sulfoxide；FS：Ficoll＋Sucrose 五、细管法玻璃化冷冻保存 （一）一步法玻璃化冷冻保存 将室温调至25℃±0.5℃，用0.25ml的塑料细管(France)按顺序吸入0.5mol/L蔗糖液（5.5cm）—空气（1.5cm）—玻璃化溶液（0.5cm）—空气（0.5cm）—玻璃化溶液（1.5cm），然后平行地置于操作台上。用巴氏吸管将胚胎直接移入1.5cm段的玻璃化溶液中，将细管继续吸入空气（0.5cm）—玻璃化溶液（0.5cm）—空气（0.5cm）—0.5mol/L蔗糖液（1.0cm）。最后用封口粉将细管封闭投入液氮中。从胚胎装入细管到投入液氮的操作时间为0.5～2min。 （二）二步法玻璃化冷冻保存 胚胎在移入细管内玻璃化溶液（1.5cm段）之前，在25℃室温下，于10％EG或10％E+10％D低浓度的抗冻保护剂溶液中平衡5min（预处理），以后操作同一步法。 （三）解冻方法 在25℃室温下，将冷冻保存的细管样本于25℃水中进行解冻，首先在空气中停留约10s，然后平行地浸入水中并轻轻晃动，待管中蔗糖溶液段由乳白变为透明时取出细管，拭去水分，剪掉粉剂封口端，用金属推杆推动棉栓，使管中内容物连同胚胎流入含有0.5mol/L蔗糖溶液的表面皿中，实体显微镜下迅速回收胚胎，并移入新鲜0.5mol/L蔗糖液小滴中平衡5min，以脱出细胞内部的乙二醇或DMSO，再用mPBS洗净后移入培养小滴中，置于二氧化碳培养箱中培养。 六、培养与观察 解冻后的胚胎用mPBS洗净后移入培养液小滴（小白鼠胚胎用CZB或mKRB；牛、羊胚胎用M199或SOF；兔胚胎用F10）中，置于二氧化碳培养箱（小鼠胚胎的培养条件为37℃、5％CO2、100％湿度；牛、羊、猪和兔胚胎的温度为38.5～39℃）中培养，每隔12h小时进行观察，记录胚胎发育情况。 七、作业 写出胚胎玻璃化冷冻·解冻的基本操作程序，并记录解冻后胚胎存活率、培养后的囊胚发育率及囊胚孵化率。 实验七 人工授精器材的认识和假阴道的安装 一、目的和要求 1．熟悉人工授精所用的采精和输精器材,了解其用途及使用方法。 2．练习假阴道的安装方法。 二、材料和仪器设备 1．采精器材：各种公畜采精用假阴道，牛、羊电刺激采精棒，猪手握法采精用的橡胶手套等。 2．输精器材：各种母畜输精器、阴道开张器、额灯和手电筒。 3．辅助器材及药品：高压灭菌器、酒精灯、长柄钳、镊子、玻璃棒、棒状温度计、漏斗、量杯、灭菌凡士林、70％和95％酒精棉球、滑石粉、来苏儿、洗衣粉等。 三、方法和步骤 先由老师讲解人工授精器材的构造、各部名称和用途，并作假阴道安装的示范。然后学生分组观察并作假阴道的安装练习。 （一）人工授精器材的认识： 1．假阴道：未长筒状，由外壳、内胎和集精杯（管）三个主要部分组成。其粗、细和长、短因畜种而异。不同国家不同时期的设计形式也不尽一致，目前我国常用的有美、苏和日等形式。 外壳：牛、羊和猪的假阴道外壳一般为硬橡胶或塑料制成的圆筒，中部装有可吹气、注水和排水的开关。猪用假阴道则在此处连接一个可向假阴道内打气的双链球，以调节压力。 马的假阴道的外壳由镀锌铁皮或金属制成。分头、颈和体三部分。筒体的中部装有把柄，其侧面有吹气和注、排水孔，并有封闭塞或橡胶带。 内胎：由优质橡胶制成的胶筒，目前有些国家将其内胎面制成粗糙面，以增强采精时对阴茎的刺激，利于采精。 集精杯（管）：牛、羊用双层的棕色集精杯（苏式）或有刻度的离心管（美式）。马用黑色橡皮杯（苏式）。猪用棕色有刻度的广口瓶。当用手握法对公猪进行采精时，只需备一只乳胶手套和收集精液的容器即可。 集精杯（管）可借橡皮圈直接固定于假阴道的一端或借橡胶漏斗与假阴道连接。 2．输精器： 苏式牛、羊输精器为一长颈玻璃注射器。