生化工程进展
堵国成
江南大学 生物工程学院
现代生化工程的主要研究内容
1.发酵过程的优化控制技术
2.生化过程的模型化
3.高密度培养技术
4.代谢工程和代谢网络控制
5.新型生化反应器的研究和开发
6.新型发酵和产品分离技术
发酵过程的优化控制
第一部分 绪论
? 一, 发酵过程优化在生化工程中的地位
? 二, 发酵过程优化的目标和研究内容
? 三, 发酵过程优化的研究进展
? 四, 流加发酵过程的优化控制
一, 发酵过程优化在生化工程中的地位
? 现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、
药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地生
产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊化学
品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环境等重
大问题的过程中必将发挥积极的作用
? 如何才能更好地发挥现代生物技术的作用？
? 以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是
一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必
须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度 (便于下游
处理 )、较高的底物转化率 (降低原料成本 )和较高的生
产强度 (缩短发酵周期 )
发酵过程优化的主要研究内容
? 第一个方面是细胞生长过程研究
? 第二个方面是微生物反应的化学计量
? 第三个方面是生物反应过程动力学的研究
（主要研究生物反应速率及其影响因素）
? 第四个方面的内容是生物反应器工程（包括
生物反应器及参数的检测与控制）
二, 发酵过程优化的研究内容和目标
发酵过程优化的目标
? 使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、
工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂
的相互作用尽可能地简化，并对这些条件
和相互关系进行优化，使之最适于特定发
酵过程的进行
? 发酵过程优化的基础 是进行生物反应宏观
动力学和生物反应器的研究
如何实现发酵过程的优化控制？
生物反应过程动力学
动力学模型的建立
发酵过程优化控制
实现发酵过程优化控制的过程
?生物反应动力学的研究内容,是有关
生物的、化学的与物理过程之间的相互
作用，诸如生物反应器中发生的细胞生
长、产物生成、传递过程等
?生物反应动力学研究的目的,是为描
述细胞动态行为提供数学依据，以便进
行数量化处理
? 建立动力学模型的目的,是为了模拟实
验过程，对适用性很强的动力学模型，
还可以推测待测数据，进而确定最佳生
产条件
? 发酵过程优化涉及非结构模型和结构模
型的建立
?什么是非结构模型？
?什么是结构模型呢？
非结构模型
? 把细胞视为单组分，则环境的变化对细
胞组成的影响可被忽略，即细胞的生长
处于所谓的平衡生长状态，此基础上建
立的模型称为非结构模型
? 非结构模型是在实验研究的基础上，通
过物料衡算建立起的经验或半经验关联
模型
结构模型
? 由于细胞内各组分的合成速率不同而使
各组分增加的比例不同，即细胞生长处
于非均衡状态时，必须运用从生物反应
机理出发推导得到的结构模型
? 在考虑细胞组成变化的基础上建立的模
型，称为结构模型
生物反应器工程的研究内容
? 生物反应器的形式、结构、操作方式、
物料的流动与混合状况、传递过程特征
等
? 是影响微生物反应宏观动力学的重要因
素
细胞调节
过程操作 细胞环境 细胞形态
反应器特性
生物反应器中复杂的相互关系
三, 发酵过程优化的研究进展
? 20世纪 40年代初抗生素工业的兴起，标志着发酵工业
进入了一个新阶段
? 40年代末一门反映生物和化工相交叉的学科 ──生化工
程诞生
? 1954年,Hasting指出,生化工程要解决的十大问题是深
层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、
冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害
? 1964年 Aiba等人认为通气搅拌与放大是生化工程学科
的核心，其中放大是生化工程的焦点
? 20世纪 60年代中期，建立了无菌操作的一整套技术
? 1973年 Aiba等人进一步指出，在大规模研究方面，仅
仅把重点放在无菌操作、通气搅拌等过程的物理现象
解析和设备的开发上是不够的，应当进一步开展对微
生物反应本质的研究
? 1979年，日本学者山根恒夫编著了, 生物反应工程,
一书，认为生物反应工程是一门以速度为基础，研究
酶反应、微生物反应及废水处理过程的合理设计、操
作和控制的工程学
? 1985年，德国学者卡尔 ?许格尔提出生物反应工程的研
究应当包括两个方面的内容 ∶ 一是宏观动力学，它涉
及生物、化学、物理之间的相互关系；二是生物反应
器工程，它主要涉及反应器本身，特别是不同的反应
器对生物化学和物理过程的影响
? 目前一般认为生物反应工程是一门以生物反应
动力学为基础，研究生物反应过程优化和控制
以及生物反应器的设计、放大与操作的学科
? 生物反应工程的研究主要采用化学动力学、传
递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优
化原理等化学工程学原理，也涉及到生物化学、
微生物学、微生物生理学和遗传学等许多学科
领域，因此是一门综合性很强的边缘学科
? 生化反应工程的核心是生物反应过程的数量化
处理和动力学模型的建立，实现发酵过程优化
则是生物反应工程的研究目标
实现发酵过程的优化与控制，必须解决
的五个问题,
? (1)系统动力学；
? (2)生物模型；
? (3)传感器技术；
? (4)适用于生物过程的最优化技术；
? (5)计算机 ─检测系统 ─发酵罐之间的接口
技术 (如神经网络、专家系统 )
? 1) 针对有关发酵产品的生产过程进行微生物
生长和产物形成的动力学研究, 提出新的或修
正的动力学模型或表达式；
? 2)结合现代生物技术产品的开发, 进行基因工
程菌, 哺乳动物细胞或植物细胞的生长动力学
和产物形成动力学的研究；
? 3)在动力学研究的基础上进行过程优化控制的
研究, 包括状态观察方程的建立, 观察数据的
噪声过滤, 不可测参数及状态的识别, 过程离
线或在线的优化控制 。
? 其中尤以流加发酵的最优化研究报道居多
有关运用生物反应工程原理进行
发酵过程优化控制的研究
四, 流加发酵
? 所谓流加发酵, 即补料分批发酵 (Fed-
batch fermentation),有时又称半连续培
养或半连续发酵, 是指在分批发酵过程
中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵
方法
优点 缺点
分批发酵 1,一般投资较小 1,因放罐、灭菌等原因，非生产时间长
2,易转产、生产灵活 2,经常灭菌会降低仪器寿命
3,分批操作中某一阶段可获得高的
转化率
3,前培养和种子的花费大
4,发酵周期短，菌种退化率小 4,需较多的操作人员或较多的自动控制系统
连续发酵 1,可实现有规律的机械、自动化 1,操作不灵活
2,操作人员少 2,因操作条件不易改变，原料质量必须稳定
3,反应器体积小、非生产时间少 3,若采用连续灭菌，加上控制系统和自动化
设备，投资较大
4,产品质量稳定 4,必须不断地排除一些非溶性的固型物
5,操作人员接触毒害物质的可能性
小
5,易染菌，菌种易退化
6,测量仪器使用寿命长
流加发酵 1,操作灵活 1,非生产时间长
2,染菌、退化的几率小 2,需较多的操作人员或计算机控制系统
3,可获得高的转化率 3,操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可
能性大
4,对发酵过程可实现优化控制
5,因经常灭菌会降低仪器使用寿命
分批、连续、流加操作方式的比较
流加发酵的研究进展
? 在 20世纪 70年代以前流加发酵的理论研
究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以
经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇
或恒速流加
? 1973年日本学者 Yoshida等人首次提出了
,Fed-Batch Fermentation”这个术语，并
从理论上建立了第一个数学模型，流加
发酵的研究才开始进入理论研究阶段
流加发酵所取得的三个方面的重大进展
? 20世纪 70年代中后期对流加发酵过程的
动力学解析
? 结合发酵过程的可测参数对流加过程进
行反馈控制 （ 如 DO法, CO2法, RQ(呼
吸商 )法, pH法, 代谢物法, 萤光法等 ）
? 流加发酵的最优化研究
? 流加发酵最优化研究的核心问题是找出
最佳的底物流加方式，以维持发酵过程
始终处于最佳状态
? 流加发酵最优化的研究内容包括：
? （ 1）状态方程的建立
? （ 2）目标泛函的确定
? （ 3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
XVdtXVd ??)(
FSXVdtSVd F??? ?)(
XVdtPVd ??)(
FdtdV ?
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值
(最大值 )原理等
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个
问题
一、何时采用流加发酵方式？
二、如何进行底物的流加？
一、何时采用流加发酵方式？
? 所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制
作用
? 高菌体浓度培养即高密度培养系统
? 非生长耦联性次级代谢产物 (如产物的合
成需要某些营养物质或前体 )
? 利用营养突变体的系统 (过量加入营养物只能使菌体
迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏
时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 )
? 营养缺陷型菌株的培养
二、如何进行流加发酵操作？
1,流加发酵类型
2,采用流加发酵应该解决的关键问题？
3.流加发酵过程中某些重要参数的确定
4.合适的流加发酵类型的确定
5,流加方式的应用
1.流加发酵类型
流加发酵的分类
类别 流 加 方 式
无反馈控
制
反馈控制
恒流量流加, 变流量流加和间歇流加
直接控制流加, 间接控制流加
定值控制流加, 程序控制流加, 最优控制流
加
2,采用流加发酵应该解决的关键问题
(1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加
葡萄糖,饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油
脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
②补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水
③加入某些微生物生长或合成需要的微量
元素或无机盐
④加入酶合成诱导物或前体物质
(2) 如何流加？
a.底物流加速率
b.流加开始时间及总流加时间
c.需控制的底物浓度
3,流加发酵过程中某些重要参数的确定
a,最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段 )
b,底物的消耗速率
c,菌体比生长速率 (?)
d,菌体对底物的产率系数 (Yx/s)
及产物对底物的产率系数 (Yp/s)
4,合适的流加发酵类型的确定
a.恒速流加 (包括单一速率和分阶段恒速流加 )
b.指数速率流加
c.底物在线测定后的反馈流加 (如葡萄糖反馈流加 )
d,pH-stat
e,DO-stat
5,流加方式的应用
(1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时, 可得到如下
的物料平衡方程式：
细胞平衡：
碳平衡：
产物平衡：
体积平衡：
xVrdt
VXd ?)(
0
)( FSVr
dt
VSd
s ???
p
dV P Vr
dt ?
dV F
dt ?
恒流速流加过程中的流量 F的确定：
(a)预试验中所得出的流加时刻菌体对
所流加基质的消耗速率
(b)发酵液中残留基质浓度
(c)流加后需要控制的发酵液中的基质
浓度
(2) 指数速率流加
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的几
点假设如下：
(a) 发酵罐内为理想混合；
(b) 葡萄糖为唯一限制性碳源；
(c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数 (YX/s)为常
数；
(d) 菌体生长遵循 Monod方程 。
对底物葡萄糖进行衡算, 则：
F为体积流加速率 (L/h),S0为流加液中基质浓
度 (g/L),Yx/s为菌体对底物的产率系数 (g/g)，
ms为细胞比维持系数 (g/g/h),X为菌体浓度
(g/L),V为培养液体积 (L),μ为菌体比生长速
率 (h-1)。
VXm
Y
FS
dt
VSd
s
sx
???? )(
)(
/
0
?
XVm
Y
SF
dt
dV
S
dt
dS
V
cx
????????? )(
/
0
?
对菌体量的变化进行物料衡算，则：
XV
dt
XVd ??)(
假定 ?为常数，则上式 积分可得：
)( Ftt
FF eVXXV
???? ?
由于生长符合 Monod方程
μ 是 S的函数，要使 μ 恒定,S必须
恒定，则有：
SK
S
s
m
?
?
?
?
?
0?
dt
dS
)(
/0
)(
)(
1
Ftt
FFs
sx
eVXm
YSS
F ???
?
? ??
其中 tF为开始指数速率流加的时间,t≥ tF，
XF和 VF分别为 tF时刻的菌体浓度和发酵液
体积
指数速率流加的速率 F的表达式
为,
指数速率流加方式在实际过程中的注意
事项：
(1)方程中各参数要预先求知
(2)应用时流加速率 F可采用阶梯递增方
式进行设定
高生产率和高细胞密度发酵
1,细胞生长环境的优化策略
? (1)培养基组成的优化
? (2)特殊营养物的添加
? (3)限制代谢副产物的积累
2,培养模式
? (1)所培养细胞的具体代谢行为
? (2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力
? (3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力
3,诱导策略
4,细胞循环发酵 (应用限制：作用于进入过滤单元的细胞
的剪应力太大；系统的放大存在许多实际困难 )
第二部分 发酵过程优化原理
一,发酵过程优化的微生物反应原理
二,发酵过程数量化方法
三,微生物反应动力学
四,微生物反应优化的一般原理
一,发酵过程优化的微生物反应原理
1,大肠杆菌生长过程中观察到下列现象 ∶
? (1)在大肠杆菌快速生长期间, 生物合成的中间体很少渗
漏到胞外培养基中, 结构单元 (氨基酸, 核酸等 )的合成
速率和聚合形成大分子的速率一致
? (2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化
? (3)一旦生长培养基中的结构单元足够, 细胞就不再合成
这些物质
? (4)特定的代谢途径代谢特定的底物, 只有底物存在时,
细胞才合成相应的酶
? (5)若两个不同的底物同时存在于培养基中, 细胞先合成
能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系, 当这种
底物消耗完毕, 再合成利用另一底物的酶 。
? 2,细胞生长过程可分为三个步骤：
? (1)底物传递进入细胞
? (2)通过胞内反应, 将底物转变为细胞质
和代谢产物
? (3)代谢产物排泄进入非生物相, 即胞外
培养基
3,底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：
? 底物是一种存在于初始非生物相或者摄
入物中起作用的可交换的化合物
? 代谢产物是一种作为代谢物产生于某代
谢途径进入非生物相的化合物
? 细胞质成分是一种细胞利用底物产生的
不可交换的化合物
? 研究表明在膜上可能存在三种不同的运
输机制：
? (1)自由扩散
? (2)协助扩散
? (3)主动运输
? 前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，
是被动的过程，在运输过程中不需要提
供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度
进行运输，需要输入一定的吉布斯自由
能。
微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程
化合物 细菌 真菌
氨基酸
葡萄糖
乳糖
甘油
乙醇
乳酸
乙酸
二氧化碳
氧气
水
主动运输
主动运输
主动运输
自由扩散，协助扩散
自由扩散
主动运输和自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
主动运输
协助扩散和主动运输
协助扩散和主动运输
自由扩散，协助扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
4,微生物细胞的胞内反应
? (1)分解代谢反应
糖类在转化为代谢产物 (CO2、乳酸、乙酸和乙醇等 )的同时，
还形成 ATP,NADH和 NADPH。 NADH和 NADPH都在分解代
谢反应中产生，但 NADPH主要消耗于合成代谢中,NADH则
主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化
? (2)生物合成和聚合反应
为了合成细胞物质, 需要合成结构单元并将其聚合 。
合成蛋白质需消耗大量的自由能, 细胞一般根据其
自身需求来调节蛋白质的合成,其合成由蛋白质合成
系统 (PSS)负责, 该系统中核糖体是主要部分
E,coli中大约 70%的能量和还原力用于合成蛋白质
合成 E,coli细胞对前体代谢物的需求
? 细胞合成所需要的结构单元数在 75～ 100之间，这些物
质都是从 12种前体代谢物合成得到的，这些前体代谢
物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细
胞生长过程中起着双重的作用 (为生物合成提供能量和
前体代谢物 )
前体代谢物 分子式 摩尔质量 (g/ m ol ) 需要量 ( ? m ol / g 细胞 )
6- 磷酸 - 葡萄糖 C 6 H 13 O 9 P 260 205
6- 磷酸果糖 C 6 H 13 O 9 P 260 71
5- 磷酸核糖 C 5 H 11 O 8 P 230 898
4- 磷酸赤藓糖 C 4 H 9 O 7 P 200 361
3- 磷酸甘油醛 C 3 H 7 O 6 P 170 129
3- 磷酸甘油酸 C 3 H 7 O 7 P 186 1496
磷酸烯醇式丙酮酸 C 3 H 5 O 6 P 168 519
丙酮酸 C 3 H 4 O 3 88 2833
乙酰辅酶 A / / 3747
? - 酮戊二酸 C 5 H 6 O 5 146 1079
琥珀酰辅酶 A / / /
草酰乙酸 C 4 H 4 O 5 132 1787
? （ 3） 次级细胞代谢
?细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程,
称之为初级代谢
?但许多工业上重要的产品, 其合成反应并不
与生长过程偶联, 我们称之为次级代谢, 这
些反应合成的产物叫次级代谢产物, 就象初
级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样
（？ ） 乳酸是初级代谢产物, 但它是乳酸菌
在非生长条件下形成的, 许多其它的初级代
谢产物也同样是在非生长条件下产生的
初级代谢产物 定义为“在细胞
生长所需要的反应中形成的产物”
可能比较确切一些
次级代谢产物 定义为“在那些
对于细胞生长不重要的反应中形成
的产物”
一些工业上重要的初级和次级代谢产物一览
初级代谢产物 次级代谢产物
乳酸 青霉素
乙醇 头孢菌素
CO
2 四环素
乙酸 链霉素
柠檬酸 短菌肽
谷氨酸 氯霉素
赖氨酸 卡那霉素
葡萄糖酸 灰黄霉素
核黄素 赤霉素
二,发酵过程数量化方法
? 发酵过程的数量化处理包括：
? 1,发酵过程的速度
? 2,化学计量学和热力学
? 3,生产率、转化率和产率
? 只有当变量可测量时，才有可能对发酵
过程进行数量化处理
1,发酵过程的速度
变量 动力学参数 物质传递 热传递
反应速度 定义式
dt
dc
r
i
i
??
包括
Hvcposx
rrrrrr,,,,,
dt
dc
n
i
i
??
dt
dH
q
v
?
单位 g ? L
-1
? h
-1
g ? L
-1
? h
-1
kJ ? L
-1
? h
-1
比反应速率 定义式
xdt
dc
i
1
?
包括 Hvcpos
qqqqq,,,,,?
单位 h
-1
速度常数 定义式
n
i
i
c
r
k
)(
?
包括 dpr
kkk,,
21
,,
LLTr
kkk
gCOs
kkk,,
2
Hv
k
发酵过程的速度概念
发酵过程常规的参数及其测量
符号 参数 测量方法
X 生物量 细胞干重，浊度，细胞数
S 底物 酶法分析，化学法，色谱法
P 产物 酶法分析,H P L C 或特殊方法
O 氧 P
O
－专用电极分析
C 二氧化碳 Ｐ
CO ２
－专用电极分析
H
v 发酵热 温度、热平衡
菌体生长速度为 ∶
dt
dsr
s ??
dt
dxr
x ?
氧和底物利用速度为 ∶
dt
dr o
o ??
P,C和 HV生成速度为,
dt
dpr
p ?
dt
dc
rc ? dt
d H vr
Hv ?
细胞生长的比速率为 ?：
dt
dx
x
?? 1?
底物消耗的比速率为 qs∶
产物形成的比速率为 qp：
dt
ds
x
q s ?? 1
dt
dp
x
q p ?? 1
dt
do
x
q o ?? 1
氧消耗的比速率为 qo：
二氧化碳生成的比速率 为 qc：
发酵热生成的比速率：
dt
dc
x
q c ?? 1
dt
dH
x
q VH
V
?? 1
? 2,化学计量学
? 化学计量方程
? 表示通用化了的碳源
?
? 根据元素分析得出的细胞组成
?
? 表示产物
vHvWCPX
NOdcbaS
HOHCONOHCNOHC
NHONOHC
?????
???
?????
???
???????? )()()()(
)()()(
22''''
32
dcba NOHC
???? NOHC
'''' ???? NOHC
3,产率系数
? (1)宏观产率系数
? 宏观产率系数 (或称得率系数 )Yi/j是化学计
量学中一种非常重要的参数，常用于对碳
源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，
其中 i表示菌体或产物,j表示底物
? 例如，菌体对底物的产率系数可表示为：
ds
dx
r
r
dtds
dtdx
SS
XX
S
XY
s
x
t
t
sx ?????
??
?
???
/
/
0
0
/
生物反应过程中宏观产率系数的定义总览
产率系数 组分间的反应或关系 定义
Y
X/S S → X
Y
X/S
=- r
X
/r
S
Y
X/ O O 2 → X
Y
X/O
= - r
X
/r
O
Y
P/S S → P
Y
P/S
= - r
P
/r
S
Y
C/S S → CO
2
Y
C/S
= - r
C
/r
S
Y
P/O O
2
→ P Y P/O = - r P /r O
Y
Hv / S S → Hv
Y
Hv / S
=- r
Hv
/r
s
Y
C/O O 2 → CO 2
Y
C/O
=- r
C
/r
O
Y
Hv /O O 2 → Hv
Y
Hv /O
=- r
Hv
/r
O
有时，以摩尔为单位表示产率系数更有利：
? 相似的概念可用于表达重要的常数：
? 值在实践中对推导元素平衡方程很重
要, 对与氧化磷酸化有关的理论问题也
有重要意义
形成的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数
A T PY
C
A T P ?
氧消耗的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数?C
OY
COY
底物消耗的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数?C
SY
? 假设发酵过程中完全没有菌体生成，则 YP/S
可达理论最高值，称为理论代谢产物产率
? （ a） 根据化学计量关系计算
? 例如, 由葡萄糖, 氨和氧生成谷氨酸的化学
计量方程为 ∶
? 依此计算, =147/180=0.82
? 此处没有考虑反应过程中 NADH及 ATP等
辅助底物的生成和消耗
(2)理论代谢产物产率
theorSPY /
OHCONOHCONHOHC 22495236126 35.1 ?????
（ b）由生物化学计量关系计算
? 根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进
行代谢过程中有关 NAD(P)+和 ATP等辅底物的
物料衡算，结合化学计量关系可求出
? 上式：
? 由该反应式得 ∶ =(147× 13)/(12× 180)=0.75
? 此处 ?-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的
NADPH由异柠檬酸脱氢反应供给
? !！用生化计量式时,必须清楚有关的代谢途径
OHCONOHCONHOHC 22495236126 272321213 ?????
(c) 实际发酵过程中的产率系数
? 在实际发酵中, 产率是变化的, 产率取
决于下列因素：
? Y= f (菌株、底物,?,m、Ｓ；,tm、
OTR,C/N,P/O)
? 式中 m为混合度, S为底物浓度, 为平均
滞留时间, tm为混合时间, OTR为氧传递
速度, C/N为碳氮比, P/O为磷氧比
t
另外,Papoutsakis和 Lim(1981)用碳流分支的概念
来解释菌体产率变化的原因：
? 其中 r1和 r２ 分别为碳源分支代谢途径 1和途径 2的反应
速度,MX和 MS为菌体和底物的分子量,?x是 S→X 反
应的化学计量系数，可见产率只随 r２ 或 r１ 变化
? 在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化 (r2)
和氧化 (r1)
? 碳源和其它营养物的浓度或温度, pH等培养条件的
任何变化都可能引起 r２ 或 r１ 变化
? 这一概念表明, 甲基营养菌菌体产率的变化是一个
动力学问题, 而不是生物合成问题
21
/ /1
1)(
rrM
MY
SX
X
SX ??? ?
三, 微生物反应动力学
? 1,被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分
转化为代谢产物，还有一部分则转化为新生
细胞的组成物质。因此，对微生物反应动力
学进行研究，至少要对底物、菌体和产物三
个状态变量进行数学描述
? 2,微生物反应是很多种物质参与的复杂代谢
过程的综合结果。因此，微生物反应的动力
学方程只能通过数学模拟得到
? 3,进行数学模拟的难点在于细胞的生长、繁
殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程
既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞
外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反
应
? 4,为了优化反应过程, 首先要进行合理的简
化, 在简化的基础上建立过程的物理模型,
再据此推导得出数学模型 。
微生物反应动力学模型的分类
模型类型 着眼点 说明
概率论模型 微生物个体 必须考虑每个细胞的差异，以说明某一特定现象；或用以
说明平均值附近的波动情况
决定论模型 微生物群体 不考虑每个细胞的差异，而是取菌体性质及数量的平均值
进行数学处理
均相模型 微生物群体 是一种认为菌体均匀分散于培养液中，可作为均相处理的
决定论模型。
生物相分离模型 微生物群体 是将菌体作为与培养液 ( 连续相 ) 分离的生物相处理所建立
的决定论模型。这种模型需要说明培养液与菌体间的物质
传递及分配效应。在高菌体浓度时，考虑微生物所占的体
积分率，以及解析废水生物处理过程中洒水滤床和旋转圆
盘的微生物膜，都是利用生物相分离模型。
结构模型 微生物群体 考虑菌体组成的变化，将活菌体和死菌体分别处理从而建
立的模型。在单一菌体的结构模型中，将整个菌体分为两
种或两种以上成分，并认为代谢过程是各种成分共同作用
的结果。均相模型和生物相分离模型都可分别构成结构模
型
非结构模型 微生物群体 与结构模型的主要区别在于它不考虑细胞组成的变化。
（一）细胞生长动力学模型
1,无抑制作用的细胞生长动力学
? 温度和 pH恒定时, 对于某一特定培养基组分的浓
度 s,Monod方程为 ∶
? 式中, ?max称为最大比生长速率 (h-1),Ks称为半饱
和 常数 (g/L)
? 底物消耗速率方程对应为 ∶
SK
S
s ?
? m a x??
SK
Sqq
s
ss ?? m a x,
? Monod方程应满足 ∶
? (1)菌体生长为均衡型非结构生长；
(2)培养基中只有一种底物是生长限
制性底物；
? (3)菌体产率系数恒定
2,细胞生长稳定期和延迟期的 Monod型动力学
? (1) 延迟期动力学模型的建立
? (2) 生长稳定期动力学模型的建立
? 式中 ?和 ?是经验常数, 取 ?=?max和 ?=xmax，
)1(),( /m a x Ltt
s
e
sK
sts ??
?
? ??
)1(
?
? xxr x ???
3,微生物死亡期和内源代谢
? (1) 微生物死亡期的动力学模型
? Kd为 比死亡速率 (h-1)
?
? 对应于由底物生成菌体的一级反应速率为 ∶
? (2) 内源代谢的动力学模型
? 或：
? ms为细胞的维持系数 (s-1),Y*X/S为最大细胞产率
dt
dx
xkd ???
1
xkr dx )( ?? ?
XmXYr s
SX
s ?????? ?*
/
1 s
SX
s mYq ??? ?*
/
1
4,底物和产物抑制的动力学模型
? (1) 底物抑制动力学 (Andrew底物抑制 模型 )
? 式中 KIS是底物抑制常数
? ( 2) 产物抑制动力学 （ Hinshelwood模型 ）
? 式中, P为产物浓度, k为动力学常数
? 或：
? 式中 KIP为产物抑制常数
ISS KSSK //1
1
m a x ??? ??
)1(m a x PkSK S
S
???? ??
PK
K
SK
S
IP
IP
S ?
??? m a x??
（二）微生物产物形成动力学模型
? Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关
系，将产物形成区分为三种类型
? 类型 Ⅰ∶ 也称为偶联模型（醇类、葡萄糖酸、乳
酸）
? 类型 Ⅱ∶ 也称部分偶联模型（柠檬酸、氨基酸）
? 类型 Ⅲ∶ 也称为非偶联模型（抗生素、酶、维生
素、多糖）
XYrYr XPXXPP ?// ?? ?XPP Yq /?
Xrr XP ???? ?? ??? ???Pq
Xr P ?? ? ??Pq
? 上述三种类型外还有一种模型是 qP与 ?负偶联
的模型，例如黑曲霉生产黑色素，其 qP与 ?的
关系可表示为：
? 当考虑到产物可能存在分解时：
? 式中,k’d为产物分解常数
?XPPP Yqq /m a x,??
PkXrr dXP ?????? ??
四, 微生物反应优化的一般原理
? 1,发酵过程优化的一般步骤
? (1) 反应过程的简化
? 是指把工艺过程的复杂结构压缩为少数系统，这些
系统可以用关键变量来表示
? (2) 定量化
? 系统、准确地检测发酵过程的各种参数
? (3) 分离
? 是指在生物过程和物理过程的各种速度相互不影响
的情况下，精心设计实验以获得关于生物和物理现
象的数据
? (4) 数学建模
? 数学模型是能以简化的形式表征过程行为, 并
实现特定目的的数学公式
? 数学模型可将特定结果通用化, 并为推论系统
的其它性质提供基础
? 建立数学模型的主要目标是,(a)为了预见任何
系统的转化率或生产率； (b)用以检查在各种操
作条件下工厂操作的性质和行为, 检查模型适
用的范围 (包括外推性 )； (c)用于进行工艺优化
和计算机模拟； (d)用于检测出可能重要但被忽
视了的参数； (e)检查是否已有效地区分生物现
象和物理现象； (f)有助于阐明反应机理
2,分批微生物反应过程的优化
? 最优化的目标函数：产量, 生产率, 纯利润等,
有时也对这些指标的其中二个以上进行多目标函
数优化
? 最优化的操作变量：反应时间, 培养基组成, 温
度, pH,溶氧等
? * 培养基组成的优化
? 预先设定 XT为最大菌体浓度, 则由可得到底物 Si
的初始浓度为 ∶
)(1 0
/
0,XXYS T
SX
i
i
??
? 无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收, 在细胞
内保持元化学状态, 且含量恒定不变 。 这类营养
物质称为储存性底物 。 可根据这些物质在菌体内
的实际含量, 用类似于上式的方法确定其需要量
? 当代谢产物的产量与培养基组成之间的关系很复
杂, 不能用解析函数的方式表示时, 可采用实验
设计法确定最优初始浓度
? 利用最优实验设计法, 即使不能提高产量, 也可
探索培养基组分的最小需用量, 从而避免不必要
的浪费
第三部分 生物反应过程的系统优化技术
一,系统优化技术概述
二,ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成
中的应用
三,有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合
系统
四,生物反应与产物分离的组合系统
一,系统优化技术概述
1.系统的定义
? 奥地利理论生物学家贝塔朗菲于 1937年第一次
提出,系统是, 一个相互作用的诸要素的综合
体, 。
? 我国科学家钱学森对系统的定义是 ∶, 系统是
由相互作用和相互依赖的若干组成部分结合而
成的，具有特定功能的有机整体，而且这个整
体又是它从属的更大的系统的组成部分,
? 换句话说，系统是同类或相关事物按一定的内
在联系组成的整体
2,系统的一般形态有：
? (一 )自然系统和人造系统
? (二 )实体系统和概念系统
? (三 )封闭系统与开放系统
? (四 )静态系统和动态系统
? (五 )对象系统和行为系统
? (六 )控制系统和因果系统
3,系统应当具备四个基本特征
(一 )整体性 (系统是由两个以上有一定区别又有一定相关
的要素所组成，系统的整体性主要表现为系统的整体
功能 )
(二 )相关性 (各要素组成了系统是因为它们之间存在相互
联系、相互作用、相互影响的关系 )
(三 )目的性 (系统具有能使各个要素集合在一起的共同目
的，而且人造系统通常具有多重目的 )
(四 )环境适应性 (环境是指出现于系统以外的事物的总称，
相对于系统而言，环境是一个更高级的、复杂的系统。
系统必须适应外部环境的变化，能够经常与外部环境
保持最佳的适应状态，才能得以存在 )
? 4.生物反应系统优化的基本思想,
? 整体优化的思想，对所研究的对象
采用定性或定量的模型优化技术，
使系统整体目标最优
5,生物反应系统优化方法的原则主要有以下几个方面：
(一 )系统整体性原则,不能从系统的局部得出有关系统整体的结论；分
系统的目标必须服从于系统整体的目标
(二 )系统有序相关原则,系统的有序性, 是系统有机联系的反映, 系统
的任何联系都是按一定等级和层次进行的, 都是秩序井然, 有条不
紊的
(三 )系统目标优化原则,优化问题是在不可控参数发生变化的情况下,
根据系统的目标, 经常, 有效地确定可控参数的数值, 使系统经常
处于最优状态
(四 )系统动态性原则,系统优化是一个比较复杂的过程, 研究对象内部
复杂的相互作用和外部环境的多变性, 使系统本身呈现出动态特性
(五 )系统分解综合原则：分解是将系统中具有密切相关关系的要素进
行分组；综合则是完成新系统的筹建过程, 即选择具有性能好, 适
用性强的分系统
(六 )系统创造思维原则：其一是把陌生的事物看作熟悉的东西, 用已
有的知识加以辩识和解决；其二是把熟悉的对象看作陌生的东西,
用新的方法, 新的原则加以研究, 从而创造出新的理论, 新的技术 。
生物反应系统示意图
生物反应
过程
上游
加工过程
加工过程
下游
成本经济学
原料
的生物
具有
应用价值
传统育种
基因工程
细胞工程
目的产物
大规模
工艺开发
设计思想
遗传学
生理学
培养技术 反应器
发酵技术 酶技术
6.生物系统 介绍：
? (1)生物产品合成的能量 (ATP)或辅因子
(NADH)再生系统
? (2)废水生物处理的厌氧 ─ 好氧组合处理
系统
? (3)生物反应与产物提取的耦合系统
? (4)有机废水处理和有用物质生产的耦合
系统
二, ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用
1,ATP再生系统的定义及分类
? ATP再生系统可定义为一个需要 ATP的生物酶反应系统与
一个 ATP生物合成系统所构成的耦合系统
? 按底物的不同分类,ATP再生系统可分为,
? (1)转移高能磷酸基的反应系统 (以高能化合物作为底物 )
? (2)采用碳水化合物作为基质的反应系统 (以碳水化合物和
磷酸基团作为底物 )
? 利用碳水化合物为基质的 ATP再生系统根据酶源的不同又
可分为：
? (1)自耦合系统
? (2)种间耦合系统
自耦合 ATP再生系统示意图
再生 A T P 的反应系统
需要 A T P 的生物合成反应
A T P
ADP 或 A M P
ADP 或 A M P
葡萄糖
前体 产物
微生物细胞
二氧化碳
水和有机酸
种间耦合 ATP再生系统示意图
需要 A T P 的生物酶反应
再生 A T P 的反应系统
A T P A D P ( A M P )
前体 产物
葡萄糖
二氧化碳、水
有机酸 ( 或乙醇 )
大肠杆菌
产氨短杆菌或面包酵母
2,建立 自耦合系统和种间耦合系统 必须满足以下条件
? (1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定
? (2)能大量提供廉价, 稳定的前体物质
? (3)再生 ATP的活性足够强且稳定, 能与生物合成酶反应成
功地耦合
? (4)提供廉价的能量底物 (如葡萄糖 )和磷酸基团供体 (如无机
磷酸盐 )以利于 ATP再生
? (5)若有类似于分解反应的有害副反应, 则必须对其加以控
制
? (6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜, 则必须设法提高
膜的通透性
3,两 种系统的不同之处：
? 自耦合 ATP再生系统只用到一种微生物，故
该菌中必须同时具有需要 ATP的生物合成反
应的酶活性和再生 ATP的酶活性
? 种间耦合 ATP再生系统采用不同的微生物，
一种作为 ATP合成活性的供体，另一种作为
与此相偶联的生物合成酶活性的供体
? 以 E,coli作为合成酶活性的受体菌和具有较
强 ATP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵
母组合而成的种间耦合反应系统
4.自耦合 ATP再生系统
? （ 1） GMP(5'-鸟苷酸钠盐 )生产过程
? XMP＋ NH3＋ ATP→ GMP＋ AMP＋ PPi
? （ 2） ATP(腺嘌呤核苷 -5'-三磷酸钠盐 )生产过程
? 葡萄糖 → PRPP(磷酸核糖焦磷酸 )
? 腺嘌呤＋ PRPP→AMP ＋ Ppi
? 产氨短杆菌同时具有 PRPP(磷酸核糖焦磷酸 )生物合成
活性与 ATP生物合成活性, 可利用腺嘌呤为前体生产
ATP
? (3) GSH(谷胱甘肽 )的生产过程
? Glu＋ Cys＋ ATP→ ?-GC(?-谷氨酰半胱氨酸 )
? ?-GC＋ Gly＋ ATP→GSH ＋ ADP＋ Pi
?