目前常用的为金属或塑料制成的输精管，其后连接一个橡皮球。冷冻细管精液输精则使用特制的卡苏枪或输精器。 对一些家畜的输精需借助阴道开张器和额灯或手电筒照明进行。开张器的种类和大小因畜种而异。 （二）假阴道的准备要点： 1．假阴道外壳及内胎的检查 （1）检查假阴道外壳两端是否光滑，外壳有否裂隙或开焊之处（特别时马用外壳）。 （2）检查内胎是否漏水。可将内胎注满水，用两手握紧两端，并扭转内胎施以压力，观察胎壁有无破损漏水之处，如发现应及时修补或更换。公猪的手握法采精用的乳胶手套在用前也应检查。 2．采精器材的清洗： （1）外壳、内胎、集精杯（管）等用具用后可用热的洗衣粉水清洗。内胎的油污必须洗净。 （2）以清水冲净洗衣粉，待自然干燥后即可使用。 3．内胎的安装： 将内胎放入外壳，内胎露出外壳两端大部分长短应相等。而后将其翻转在外壳上，内胎应平整，不应扭曲，再以橡皮圈加以固定。 4．消毒： 先以长柄钳夹取75%的酒精棉球擦拭内胎和集精杯，再以95%的酒精棉球充分擦拭。采精前，最好用稀释液冲洗1～2次。 5．集精杯（管）的的安装： 牛、羊、猪的集精杯（管）可借助特制的保定套或橡皮漏斗与假阴道连接。 6．注水： 通过注水孔向假阴道内、外壁之间注入50～55℃温水，使其能在采精时保持38～42℃，注水总量约为内、外壁间容积的1/3～1/2。 7．涂润滑剂： 用消毒好的玻璃棒，取灭菌凡士林少许，均匀的涂于内胎的表面，涂抹深度为假阴道长度的1/2左右，润滑剂不宜过多、过厚，以免混入精液，降低精液品质。当用手握法给公猪采精时不须使用润滑剂。 8．调节假阴道内腔的压力： 从注气孔吹入或打入（猪）空气，根据不同家畜和个体的要求调整内腔压力。 9．假阴道内腔温度的测量： 把消毒的温度计插入假阴道内腔，待温度不变时再读数，一般40℃左右为宜，马可稍高，也要根据不同个体的要求，作适当调整。 10．用一块褶成四折的消毒纱布盖住假阴道入口，以防灰尘落入，即可准备采精。 (三) 输精器材的准备 金属和玻璃制成的输精管、输精枪，最好用高压蒸汽消毒，在输精前最好将输精管用稀释液冲洗1～2次。 细管冷冻精液的输精器一般由金属外壳和里面的推杆组成。使用前金属外套应进行消毒，前端的金属套不能连续使用。使用时将细管的一端剪去，另一端插在输精枪的推杆上。借助推杆，推动细管中的活塞即可将精液推出。 若采用开张器法输精，需对开张器先进行严格消毒方可使用。 四、作业 指出各种公畜采精器材的异同及优缺点，试提出改进意见。 实验八 精液品质的肉眼检查及精子活率评定 一、目的和要求 掌握检查精子密度、评定活率的方法；熟悉肉眼检查精液品质的方法；验证观察理化因素对精子运动及生存能力的影响。 二、材料和仪器 1．精液：牛、猪或兔等任一种动物的精液。 2．药品器械：显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温台）、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、温度计、滴管、擦镜纸、纱布、试管、3%和0.9%氯化钠溶液、2%煤酚皂溶液、1/1000新洁而灭溶液、76%酒精、5%伊红、1%苯胺黑。 3．精子密度的投影图表。 三、内容和方法 （一）精液的肉眼观察 观察测定下列各项结果并记入登记表内。 1．射精量：将采集的精液倒入有刻度的试管或集精杯中，测量其容量。各种家畜的平均射精量（ml）：牛6（4～8），羊1.0（0.75～1.2），猪250（200～300），马70（30～100）。如果精液量太少，表明有问题（健康原因或采精不当）。 2．色泽、气味：家畜的精液通常为乳白色，因畜种和个体不同而有浓淡的差异。马、猪精液稀薄，灰白色；牛、羊精液浓密，为浓乳白色。