谷胱苷肽的生物合成过程
葡萄糖
6 －磷酸葡萄糖
6 －磷酸果糖
1,6 －二磷酸果糖
磷酸二羟丙酮 3 －磷酸甘油醛
1,3 －二磷酸甘油酸
3 －磷酸甘油酸
2 －磷酸甘油酸
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
E M P
乙醛 乙醇
谷氨酸
γ －谷氨酰半胱氨酸
甘氨酸半胱氨酸
谷胱甘肽
A T P A T PA D P A D P
G S H Ⅰ G S H Ⅱ
5,种间耦合 ATP再生系统
? （ 1） IMP(5'-肌苷酸钠盐 )的生产过程
? Inosine(肌苷 )＋ ATP→IMP ＋ ADP
? （ 2） CDP(胞苷二磷酸 )胆碱的生产过程
? 氯化胆碱＋ ATP→ 磷酸胆碱＋ ADP
? CTP＋磷酸胆碱 → CDP胆碱
? 在 （ 1）和（ 2）中均采用重组 E,Coli和产氨短杆菌
? （ 3） GSH的生产过程, 可采用两种系统：
? 共固定化系统 (S,cerevisiae和 E,coli细胞一起固定化在
同一聚丙烯酰胺凝胶中 )和混合固定化系统 (S,cerevisiae
和 E,coli分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用 )
6,ATP再生系统存在的问题
? （ 1） 除了合成产物所需的关键酶以外,
细胞内还有许多种酶, 其中一些具有分
解活性, 能将反应的底物和预定的产物
转化为副产物
? （ 2） 微生物细胞具有很强的自我保护功
能, 作为渗透屏障的细胞膜可防止胞内
物质渗出 。 但当细胞用作酶源时, 这种
屏障就会阻碍底物和产物进出细胞
7,解决 ATP再生系统存在问题的办法
? ( 1) 抑制副反应的方法
? 对于具有分解, 转移底物或产物为副产物的
酶, 可通过选育缺失该酶活性的突变株, 或
优化反应条件使副产物的形成降低到最小的
限度
? ( 2) 提高膜通透性的方法
? 干燥细胞或用溶剂, 表面活性剂处理细胞都
可以提高细胞膜的通透性
? （ 3）固定化微生物细胞的方法
? 该法具有以下优势 ∶ ①不需要提取和纯化酶
的过程；②细胞可以重复使用；③可以实现
连续操作；④反应器占地小；⑤反应控制容
易；⑥要处理的液体体积小；⑦可以获得高
纯度产品；⑨工厂污染减轻
? 缺点：固定化操作较为繁琐
? 研究由固定化细胞组成的 ATP再生系统生产
有用物质的过程，仍是这一领域今后的发展
方向
三, 有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统
? 工合成塑料污染的主要特点是 ∶
? (1)污染范围广 。 江河湖泊, 田野山川无处不有
? (2)污染物增长量快 。 全世界每年对塑料的需求量为 1亿吨 。
由于价廉, 易老化, 塑料用量的增加导致其废弃物也迅速
增加, 倾入海洋的塑料垃圾达数十万吨, 陆上的更是难以
计数
? (3)处理困难 。 塑料具有耐酸碱, 抗氧化, 难腐蚀, 难降解
的特性, 埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体,
如 HCl,硫氧化物, 碳氧化物等
? (4)回收利用难 。 塑料制品种类繁多, 难以分拣回收
? (5)对生态环境危害大 。 地膜降低耕地质量, 农作物植株矮
小, 抗病力差；残膜随风飘动, 对周围环境, 畜牧业, 养
殖业都有很大的影响
生物可降解塑料的特点：
? 聚羟基烷酸酯 (Polyhydroxyalkoates，简称 PHAs)是生物
可降解材料的一个研究热点。其中聚 -?-羟基丁酸 (简称
PHB)及 3-羟基丁酸与 3-羟基戊酸的共聚物 (简称 P(3HB-
co-3HV)或 PHBV)是 PHAs族中研究和应用最广泛的两
种多聚体
? PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合
物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗
射线等外，更重要的是其还具有生物可降解性和生物
可相容性。已有研究表明，采用 PHAs制作的香波瓶，
在自然环境中 9个月后，可基本上被完全降解，而用合
成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需 100年
有机废水的资源化处理
? 有机废水是地球环境的一大污染源, 但同时也是一种
资源, 近几十年来, 有机废水的资源化技术发展极其
迅速, 已被认为是消除有机废水污染的最经济有效的
途径之一
? 用于高浓度有机废水处理的厌氧消化技术, 自 20世纪
50年代以后得到了迅速发展, 先后出现了厌氧滤池
(AF),上流式厌氧污泥床反应器 (UASB),附着膜厌氧
膨胀床反应器 (AAFEB),厌氧流化床反应器等, 其中
UASB的应用最为广泛
? 该反应器能培养并保持大量活性高, 沉降性能好的颗
粒污泥, 因而反应器的处理能力大大提高, 水力停留
时间大大缩短
有机废水的厌氧处理
? 有机废水的厌氧发酵过程是一个复杂的有多种
微生物类群参加的生物化学过程，通常可分为
酸性发酵阶段 (产酸 )和甲烷化阶段 (产甲烷 )两阶
段
? 产酸阶段主要是有机废水中复杂的大分子有机
物在厌氧条件下被水解和产酸细菌发酵成为有
机酸，如丁酸、乙酸、乳酸和丙酸等。此阶段
的细菌种类多，代谢能力强，繁殖速度快。
? 产甲烷阶段主要是产酸阶段产生的小分子有机
酸被产甲烷菌利用转化为甲烷
不同研究者的厌氧发酵产物
基质 温度 反应器 酸化相优势产物 研究者
葡萄糖 20 CS TR 丁酸 Co h e n
糖蜜废水 35 CS TR 丁酸 Gi l - P en a
葡萄糖 35 CS TR 乙酸 Z o et em e y er
葡萄糖 35 CS TR 乙酸 Ro y
葡萄糖 35 U AS B 乳酸 S h i y i L u n
有机废水处理和 PHAs生产耦合系统
? 理论依据是 ∶
? （ 1） 有机废水在厌氧处理过程中, 产酸微生物能将废
水中生物可降解的大分子物质转变为小分子有机酸,
如乙酸, 丙酸, 乳酸, 丁酸以及其它可溶性小分子化
合物
? （ 2） 真养产碱杆菌在好氧, 碳源充足, 贫氮的条件下
能利用有机酸在胞内大量积累 PHAs
? 将有机废水酸化反应器与 PHAs发酵罐相组合, 可使
酸化反应器为 R,eutrophus 提供相对稳定, 较佳的底物,
从而在发酵罐中相对廉价地生产出 PHAs
主要内容包括以下五个方面 ∶
1,有机废水生产 PHAs的初步条件；
2,R,eutropha发酵生产 PHAs最佳有机酸种类的确定, 包括以
有机酸为底物生产 PHAs的代谢机理, 理论产率和 PHAs发
酵的实际产率；
3,高效厌氧酸化工艺, 包括酸化率达 100%时有机酸分布的工
艺学条件等；
4,在小型发酵罐中, 以不同浓度的酸化废水为碳源进行分批
发酵实验, 在对 PHAs发酵过程动力学分析的基础上, 建
立较为合理的 PHAs发酵过程动力学模型；
5,进行了有机废水生产 PHAs流加发酵的初步研究, 比较了分
批和流加发酵过程中丁酸对 PHAs产率的变化
有机废水酸化和 PHAs生产耦合系统
①进水池 ②泵 ③ UASB酸化反应器 ④出水池 ⑤分离浓缩系统
⑥浓缩的有机酸 ⑦ PHA发酵罐
③
④
⑤
⑥
⑦
DO
pH
T
①
②
1,有机废水生产 PHAs的初步研究
? 有机废水生产 PHAs是指 R,eutropha 以有机废水
厌氧酸化的产物为生产 PHAs的基质
? 在一定温度下，影响有机废水酸化的主要因素：
? (a) 水力停留时间 (HRT)
? (b) pH值 (进水碱度 )
酸化阶段 HRT对发酵阶段 PHAs浓度的影响
中
液
酵
发
度
浓
H R T ( h )
2 4 6 8 10
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
度
浓
中
液
酵
发
碱度 ( m g / L )
4 00 0 6 00 0 8 00 0 1 00 0 0 1 20 0 0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
进水碱度对发酵阶段 PHAs浓度的影响
2,R,eutropha 利用不同有机酸生产 PHAs
的比较研究
? 目前研究采用的 PHAs生产方式通常有两种,
? 一种是一步发酵法，即细胞生长与 PHAs积累相偶
联；
? 另一种是两步发酵法，即微生物生长和 PHA积累
分两阶段进行，第一阶段细胞大量形成，第二阶
段细胞基本不繁殖而 PHAs大量积累，这种方法需
进行菌体的离心收集
(1) 一步发酵法生产 PHAs
采用不同工艺对有机废水进行厌氧酸化，可得到
以乙酸、丙酸、乳酸或丁酸等为优势产物的酸化废水
乙酸 丙酸 乳酸 丁酸
细胞干重 / g ? L
-1 6.5 8.9 9.7 14.8
PHA s 浓度 / g ? L
-1 2.1 4.3 5.2 10.2
PHA s 含量 / % 32.3 48.3 53.6 68.9
R,eutrophus WSH1对不同酸的利用 *
* 初始酸浓度为 10 g/L，分别在 19h,25h,32h,43h,50h加入
5 g/L的酸
(2)两步发酵法生产 PHAs
? 4种有机酸的初始浓度采用 10 g/L，并分别在发酵的 19 h,25.5 h、
32.5 h和 43 h补充加入 2.5 g/L的酸。 PHAs合成阶段初始细胞干重为
3.3 g/L，细胞中无 PHAs积累
t /h
发酵过程中菌体干重的变化
碳源为∶,丁酸；,乳酸；,丙酸；,乙酸
t /h
P H A s 的积累过程
碳源为∶,丁酸；,乳酸；,丙酸；,乙酸
(3) R,eutropha WSH1利用混合酸发酵 PHAs
初始酸浓度 10 g/L(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各 2.5 g/L)，发酵 41 h和 57 h分别加
入 8 g/L的混合酸 (乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各 2 g/L)
结论：在生长和合成 PHAs阶段对有机酸的利用顺序皆为
丁酸 >乳酸 >丙酸 >乙酸
重
干
胞
细
A
+
t /h
度
浓
酸
B
t /h
发酵过程中细胞干重 ( ), P H A ( ) 和 NH 4 + 浓度 ( ) 的变化发酵过程中乙酸 ( ),丙酸 ( ),乳酸 ( ) 和丁酸 ( ) 浓度的变化
3,有机废水生产 PHAs的机理研究
(1) 废水中大分子物质转化为小分子有机酸
厌氧微生物己糖降解最重要的代谢途径是 EMP和 HMP途径，
先生成丙酮酸，然后形成挥发性有机酸、乳酸等。控制不
同酸化条件，可以使不同的有机酸成为主要酸化产物。
代谢方程分别为 ∶
C6H12O6 + 4H2O→2CH 3COO- + 2HCO3- + 4H+ + 4H2
C6H12O6 + 2H2 →2CH 3CH2COO- + 2H2O +2H+
C6H12O6 + 2H2O →CH 3CH2CH2COO- + 2HCO3- +3H+ +2H2
C6H12O6 →2CH 3CHOHCOO- + 2H+
(2) 有机酸合成 PHAs的代谢途径
? R,eutropha 利用小分子有机酸合成的 PHAs主要为聚羟
基丁酸 (PHB)、羟基丁酸和羟基戊酸的共聚物 (PHBV)
? 以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为碳源时 PHAs的合成途径,
2, 3 - 酮硫解酶
4, P H B 合成酶3,乙酰乙酰 C o A 还原酶
1,硫激酶乙酰 C o A
乙酰乙酰 C o A
3- 羟基丁酰 C o A
C o A S H N A D P H
N A D PC o A S H
P H B
C o A S H乙酸
1 2
3
4
丙酸 丙酰 C o A 3- 酮戊酰 C o A 3- 羟基戊酰 C o A
乙酰 C o A 乙酰乙酰 C o A 3- 羟基丁酰 C o A
P HB VCO 2
C o AS H
1,硫激酶 2.β- 酮硫解酶 3,乙酰乙酰 C o A 还原酶 4,脱羧酶系 5.P HB V 合成酶
1
2
4 5NADNADH
3
NADNADH
3
C o AS H
C o AS H
2
NAD NADH
乳酸 丙酮酸
乙酰乙酰 C o A
C o AS HNADH
乙酰 C o A
CO 2
1,脱氢酶
5.P HB 合成酶
2,丙酮酸脱氢酶复合体
4,乙酰乙酰 C o A 还原酶3.β- 酮硫解酶
3- 羟基丁酰 C o AP HB
C o AS H
NA DP HNADP
1 2
3
45
NAD
丁酸 丁酰 C o A 2- 烯丁酰 C o A
A T P A M P + 2 P i
C o A S H
F A D 2F A D H
H O2
1,硫激酶 2,脱氢酶 3,水化酶 4,聚合酶
H O2
3- 羟基 - 丁酰 C o A
( D - 型 )
P H B
C o A S H
3- 羟基丁酰 C o A
( L- 型 )
3- 酮 - 丁酰 C o A
NAD NADH
1 2 3
4
(3)不同有机酸对 PHAs的产率与理论产率的比较
不同有机酸对 PHAs的产率与理论产率的比较
一步法碳源 N A D PH 再生 PH A s Y
p c
t h e o r
/
( )
/ g ? g -1
Y
p c/
Y c e l l c/
两步法
Y
p c/
乙酸 异柠檬酸 PH B 0.48 0.12 0.24 0.27
丙酸 异柠檬酸 PH B V 0.58 ～ 0.68 0.18 0.19 0.32
乳酸 不需要 PH B 0.48 0.19 0.16 0.33
丁酸 异柠檬酸 PH B 0.65 0.32 0.14 0.41
在一步发酵法中，由于所消耗的有机酸有一部分
用于合成细胞的合成，因而四种有机酸对 PHAs
的实际产率均小于两步法，但它们对 PHAs和细
胞的产率之和却大于两步法的产率
(4) 产酸相产物分布及其影响因子的研究
(a) HRT对酸化产物分布的影响
度
浓
酸
机
有
丙酸
乳酸
丁酸
乙酸
HRT对酸化产物分布的影响
(b) 不同 pH条件下 UASB反应器出水产物分布
pH
度
浓
量
质
酸
水
出
U A S B 反应器中 pH 值对出水酸分布的影响
丁酸 乙酸 丙酸 乳酸
4,不同初始酸浓度对 PHAs发酵过程的影响
t
不同初始酸浓度对 细胞干重 的影响
初始酸浓度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L
当硫酸铵浓度为 1.5g/L时，初始酸浓度在 20g/L左右较佳
t
ac et ic a ci d
t
b u t y r ic a ci d
p r o p io n ic ac id
乙酸、丁酸和丙酸浓度与发酵时间的关系
初始酸浓度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L
丁酸消耗速率大大超过乙酸和丙酸的消耗速率,当初始酸浓
度为 5, 10,15,20和 25 g/L时，最终发酵液中残留的丁酸
浓度为 ∶ 0,0.01,0.16,0.58和 3.81g/L
PHAs浓度的变化 残留细胞量随时间的变化
初始酸浓度, ○ 5 g/L; □ 10 g/L; ? 15 g/L; 20 g/L;◇ 25g/L
t
5,PHAs分批发酵动力学
(1)细胞生长动力学 ))
6.34
/(1(
15.1/
/21.0 87.0NC
NC
NC ss
ss
ss ?
???
C/ N 对细胞生长速率的影响
○为实验值，曲线代表模型计算值
(2) PHAs形成模型
R
R x
dt
dx
dt
dp 057.096.0 ??
t /h
PH As 积累与模型计算值的比较
○为实验值，曲线代表模型计算值
6,以有机废水酸化产物为底物进行 PHAs流加发酵
（ 1）流加发酵过程曲线
将 UASB出水中的总有机酸浓度浓缩至 150 g/L左右，
进行 PHAs生产的 流加发酵，发酵结果见图
t / h
度
浓
量
质
的
质
物
各
流加发酵过程中 D C W, P H A s, NH 4 +,有机酸的浓度变化
□ D C W ； PH A ；? 丁酸；● 乙酸；? 丙酸；■ N H 4 +
(2)酸化废水发酵过程中丁酸对 PHAs的产率的变化
酸
丁
发酵时间
酸
丁
发酵时间
分批发酵过程中丁酸对 P H A s 的产率变化
流加发酵过程中丁酸对 P H A s 的产率变化
四, 生物反应与产物分离的组合系统
生物反应与分离 (或分配 )相组合的技术：
选择性地从培养液中连续分离有抑制性、有毒
性或不稳定性产物，或者将底物以一种可控的方式
添加到培养液中，对生物反应过程都能产生极大的
促进作用
生物反应与产物分离的组合系统也称为原位 (in
situ)产物分离过程或提取生物转化，即在生物反应
发生的同时，选择一种合适的分离方法及时将对生
物反应有抑制或毒害作用的产物或副产物选择性地
从生产性细胞或生物催化剂周围移走
生物反应与产物分离的组合系统具有如下三个特征：
(1)耦合过程是一种集成式单元操作，其生物反应器
具有特殊的结构
(2)实现产物及时分离的方法有很多，但必须考虑产
物的特性及具体的生物反应体系来合理选择和设计
(3)耦合过程作为一种新的反应工程技术，可适用于
各种生物反应过程
分离技术的选择主要基于四个方面的因素：
(1)分离技术应当具备生物相容性，适宜的分离技
术应当对生物反应不造成负面影响，不会造成生
物催化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改
变生物反应的代谢和调节机制； (2)应当考虑产物
或副产物的物理化学特性和生物学特性； (3)考虑
系统的流体特性，因为流体力学性质决定并影响
分离过程的传质，从而影响分离的容量和速度，
如高粘度的非牛顿型流体就不能用膜分离技术；
(4)考虑工程及经济因素，理想的分离技术应当是
操作费用低、性能稳定、工程上易于实现的技术
1,随程溶剂萃取
? 包括内部随程萃取和外部随程萃取两种方式
(1) 内部随程萃取是指萃取剂在反应器中与培养基
直接接触，以便将产物萃取到溶剂中去
(例如，在利用帚状地霉发酵生产酯类风味物质的
研究中，内部溶剂萃取技术得到了很好的应用 )
? 内部溶剂萃取的特点是 ∶ 溶剂和液相混合均匀，
因而有利于传质的进行；但溶剂也可能在培养液
中形成稳定的乳化作用，这对溶剂与产物的分离
不利
(2) 外部随程萃取是指萃取剂和培养液在反应器外
的萃取装置中逆流接触，从而萃取产物的过程
¤ 用这种方法可以减轻内部溶剂萃取中的乳化问题
¤ 假如用己烷进行内部溶剂萃取时，因为在发酵系
统中加入挥发性溶剂，会导致传氧困难，即便细
胞处于产物合成的旺盛期也会减少产物的生成，
即所谓的“相毒性” (phase toxocity)。外部随程
萃取则不存在这一问题，在外循环中多余的溶剂
可用气体抽提去除，若细胞对溶剂敏感，还可在
微量溶剂回流反应器前进行脱气处理
2,渗透萃取
? 渗透萃取是一种基于膜技术的萃取系统
? 膜技术在萃取中具有能够增加传质面积和降低乳
化程度及减轻溶剂对微生物的毒害作用的优点
? Solichien采用氧化三辛基膦 (TOPO)与煤油的复
合体系作为溶剂，由于萃取剂和培养液被膜隔开，
萃取剂对细胞的毒性有所降低
? 例如，在丙酸、乙酸和 乳酸的发酵生产中，利
用渗透萃取技术可降低产物对微生物的毒害作用，
从而大大提高发酵水平
3,渗透蒸发
? 渗透蒸发技术具有分离因子高、操作费用低、
对膜结构的无限制性及操作时具有较高的机械
强度等优点
? 例如，在乙醇生产中，渗透蒸发是将乙醇从发
酵液中连续分离的最有效手段，由于降低了产
物抑制和分离操作费用，生产率得以显著提高
? Susumu等人采用聚二甲基硅氧烷中空纤维膜
(PDMS─HF)结合氮气作为载气，可从水相中
连续分离乙醇和异丙醇
4,其它生物反应与产物分离技术
? (1) 气体抽提
? (2) 吸附
? (3) 结晶
? (4) 层析技术
? (5) 电渗析
? (6) 动电技术
? (7) 受控底物分配
? (8) 在酶学上的应用
5,生物反应与产物分离组合系统的发展趋势
? (1) 目前的研究更加深入和细化，包括,
? (a)有抑制或毒害作用副产物的选择性分离；
? (b)选择性地供给营养底物；
? (c)不可发酵底物或老龄化细胞的分离
? (2) 新的分离技术不断出现，主要体现在,
? (a)新的选择性更强、生物相容性更好的生化分离
方法的开发和应用 (如基于分子识别的分离方法 )；
? (b)将传统分离技术组合使耦合系统的选择性更好、
效果更理想，如前面介绍的膜技术
代谢工程
一、代谢工程概述
代谢工程的基本理论及应用策略的形成：
1.微生物细胞在代谢繁殖过程中，经济、合
理地利用和合成自身所需的各种物质和能量，
使细胞处于平衡生长状态。
2.对于发酵工业和人类的经济活动来说，活
细胞这种自身固有的代谢网络的遗传特性并
不是最佳的。为了大量积累某种代谢产物，
就必须打破微生物原有的平衡状态，这就需
要对细胞的代谢途径进行修饰。
3.现代发酵工业通过以代谢控制发酵理论为指导，
应用基因突变来改造微生物原有的调节系统。由
于该工程在很大程度上依赖于传统的化学诱变技
术及设计精巧的选择程序，因此手段单一，结果
不尽人意。
4.随着基因工程技术的飞速发展，利用基因克隆
改变代谢流，扩展和构建新的代谢途径，尽可能
最大限度地提高目的代谢产物的产率，已取得令
人瞩目的成果。
代谢工程的第一个应用实例：
1974年, Chakrabarty在假单胞菌属的恶臭
假单胞菌 （ P,putide） 和铜绿假单胞菌 （ P.
aeruginosa） 中分别引入几个稳定的重组
质粒, 增加了两者对樟脑和萘的降解催化
活性 。
这标志着代谢工程作为一门学科的诞生 。
代谢工程的一般定义：
通过某些特定生化反应的修饰来定向改善
细胞的特性或运用重组 DNA 技术来创造新
的化合物
具体定义：
代谢工程是应用重组 DNA技术和应用分析生
物学相关的遗传学手段进行有精确目标的基
因操作，以改变微生物原有的调节系统（酶
的功能和输送体系的功能、甚至产能系统的
功能），通过有目的地对细胞代谢进行修饰
（功利性修饰）以改变细胞某些方面的代谢
活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、
遗传操作、目的代谢获悉功能的实现），从
而达到实现目的代谢活性的提高这一预期目
标的一个崭新的领域。
研究手段：
代谢工程注重酶学、化学计量学、分子反
应动力学以及现代数学的理论及技术为研
究手段，在细胞水平上阐明代谢途径与代
谢网络之间局部与整体的关系、胞内代谢
过程与胞外物质运输之间的偶联以及代谢
流流向与控制的机制，并在此基础上通过
工程和工艺操作达到优化细胞性能的目的。
代谢工程中的遗传手段可以采用基因工程
技术，也可以采用常规诱变育种技术，但
前者有机会引进外源基因和外源调节因子，
这同传统的改良菌种的遗传方法不同。
代谢工程通过对特定的生化反应的遗传基
础进行修饰或用重组 DNA技术导入新的生
化反应来改进蛋白质分子的性质。
代谢工程的实质：
对代谢流量及其控制进行定量分析
的方法与用来实现预期的遗传修饰的
分子生物学技术的结合
代谢工程所要解决的问题是什么呢？
代谢工程要解决的主要问题：
改变某些途径中的碳架物质流量或改变
碳架物质流在不同途径中的流量分布
典型目标是：
修饰初级或次级代谢，将碳架物质流
导入目的产物的理想载流途径以获得
产物的最大转化率
具体表现为：
① 提高细胞现存代谢途径中目标产物
的产量； ② 改造细胞现存代谢途径,
使其合成新产物, 这种新产物可以使
中间代谢产物或修饰型的最终产物；
③ 对不同细胞的代谢途径进行拟合,
构建全新的代谢通路, 从而产生细胞
自身不能合成的新产物；
④ 优化细胞的生物学特性, 如生长速
率, 某些极端环境条件的耐受性等 。
代谢工程的实质：
对代谢网络进行定量分析，并在
此基础上进行代谢改造（代谢网络重
构），以最大限度地提高目标产物的
产率
代谢工程设计的主要内容包括：
① 生物合成相关代谢调控
和代谢网络理论；
② 代谢流的定量分析；
③ 代谢网络的重新设计；
④ 中心代谢作用机理及相关代谢分析；
⑤ 基因操作 。
代谢工程关注的最多的 是代谢途径的组合
而非单一的反应。完整的生化反应网络就
是代谢工程必须要考察的，重视代谢网络
和目标产物的热力学可行性、代谢流及其
控制。
代谢工程的精髓 在于其从传统的单一酶促
反应分析向相互作用的生化反应系统转移，
更强调了代谢网络的概念，也只有这样，
生物体代谢活动和细胞功能的图视效果才
能被强化。
代谢工程的原理与方法是在基于功能基因组信息重
建的代谢网络系统分析的基础上采用 DNA重组技术
改造细胞代谢系统。
主要包括关键的三个步骤：
（ 1）是合成 (synthesis)---即性能改进的重组菌的构
建；
（ 2）是分析 ---即重组菌的代谢途径分析，特别是
其性能与原菌种性能的比较；
（ 3）是设计 ---即为下一步基因工程的目标进行设
计。
综合, 合成合理设计途径优化
分析, 表征
DNA重组
酶定向进化
途径定向进化
DNA重排
基因组重排
诱变筛选代谢模型
代谢反应数据库
生物信息学工具
代谢物组学研究
GC,LC,GC-MS,LC-MS
LC-MS-MS,FTMS,NMRTLC
基因组信息
转录物信息
蛋白质组信息
生物化学知识
微生物学知识
代谢工程原理与方法
代谢工程最为突出的特征 就是强调生化反应途径
与代谢流及其体内条件下的控制相关联。
将代谢流的定量分析方法与代谢流控制的分子生
物学技术结合在一起，系统、合理地修饰生物细
胞的遗传性状是 代谢工程的基础 。
代谢工程的一个基本目标 就是阐明代谢流控
制的因素和机制，可以说对代谢流控制的全
面理解是代谢网络修饰的基础
系统研究代谢流及其控制机制包括以下三大
基本步骤：
①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测
定其流量的方法。
通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进
行简单的物料平衡。由于一个代谢途径的代
谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性
，所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的
代谢流信息，除非相应的酶在体外分析条件
下存在并具有活性。
② 在代谢网络中施加一个已知的扰动, 以
确定在系统松散之后达到新的稳态时的代
谢流 。
常用的扰动方式包括启动式的诱导, 底物
流加, 特定碳源消除或物理因素变化等 。
任何有效的扰动对代谢流的作用都是可以
接受的, 但扰动必须定位于紧邻途径节点
的酶分子上 。 一种扰动往往能够提供多个
节点上的相关信息, 这对于精确描述代谢
网络控制结构所必需的最小实验量是至关
重要的 。
③ 系统分析代谢流扰动的结果 。 如果某个代谢
流的扰动对下游代谢流并未能造成可观察的影
响, 那么就可以认为该处的节点对上游的扰动
式刚性的, 相反则成为柔性的 。
一般地, 在刚性节点处, 不能通过改变上游酶
活性来影响下游代谢流 。 除了上述对代谢途径
的物质流和能量流进行分析外, 代谢工程还包
括信息流分析, 如信号转导途径等 。 随着分子
生物学研究的不断深入, 生物体内各种形式的
信号转导途径作用机制目前已得以阐明, 从而
形成了代谢工程新的分支 ----信号转导代谢工程 。
在研究方法和技术方面它有三大常用手段：
①检测技术。常规的化学和生物化学检测
手段都可用于代谢工程的研究，这包括：
体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记
示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶
促反应动力学分析方法；测定同位素富集
和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学
方法，如核磁共振、质谱、液相色谱分析
和气相色谱分析等；生物传感器技术。
② 分析技术。在获得大量生化反应基本数据
的基础上，采用化学计量学、分子反应动力
学和化学工程学的研究方法并结合先进的计
算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的
动态特征与控制机理，以确定代谢途径改造
的思路。
这些分析手段包括能准确测定细胞内代
谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动
法、简化复杂代谢网络的组合法以及代谢网
络优化技术等。
例如,
（ 1） Seressiotis 等提出的 MPS(Metabolic
Pathway Synthesis)体系可系统地构建生化途
径，从而推测出产物的可能途径；
（ 2) Mavrovouniots 等利用计算机辅助设计
生化途径，将计算出的最大理论转化率与代
谢途径中诸多因素相结合，并在多个化学计
量学因子的限定条件下模拟出底物到产物的
可能途径。
③ 基因操作技术。
在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以
归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几
乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，
如基因和基因簇的克隆、表达、调控,DNA
的杂交检测与序列分析，外源 DNA的转化，
基因的体内同源重组与敲除，整合型重组
DNA在细胞内的稳定维持等。
代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提
就是外源基因在所有生物物种 （ 包括人体 ）
中转化和表达的可行性, 而这种可行性又在
很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控
元件的开发 。
到目前为止, 事实上许多物种的基因转化
和表达仍然存在技术上的困难, 另外, 由于
细胞本身复杂的调控机制使得单基因操作在
代谢工程中往往难以奏效, 所以需要基于多
重调控基础上的多重调节多基因操作技术的
发展 。
代谢工程研究的重点在于改造代谢网络,
以便生产特定的目的代谢产物或其有过
量生产能力的工程菌应用于工业生产 。
根据微生物的不同代谢特性, 常采用三
种方法,
(1)改变代谢流 ;
(2)扩展代谢途径 ;
(3)构建新的代谢途径 。
(1) 改变代谢途径
(a)可通过加速限速反应 (例如将编码限速酶
的基因通过基因扩增，增加拷贝数，在
宿主中表达以实现目的产物产率的提高。
因为，代谢网络是一个整体，限速反应
步骤流量的改变会对整个代谢途径造成
很大的影响，从而提高目的代谢产物的
产量 )
(b)构建代谢旁路、改变能量代谢途径（除了
通过相关代谢途径的基因操作改变代谢流
这种直接方法外，改变能量代谢途径或电
子传递系统也可以有效改变代谢流）
(c) 改变分支代谢途径流向（提高代谢分支点
某一分支代谢途径酶活力，使其在与另外
的分支代谢途径的竞争上占据优势，从而
提高目的代谢产物的产量）
(2)扩展代谢途径 的战略就是在宿
主菌中克隆和表达特定外源基因，
从而延伸代谢途径，以生产新的代
谢产物和提高产率。
扩展代谢途径还可使宿主菌能够利
用自身的酶或酶系利用原来不能利
用的底物。
(3) 构建新的代谢途径 可通过转
移代谢途径, 或直接构建新的代
谢途径等方法来实现 。
代谢工程的应用领域包括 10个方面：
①发酵工业方面，用于提高微生物合成天然目标产
物的得率和生产能力；
②扩大微底物利用范围；
③生产原来不存在的新物质；
④提高菌体对环境的适应能力，如耐受缺氧、改善
同化氮的能力或抑制性物质的能力；
⑤阻断或降低副产物的生成；⑥在环境工程方面降
解有害废弃物及有害物质；⑦制备手性化合物，作
为医药中间体；⑧在医疗方面，用于整体器官和组
织的代谢过程分析，用于鉴定基因治疗或营养控制
疾病的目标；⑨信息传导途径方面，进行信息流分
析，为了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，
以及阐明信息流的相互作用和控制；⑩异源蛋白的
⑥ 在环境工程方面降解有害废弃物及有害物
质；
⑦制备手性化合物，作为医药中间体；
⑧在医疗方面，用于整体器官和组织的代谢
过程分析，用于鉴定基因治疗或营养控制疾
病的目标；
⑨信息传导途径方面，进行信息流分析，为
了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，
以及阐明信息流的相互作用和控制；
⑩异源蛋白的生产。
二、代谢流量分析
1,基本理论
代谢流量分析 (MFA)方法是根据代谢路
径中各反应的计量关系，以及实验的某些底
物、产物的流量和细胞组成等确定整个代谢
网络的流量分布
MTA方法的基础是准稳态假设：
假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态，
即其浓度变化速率为 0，这样由 n个中间代
谢物即可得到 n个关于速率的约束条件 (由
计量关系确定 )，若选定的速率的总数目
为 J，则待解问题的自由度为 F = J - n 。这
样，通过实验测出 F个不相关速率可确定
整体流量分布。
要得到正确的流量分布，必须对细胞内代谢
路径有清楚的了解，尤其是各个分支点。缺
少某一重要的分支，或增加某一根本不存在
的分支，都可能使求得流量分布有很大变化。
式 (1) 即为计算代谢物质量平衡的化学计量方
程：
Ar ( t) + b ( t) + Rmb = 0
式中,A 为系数矩阵,r ( t) 为反应速率向量，
b ( t) 为代谢物积累速率,Rmb 为残差向量。
其中 b ( t) 为胞外、胞内代谢物积累速率，前
者可通过测量获得，后者根据准稳态假设为
零。
这样，利用胞内反应的计量系数信息，只需
测量几个胞外速率或其它约束条件 (如底物
代谢在分支点上的分配比例等 )，就可以计
算出胞内各代谢反应的速率，从而对其生理
行为进行定量的描述。
要利用 MFA 得到正确的通量分布，必须对
细胞内代谢路径有清楚的了解，尤其是各个
分支点
2,代谢流平衡分析的应用
代谢流平衡分析的作用可概括如下几点：
①胞内代谢流分布的定量测定
通过对不同途径代谢流量进行定量分析，就
可以判定胞内碳源的流向
② 代谢网络节点（分支点）性质的鉴定
通过比较不同突变株和不同操作条件下的
各途径的物流分布，就可以鉴别途径的节点
是刚性、弱刚性、还是柔性。
通常，刚性节点的分支流量不会发生较大
的改变，而柔性节点的分支流量会随着环境
或细胞性状的改变而进行相应的调节。
运用这种方法已证明谷氨酸棒杆菌赖氨酸
生物合成途径中的 6-磷酸葡萄糖节点是柔性
的，而丙酮酸节点是柔刚性的
③ 确定胞内代谢路径
通过代谢流平衡分析，可以识别胞内是否存
在某代谢途径。胞内反应的化学计量关系是代
谢流分析的基础。用公式表示这种计量关系，
需要知道与生化反应有关的详细信息。然而，
在许多微生物细胞中，生化反应的分子机制并
不是非常清楚。通过计算不同细胞途径的代谢
物流可鉴别很可能存在哪些途径，并获得相关
同功酶和（或）途径功能的信息。通过对酿酒
酵母厌氧生长的分析，发现醇脱氢酶 Ⅲ （一种
线粒体酶，功能尚未鉴别）在维持线粒体内的
氧化还原电位中起重要的作用，在这类酶的跟
踪中，需测定无细胞萃取液中的酶活
④ 非测量性胞外物流的计算
例如，利用代谢流平衡模型和测定的物流，
就可以计算几种胞外副产物的生成速率，但这
种计算的前提是代谢流平衡要尽可能贴近实际
状况以及所测物流精确度要高
⑤ 分析替代路径对通量分布的影响
从优化代谢产物生成来看，可鉴别一种或几
种物流的限制作用。为此，可考察一些设想，
如引入一条新途径或同功酶（或将其消除）是
否具有消除该限制的积极效果，从而导致所需
物流的增加
⑥ 最大理论得率的计算
基于代谢流平衡模型，如已知各种限制条件，便可
以计算某一已知代谢物的最大理论得率。此值对揭示
过程得率的上限非常有用。为了保证形成的目标产物
达到最大值，流量分割率必须是固定的，而且还需要
密切注意中间代谢物和通用代谢物对目的产物产量的
负面影响。
在复杂的代谢网络中，依据代谢网络分析结果计算
目的产物的产量则更为合理。
另一方面，理论得率的计算为代谢设计和操作过程
提供了一个基准点，在此给定的范围内可以方便地选
择最优化的代谢途径。此模型曾应用于谷氨酸棒杆菌
的赖氨酸发酵和产黄青霉的青霉素生产上。
代谢流的分析的应用和方法：
代谢流的分析在微生物培养中的应用比较广泛，
它有助于理解细胞各代谢途径的特点，并提供
代谢调控或优化的信息
方法,(1)较直接及准确的方法是通过同位素
标记及核磁共振 (NMR) 来测定 (这类方法的缺
点是测定费用昂贵 )
(2)另一种方法不需要复杂的设备，测定过程
也相对比较简单，通过测定细胞外代谢物及菌
体组成，根据物料平衡和已知的代谢途径来计
算
MFA的局限性和解决方法：
由于细胞代谢网络的复杂性，建立的质量平
衡方程组常常不能得到唯一解，因此有一定
的局限性。
可能的解决方法有三种：
①一是合并反应，减少变量个数；
②二是通过共同的代谢物的测定来确定循环
反应的流量；
③三是利用线性规划的方法来求得最优化解。
应用例子：
赵学明等人首次采用代谢通量分析法对黄
原胶发酵过程的实验数据进行了定量分析。
根据黄单胞菌的胶合成及糖分解代谢机理
求得了产胶期的内部代谢通量分布，得出
了得率与呼吸商间的关系式；并根据一定
的维持机理求得了维持系数,P/O 及理论得
率等
3,胞内代谢流量的测定
大多数测定代谢流量的实验方法最好在代谢
进行时和同位素的稳定状态下进行, 而且最
好是在连续流动生物反应器的稳定状态下完
成 。
可能的状态是在分批发酵罐瞬间建立代谢和
同位素稳定状态, 然而在这种情况下必须证
实确实存在一个稳定状态或者在分析中采用
更多且复杂的瞬时方法
近年来, 产生了一些新的用于测定胞内代
谢流量的方法：
(1)这些方法都是基于物料平衡, 选择性的
代谢产物中标记增加的测定, NMR光谱细
微结构分析以及气相色谱测定同位素分子
量分布等 。
(2)另外, Aida和 Matsuoka采用胞外代谢物
测定与体内化学反应的化学计量方法相结
合的方法测定柠檬酸发酵中体内代谢流量
的变化, 依此数据用于指导柠檬酸的发酵
生产
三, 代谢控制分析技术
代谢控制分析是以生化反应体系的敏感
性分析为基础，研究分析代谢控制在各
途径之间的分配规律，是一种以系统的
观点对细胞内代谢调控进行定量分析的
理论和实验方法
1,代谢控制分析的基本理论
代谢控制分析的基本研究对象是由代谢反应系
列和代谢途径组成的代谢系统，其中单步反应
是组成系统的基本结构单元。代谢控制分析理
论认为，代谢系统中所有反应步骤都会直接或
间接地对代谢流量和代谢物浓度产生影响。因
此，对其中任一反应施加轻微的扰动，由此产
生的代谢流量或代谢物浓度的变化，可以作为
该反应对代谢系统控制的度量
2,代谢工程的应用
(1) 代谢途径中限速步骤概念的演绎
长期以来, 一种普遍的观点认为代谢途径中
存在着固有的限速步骤, 它们控制着流经代
谢途径的代谢流, 其主要特征表现在：
(a) 限速步骤的反应速度很低, 整个系统的代
谢流取决于催化该反应步骤的酶活性；
(b) 限速步骤是热力学不可行的反应, 具有较
高的平衡常数, 需要由与其相偶联的, 热力
学上容易进行的反应驱动；
(c) 限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋
白合成的调节
代谢控制分析的研究突破了这一传统观念，
使人们对代谢调控有了更加全面的认识。
以线性代谢途径形成的代谢系统为例，当系
统处于稳定状态时，所有的生化反应具有相
同的反应速度。
根据限速步骤的观点，与代谢途径中催化
其他生化反应的酶相比，限速酶则以较低的
速度催化该反应，因而这些所谓的限速酶控
制着整个代谢途径的总运行速度。
如果要提高代谢途径的代谢流，就必须增
加限速酶的浓度或（和）酶活水平，即通过
加速限速步骤的反应速度实现这一目标。
然而，许多实验的研究结果表明，大幅度
提高代谢途径中限速酶的酶活水平并不能导
致代谢流的显著增加。
例子：
(a) 在粗糙脉孢菌 (Neuropra crassa)的精氨酸
合成途径中，控制限速步骤的酶的浓度增加仅
仅使该途径中部分代谢物的流量增加，但另一
些代谢物的流量反而有所减少，也就是说，这
种改进并没有提高整个代谢途径的代谢流，用
限速酶的概念显然不能解释这种现象
(b)利用 DNA重组技术对酿酒酵母糖酵解途
径中的一个或多个被认为是限速步骤的酶
进行修饰，分别构建了这些关键酶高活力
的菌株，但是也没有观察到乙醇产率及细
胞生长速度的显著变化，这表明通过增加
基因拷贝数提高某一特定酶表达量的方法，
同样不能有效提高目标代谢流
(c)酿酒酵母色氨酸合成途径中限速酶的
控制系数很小，即使限速酶超量表达，
仍然不能有效提高色氨酸的合成速率，
而且随着酶活力的增加，限速酶对代谢
流的控制能力反而趋于减小
(d) 在移动发酵单胞菌中，利用基因重
组技术提高 ED途径中被推断为控制代
谢流的酶的表达活性，不仅没有提高整
个代谢途径的代谢流，反而显著降低了
糖酵解途径的代谢流和菌体生长速率
代谢控制分析理论认为：
(a)代谢流的控制是由组成代谢途径的各
个步骤及其相互之间的关系决定的，并且
分布在整个代谢途径上；
(b)生物大分子和效应物并不能直接产生
控制，而是通过作用于所在的反应而影响
整个代谢系统的控制；
(c)限速步骤不是固定的，但系统控制系
数的总和却是固定的，并且可以定量描述
各个步骤对代谢控制的发挥作用的相对程
度，从而使实验结果的解释更趋合理。
根据代谢控制分析理论：
(a)一方面, 代谢途径对代谢流控制起主导作用的酶
的种类是变化的, 不存在唯一或固定不变的限速
步骤 。 当解除了某个控制因子对途径的限制作用,
下一个控制因子又将成为途径控制的关键因素 。
(b) 另一方面, 对于那些刚性节点, 提高控制其反应
速度的酶活对流量分配是没有明显影响的 。
(b) 研究代谢调控必须将代谢途径作为一个内部相互
作用的整体来看待, 并且不能脱离代谢途径所处
的外部环境 。 根据代谢控制分析的观点,, 限速,
的概念只能是对特定的代谢途径在具体环境条件
下使用 。
(2) 代谢网络的系统分析
细胞内同时进行的数千个生化反应构成了错综
复杂的细胞代谢网络体系，其中的各反应速率
决定了整个网络的代谢流，而这些反应的速率
受相应的酶活水平以及参与反应的代谢物浓度
的影响，它们同时又受细胞性状和所处环境的
制约。 整个网络代谢流的分布、代谢流机制、
基因和环境条件的改变对代谢流控制的影响等
问题是代谢网络研究的重要内容
代谢 网络的系统 分析,
从系统论的角度考察代谢现象，把每个酶促
反应作为代谢系统最基本的组成部分，同时
将基因表达、酶活水平、代谢物浓度、抑制
机制、效应物、抑制剂、激活剂以及环境条
件等的影响归结为对途径反应的扰动，再根
据代谢系统的结构特点进行系统综合分析
代谢控制分析的不足之处：
(a)代谢控制分析的连通原理要求对代谢系统中的所
有效应物（包括酶和代谢物）都具有详细的了解，
但在大多数实际应用中，有关典型生物细胞的代谢
背景知识很少，这是代谢控制分析理论应用的, 瓶
颈, 问题。
(b)根据代谢控制分析理论对代谢途径进行合理修饰，
大多集中在调节酶浓度的手段上，这对于那些流量
控制系数较大的酶促反应通常难以奏效。
(c)代谢控制分析在途径操作的指导作用方面也存
在着明显的不足，它只能处理稳定态下的代谢系统，
并且代谢流控制分析只能在对反应速度实施微扰的
情况下进行评估，所确定的控制系数也只对该稳定
态有效，因此利用代谢控制分析指导各种状态下的
代谢系统调节问题还存在疑问的
展望：
(1)近年来, 生物化学和分子生物学知识的倍
增使生物技术的应用领域更加广阔, 与此同
时, 依靠传统的理论和方法分析, 理解生物
分析与细胞整体功能之间的复杂关系也变得
越来越困难 。 考察和改造细胞代谢不仅需要
从组成细胞代谢的各个要素之间的相互关系
方面入手, 而且还必须从系统整体特性的角
度上理解代谢网络和生物分子功能之间的有
机联系 。 代谢控制分析从系统的角度考察并
高度概括了复杂的代谢现象, 从这个意义上
说, 该理论具有明显的系统论的概念 。 另一
方面, 代谢控制分析把代谢的控制事件形式
化, 演绎出代谢系统中一系列的重要原理,
(2)另一方面, 代谢控制分析把代谢的控制事
件形式化, 演绎出代谢系统中一系列的重要
原理, 并设计了许多研究代谢系统控制的实
验模型 。 在此基础上, 代谢控制分析将理论
与实验结果相结合, 将代谢系统的特征描述
与单一酶的动力学特性相结合, 使得代谢途
径的研究不至于沉没在浩瀚分散的零碎生物
学知识中, 这对分析复杂的代谢现象, 有目
的地改进细胞代谢以及促进细胞代谢多学科
研究的交汇等, 都具有非常重要的意义 。 因
此可以预期, 代谢控制分析在发酵工程领域
中将会得到更加广泛的应用
四, 代谢工程技术在发酵工程中的应用
代谢工程在发酵工业中的应用领域主要包括,(1)
通过加速限制反应, 改变分叉代谢途径的流向,
构建代谢旁路和改变能量代谢途径等策略来改
变代谢流, 并阻断副产物的合成途径 。
(2)代谢工程在发酵工业中的应用还涉及到引入
外源基因来延伸原来的代谢途径, 产生新的末