无味或略带腥味。 3．云雾状的观察：取原精液一滴于载波片上，不加盖玻片，用低倍显微镜观察精液滴的边缘部分。可见牛、羊精液翻腾滚动的云雾状态。猪、马精液无此现象。按以下符号记入表内。云雾状显著者用“＋＋＋”表示；有云雾状用“＋＋”表示；云雾状不显著者用“＋”表示。 （二）精子密度的检查（显微镜观测法）及活率评分 1．检查精子的密度：取一小滴精液于洁净的载玻上，盖上洁净的盖玻片，使精液分散成均匀的一薄层，不得有气泡存留，也不能使精液外流或溢出于盖玻片上。置于显微镜下放大100倍观察，按下列等级评定其密度。 密——在整个视野中精子的密度很大，彼此之间空隙很小，看不清各个精子个体运动的情况。每毫升精液含精子数约在10亿个以上。登记时以“密”字。 中——精子之间空隙明显，精子彼此之间的距离约有一个精子的长度，有些精子的活动情况清楚可见。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约2～10亿个之间。登记时以“中”字。 稀——视野中精子稀疏、分散，精子之间的空隙超过一个精子的长度。这种精液每毫升所含精子数在2亿以下。登记时以“稀”字。 2．评定精子的活率：必须于采精后立刻在25℃左右的实验室内进行，最好在37℃保温箱内或加热的载物台上进行。在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。 用玻璃棒蘸取一滴原精液或经稀释的精液（马、猪精液的精子密度低，不须稀释；而牛、羊精液的密度大，须用0.9%氯化钠溶液稀释，其温度须与精液密度相近），滴在洁净的载玻片上，盖上洁净的盖玻片，其间充满精液，不存留气泡。也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上。置于显微镜下，放大250～400倍检查。注意显微镜的载物台须放平，最好是在暗视野中观察。 精子活动有三种类型：直线前进运动、旋转运动和原地摆动。评价精子活率是根据直线前进运动精子数的多少而定。 精子活率＝×100% 分子也可用“总精子数-非直线前进运动精子数表示。 目前评定精子活率等级的方法有两种： 十级制——在显微镜视野中估算直线前进运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级；90%者为0.9级。以此类推。 五级制——全部精子都呈直线前进运动，属于“5“级；绝大多数呈直线前进运动（约80%）为”4“级‘前进运动精子略多于半数者（约60%）为”3”级；不及半数者为“2”级；呈直线前进运动的精子数目极少者属“1”级。 精子活率是精液品质评定的重要指标。受精能力与直线前进运动精子数的多少密切相关。一般活率在50～80%之间时，输精后受精力差别不大；而低于50%者，对于受精力影响较大。 （三）死活精子百分率测定： 方法： （1）将5%的伊红和1%的苯胺黑按1:1混匀，分装于1～2ml容量的试管中（加入试管容量的1/2），并在37℃水浴中加温，随后加入原精液1～3滴，摇匀后再放回水浴中，3min后立即取出待用。 （2）从以上混合液中用火柴棍沾上一小滴于载玻片的一端，用另一载玻片进行推动制成抹片，待干燥后，高倍镜镜检（500～600倍）。抹片时，最好在35～40℃的条件下制作，而且制作过程要快。 结果：活精子头部是不易着色的，镜检时，精子头部是透明、无色的。而死精子则因伊红渗入细胞质，使整个精子头部呈红色。苯胺黑为背景染色，使着色的精子头部可见。在高倍镜下数200或500个精子，其中分别数出死、活精子各占的百分率。活精子百分率总是要比精子活率高。 活精子百分率＝ ×100% 四、作业 将实验结果填入下表内。 