端代谢产物, 或者利用新的底物作为生物合成
的原料, 也可构建新的代谢途径合成具有新化
学结构的代谢产物 。
代谢工程的最终目标 是改变代谢流提高产物
产率，其依据是代谢节点的判断。
根据对不同代谢要求的可调控程度，可将
节点分为柔性节点、刚性节点和柔刚性节点。
代谢流分析是代谢分析的一个重要手段，
它通过对细胞在不同情况 (如改变培养环境、
增加或减少酶活等 )下的代谢流分析，可确
定节点类型、确定最优途径、估算基因改造
结果、计算最大理论得率等。
例如：在赖氨酸发酵过程中, 赖氨酸产率变化时,
其合成途径中多节点的代谢流量分配的明显改变仅
发生在 3个节点,6-磷酸葡萄糖 （ G6P）, 磷酸烯醇
式丙酮酸 （ PEP） 和丙酮酸 （ Pyr） 。
Vallino等以葡萄糖酸盐代替葡萄糖进行赖氨酸发酵,
发现 G6P节点的 NADP 代谢流降低 50%时, 赖氨酸的
产率可保持不变；通过 DNA技术消减 6-磷酸葡萄糖
异构酶 90%的活性, 赖氨酸代谢流分布不变, 但总代
谢流降为原来的 75%。 由此, 确定 G6P节点是柔性的,
磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸中定有刚性节点存在；
随后的分析表明丙酮酸为柔性, PEP为刚性 。
堵国成
江南大学 生物工程学院
现代生化工程的主要研究内容
1.发酵过程的优化控制技术
2.生化过程的模型化
3.高密度培养技术
4.代谢工程和代谢网络控制
5.新型生化反应器的研究和开发
6.新型发酵和产品分离技术
发酵过程的优化控制
第一部分 绪论
? 一, 发酵过程优化在生化工程中的地位
? 二, 发酵过程优化的目标和研究内容
? 三, 发酵过程优化的研究进展
? 四, 流加发酵过程的优化控制
一, 发酵过程优化在生化工程中的地位
? 现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、
药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地生
产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊化学
品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环境等重
大问题的过程中必将发挥积极的作用
? 如何才能更好地发挥现代生物技术的作用？
? 以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是
一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必
须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度 (便于下游
处理 )、较高的底物转化率 (降低原料成本 )和较高的生
产强度 (缩短发酵周期 )
发酵过程优化的主要研究内容
? 第一个方面是细胞生长过程研究
? 第二个方面是微生物反应的化学计量
? 第三个方面是生物反应过程动力学的研究
（主要研究生物反应速率及其影响因素）
? 第四个方面的内容是生物反应器工程（包括
生物反应器及参数的检测与控制）
二, 发酵过程优化的研究内容和目标
发酵过程优化的目标
? 使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、
工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂
的相互作用尽可能地简化，并对这些条件
和相互关系进行优化，使之最适于特定发
酵过程的进行
? 发酵过程优化的基础 是进行生物反应宏观
动力学和生物反应器的研究
如何实现发酵过程的优化控制？
生物反应过程动力学
动力学模型的建立
发酵过程优化控制
实现发酵过程优化控制的过程
?生物反应动力学的研究内容,是有关
生物的、化学的与物理过程之间的相互
作用，诸如生物反应器中发生的细胞生
长、产物生成、传递过程等
?生物反应动力学研究的目的,是为描
述细胞动态行为提供数学依据，以便进
行数量化处理
? 建立动力学模型的目的,是为了模拟实
验过程，对适用性很强的动力学模型，
还可以推测待测数据，进而确定最佳生
产条件
? 发酵过程优化涉及非结构模型和结构模
型的建立
?什么是非结构模型？
?什么是结构模型呢？
非结构模型
? 把细胞视为单组分，则环境的变化对细
胞组成的影响可被忽略，即细胞的生长
处于所谓的平衡生长状态，此基础上建
立的模型称为非结构模型
? 非结构模型是在实验研究的基础上，通
过物料衡算建立起的经验或半经验关联
模型
结构模型
? 由于细胞内各组分的合成速率不同而使
各组分增加的比例不同，即细胞生长处
于非均衡状态时，必须运用从生物反应
机理出发推导得到的结构模型
? 在考虑细胞组成变化的基础上建立的模
型，称为结构模型
生物反应器工程的研究内容
? 生物反应器的形式、结构、操作方式、
物料的流动与混合状况、传递过程特征
等
? 是影响微生物反应宏观动力学的重要因
素
细胞调节
过程操作 细胞环境 细胞形态
反应器特性
生物反应器中复杂的相互关系
三, 发酵过程优化的研究进展
? 20世纪 40年代初抗生素工业的兴起，标志着发酵工业
进入了一个新阶段
? 40年代末一门反映生物和化工相交叉的学科 ──生化工
程诞生
? 1954年,Hasting指出,生化工程要解决的十大问题是深
层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、
冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害
? 1964年 Aiba等人认为通气搅拌与放大是生化工程学科
的核心，其中放大是生化工程的焦点
? 20世纪 60年代中期，建立了无菌操作的一整套技术
? 1973年 Aiba等人进一步指出，在大规模研究方面，仅
仅把重点放在无菌操作、通气搅拌等过程的物理现象
解析和设备的开发上是不够的，应当进一步开展对微
生物反应本质的研究
? 1979年，日本学者山根恒夫编著了, 生物反应工程,
一书，认为生物反应工程是一门以速度为基础，研究
酶反应、微生物反应及废水处理过程的合理设计、操
作和控制的工程学
? 1985年，德国学者卡尔 ?许格尔提出生物反应工程的研
究应当包括两个方面的内容 ∶ 一是宏观动力学，它涉
及生物、化学、物理之间的相互关系；二是生物反应
器工程，它主要涉及反应器本身，特别是不同的反应
器对生物化学和物理过程的影响
? 目前一般认为生物反应工程是一门以生物反应
动力学为基础，研究生物反应过程优化和控制
以及生物反应器的设计、放大与操作的学科
? 生物反应工程的研究主要采用化学动力学、传
递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优
化原理等化学工程学原理，也涉及到生物化学、
微生物学、微生物生理学和遗传学等许多学科
领域，因此是一门综合性很强的边缘学科
? 生化反应工程的核心是生物反应过程的数量化
处理和动力学模型的建立，实现发酵过程优化
则是生物反应工程的研究目标
实现发酵过程的优化与控制，必须解决
的五个问题,
? (1)系统动力学；
? (2)生物模型；
? (3)传感器技术；
? (4)适用于生物过程的最优化技术；
? (5)计算机 ─检测系统 ─发酵罐之间的接口
技术 (如神经网络、专家系统 )
? 1) 针对有关发酵产品的生产过程进行微生物
生长和产物形成的动力学研究, 提出新的或修
正的动力学模型或表达式；
? 2)结合现代生物技术产品的开发, 进行基因工
程菌, 哺乳动物细胞或植物细胞的生长动力学
和产物形成动力学的研究；
? 3)在动力学研究的基础上进行过程优化控制的
研究, 包括状态观察方程的建立, 观察数据的
噪声过滤, 不可测参数及状态的识别, 过程离
线或在线的优化控制 。
? 其中尤以流加发酵的最优化研究报道居多
有关运用生物反应工程原理进行
发酵过程优化控制的研究
四, 流加发酵
? 所谓流加发酵, 即补料分批发酵 (Fed-
batch fermentation),有时又称半连续培
养或半连续发酵, 是指在分批发酵过程
中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵
方法
优点 缺点
分批发酵 1,一般投资较小 1,因放罐、灭菌等原因，非生产时间长
2,易转产、生产灵活 2,经常灭菌会降低仪器寿命
3,分批操作中某一阶段可获得高的
转化率
3,前培养和种子的花费大
4,发酵周期短，菌种退化率小 4,需较多的操作人员或较多的自动控制系统
连续发酵 1,可实现有规律的机械、自动化 1,操作不灵活
2,操作人员少 2,因操作条件不易改变，原料质量必须稳定
3,反应器体积小、非生产时间少 3,若采用连续灭菌，加上控制系统和自动化
设备，投资较大
4,产品质量稳定 4,必须不断地排除一些非溶性的固型物
5,操作人员接触毒害物质的可能性
小
5,易染菌，菌种易退化
6,测量仪器使用寿命长
流加发酵 1,操作灵活 1,非生产时间长
2,染菌、退化的几率小 2,需较多的操作人员或计算机控制系统
3,可获得高的转化率 3,操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可
能性大
4,对发酵过程可实现优化控制
5,因经常灭菌会降低仪器使用寿命
分批、连续、流加操作方式的比较
流加发酵的研究进展
? 在 20世纪 70年代以前流加发酵的理论研
究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以
经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇
或恒速流加
? 1973年日本学者 Yoshida等人首次提出了
,Fed-Batch Fermentation”这个术语，并
从理论上建立了第一个数学模型，流加
发酵的研究才开始进入理论研究阶段
流加发酵所取得的三个方面的重大进展
? 20世纪 70年代中后期对流加发酵过程的
动力学解析
? 结合发酵过程的可测参数对流加过程进
行反馈控制 （ 如 DO法, CO2法, RQ(呼
吸商 )法, pH法, 代谢物法, 萤光法等 ）
? 流加发酵的最优化研究
? 流加发酵最优化研究的核心问题是找出
最佳的底物流加方式，以维持发酵过程
始终处于最佳状态
? 流加发酵最优化的研究内容包括：
? （ 1）状态方程的建立
? （ 2）目标泛函的确定
? （ 3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
XVdtXVd ??)(
FSXVdtSVd F??? ?)(
XVdtPVd ??)(
FdtdV ?
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值
(最大值 )原理等
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个
问题
一、何时采用流加发酵方式？
二、如何进行底物的流加？
一、何时采用流加发酵方式？
? 所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制
作用
? 高菌体浓度培养即高密度培养系统
? 非生长耦联性次级代谢产物 (如产物的合
成需要某些营养物质或前体 )
? 利用营养突变体的系统 (过量加入营养物只能使菌体
迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏
时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 )
? 营养缺陷型菌株的培养
二、如何进行流加发酵操作？
1,流加发酵类型
2,采用流加发酵应该解决的关键问题？
3.流加发酵过程中某些重要参数的确定
4.合适的流加发酵类型的确定
5,流加方式的应用
1.流加发酵类型
流加发酵的分类
类别 流 加 方 式
无反馈控
制
反馈控制
恒流量流加, 变流量流加和间歇流加
直接控制流加, 间接控制流加
定值控制流加, 程序控制流加, 最优控制流
加
2,采用流加发酵应该解决的关键问题
(1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加
葡萄糖,饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油
脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
②补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水
③加入某些微生物生长或合成需要的微量
元素或无机盐
④加入酶合成诱导物或前体物质
(2) 如何流加？
a.底物流加速率
b.流加开始时间及总流加时间
c.需控制的底物浓度
3,流加发酵过程中某些重要参数的确定
a,最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段 )
b,底物的消耗速率
c,菌体比生长速率 (?)
d,菌体对底物的产率系数 (Yx/s)
及产物对底物的产率系数 (Yp/s)
4,合适的流加发酵类型的确定
a.恒速流加 (包括单一速率和分阶段恒速流加 )
b.指数速率流加
c.底物在线测定后的反馈流加 (如葡萄糖反馈流加 )
d,pH-stat
e,DO-stat
5,流加方式的应用
(1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时, 可得到如下
的物料平衡方程式：
细胞平衡：
碳平衡：
产物平衡：
体积平衡：
xVrdt
VXd ?)(
0
)( FSVr
dt
VSd
s ???
p
dV P Vr
dt ?
dV F
dt ?
恒流速流加过程中的流量 F的确定：
(a)预试验中所得出的流加时刻菌体对
所流加基质的消耗速率
(b)发酵液中残留基质浓度
(c)流加后需要控制的发酵液中的基质
浓度
(2) 指数速率流加
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的几
点假设如下：
(a) 发酵罐内为理想混合；
(b) 葡萄糖为唯一限制性碳源；
(c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数 (YX/s)为常
数；
(d) 菌体生长遵循 Monod方程 。
对底物葡萄糖进行衡算, 则：
F为体积流加速率 (L/h),S0为流加液中基质浓
度 (g/L),Yx/s为菌体对底物的产率系数 (g/g)，
ms为细胞比维持系数 (g/g/h),X为菌体浓度
(g/L),V为培养液体积 (L),μ为菌体比生长速
率 (h-1)。
VXm
Y
FS
dt
VSd
s
sx
???? )(
)(
/
0
?
XVm
Y
SF
dt
dV
S
dt
dS
V
cx
????????? )(
/
0
?
对菌体量的变化进行物料衡算，则：
XV
dt
XVd ??)(
假定 ?为常数，则上式 积分可得：
)( Ftt
FF eVXXV
???? ?
由于生长符合 Monod方程
μ 是 S的函数，要使 μ 恒定,S必须
恒定，则有：
SK
S
s
m
?
?
?
?
?
0?
dt
dS
)(
/0
)(
)(
1
Ftt
FFs
sx
eVXm
YSS
F ???
?
? ??
其中 tF为开始指数速率流加的时间,t≥ tF，
XF和 VF分别为 tF时刻的菌体浓度和发酵液
体积
指数速率流加的速率 F的表达式
为,
指数速率流加方式在实际过程中的注意
事项：
(1)方程中各参数要预先求知
(2)应用时流加速率 F可采用阶梯递增方
式进行设定
高生产率和高细胞密度发酵
1,细胞生长环境的优化策略
? (1)培养基组成的优化
? (2)特殊营养物的添加
? (3)限制代谢副产物的积累
2,培养模式
? (1)所培养细胞的具体代谢行为
? (2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力
? (3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力
3,诱导策略
4,细胞循环发酵 (应用限制：作用于进入过滤单元的细胞
的剪应力太大；系统的放大存在许多实际困难 )
第二部分 发酵过程优化原理
一,发酵过程优化的微生物反应原理
二,发酵过程数量化方法
三,微生物反应动力学
四,微生物反应优化的一般原理
一,发酵过程优化的微生物反应原理
1,大肠杆菌生长过程中观察到下列现象 ∶
? (1)在大肠杆菌快速生长期间, 生物合成的中间体很少渗
漏到胞外培养基中, 结构单元 (氨基酸, 核酸等 )的合成
速率和聚合形成大分子的速率一致
? (2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化
? (3)一旦生长培养基中的结构单元足够, 细胞就不再合成
这些物质
? (4)特定的代谢途径代谢特定的底物, 只有底物存在时,
细胞才合成相应的酶
? (5)若两个不同的底物同时存在于培养基中, 细胞先合成
能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系, 当这种
底物消耗完毕, 再合成利用另一底物的酶 。
? 2,细胞生长过程可分为三个步骤：
? (1)底物传递进入细胞
? (2)通过胞内反应, 将底物转变为细胞质
和代谢产物
? (3)代谢产物排泄进入非生物相, 即胞外
培养基
3,底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：
? 底物是一种存在于初始非生物相或者摄
入物中起作用的可交换的化合物
? 代谢产物是一种作为代谢物产生于某代
谢途径进入非生物相的化合物
? 细胞质成分是一种细胞利用底物产生的
不可交换的化合物
? 研究表明在膜上可能存在三种不同的运
输机制：
? (1)自由扩散
? (2)协助扩散
? (3)主动运输
? 前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，
是被动的过程，在运输过程中不需要提
供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度
进行运输，需要输入一定的吉布斯自由
能。
微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程
化合物 细菌 真菌
氨基酸
葡萄糖
乳糖
甘油
乙醇
乳酸
乙酸
二氧化碳
氧气
水
主动运输
主动运输
主动运输
自由扩散，协助扩散
自由扩散
主动运输和自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
主动运输
协助扩散和主动运输
协助扩散和主动运输
自由扩散，协助扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
自由扩散
4,微生物细胞的胞内反应
? (1)分解代谢反应
糖类在转化为代谢产物 (CO2、乳酸、乙酸和乙醇等 )的同时，
还形成 ATP,NADH和 NADPH。 NADH和 NADPH都在分解代
谢反应中产生，但 NADPH主要消耗于合成代谢中,NADH则
主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化
? (2)生物合成和聚合反应
为了合成细胞物质, 需要合成结构单元并将其聚合 。
合成蛋白质需消耗大量的自由能, 细胞一般根据其
自身需求来调节蛋白质的合成,其合成由蛋白质合成
系统 (PSS)负责, 该系统中核糖体是主要部分
E,coli中大约 70%的能量和还原力用于合成蛋白质
合成 E,coli细胞对前体代谢物的需求
? 细胞合成所需要的结构单元数在 75～ 100之间，这些物
质都是从 12种前体代谢物合成得到的，这些前体代谢
物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细
胞生长过程中起着双重的作用 (为生物合成提供能量和
前体代谢物 )
前体代谢物 分子式 摩尔质量 (g/ m ol ) 需要量 ( ? m ol / g 细胞 )
6- 磷酸 - 葡萄糖 C 6 H 13 O 9 P 260 205
6- 磷酸果糖 C 6 H 13 O 9 P 260 71
5- 磷酸核糖 C 5 H 11 O 8 P 230 898
4- 磷酸赤藓糖 C 4 H 9 O 7 P 200 361
3- 磷酸甘油醛 C 3 H 7 O 6 P 170 129
3- 磷酸甘油酸 C 3 H 7 O 7 P 186 1496
磷酸烯醇式丙酮酸 C 3 H 5 O 6 P 168 519
丙酮酸 C 3 H 4 O 3 88 2833
乙酰辅酶 A / / 3747
? - 酮戊二酸 C 5 H 6 O 5 146 1079
琥珀酰辅酶 A / / /
草酰乙酸 C 4 H 4 O 5 132 1787
? （ 3） 次级细胞代谢
?细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程,
称之为初级代谢
?但许多工业上重要的产品, 其合成反应并不
与生长过程偶联, 我们称之为次级代谢, 这
些反应合成的产物叫次级代谢产物, 就象初
级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样
（？ ） 乳酸是初级代谢产物, 但它是乳酸菌
在非生长条件下形成的, 许多其它的初级代
谢产物也同样是在非生长条件下产生的
初级代谢产物 定义为“在细胞
生长所需要的反应中形成的产物”
可能比较确切一些
次级代谢产物 定义为“在那些
对于细胞生长不重要的反应中形成
的产物”
一些工业上重要的初级和次级代谢产物一览
初级代谢产物 次级代谢产物
乳酸 青霉素
乙醇 头孢菌素
CO
2 四环素
乙酸 链霉素
柠檬酸 短菌肽
谷氨酸 氯霉素
赖氨酸 卡那霉素
葡萄糖酸 灰黄霉素
核黄素 赤霉素
二,发酵过程数量化方法
? 发酵过程的数量化处理包括：
? 1,发酵过程的速度
? 2,化学计量学和热力学
? 3,生产率、转化率和产率
? 只有当变量可测量时，才有可能对发酵
过程进行数量化处理
1,发酵过程的速度
变量 动力学参数 物质传递 热传递
反应速度 定义式
dt
dc
r
i
i
??
包括
Hvcposx
rrrrrr,,,,,
dt
dc
n
i
i
??
dt
dH
q
v
?
单位 g ? L
-1
? h
-1
g ? L
-1
? h
-1
kJ ? L
-1
? h
-1
比反应速率 定义式
xdt
dc
i
1
?
包括 Hvcpos
qqqqq,,,,,?
单位 h
-1
速度常数 定义式
n
i
i
c
r
k
)(
?
包括 dpr
kkk,,
21
,,
LLTr
kkk
gCOs
kkk,,
2
Hv
k
发酵过程的速度概念
发酵过程常规的参数及其测量
符号 参数 测量方法
X 生物量 细胞干重，浊度，细胞数
S 底物 酶法分析，化学法，色谱法
P 产物 酶法分析,H P L C 或特殊方法
O 氧 P
O
－专用电极分析
C 二氧化碳 Ｐ
CO ２
－专用电极分析
H
v 发酵热 温度、热平衡
菌体生长速度为 ∶
dt
dsr
s ??
dt
dxr
x ?
氧和底物利用速度为 ∶
dt
dr o
o ??
P,C和 HV生成速度为,
dt
dpr
p ?
dt
dc
rc ? dt
d H vr
Hv ?
细胞生长的比速率为 ?：
dt
dx
x
?? 1?