种公畜精液品质检查登记表 畜别 畜号 采精时间 (年月日) 射精量（ml） 色泽 气味 云雾状 密度 活率             实验九 精子密度计数检查及精子生理特性的测定 一、目的和要求 由于目测法不够准确，所以采用精子计数的方法，测定1ml精液内的精子数。不过要有一定经验才会准确。要求同学们一定要熟练掌握此法，它是目前许多简单而实用方法的基础。 精子的代谢作用主要表现为精子呼吸和果糖分解（能量代谢）两种方式。精子呼吸强度和果糖分解能力又都取决于精子的密度与活率。在相同的条件下，精子密度越大，活率越高，精子的呼吸强度和果糖分解指数也越大。所以这两种指数都可以用来作为精液品质鉴定的指标。因此，要求同学要掌握精子呼吸强度的测定方法，并了解其原理和用途。 二、精子呼吸强度的测定 （一）材料和设备 1．新鲜的牛或羊精液（其它家畜也可）。 2．器材：毛细玻璃管、载玻片、小烧杯、水浴锅、试管、试管架、滴管。 3．试剂：美兰溶液：取美兰100mg，溶解于100ml的1%NaCl溶液中，然后置于容量瓶内保存三天，再用1%NaCl溶液稀释10倍。 （二）方法和步骤 1．原理：精子在呼吸过程中，要消耗溶解在精液中的氧。由于氧的耗尽，美兰退色，美兰遇氧时又恢复其颜色（变兰），其反应机制是由于精子脱氢酶的作用，脱去糖原上的氢原子，在无氧条件下，氢原子与蓝色的甲烯兰（美兰）结合变成甲烯白（白色）。因此，实际上也是测定精子脱氢酶的活性的一种方法。 精子呼吸强度与美兰退色在时间上呈反比，精子密度越大，活率越高，则精子的耗氧量也越大，美兰退色的时间也就越短。以上过程一般要求在37℃条件下进行测定。 牛、羊精液美兰退色时间标准表 公畜 退色所需时间 评定  牛 10min 10～30min 30min以上 优 中 劣  羊 7min 8～12min 12min以上 优 中 劣   2．方法： 取美兰溶液与精液各一滴于载玻片上。混匀后，吸入到两段毛细管中约2～3cm，一段置于37～40℃条件下，另一段置于10℃条件下，比较和观察美兰退色所需要的时间。 三、精子密度的计数检查 （一）器材 普通显微镜、血球计数器、纱布、95%酒精、乙醚、3%NaCl、保温瓶、温度计、药棉、试管、滴管等。 （二）器材介绍： 1．介绍血球计数室的构造（用多媒体或投影仪）。 2．介绍血球吸管的构造及各种家畜应该使用何种血球吸管（红血球吸管或白血球吸管）。由于同学们在学习生理时已熟悉有关血球计数器的运用，故不再详述它的结构。 （1）牛、羊、鸡的精液（密度高）用红血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸3% NaCl至“101”刻度，为稀释200倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸3%NaCl至“101”刻度，则为稀释100倍。 2）猪、马、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸3%NaCl至“11”刻度，为稀释20倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸3%NaCl至“11”刻度，则为稀释10倍。 （三）方法和步骤 1．将计数室推上盖玻片。要求盖玻片被推上后以立起计数板不掉下来为原则，并且盖玻片在折光时可见到清晰的彩色条纹。 2．将盖好盖玻片的计数板置于低倍镜下观察，首先要求找到清晰的计数室。 3．用血球吸管吸精液，用药棉擦去吸管尖端外围附着的精液，并用3%NaCl稀释，因不同的家畜用不同的吸管稀释。 4．吸管吸好精液和3%NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管两端进行来回的充分摇动，混匀。然后弃去吸管中的前两滴，再将吸管尖端置于血球计数室和盖玻片交界处的边缘上，吸管内的精液自动渗入计数室内，使之自然、均匀地分充满计数室。注意不要使精液溢出盖玻片，也不可因精液不足而使计数室内有气泡或干燥处，否则，应重新操作。静放2分钟，开始计数。 5．镜检和计数：移到高倍镜下检查。 首先数出四角和正中间的五个方格中的精子数，也就是80个小方格中的精子数。载物台要平置，不能斜放。光线不必过强。 计算精子数：5个方格中共数的精子数×5＝整个计数室中25个中方格内的精子总数。也就是1m2×1/10mm＝1/10mm3的精子。如果再×10，就＝1mm3精液内的精子数。再×1000＝1ml精液内的精子数（因为100ml3为1ml）。再×稀释倍数。如果取来的精液本身不是原精液，而是经稀释“X”倍，那么还须再דX”倍。将以上的结果总括起来说： 1ml原精液内的精子数＝5个中方格数的精子数×5×10×1000×稀释倍数（如果是原精液不要דX”）。 注：（1）一般羊的精子密度大约为20～30亿／ml； 一般牛的精子密度为10～15亿／ml； 一般猪、马的精子密度为1～1.5亿／ml； 一般兔的精子密度为2～3亿／ml； 一般鸡的精子密度为35～38亿／ml。 （2）吸管用后清洗步骤： 自来水→蒸馏水→95％酒精→乙醚。 （3）计数板用后清洗方法: 自来水→蒸馏水→白稠布擦干净备用。 （4）也可用移液器稀释。 用移液器吸10μl精液＋1990μl（在小试管内先加2ml，再吸出10μl）的3%NaCl，即稀释200倍。同样，20μl精液用1980μl的3％NaCl稀释，即稀释100倍。以此类推。 还有其它方法，如在10ml离心管中，加0.5ml精液，再用NaCl稀释至10ml，即稀释20倍。 5）也可用2％伊红溶液稀释精子，既杀死精子又使精子头部着色，使计数容易。 （四）注意事项： 1．若精子压计数室的线，则以精子头为准，按照“数上不数下，数左不数右”的原则计数。 2．为了减少误差，应对同一样品做2～3次重复，求其平均值。如果计数的结果相差较大，则应进行再次检查。 四、作业 写出实验过程及其精子计数结果。 实验十 精子形态和畸形率的测定 一、目的和要求 由于所需时间等原因，无需对每次采精进行精子畸形率的测定。但应当每月对每一头种公畜进行一次畸形率的测定，以绘出精子畸形率变化图。畸形率突然增高，表明存在问题，应当查找和分析原因。畸形率在25％以内，受精力一般不受影响。畸形精子一般不表现前进运动，因而随着畸形精子数增多，精子活率下降。如在检查精子运动力时，可观察到许多畸形精子，也需要进一步作形态学检查。 通过本实验，了解家畜精液中精子形态与精液品质的关系，掌握精子形态的分类和分析方法。 二、材料和仪器设备： 精液、染色液、高倍显微镜、相差显微镜等。 三、方法和步骤： （一）威廉氏染色法： 观察精子头部形态的染色方法。 1．染色液 复红（又称品红）染色液：复红原液（10g复红溶于100ml 96％的酒精）10ml加5％的石碳酸（苯酚）100ml。取上述混合液50ml加饱和伊红酒精溶液25ml放置两周后即可使用。 美兰（又称甲基兰）染色液：美兰溶液（10g美兰溶于1000ml 96％的酒精中）30ml加0.01％KOH 100ml过虑后再加入3倍量的蒸馏水，混合后即可使用。 2．染色程序 （1）先制作精液抹片，要求薄而均匀。然后风干或用酒精灯火焰固定。 （2）浸入无水酒精中固定2～3min，取出风干。 （3）浸入0.5％氯胺T中1～2min。 （4）用清水洗1～2min。 （5）迅速通过96％的酒精、风干。 （6）放入石碳酸复红染色液中10～15min。清水中沾2次。 （7）迅速通过美兰染色液。 （8）水洗后风干。 经此染色后，精子头部呈淡红色，中段及尾部为暗红色，头部轮廓清晰。可在高倍显微镜（油镜）下清楚地区分各种头部畸形的精子。随机观察200个精子计算各类头部畸形精子的比例。 （二）苏木精—伊红染色： 用以观察精液中非精子有形成分的类型和比例。细胞核染成蓝色，细胞浆呈红色。 苏木精溶液：2g苏木精溶于100ml无水酒精中，加入100ml蒸馏水，100ml甘油，3g冰醋酸和10g铝酸钾混合，放置14天后使用，用前震荡。 伊红染液：1g伊红加入100ml 95％的酒精，染色时，取一定量的该液加入等量70％的酒精。 2．染色程序 （1）制备间断式的精液抹片（即当推制抹片时，不要一推到底，而要断续前推，使抹片厚度有一个梯度变化，染色后易于观察不同类型的精子成分），风干。 （2）浸入无水酒精中固定3～5min，风干。 （3）分别浸入95％、75％的酒精和蒸馏水中各1min。 （4）浸入苏木精染色液中5min。 （5）浸入伊红染色液中1～2min。 （6）水洗1～3min。 （7）通过70％和无水酒精。 （8）风干后，用二甲苯加盖片封存。如不保存，直接观察。 经染色后，可在高倍显微镜（油镜）下观察各种非精子有形成分的量估计它们所占的比例。细胞核染成蓝色；细胞质染成红色。 （三）精子尾部形态的观察 1．福尔马林—缓冲液的制备 将21.82g二水磷酸氢二钠和22.25g磷酸二氢钾分别溶于500ml蒸馏水中，取200ml磷酸氢二钠溶液加80ml磷酸二氢钾溶液，配成缓冲液。取该缓冲液100ml，加入40％（V/V）福尔马林溶液62.5ml，最后加蒸馏水至500ml。 2．观察程序 （1）将福尔马林—缓冲液注入容量为1ml的小玻璃管中，然后置37℃恒温箱中备用。 （2）根据原精液的浓度，向装有福尔马林—缓冲液的小管中注入2～5滴精液充分混合。 （3）取一滴混合后的精液置于载波片上，加盖片后静止数分钟。可在400倍的相差显微镜下观察精子尾部的形态。随机观察400个精子，计算各种尾部畸形精子所占的比例。 （四）精子形态的分类 1．头部畸形的精子 包括：窄头、头基部狭窄、梨形头、圆头、巨头、小头、头基部过宽、双头、顶部脱落等。但以前六种居多。 2．尾部畸形精子 包括：带原生质滴的精子（近端、远端）、无头的尾（它和无尾的头往往是一个精子的两部分，在分析时一般算作尾部的畸形）、单卷尾、多重卷尾、环形卷尾、双尾等。 3．中段畸形 包括：颈部肿胀、中段纤丝裸露、中段呈螺旋状、双中段等。 （五）非精子有形成分 多为精子形成过程中的某些退化物，生殖上皮的脱落物和血细胞等。这些成分在精液中出现的比例和类型在一定程度上能反映睾丸和精液排出管道的生理状态。 在精液中经常出现的有：白细胞、红细胞和鳞状上皮细胞等。 四、作业 绘出你所观察到的各类畸形精子。 实验十一 精子顶体染色观察 一、目的和要求 顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因它能释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的粘合基质，使精子能够通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或者不受精。精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏，先是顶体嵴部分变化，最后整个顶体消失。这些变化可用电镜观察到。但用微分干涉差显微镜及相差显微镜也能看到。精液冷冻解冻会损伤一些精子，重要的是要准确知道受伤精子百分数。优质奶牛精液冷冻前，约90％精子具有完整的顶体。冷冻后下降至60％～65％。