底物消耗的比速率为 qs∶
产物形成的比速率为 qp：
dt
ds
x
q s ?? 1
dt
dp
x
q p ?? 1
dt
do
x
q o ?? 1
氧消耗的比速率为 qo：
二氧化碳生成的比速率 为 qc：
发酵热生成的比速率：
dt
dc
x
q c ?? 1
dt
dH
x
q VH
V
?? 1
? 2,化学计量学
? 化学计量方程
? 表示通用化了的碳源
?
? 根据元素分析得出的细胞组成
?
? 表示产物
vHvWCPX
NOdcbaS
HOHCONOHCNOHC
NHONOHC
?????
???
?????
???
???????? )()()()(
)()()(
22''''
32
dcba NOHC
???? NOHC
'''' ???? NOHC
3,产率系数
? (1)宏观产率系数
? 宏观产率系数 (或称得率系数 )Yi/j是化学计
量学中一种非常重要的参数，常用于对碳
源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，
其中 i表示菌体或产物,j表示底物
? 例如，菌体对底物的产率系数可表示为：
ds
dx
r
r
dtds
dtdx
SS
XX
S
XY
s
x
t
t
sx ?????
??
?
???
/
/
0
0
/
生物反应过程中宏观产率系数的定义总览
产率系数 组分间的反应或关系 定义
Y
X/S S → X
Y
X/S
=- r
X
/r
S
Y
X/ O O 2 → X
Y
X/O
= - r
X
/r
O
Y
P/S S → P
Y
P/S
= - r
P
/r
S
Y
C/S S → CO
2
Y
C/S
= - r
C
/r
S
Y
P/O O
2
→ P Y P/O = - r P /r O
Y
Hv / S S → Hv
Y
Hv / S
=- r
Hv
/r
s
Y
C/O O 2 → CO 2
Y
C/O
=- r
C
/r
O
Y
Hv /O O 2 → Hv
Y
Hv /O
=- r
Hv
/r
O
有时，以摩尔为单位表示产率系数更有利：
? 相似的概念可用于表达重要的常数：
? 值在实践中对推导元素平衡方程很重
要, 对与氧化磷酸化有关的理论问题也
有重要意义
形成的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数
A T PY
C
A T P ?
氧消耗的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数?C
OY
COY
底物消耗的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数?C
SY
? 假设发酵过程中完全没有菌体生成，则 YP/S
可达理论最高值，称为理论代谢产物产率
? （ a） 根据化学计量关系计算
? 例如, 由葡萄糖, 氨和氧生成谷氨酸的化学
计量方程为 ∶
? 依此计算, =147/180=0.82
? 此处没有考虑反应过程中 NADH及 ATP等
辅助底物的生成和消耗
(2)理论代谢产物产率
theorSPY /
OHCONOHCONHOHC 22495236126 35.1 ?????
（ b）由生物化学计量关系计算
? 根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进
行代谢过程中有关 NAD(P)+和 ATP等辅底物的
物料衡算，结合化学计量关系可求出
? 上式：
? 由该反应式得 ∶ =(147× 13)/(12× 180)=0.75
? 此处 ?-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的
NADPH由异柠檬酸脱氢反应供给
? !！用生化计量式时,必须清楚有关的代谢途径
OHCONOHCONHOHC 22495236126 272321213 ?????
(c) 实际发酵过程中的产率系数
? 在实际发酵中, 产率是变化的, 产率取
决于下列因素：
? Y= f (菌株、底物,?,m、Ｓ；,tm、
OTR,C/N,P/O)
? 式中 m为混合度, S为底物浓度, 为平均
滞留时间, tm为混合时间, OTR为氧传递
速度, C/N为碳氮比, P/O为磷氧比
t
另外,Papoutsakis和 Lim(1981)用碳流分支的概念
来解释菌体产率变化的原因：
? 其中 r1和 r２ 分别为碳源分支代谢途径 1和途径 2的反应
速度,MX和 MS为菌体和底物的分子量,?x是 S→X 反
应的化学计量系数，可见产率只随 r２ 或 r１ 变化
? 在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化 (r2)
和氧化 (r1)
? 碳源和其它营养物的浓度或温度, pH等培养条件的
任何变化都可能引起 r２ 或 r１ 变化
? 这一概念表明, 甲基营养菌菌体产率的变化是一个
动力学问题, 而不是生物合成问题
21
/ /1
1)(
rrM
MY
SX
X
SX ??? ?
三, 微生物反应动力学
? 1,被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分
转化为代谢产物，还有一部分则转化为新生
细胞的组成物质。因此，对微生物反应动力
学进行研究，至少要对底物、菌体和产物三
个状态变量进行数学描述
? 2,微生物反应是很多种物质参与的复杂代谢
过程的综合结果。因此，微生物反应的动力
学方程只能通过数学模拟得到
? 3,进行数学模拟的难点在于细胞的生长、繁
殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程
既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞
外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反
应
? 4,为了优化反应过程, 首先要进行合理的简
化, 在简化的基础上建立过程的物理模型,
再据此推导得出数学模型 。
微生物反应动力学模型的分类
模型类型 着眼点 说明
概率论模型 微生物个体 必须考虑每个细胞的差异，以说明某一特定现象；或用以
说明平均值附近的波动情况
决定论模型 微生物群体 不考虑每个细胞的差异，而是取菌体性质及数量的平均值
进行数学处理
均相模型 微生物群体 是一种认为菌体均匀分散于培养液中，可作为均相处理的
决定论模型。
生物相分离模型 微生物群体 是将菌体作为与培养液 ( 连续相 ) 分离的生物相处理所建立
的决定论模型。这种模型需要说明培养液与菌体间的物质
传递及分配效应。在高菌体浓度时，考虑微生物所占的体
积分率，以及解析废水生物处理过程中洒水滤床和旋转圆
盘的微生物膜，都是利用生物相分离模型。
结构模型 微生物群体 考虑菌体组成的变化，将活菌体和死菌体分别处理从而建
立的模型。在单一菌体的结构模型中，将整个菌体分为两
种或两种以上成分，并认为代谢过程是各种成分共同作用
的结果。均相模型和生物相分离模型都可分别构成结构模
型
非结构模型 微生物群体 与结构模型的主要区别在于它不考虑细胞组成的变化。
（一）细胞生长动力学模型
1,无抑制作用的细胞生长动力学
? 温度和 pH恒定时, 对于某一特定培养基组分的浓
度 s,Monod方程为 ∶
? 式中, ?max称为最大比生长速率 (h-1),Ks称为半饱
和 常数 (g/L)
? 底物消耗速率方程对应为 ∶
SK
S
s ?
? m a x??
SK
Sqq
s
ss ?? m a x,
? Monod方程应满足 ∶
? (1)菌体生长为均衡型非结构生长；
(2)培养基中只有一种底物是生长限
制性底物；
? (3)菌体产率系数恒定
2,细胞生长稳定期和延迟期的 Monod型动力学
? (1) 延迟期动力学模型的建立
? (2) 生长稳定期动力学模型的建立
? 式中 ?和 ?是经验常数, 取 ?=?max和 ?=xmax，
)1(),( /m a x Ltt
s
e
sK
sts ??
?
? ??
)1(
?
? xxr x ???
3,微生物死亡期和内源代谢
? (1) 微生物死亡期的动力学模型
? Kd为 比死亡速率 (h-1)
?
? 对应于由底物生成菌体的一级反应速率为 ∶
? (2) 内源代谢的动力学模型
? 或：
? ms为细胞的维持系数 (s-1),Y*X/S为最大细胞产率
dt
dx
xkd ???
1
xkr dx )( ?? ?
XmXYr s
SX
s ?????? ?*
/
1 s
SX
s mYq ??? ?*
/
1
4,底物和产物抑制的动力学模型
? (1) 底物抑制动力学 (Andrew底物抑制 模型 )
? 式中 KIS是底物抑制常数
? ( 2) 产物抑制动力学 （ Hinshelwood模型 ）
? 式中, P为产物浓度, k为动力学常数
? 或：
? 式中 KIP为产物抑制常数
ISS KSSK //1
1
m a x ??? ??
)1(m a x PkSK S
S
???? ??
PK
K
SK
S
IP
IP
S ?
??? m a x??
（二）微生物产物形成动力学模型
? Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关
系，将产物形成区分为三种类型
? 类型 Ⅰ∶ 也称为偶联模型（醇类、葡萄糖酸、乳
酸）
? 类型 Ⅱ∶ 也称部分偶联模型（柠檬酸、氨基酸）
? 类型 Ⅲ∶ 也称为非偶联模型（抗生素、酶、维生
素、多糖）
XYrYr XPXXPP ?// ?? ?XPP Yq /?
Xrr XP ???? ?? ??? ???Pq
Xr P ?? ? ??Pq
? 上述三种类型外还有一种模型是 qP与 ?负偶联
的模型，例如黑曲霉生产黑色素，其 qP与 ?的
关系可表示为：
? 当考虑到产物可能存在分解时：
? 式中,k’d为产物分解常数
?XPPP Yqq /m a x,??
PkXrr dXP ?????? ??
四, 微生物反应优化的一般原理
? 1,发酵过程优化的一般步骤
? (1) 反应过程的简化
? 是指把工艺过程的复杂结构压缩为少数系统，这些
系统可以用关键变量来表示
? (2) 定量化
? 系统、准确地检测发酵过程的各种参数
? (3) 分离
? 是指在生物过程和物理过程的各种速度相互不影响
的情况下，精心设计实验以获得关于生物和物理现
象的数据
? (4) 数学建模
? 数学模型是能以简化的形式表征过程行为, 并
实现特定目的的数学公式
? 数学模型可将特定结果通用化, 并为推论系统
的其它性质提供基础
? 建立数学模型的主要目标是,(a)为了预见任何
系统的转化率或生产率； (b)用以检查在各种操
作条件下工厂操作的性质和行为, 检查模型适
用的范围 (包括外推性 )； (c)用于进行工艺优化
和计算机模拟； (d)用于检测出可能重要但被忽
视了的参数； (e)检查是否已有效地区分生物现
象和物理现象； (f)有助于阐明反应机理
2,分批微生物反应过程的优化
? 最优化的目标函数：产量, 生产率, 纯利润等,
有时也对这些指标的其中二个以上进行多目标函
数优化
? 最优化的操作变量：反应时间, 培养基组成, 温
度, pH,溶氧等
? * 培养基组成的优化
? 预先设定 XT为最大菌体浓度, 则由可得到底物 Si
的初始浓度为 ∶
)(1 0
/
0,XXYS T
SX
i
i
??
? 无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收, 在细胞
内保持元化学状态, 且含量恒定不变 。 这类营养
物质称为储存性底物 。 可根据这些物质在菌体内
的实际含量, 用类似于上式的方法确定其需要量
? 当代谢产物的产量与培养基组成之间的关系很复
杂, 不能用解析函数的方式表示时, 可采用实验
设计法确定最优初始浓度
? 利用最优实验设计法, 即使不能提高产量, 也可
探索培养基组分的最小需用量, 从而避免不必要
的浪费
第三部分 生物反应过程的系统优化技术
一,系统优化技术概述
二,ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成
中的应用
三,有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合
系统
四,生物反应与产物分离的组合系统
一,系统优化技术概述
1.系统的定义
? 奥地利理论生物学家贝塔朗菲于 1937年第一次
提出,系统是, 一个相互作用的诸要素的综合
体, 。
? 我国科学家钱学森对系统的定义是 ∶, 系统是
由相互作用和相互依赖的若干组成部分结合而
成的，具有特定功能的有机整体，而且这个整
体又是它从属的更大的系统的组成部分,
? 换句话说，系统是同类或相关事物按一定的内
在联系组成的整体
2,系统的一般形态有：
? (一 )自然系统和人造系统
? (二 )实体系统和概念系统
? (三 )封闭系统与开放系统
? (四 )静态系统和动态系统
? (五 )对象系统和行为系统
? (六 )控制系统和因果系统
3,系统应当具备四个基本特征
(一 )整体性 (系统是由两个以上有一定区别又有一定相关
的要素所组成，系统的整体性主要表现为系统的整体
功能 )
(二 )相关性 (各要素组成了系统是因为它们之间存在相互
联系、相互作用、相互影响的关系 )
(三 )目的性 (系统具有能使各个要素集合在一起的共同目
的，而且人造系统通常具有多重目的 )
(四 )环境适应性 (环境是指出现于系统以外的事物的总称，
相对于系统而言，环境是一个更高级的、复杂的系统。
系统必须适应外部环境的变化，能够经常与外部环境
保持最佳的适应状态，才能得以存在 )
? 4.生物反应系统优化的基本思想,
? 整体优化的思想，对所研究的对象
采用定性或定量的模型优化技术，
使系统整体目标最优
5,生物反应系统优化方法的原则主要有以下几个方面：
(一 )系统整体性原则,不能从系统的局部得出有关系统整体的结论；分
系统的目标必须服从于系统整体的目标
(二 )系统有序相关原则,系统的有序性, 是系统有机联系的反映, 系统
的任何联系都是按一定等级和层次进行的, 都是秩序井然, 有条不
紊的
(三 )系统目标优化原则,优化问题是在不可控参数发生变化的情况下,
根据系统的目标, 经常, 有效地确定可控参数的数值, 使系统经常
处于最优状态
(四 )系统动态性原则,系统优化是一个比较复杂的过程, 研究对象内部
复杂的相互作用和外部环境的多变性, 使系统本身呈现出动态特性
(五 )系统分解综合原则：分解是将系统中具有密切相关关系的要素进
行分组；综合则是完成新系统的筹建过程, 即选择具有性能好, 适
用性强的分系统
(六 )系统创造思维原则：其一是把陌生的事物看作熟悉的东西, 用已
有的知识加以辩识和解决；其二是把熟悉的对象看作陌生的东西,
用新的方法, 新的原则加以研究, 从而创造出新的理论, 新的技术 。
生物反应系统示意图
生物反应
过程
上游
加工过程
加工过程
下游
成本经济学
原料
的生物
具有
应用价值
传统育种
基因工程
细胞工程
目的产物
大规模
工艺开发
设计思想
遗传学
生理学
培养技术 反应器
发酵技术 酶技术
6.生物系统 介绍：
? (1)生物产品合成的能量 (ATP)或辅因子
(NADH)再生系统
? (2)废水生物处理的厌氧 ─ 好氧组合处理
系统
? (3)生物反应与产物提取的耦合系统
? (4)有机废水处理和有用物质生产的耦合
系统
二, ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用
1,ATP再生系统的定义及分类
? ATP再生系统可定义为一个需要 ATP的生物酶反应系统与
一个 ATP生物合成系统所构成的耦合系统
? 按底物的不同分类,ATP再生系统可分为,
? (1)转移高能磷酸基的反应系统 (以高能化合物作为底物 )
? (2)采用碳水化合物作为基质的反应系统 (以碳水化合物和
磷酸基团作为底物 )
? 利用碳水化合物为基质的 ATP再生系统根据酶源的不同又
可分为：
? (1)自耦合系统
? (2)种间耦合系统
自耦合 ATP再生系统示意图
再生 A T P 的反应系统
需要 A T P 的生物合成反应
A T P
ADP 或 A M P
ADP 或 A M P
葡萄糖
前体 产物
微生物细胞
二氧化碳
水和有机酸
种间耦合 ATP再生系统示意图
需要 A T P 的生物酶反应
再生 A T P 的反应系统
A T P A D P ( A M P )
前体 产物
葡萄糖
二氧化碳、水
有机酸 ( 或乙醇 )
大肠杆菌
产氨短杆菌或面包酵母
2,建立 自耦合系统和种间耦合系统 必须满足以下条件
? (1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定
? (2)能大量提供廉价, 稳定的前体物质
? (3)再生 ATP的活性足够强且稳定, 能与生物合成酶反应成
功地耦合
? (4)提供廉价的能量底物 (如葡萄糖 )和磷酸基团供体 (如无机
磷酸盐 )以利于 ATP再生
? (5)若有类似于分解反应的有害副反应, 则必须对其加以控
制
? (6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜, 则必须设法提高
膜的通透性
3,两 种系统的不同之处：
? 自耦合 ATP再生系统只用到一种微生物，故
该菌中必须同时具有需要 ATP的生物合成反
应的酶活性和再生 ATP的酶活性
? 种间耦合 ATP再生系统采用不同的微生物，
一种作为 ATP合成活性的供体，另一种作为
与此相偶联的生物合成酶活性的供体
? 以 E,coli作为合成酶活性的受体菌和具有较
强 ATP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵
母组合而成的种间耦合反应系统
4.自耦合 ATP再生系统
? （ 1） GMP(5'-鸟苷酸钠盐 )生产过程
? XMP＋ NH3＋ ATP→ GMP＋ AMP＋ PPi
? （ 2） ATP(腺嘌呤核苷 -5'-三磷酸钠盐 )生产过程
? 葡萄糖 → PRPP(磷酸核糖焦磷酸 )
? 腺嘌呤＋ PRPP→AMP ＋ Ppi
? 产氨短杆菌同时具有 PRPP(磷酸核糖焦磷酸 )生物合成
活性与 ATP生物合成活性, 可利用腺嘌呤为前体生产
ATP
? (3) GSH(谷胱甘肽 )的生产过程
? Glu＋ Cys＋ ATP→ ?-GC(?-谷氨酰半胱氨酸 )
? ?-GC＋ Gly＋ ATP→GSH ＋ ADP＋ Pi
?