研究表明，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间相关性更强。因而，检查精子顶体完整率很重要。 通过本实验，要求同学：1）学习精液抹片染色技术；2）观察正常精子顶体和异常精子顶体形态，计算精子顶体完整率。 二、材料和仪器设备 （一）二人一组，每组所需材料及器材： 烧杯2个（大小均可，用于清洗染色片用）；玻璃滴管2支；小磁盘、染色架各一个；卫生纸（垫在小磁盘内，以免磁盘被颜色污染）；玻璃平皿1个；切片盒一个；血球计数器2个；普通光学显微镜1台；镊子1把。 （二）公用器材 酒精棉球；姬姆萨（Giemsa）原液（预先一个月前配好）；固定液；擦镜纸；精液；蒸馏水；玻璃移液管；玻璃滴管2支，小镊子2把；pH试纸；玻璃棒2支。 （三）试液的配制： 1．磷酸盐缓冲液： Na2HPO4·12H2O 2.2g NaH2PO4·2H2O 0.55g 先用少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至100ml 用pH试纸测 pH值，应为7.0～7.2。 2．福尔马林磷酸盐固定液： （1）Na2HPO4·12H2O 2.25g NaH2PO4·2H2O 0.55g 置于100ml容量瓶中，加入0.89％NaCl溶液约30ml，使之溶解。 （2）加入甲醛MgCO3饱和液8ml 甲醛MgCO3饱和液配制方法：在500ml福尔马林（40％甲醛）中加入8g MgCO3。此饱和液必须在一周前配好。 （3）用0.89％NaCl溶液少许冲洗装过甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室温下保存。此液pH 为7.0～7.2。 3．Giemsa原液： Giemsa原料：1g 甘油：66ml 甲醇：66ml 将Giemsa染料置于研钵中，先加入少量温热（60℃）的甘油，充分研磨至无颗粒呈浆糊状。再将剩余甘油全部倒入，置56℃恒温箱中保温2小时。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一个月后才能使用。此原液放置时间越长越好，但使用前需经过滤。 4．Giemsa染液：必须在染色前配制。 Giemsa原液 : 缓冲液 : 蒸馏水的比例为2 : 3 : 5。 例如做40个片子，每个片子需用2ml染液。因此需配80ml新鲜染液。则分别取Giemsa原液16ml、缓冲液24ml、蒸馏水40ml。混匀即可。 三、顶体染色方法步骤： 先准备洁净的载波片。用洗涤灵擦洗，清水冲洗，在用蒸馏水漂洗，以不挂水珠为净。烘干或凉干备用。 1．抹片：将需测定的样品摇匀，取1滴中层精液平滴于载玻片的右端，取另一张边缘光滑平直的扁平呈35°角自精液滴的左面向右接触样品，样品精液即呈条状分布在两个载玻片接触边缘之间。将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着精液均匀地涂抹在载玻片上。切忌直接将精液滴“推”过去，人为造成精子损伤。在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号。每份精液样品需同时制作两个抹片。 2．风干：自然风干5～20min。 3．固定：将风干的抹片平置于染色架上，用滴管吸取1ml固定液，滴于抹片上，并使固定液布满于整个抹片表面。静止固定15min。 4．水洗：用玻片镊夹住抹片一端，将固定液弃去倒入染色缸或平皿内，在装有蒸馏水的烧杯中，上下左右摇晃涮洗，夹住松开镊子几次，取出抹片于磁盘边，待干。 5．染色：将固定后的抹片平置于染色架上，用滴管吸取新配制Giemsa染液约2ml，置于要染的玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上，使染液均匀布满在抹片上。