谷胱苷肽的生物合成过程
葡萄糖
6 －磷酸葡萄糖
6 －磷酸果糖
1,6 －二磷酸果糖
磷酸二羟丙酮 3 －磷酸甘油醛
1,3 －二磷酸甘油酸
3 －磷酸甘油酸
2 －磷酸甘油酸
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
E M P
乙醛 乙醇
谷氨酸
γ －谷氨酰半胱氨酸
甘氨酸半胱氨酸
谷胱甘肽
A T P A T PA D P A D P
G S H Ⅰ G S H Ⅱ
5,种间耦合 ATP再生系统
? （ 1） IMP(5'-肌苷酸钠盐 )的生产过程
? Inosine(肌苷 )＋ ATP→IMP ＋ ADP
? （ 2） CDP(胞苷二磷酸 )胆碱的生产过程
? 氯化胆碱＋ ATP→ 磷酸胆碱＋ ADP
? CTP＋磷酸胆碱 → CDP胆碱
? 在 （ 1）和（ 2）中均采用重组 E,Coli和产氨短杆菌
? （ 3） GSH的生产过程, 可采用两种系统：
? 共固定化系统 (S,cerevisiae和 E,coli细胞一起固定化在
同一聚丙烯酰胺凝胶中 )和混合固定化系统 (S,cerevisiae
和 E,coli分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用 )
6,ATP再生系统存在的问题
? （ 1） 除了合成产物所需的关键酶以外,
细胞内还有许多种酶, 其中一些具有分
解活性, 能将反应的底物和预定的产物
转化为副产物
? （ 2） 微生物细胞具有很强的自我保护功
能, 作为渗透屏障的细胞膜可防止胞内
物质渗出 。 但当细胞用作酶源时, 这种
屏障就会阻碍底物和产物进出细胞
7,解决 ATP再生系统存在问题的办法
? ( 1) 抑制副反应的方法
? 对于具有分解, 转移底物或产物为副产物的
酶, 可通过选育缺失该酶活性的突变株, 或
优化反应条件使副产物的形成降低到最小的
限度
? ( 2) 提高膜通透性的方法
? 干燥细胞或用溶剂, 表面活性剂处理细胞都
可以提高细胞膜的通透性
? （ 3）固定化微生物细胞的方法
? 该法具有以下优势 ∶ ①不需要提取和纯化酶
的过程；②细胞可以重复使用；③可以实现
连续操作；④反应器占地小；⑤反应控制容
易；⑥要处理的液体体积小；⑦可以获得高
纯度产品；⑨工厂污染减轻
? 缺点：固定化操作较为繁琐
? 研究由固定化细胞组成的 ATP再生系统生产
有用物质的过程，仍是这一领域今后的发展
方向
三, 有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统
? 工合成塑料污染的主要特点是 ∶
? (1)污染范围广 。 江河湖泊, 田野山川无处不有
? (2)污染物增长量快 。 全世界每年对塑料的需求量为 1亿吨 。
由于价廉, 易老化, 塑料用量的增加导致其废弃物也迅速
增加, 倾入海洋的塑料垃圾达数十万吨, 陆上的更是难以
计数
? (3)处理困难 。 塑料具有耐酸碱, 抗氧化, 难腐蚀, 难降解
的特性, 埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体,
如 HCl,硫氧化物, 碳氧化物等
? (4)回收利用难 。 塑料制品种类繁多, 难以分拣回收
? (5)对生态环境危害大 。 地膜降低耕地质量, 农作物植株矮
小, 抗病力差；残膜随风飘动, 对周围环境, 畜牧业, 养
殖业都有很大的影响
生物可降解塑料的特点：
? 聚羟基烷酸酯 (Polyhydroxyalkoates，简称 PHAs)是生物
可降解材料的一个研究热点。其中聚 -?-羟基丁酸 (简称
PHB)及 3-羟基丁酸与 3-羟基戊酸的共聚物 (简称 P(3HB-
co-3HV)或 PHBV)是 PHAs族中研究和应用最广泛的两
种多聚体
? PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合
物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗
射线等外，更重要的是其还具有生物可降解性和生物
可相容性。已有研究表明，采用 PHAs制作的香波瓶，
在自然环境中 9个月后，可基本上被完全降解，而用合
成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需 100年
有机废水的资源化处理
? 有机废水是地球环境的一大污染源, 但同时也是一种
资源, 近几十年来, 有机废水的资源化技术发展极其
迅速, 已被认为是消除有机废水污染的最经济有效的
途径之一
? 用于高浓度有机废水处理的厌氧消化技术, 自 20世纪
50年代以后得到了迅速发展, 先后出现了厌氧滤池
(AF),上流式厌氧污泥床反应器 (UASB),附着膜厌氧
膨胀床反应器 (AAFEB),厌氧流化床反应器等, 其中
UASB的应用最为广泛
? 该反应器能培养并保持大量活性高, 沉降性能好的颗
粒污泥, 因而反应器的处理能力大大提高, 水力停留
时间大大缩短
有机废水的厌氧处理
? 有机废水的厌氧发酵过程是一个复杂的有多种
微生物类群参加的生物化学过程，通常可分为
酸性发酵阶段 (产酸 )和甲烷化阶段 (产甲烷 )两阶
段
? 产酸阶段主要是有机废水中复杂的大分子有机
物在厌氧条件下被水解和产酸细菌发酵成为有
机酸，如丁酸、乙酸、乳酸和丙酸等。此阶段
的细菌种类多，代谢能力强，繁殖速度快。
? 产甲烷阶段主要是产酸阶段产生的小分子有机
酸被产甲烷菌利用转化为甲烷
不同研究者的厌氧发酵产物
基质 温度 反应器 酸化相优势产物 研究者
葡萄糖 20 CS TR 丁酸 Co h e n
糖蜜废水 35 CS TR 丁酸 Gi l - P en a
葡萄糖 35 CS TR 乙酸 Z o et em e y er
葡萄糖 35 CS TR 乙酸 Ro y
葡萄糖 35 U AS B 乳酸 S h i y i L u n
有机废水处理和 PHAs生产耦合系统
? 理论依据是 ∶
? （ 1） 有机废水在厌氧处理过程中, 产酸微生物能将废
水中生物可降解的大分子物质转变为小分子有机酸,
如乙酸, 丙酸, 乳酸, 丁酸以及其它可溶性小分子化
合物
? （ 2） 真养产碱杆菌在好氧, 碳源充足, 贫氮的条件下
能利用有机酸在胞内大量积累 PHAs
? 将有机废水酸化反应器与 PHAs发酵罐相组合, 可使
酸化反应器为 R,eutrophus 提供相对稳定, 较佳的底物,
从而在发酵罐中相对廉价地生产出 PHAs
主要内容包括以下五个方面 ∶
1,有机废水生产 PHAs的初步条件；
2,R,eutropha发酵生产 PHAs最佳有机酸种类的确定, 包括以
有机酸为底物生产 PHAs的代谢机理, 理论产率和 PHAs发
酵的实际产率；
3,高效厌氧酸化工艺, 包括酸化率达 100%时有机酸分布的工
艺学条件等；
4,在小型发酵罐中, 以不同浓度的酸化废水为碳源进行分批
发酵实验, 在对 PHAs发酵过程动力学分析的基础上, 建
立较为合理的 PHAs发酵过程动力学模型；
5,进行了有机废水生产 PHAs流加发酵的初步研究, 比较了分
批和流加发酵过程中丁酸对 PHAs产率的变化
有机废水酸化和 PHAs生产耦合系统
①进水池 ②泵 ③ UASB酸化反应器 ④出水池 ⑤分离浓缩系统
⑥浓缩的有机酸 ⑦ PHA发酵罐
③
④
⑤
⑥
⑦
DO
pH
T
①
②
1,有机废水生产 PHAs的初步研究
? 有机废水生产 PHAs是指 R,eutropha 以有机废水
厌氧酸化的产物为生产 PHAs的基质
? 在一定温度下，影响有机废水酸化的主要因素：
? (a) 水力停留时间 (HRT)
? (b) pH值 (进水碱度 )
酸化阶段 HRT对发酵阶段 PHAs浓度的影响
中
液
酵
发
度
浓
H R T ( h )
2 4 6 8 10
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
度
浓
中
液
酵
发
碱度 ( m g / L )
4 00 0 6 00 0 8 00 0 1 00 0 0 1 20 0 0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
进水碱度对发酵阶段 PHAs浓度的影响
2,R,eutropha 利用不同有机酸生产 PHAs
的比较研究
? 目前研究采用的 PHAs生产方式通常有两种,
? 一种是一步发酵法，即细胞生长与 PHAs积累相偶
联；
? 另一种是两步发酵法，即微生物生长和 PHA积累
分两阶段进行，第一阶段细胞大量形成，第二阶
段细胞基本不繁殖而 PHAs大量积累，这种方法需
进行菌体的离心收集
(1) 一步发酵法生产 PHAs
采用不同工艺对有机废水进行厌氧酸化，可得到
以乙酸、丙酸、乳酸或丁酸等为优势产物的酸化废水
乙酸 丙酸 乳酸 丁酸
细胞干重 / g ? L
-1 6.5 8.9 9.7 14.8
PHA s 浓度 / g ? L
-1 2.1 4.3 5.2 10.2
PHA s 含量 / % 32.3 48.3 53.6 68.9
R,eutrophus WSH1对不同酸的利用 *
* 初始酸浓度为 10 g/L，分别在 19h,25h,32h,43h,50h加入
5 g/L的酸
(2)两步发酵法生产 PHAs
? 4种有机酸的初始浓度采用 10 g/L，并分别在发酵的 19 h,25.5 h、
32.5 h和 43 h补充加入 2.5 g/L的酸。 PHAs合成阶段初始细胞干重为
3.3 g/L，细胞中无 PHAs积累
t /h
发酵过程中菌体干重的变化
碳源为∶,丁酸；,乳酸；,丙酸；,乙酸
t /h
P H A s 的积累过程
碳源为∶,丁酸；,乳酸；,丙酸；,乙酸
(3) R,eutropha WSH1利用混合酸发酵 PHAs
初始酸浓度 10 g/L(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各 2.5 g/L)，发酵 41 h和 57 h分别加
入 8 g/L的混合酸 (乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各 2 g/L)
结论：在生长和合成 PHAs阶段对有机酸的利用顺序皆为
丁酸 >乳酸 >丙酸 >乙酸
重
干
胞
细
A
+
t /h
度
浓
酸
B
t /h
发酵过程中细胞干重 ( ), P H A ( ) 和 NH 4 + 浓度 ( ) 的变化发酵过程中乙酸 ( ),丙酸 ( ),乳酸 ( ) 和丁酸 ( ) 浓度的变化
3,有机废水生产 PHAs的机理研究
(1) 废水中大分子物质转化为小分子有机酸
厌氧微生物己糖降解最重要的代谢途径是 EMP和 HMP途径，
先生成丙酮酸，然后形成挥发性有机酸、乳酸等。控制不
同酸化条件，可以使不同的有机酸成为主要酸化产物。
代谢方程分别为 ∶
C6H12O6 + 4H2O→2CH 3COO- + 2HCO3- + 4H+ + 4H2
C6H12O6 + 2H2 →2CH 3CH2COO- + 2H2O +2H+
C6H12O6 + 2H2O →CH 3CH2CH2COO- + 2HCO3- +3H+ +2H2
C6H12O6 →2CH 3CHOHCOO- + 2H+
(2) 有机酸合成 PHAs的代谢途径
? R,eutropha 利用小分子有机酸合成的 PHAs主要为聚羟
基丁酸 (PHB)、羟基丁酸和羟基戊酸的共聚物 (PHBV)
? 以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为碳源时 PHAs的合成途径,
2, 3 - 酮硫解酶
4, P H B 合成酶3,乙酰乙酰 C o A 还原酶
1,硫激酶乙酰 C o A
乙酰乙酰 C o A
3- 羟基丁酰 C o A
C o A S H N A D P H
N A D PC o A S H
P H B
C o A S H乙酸
1 2
3
4
丙酸 丙酰 C o A 3- 酮戊酰 C o A 3- 羟基戊酰 C o A
乙酰 C o A 乙酰乙酰 C o A 3- 羟基丁酰 C o A
P HB VCO 2
C o AS H
1,硫激酶 2.β- 酮硫解酶 3,乙酰乙酰 C o A 还原酶 4,脱羧酶系 5.P HB V 合成酶
1
2
4 5NADNADH
3
NADNADH
3
C o AS H
C o AS H
2
NAD NADH
乳酸 丙酮酸
乙酰乙酰 C o A
C o AS HNADH
乙酰 C o A
CO 2
1,脱氢酶
5.P HB 合成酶
2,丙酮酸脱氢酶复合体
4,乙酰乙酰 C o A 还原酶3.β- 酮硫解酶
3- 羟基丁酰 C o AP HB
C o AS H
NA DP HNADP
1 2
3
45
NAD
丁酸 丁酰 C o A 2- 烯丁酰 C o A
A T P A M P + 2 P i
C o A S H
F A D 2F A D H
H O2
1,硫激酶 2,脱氢酶 3,水化酶 4,聚合酶
H O2
3- 羟基 - 丁酰 C o A
( D - 型 )
P H B
C o A S H
3- 羟基丁酰 C o A
( L- 型 )
3- 酮 - 丁酰 C o A
NAD NADH
1 2 3
4
(3)不同有机酸对 PHAs的产率与理论产率的比较
不同有机酸对 PHAs的产率与理论产率的比较
一步法碳源 N A D PH 再生 PH A s Y
p c
t h e o r
/
( )
/ g ? g -1
Y
p c/
Y c e l l c/
两步法
Y
p c/
乙酸 异柠檬酸 PH B 0.48 0.12 0.24 0.27
丙酸 异柠檬酸 PH B V 0.58 ～ 0.68 0.18 0.19 0.32
乳酸 不需要 PH B 0.48 0.19 0.16 0.33
丁酸 异柠檬酸 PH B 0.65 0.32 0.14 0.41
在一步发酵法中，由于所消耗的有机酸有一部分
用于合成细胞的合成，因而四种有机酸对 PHAs
的实际产率均小于两步法，但它们对 PHAs和细
胞的产率之和却大于两步法的产率
(4) 产酸相产物分布及其影响因子的研究
(a) HRT对酸化产物分布的影响
度
浓
酸
机
有
丙酸
乳酸
丁酸
乙酸
HRT对酸化产物分布的影响
(b) 不同 pH条件下 UASB反应器出水产物分布
pH
度
浓
量
质
酸
水
出
U A S B 反应器中 pH 值对出水酸分布的影响
丁酸 乙酸 丙酸 乳酸
4,不同初始酸浓度对 PHAs发酵过程的影响
t
不同初始酸浓度对 细胞干重 的影响
初始酸浓度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L
当硫酸铵浓度为 1.5g/L时，初始酸浓度在 20g/L左右较佳
t
ac et ic a ci d
t
b u t y r ic a ci d
p r o p io n ic ac id
乙酸、丁酸和丙酸浓度与发酵时间的关系
初始酸浓度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L
丁酸消耗速率大大超过乙酸和丙酸的消耗速率,当初始酸浓
度为 5, 10,15,20和 25 g/L时，最终发酵液中残留的丁酸
浓度为 ∶ 0,0.01,0.16,0.58和 3.81g/L
PHAs浓度的变化 残留细胞量随时间的变化
初始酸浓度, ○ 5 g/L; □ 10 g/L; ? 15 g/L; 20 g/L;◇ 25g/L
t
5,PHAs分批发酵动力学
(1)细胞生长动力学 ))
6.34
/(1(
15.1/
/21.0 87.0NC
NC
NC ss
ss
ss ?
???
C/ N 对细胞生长速率的影响
○为实验值，曲线代表模型计算值
(2) PHAs形成模型
R
R x
dt
dx
dt
dp 057.096.0 ??
t /h
PH As 积累与模型计算值的比较
○为实验值，曲线代表模型计算值
6,以有机废水酸化产物为底物进行 PHAs流加发酵
（ 1）流加发酵过程曲线
将 UASB出水中的总有机酸浓度浓缩至 150 g/L左右，
进行 PHAs生产的 流加发酵，发酵结果见图
t / h
度
浓
量
质
的
质
物
各
流加发酵过程中 D C W, P H A s, NH 4 +,有机酸的浓度变化
□ D C W ； PH A ；? 丁酸；● 乙酸；? 丙酸；■ N H 4 +
(2)酸化废水发酵过程中丁酸对 PHAs的产率的变化
酸
丁
发酵时间
酸
丁
发酵时间
分批发酵过程中丁酸对 P H A s 的产率变化
流加发酵过程中丁酸对 P H A s 的产率变化
四, 生物反应与产物分离的组合系统
生物反应与分离 (或分配 )相组合的技术：
选择性地从培养液中连续分离有抑制性、有毒
性或不稳定性产物，或者将底物以一种可控的方式
添加到培养液中，对生物反应过程都能产生极大的
促进作用
生物反应与产物分离的组合系统也称为原位 (in
situ)产物分离过程或提取生物转化，即在生物反应
发生的同时，选择一种合适的分离方法及时将对生
物反应有抑制或毒害作用的产物或副产物选择性地
从生产性细胞或生物催化剂周围移走
生物反应与产物分离的组合系统具有如下三个特征：
(1)耦合过程是一种集成式单元操作，其生物反应器
具有特殊的结构
(2)实现产物及时分离的方法有很多，但必须考虑产
物的特性及具体的生物反应体系来合理选择和设计
(3)耦合过程作为一种新的反应工程技术，可适用于
各种生物反应过程
分离技术的选择主要基于四个方面的因素：
(1)分离技术应当具备生物相容性，适宜的分离技
术应当对生物反应不造成负面影响，不会造成生
物催化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改
变生物反应的代谢和调节机制； (2)应当考虑产物
或副产物的物理化学特性和生物学特性； (3)考虑
系统的流体特性，因为流体力学性质决定并影响
分离过程的传质，从而影响分离的容量和速度，
如高粘度的非牛顿型流体就不能用膜分离技术；
(4)考虑工程及经济因素，理想的分离技术应当是
操作费用低、性能稳定、工程上易于实现的技术
1,随程溶剂萃取
? 包括内部随程萃取和外部随程萃取两种方式
(1) 内部随程萃取是指萃取剂在反应器中与培养基
直接接触，以便将产物萃取到溶剂中去
(例如，在利用帚状地霉发酵生产酯类风味物质的
研究中，内部溶剂萃取技术得到了很好的应用 )
? 内部溶剂萃取的特点是 ∶ 溶剂和液相混合均匀，
因而有利于传质的进行；但溶剂也可能在培养液
中形成稳定的乳化作用，这对溶剂与产物的分离
不利
(2) 外部随程萃取是指萃取剂和培养液在反应器外
的萃取装置中逆流接触，从而萃取产物的过程
¤ 用这种方法可以减轻内部溶剂萃取中的乳化问题
¤ 假如用己烷进行内部溶剂萃取时，因为在发酵系
统中加入挥发性溶剂，会导致传氧困难，即便细
胞处于产物合成的旺盛期也会减少产物的生成，
即所谓的“相毒性” (phase toxocity)。外部随程
萃取则不存在这一问题，在外循环中多余的溶剂
可用气体抽提去除，若细胞对溶剂敏感，还可在
微量溶剂回流反应器前进行脱气处理
2,渗透萃取
? 渗透萃取是一种基于膜技术的萃取系统
? 膜技术在萃取中具有能够增加传质面积和降低乳
化程度及减轻溶剂对微生物的毒害作用的优点
? Solichien采用氧化三辛基膦 (TOPO)与煤油的复
合体系作为溶剂，由于萃取剂和培养液被膜隔开，
萃取剂对细胞的毒性有所降低
? 例如，在丙酸、乙酸和 乳酸的发酵生产中，利
用渗透萃取技术可降低产物对微生物的毒害作用，
从而大大提高发酵水平
3,渗透蒸发
? 渗透蒸发技术具有分离因子高、操作费用低、
对膜结构的无限制性及操作时具有较高的机械
强度等优点
? 例如，在乙醇生产中，渗透蒸发是将乙醇从发
酵液中连续分离的最有效手段，由于降低了产
物抑制和分离操作费用，生产率得以显著提高
? Susumu等人采用聚二甲基硅氧烷中空纤维膜
(PDMS─HF)结合氮气作为载气，可从水相中
连续分离乙醇和异丙醇
4,其它生物反应与产物分离技术
? (1) 气体抽提
? (2) 吸附
? (3) 结晶
? (4) 层析技术
? (5) 电渗析
? (6) 动电技术
? (7) 受控底物分配
? (8) 在酶学上的应用
5,生物反应与产物分离组合系统的发展趋势
? (1) 目前的研究更加深入和细化，包括,
? (a)有抑制或毒害作用副产物的选择性分离；
? (b)选择性地供给营养底物；
? (c)不可发酵底物或老龄化细胞的分离
? (2) 新的分离技术不断出现，主要体现在,
? (a)新的选择性更强、生物相容性更好的生化分离
方法的开发和应用 (如基于分子识别的分离方法 )；
? (b)将传统分离技术组合使耦合系统的选择性更好、
效果更理想，如前面介绍的膜技术
代谢工程
一、代谢工程概述
代谢工程的基本理论及应用策略的形成：
1.微生物细胞在代谢繁殖过程中，经济、合
理地利用和合成自身所需的各种物质和能量，
使细胞处于平衡生长状态。
2.对于发酵工业和人类的经济活动来说，活
细胞这种自身固有的代谢网络的遗传特性并
不是最佳的。为了大量积累某种代谢产物，
就必须打破微生物原有的平衡状态，这就需
要对细胞的代谢途径进行修饰。
3.现代发酵工业通过以代谢控制发酵理论为指导，
应用基因突变来改造微生物原有的调节系统。由
于该工程在很大程度上依赖于传统的化学诱变技
术及设计精巧的选择程序，因此手段单一，结果
不尽人意。
4.随着基因工程技术的飞速发展，利用基因克隆
改变代谢流，扩展和构建新的代谢途径，尽可能
最大限度地提高目的代谢产物的产率，已取得令
人瞩目的成果。
代谢工程的第一个应用实例：
1974年, Chakrabarty在假单胞菌属的恶臭
假单胞菌 （ P,putide） 和铜绿假单胞菌 （ P.