静止染色90min。 6．水洗：用镊子夹住染片，将染片上的染液弃去倒入平皿内，再在装有自来水的烧杯中冲洗，冲洗方法同上。经数次涮洗，直至水洗液无色为止。洗的过程中，若水已变蓝，则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边，待干。 四、精子顶体观察 将精液染片置于显微镜下，先用低倍镜找到精子，再在1000倍下进行油镜观察。精子顶体呈紫色，包围精子头前部。 根据精子顶体完整和损伤与否，将精子顶体形态分为4种类型： 1．顶体完整型：精子头部外形正常，着色均匀，顶体完整，边缘整齐，可见微隆起的顶体嵴，赤道带清晰。 2．顶体膨胀型：顶体轻微膨胀，边缘不整齐，顶体嵴肿胀，核前细胞膜不明显或缺损。 3．顶体破损型：顶体破损，精子质膜严重膨胀破损，着色浅且不均匀，头前部边缘不整齐。 4．顶体全脱型：精子顶体全部脱落，精子核裸露。 根据以上4种类型分别统计，观察300个精子。并计算出精子顶体完整率。 精子顶体完整率＝×100％ 要求两张抹片精子顶体完整率差异不超过15％。求平均值。 一般精子冷冻前顶体完整率较高，如我国绵羊微44％～45％。解冻后1小时为25％。牛精液精子顶体完整率比羊高。猪比羊低。 五、作业 分析制片染色的质量。观察各种类型精子顶体形态。统计精子顶体完整率。 实验十二 家畜精液的冷冻 一、目的和要求 通过实验，了解家畜精液冷冻保存的基本操作和流程，初步掌握家畜精液冷冻和解冻的基本方法。 二、材料和仪器 牛和猪的精液样品、液氮罐、铝饭盒、烧杯、试管、冰箱、水浴箱、低温温度计、显微镜、盖玻片、载玻片等。 三、内容和方法 （一）牛精液的冷冻 1．冷冻稀释液的配制 12％蔗糖液 75ml 卵黄 20ml 甘油 5ml 青霉素 1000IU/ml 链霉素 1000IU/ml 2．解冻液的配制 柠檬酸钠 2.9g 蒸馏水 100ml 3．精液的稀释与平衡 稀释前先检查精液的活率，一般不低于0.7，密度应在8亿/ml左右，用与精液同温的稀释液作2～5倍稀释。将稀释后的精液用棉花包裹放入冰箱内缓慢降温到0～5℃，并保持2～4h。 4．滴冻和保存 用吸管吸取平衡后的精液滴于用液氮冷却到-100℃左右的铝饭盒的表面（饭盒表面距液氮面2～3cm），制成0.1ml剂量的冷冻颗粒。滴冻要求快速、均匀，滴冻结束应使精液颗粒停留3min，待颗粒由黄变白，即可将饭盒盖浸入液氮。然后用青霉素瓶或纱布袋收集颗粒，作好标记，投入液氮罐中保存。 5．解冻 在1ml容量的试管内装入2.9％的柠檬酸钠解冻液1ml，放入4℃的水浴中，随后取1～2粒精液投入试管中，立即摇动直至颗粒溶化再取出试管，取样观察，凡活率在0.3以上即为合格。 （二）猪精液的冷冻 1．冷冻和解冻稀释液的配制 （1）冷冻稀释液 8％的葡萄糖 77ml 卵黄 20ml 甘油 3ml 青霉素 500～1000IU/ml （2）解冻液为5％的葡萄糖溶液 2．精液的稀释与平衡 用手握法采精获得的浓份精液，活率应在0.7以上。用同温的稀释液作1:2稀释。随后用棉花和纱布包裹，放于8℃的冰箱内，缓慢降温到8℃并保持3～6h。 3．滴冻和解冻 在滴冻前，自冰箱内取出的经平衡的精液，检查活率不应低于0.6。用吸管吸取平衡后的精液，迅速滴于经液氮冷却的铝饭盒上，制成0.1～0.2ml的冷冻颗粒，停留3min后浸入液氮。 取装有5％葡萄糖解冻液的小试管一支，在40℃的水浴中遇热，投入颗粒冷冻精液一粒，经摇动直至颗粒溶化，立即取出检查精子活率。凡在0.3以上者即为合格，可用于输精。 四、作业 写出牛、猪精液冷冻的基本程序，并比较其异同。