aeruginosa） 中分别引入几个稳定的重组
质粒, 增加了两者对樟脑和萘的降解催化
活性 。
这标志着代谢工程作为一门学科的诞生 。
代谢工程的一般定义：
通过某些特定生化反应的修饰来定向改善
细胞的特性或运用重组 DNA 技术来创造新
的化合物
具体定义：
代谢工程是应用重组 DNA技术和应用分析生
物学相关的遗传学手段进行有精确目标的基
因操作，以改变微生物原有的调节系统（酶
的功能和输送体系的功能、甚至产能系统的
功能），通过有目的地对细胞代谢进行修饰
（功利性修饰）以改变细胞某些方面的代谢
活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、
遗传操作、目的代谢获悉功能的实现），从
而达到实现目的代谢活性的提高这一预期目
标的一个崭新的领域。
研究手段：
代谢工程注重酶学、化学计量学、分子反
应动力学以及现代数学的理论及技术为研
究手段，在细胞水平上阐明代谢途径与代
谢网络之间局部与整体的关系、胞内代谢
过程与胞外物质运输之间的偶联以及代谢
流流向与控制的机制，并在此基础上通过
工程和工艺操作达到优化细胞性能的目的。
代谢工程中的遗传手段可以采用基因工程
技术，也可以采用常规诱变育种技术，但
前者有机会引进外源基因和外源调节因子，
这同传统的改良菌种的遗传方法不同。
代谢工程通过对特定的生化反应的遗传基
础进行修饰或用重组 DNA技术导入新的生
化反应来改进蛋白质分子的性质。
代谢工程的实质：
对代谢流量及其控制进行定量分析
的方法与用来实现预期的遗传修饰的
分子生物学技术的结合
代谢工程所要解决的问题是什么呢？
代谢工程要解决的主要问题：
改变某些途径中的碳架物质流量或改变
碳架物质流在不同途径中的流量分布
典型目标是：
修饰初级或次级代谢，将碳架物质流
导入目的产物的理想载流途径以获得
产物的最大转化率
具体表现为：
① 提高细胞现存代谢途径中目标产物
的产量； ② 改造细胞现存代谢途径,
使其合成新产物, 这种新产物可以使
中间代谢产物或修饰型的最终产物；
③ 对不同细胞的代谢途径进行拟合,
构建全新的代谢通路, 从而产生细胞
自身不能合成的新产物；
④ 优化细胞的生物学特性, 如生长速
率, 某些极端环境条件的耐受性等 。
代谢工程的实质：
对代谢网络进行定量分析，并在
此基础上进行代谢改造（代谢网络重
构），以最大限度地提高目标产物的
产率
代谢工程设计的主要内容包括：
① 生物合成相关代谢调控
和代谢网络理论；
② 代谢流的定量分析；
③ 代谢网络的重新设计；
④ 中心代谢作用机理及相关代谢分析；
⑤ 基因操作 。
代谢工程关注的最多的 是代谢途径的组合
而非单一的反应。完整的生化反应网络就
是代谢工程必须要考察的，重视代谢网络
和目标产物的热力学可行性、代谢流及其
控制。
代谢工程的精髓 在于其从传统的单一酶促
反应分析向相互作用的生化反应系统转移，
更强调了代谢网络的概念，也只有这样，
生物体代谢活动和细胞功能的图视效果才
能被强化。
代谢工程的原理与方法是在基于功能基因组信息重
建的代谢网络系统分析的基础上采用 DNA重组技术
改造细胞代谢系统。
主要包括关键的三个步骤：
（ 1）是合成 (synthesis)---即性能改进的重组菌的构
建；
（ 2）是分析 ---即重组菌的代谢途径分析，特别是
其性能与原菌种性能的比较；
（ 3）是设计 ---即为下一步基因工程的目标进行设
计。
综合, 合成合理设计途径优化
分析, 表征
DNA重组
酶定向进化
途径定向进化
DNA重排
基因组重排
诱变筛选代谢模型
代谢反应数据库
生物信息学工具
代谢物组学研究
GC,LC,GC-MS,LC-MS
LC-MS-MS,FTMS,NMRTLC
基因组信息
转录物信息
蛋白质组信息
生物化学知识
微生物学知识
代谢工程原理与方法
代谢工程最为突出的特征 就是强调生化反应途径
与代谢流及其体内条件下的控制相关联。
将代谢流的定量分析方法与代谢流控制的分子生
物学技术结合在一起，系统、合理地修饰生物细
胞的遗传性状是 代谢工程的基础 。
代谢工程的一个基本目标 就是阐明代谢流控
制的因素和机制，可以说对代谢流控制的全
面理解是代谢网络修饰的基础
系统研究代谢流及其控制机制包括以下三大
基本步骤：
①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测
定其流量的方法。
通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进
行简单的物料平衡。由于一个代谢途径的代
谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性
，所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的
代谢流信息，除非相应的酶在体外分析条件
下存在并具有活性。
② 在代谢网络中施加一个已知的扰动, 以
确定在系统松散之后达到新的稳态时的代
谢流 。
常用的扰动方式包括启动式的诱导, 底物
流加, 特定碳源消除或物理因素变化等 。
任何有效的扰动对代谢流的作用都是可以
接受的, 但扰动必须定位于紧邻途径节点
的酶分子上 。 一种扰动往往能够提供多个
节点上的相关信息, 这对于精确描述代谢
网络控制结构所必需的最小实验量是至关
重要的 。
③ 系统分析代谢流扰动的结果 。 如果某个代谢
流的扰动对下游代谢流并未能造成可观察的影
响, 那么就可以认为该处的节点对上游的扰动
式刚性的, 相反则成为柔性的 。
一般地, 在刚性节点处, 不能通过改变上游酶
活性来影响下游代谢流 。 除了上述对代谢途径
的物质流和能量流进行分析外, 代谢工程还包
括信息流分析, 如信号转导途径等 。 随着分子
生物学研究的不断深入, 生物体内各种形式的
信号转导途径作用机制目前已得以阐明, 从而
形成了代谢工程新的分支 ----信号转导代谢工程 。
在研究方法和技术方面它有三大常用手段：
①检测技术。常规的化学和生物化学检测
手段都可用于代谢工程的研究，这包括：
体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记
示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶
促反应动力学分析方法；测定同位素富集
和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学
方法，如核磁共振、质谱、液相色谱分析
和气相色谱分析等；生物传感器技术。
② 分析技术。在获得大量生化反应基本数据
的基础上，采用化学计量学、分子反应动力
学和化学工程学的研究方法并结合先进的计
算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的
动态特征与控制机理，以确定代谢途径改造
的思路。
这些分析手段包括能准确测定细胞内代
谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动
法、简化复杂代谢网络的组合法以及代谢网
络优化技术等。
例如,
（ 1） Seressiotis 等提出的 MPS(Metabolic
Pathway Synthesis)体系可系统地构建生化途
径，从而推测出产物的可能途径；
（ 2) Mavrovouniots 等利用计算机辅助设计
生化途径，将计算出的最大理论转化率与代
谢途径中诸多因素相结合，并在多个化学计
量学因子的限定条件下模拟出底物到产物的
可能途径。
③ 基因操作技术。
在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以
归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几
乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，
如基因和基因簇的克隆、表达、调控,DNA
的杂交检测与序列分析，外源 DNA的转化，
基因的体内同源重组与敲除，整合型重组
DNA在细胞内的稳定维持等。
代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提
就是外源基因在所有生物物种 （ 包括人体 ）
中转化和表达的可行性, 而这种可行性又在
很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控
元件的开发 。
到目前为止, 事实上许多物种的基因转化
和表达仍然存在技术上的困难, 另外, 由于
细胞本身复杂的调控机制使得单基因操作在
代谢工程中往往难以奏效, 所以需要基于多
重调控基础上的多重调节多基因操作技术的
发展 。
代谢工程研究的重点在于改造代谢网络,
以便生产特定的目的代谢产物或其有过
量生产能力的工程菌应用于工业生产 。
根据微生物的不同代谢特性, 常采用三
种方法,
(1)改变代谢流 ;
(2)扩展代谢途径 ;
(3)构建新的代谢途径 。
(1) 改变代谢途径
(a)可通过加速限速反应 (例如将编码限速酶
的基因通过基因扩增，增加拷贝数，在
宿主中表达以实现目的产物产率的提高。
因为，代谢网络是一个整体，限速反应
步骤流量的改变会对整个代谢途径造成
很大的影响，从而提高目的代谢产物的
产量 )
(b)构建代谢旁路、改变能量代谢途径（除了
通过相关代谢途径的基因操作改变代谢流
这种直接方法外，改变能量代谢途径或电
子传递系统也可以有效改变代谢流）
(c) 改变分支代谢途径流向（提高代谢分支点
某一分支代谢途径酶活力，使其在与另外
的分支代谢途径的竞争上占据优势，从而
提高目的代谢产物的产量）
(2)扩展代谢途径 的战略就是在宿
主菌中克隆和表达特定外源基因，
从而延伸代谢途径，以生产新的代
谢产物和提高产率。
扩展代谢途径还可使宿主菌能够利
用自身的酶或酶系利用原来不能利
用的底物。
(3) 构建新的代谢途径 可通过转
移代谢途径, 或直接构建新的代
谢途径等方法来实现 。
代谢工程的应用领域包括 10个方面：
①发酵工业方面，用于提高微生物合成天然目标产
物的得率和生产能力；
②扩大微底物利用范围；
③生产原来不存在的新物质；
④提高菌体对环境的适应能力，如耐受缺氧、改善
同化氮的能力或抑制性物质的能力；
⑤阻断或降低副产物的生成；⑥在环境工程方面降
解有害废弃物及有害物质；⑦制备手性化合物，作
为医药中间体；⑧在医疗方面，用于整体器官和组
织的代谢过程分析，用于鉴定基因治疗或营养控制
疾病的目标；⑨信息传导途径方面，进行信息流分
析，为了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，
以及阐明信息流的相互作用和控制；⑩异源蛋白的
⑥ 在环境工程方面降解有害废弃物及有害物
质；
⑦制备手性化合物，作为医药中间体；
⑧在医疗方面，用于整体器官和组织的代谢
过程分析，用于鉴定基因治疗或营养控制疾
病的目标；
⑨信息传导途径方面，进行信息流分析，为
了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，
以及阐明信息流的相互作用和控制；
⑩异源蛋白的生产。
二、代谢流量分析
1,基本理论
代谢流量分析 (MFA)方法是根据代谢路
径中各反应的计量关系，以及实验的某些底
物、产物的流量和细胞组成等确定整个代谢
网络的流量分布
MTA方法的基础是准稳态假设：
假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态，
即其浓度变化速率为 0，这样由 n个中间代
谢物即可得到 n个关于速率的约束条件 (由
计量关系确定 )，若选定的速率的总数目
为 J，则待解问题的自由度为 F = J - n 。这
样，通过实验测出 F个不相关速率可确定
整体流量分布。
要得到正确的流量分布，必须对细胞内代谢
路径有清楚的了解，尤其是各个分支点。缺
少某一重要的分支，或增加某一根本不存在
的分支，都可能使求得流量分布有很大变化。
式 (1) 即为计算代谢物质量平衡的化学计量方
程：
Ar ( t) + b ( t) + Rmb = 0
式中,A 为系数矩阵,r ( t) 为反应速率向量，
b ( t) 为代谢物积累速率,Rmb 为残差向量。
其中 b ( t) 为胞外、胞内代谢物积累速率，前
者可通过测量获得，后者根据准稳态假设为
零。
这样，利用胞内反应的计量系数信息，只需
测量几个胞外速率或其它约束条件 (如底物
代谢在分支点上的分配比例等 )，就可以计
算出胞内各代谢反应的速率，从而对其生理
行为进行定量的描述。
要利用 MFA 得到正确的通量分布，必须对
细胞内代谢路径有清楚的了解，尤其是各个
分支点
2,代谢流平衡分析的应用
代谢流平衡分析的作用可概括如下几点：
①胞内代谢流分布的定量测定
通过对不同途径代谢流量进行定量分析，就
可以判定胞内碳源的流向
② 代谢网络节点（分支点）性质的鉴定
通过比较不同突变株和不同操作条件下的
各途径的物流分布，就可以鉴别途径的节点
是刚性、弱刚性、还是柔性。
通常，刚性节点的分支流量不会发生较大
的改变，而柔性节点的分支流量会随着环境
或细胞性状的改变而进行相应的调节。
运用这种方法已证明谷氨酸棒杆菌赖氨酸
生物合成途径中的 6-磷酸葡萄糖节点是柔性
的，而丙酮酸节点是柔刚性的
③ 确定胞内代谢路径
通过代谢流平衡分析，可以识别胞内是否存
在某代谢途径。胞内反应的化学计量关系是代
谢流分析的基础。用公式表示这种计量关系，
需要知道与生化反应有关的详细信息。然而，
在许多微生物细胞中，生化反应的分子机制并
不是非常清楚。通过计算不同细胞途径的代谢
物流可鉴别很可能存在哪些途径，并获得相关
同功酶和（或）途径功能的信息。通过对酿酒
酵母厌氧生长的分析，发现醇脱氢酶 Ⅲ （一种
线粒体酶，功能尚未鉴别）在维持线粒体内的
氧化还原电位中起重要的作用，在这类酶的跟
踪中，需测定无细胞萃取液中的酶活
④ 非测量性胞外物流的计算
例如，利用代谢流平衡模型和测定的物流，
就可以计算几种胞外副产物的生成速率，但这
种计算的前提是代谢流平衡要尽可能贴近实际
状况以及所测物流精确度要高
⑤ 分析替代路径对通量分布的影响
从优化代谢产物生成来看，可鉴别一种或几
种物流的限制作用。为此，可考察一些设想，
如引入一条新途径或同功酶（或将其消除）是
否具有消除该限制的积极效果，从而导致所需
物流的增加
⑥ 最大理论得率的计算
基于代谢流平衡模型，如已知各种限制条件，便可
以计算某一已知代谢物的最大理论得率。此值对揭示
过程得率的上限非常有用。为了保证形成的目标产物
达到最大值，流量分割率必须是固定的，而且还需要
密切注意中间代谢物和通用代谢物对目的产物产量的
负面影响。
在复杂的代谢网络中，依据代谢网络分析结果计算
目的产物的产量则更为合理。
另一方面，理论得率的计算为代谢设计和操作过程
提供了一个基准点，在此给定的范围内可以方便地选
择最优化的代谢途径。此模型曾应用于谷氨酸棒杆菌
的赖氨酸发酵和产黄青霉的青霉素生产上。
代谢流的分析的应用和方法：
代谢流的分析在微生物培养中的应用比较广泛，
它有助于理解细胞各代谢途径的特点，并提供
代谢调控或优化的信息
方法,(1)较直接及准确的方法是通过同位素
标记及核磁共振 (NMR) 来测定 (这类方法的缺
点是测定费用昂贵 )
(2)另一种方法不需要复杂的设备，测定过程
也相对比较简单，通过测定细胞外代谢物及菌
体组成，根据物料平衡和已知的代谢途径来计
算
MFA的局限性和解决方法：
由于细胞代谢网络的复杂性，建立的质量平
衡方程组常常不能得到唯一解，因此有一定
的局限性。
可能的解决方法有三种：
①一是合并反应，减少变量个数；
②二是通过共同的代谢物的测定来确定循环
反应的流量；
③三是利用线性规划的方法来求得最优化解。
应用例子：
赵学明等人首次采用代谢通量分析法对黄
原胶发酵过程的实验数据进行了定量分析。
根据黄单胞菌的胶合成及糖分解代谢机理
求得了产胶期的内部代谢通量分布，得出
了得率与呼吸商间的关系式；并根据一定
的维持机理求得了维持系数,P/O 及理论得
率等
3,胞内代谢流量的测定
大多数测定代谢流量的实验方法最好在代谢
进行时和同位素的稳定状态下进行, 而且最
好是在连续流动生物反应器的稳定状态下完
成 。
可能的状态是在分批发酵罐瞬间建立代谢和
同位素稳定状态, 然而在这种情况下必须证
实确实存在一个稳定状态或者在分析中采用
更多且复杂的瞬时方法
近年来, 产生了一些新的用于测定胞内代
谢流量的方法：
(1)这些方法都是基于物料平衡, 选择性的
代谢产物中标记增加的测定, NMR光谱细
微结构分析以及气相色谱测定同位素分子
量分布等 。
(2)另外, Aida和 Matsuoka采用胞外代谢物
测定与体内化学反应的化学计量方法相结
合的方法测定柠檬酸发酵中体内代谢流量
的变化, 依此数据用于指导柠檬酸的发酵
生产
三, 代谢控制分析技术
代谢控制分析是以生化反应体系的敏感
性分析为基础，研究分析代谢控制在各
途径之间的分配规律，是一种以系统的
观点对细胞内代谢调控进行定量分析的
理论和实验方法
1,代谢控制分析的基本理论
代谢控制分析的基本研究对象是由代谢反应系
列和代谢途径组成的代谢系统，其中单步反应
是组成系统的基本结构单元。代谢控制分析理
论认为，代谢系统中所有反应步骤都会直接或
间接地对代谢流量和代谢物浓度产生影响。因
此，对其中任一反应施加轻微的扰动，由此产
生的代谢流量或代谢物浓度的变化，可以作为
该反应对代谢系统控制的度量
2,代谢工程的应用
(1) 代谢途径中限速步骤概念的演绎
长期以来, 一种普遍的观点认为代谢途径中
存在着固有的限速步骤, 它们控制着流经代
谢途径的代谢流, 其主要特征表现在：
(a) 限速步骤的反应速度很低, 整个系统的代
谢流取决于催化该反应步骤的酶活性；
(b) 限速步骤是热力学不可行的反应, 具有较
高的平衡常数, 需要由与其相偶联的, 热力
学上容易进行的反应驱动；
(c) 限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋
白合成的调节
代谢控制分析的研究突破了这一传统观念，
使人们对代谢调控有了更加全面的认识。
以线性代谢途径形成的代谢系统为例，当系
统处于稳定状态时，所有的生化反应具有相
同的反应速度。
根据限速步骤的观点，与代谢途径中催化
其他生化反应的酶相比，限速酶则以较低的
速度催化该反应，因而这些所谓的限速酶控
制着整个代谢途径的总运行速度。
如果要提高代谢途径的代谢流，就必须增
加限速酶的浓度或（和）酶活水平，即通过
加速限速步骤的反应速度实现这一目标。
然而，许多实验的研究结果表明，大幅度
提高代谢途径中限速酶的酶活水平并不能导
致代谢流的显著增加。
例子：
(a) 在粗糙脉孢菌 (Neuropra crassa)的精氨酸
合成途径中，控制限速步骤的酶的浓度增加仅
仅使该途径中部分代谢物的流量增加，但另一
些代谢物的流量反而有所减少，也就是说，这
种改进并没有提高整个代谢途径的代谢流，用
限速酶的概念显然不能解释这种现象
(b)利用 DNA重组技术对酿酒酵母糖酵解途
径中的一个或多个被认为是限速步骤的酶
进行修饰，分别构建了这些关键酶高活力
的菌株，但是也没有观察到乙醇产率及细
胞生长速度的显著变化，这表明通过增加
基因拷贝数提高某一特定酶表达量的方法，
同样不能有效提高目标代谢流
(c)酿酒酵母色氨酸合成途径中限速酶的
控制系数很小，即使限速酶超量表达，
仍然不能有效提高色氨酸的合成速率，
而且随着酶活力的增加，限速酶对代谢
流的控制能力反而趋于减小
(d) 在移动发酵单胞菌中，利用基因重
组技术提高 ED途径中被推断为控制代
谢流的酶的表达活性，不仅没有提高整
个代谢途径的代谢流，反而显著降低了
糖酵解途径的代谢流和菌体生长速率
代谢控制分析理论认为：
(a)代谢流的控制是由组成代谢途径的各
个步骤及其相互之间的关系决定的，并且
分布在整个代谢途径上；
(b)生物大分子和效应物并不能直接产生
控制，而是通过作用于所在的反应而影响
整个代谢系统的控制；
(c)限速步骤不是固定的，但系统控制系
数的总和却是固定的，并且可以定量描述
各个步骤对代谢控制的发挥作用的相对程
度，从而使实验结果的解释更趋合理。
根据代谢控制分析理论：
(a)一方面, 代谢途径对代谢流控制起主导作用的酶
的种类是变化的, 不存在唯一或固定不变的限速
步骤 。 当解除了某个控制因子对途径的限制作用,
下一个控制因子又将成为途径控制的关键因素 。
(b) 另一方面, 对于那些刚性节点, 提高控制其反应
速度的酶活对流量分配是没有明显影响的 。
(b) 研究代谢调控必须将代谢途径作为一个内部相互
作用的整体来看待, 并且不能脱离代谢途径所处
的外部环境 。 根据代谢控制分析的观点,, 限速,
的概念只能是对特定的代谢途径在具体环境条件
下使用 。
(2) 代谢网络的系统分析
细胞内同时进行的数千个生化反应构成了错综
复杂的细胞代谢网络体系，其中的各反应速率
决定了整个网络的代谢流，而这些反应的速率
受相应的酶活水平以及参与反应的代谢物浓度
的影响，它们同时又受细胞性状和所处环境的
制约。 整个网络代谢流的分布、代谢流机制、
基因和环境条件的改变对代谢流控制的影响等
问题是代谢网络研究的重要内容
代谢 网络的系统 分析,
从系统论的角度考察代谢现象，把每个酶促
反应作为代谢系统最基本的组成部分，同时
将基因表达、酶活水平、代谢物浓度、抑制
机制、效应物、抑制剂、激活剂以及环境条
件等的影响归结为对途径反应的扰动，再根
据代谢系统的结构特点进行系统综合分析
代谢控制分析的不足之处：
(a)代谢控制分析的连通原理要求对代谢系统中的所
有效应物（包括酶和代谢物）都具有详细的了解，
但在大多数实际应用中，有关典型生物细胞的代谢
背景知识很少，这是代谢控制分析理论应用的, 瓶
颈, 问题。
(b)根据代谢控制分析理论对代谢途径进行合理修饰，
大多集中在调节酶浓度的手段上，这对于那些流量
控制系数较大的酶促反应通常难以奏效。
(c)代谢控制分析在途径操作的指导作用方面也存
在着明显的不足，它只能处理稳定态下的代谢系统，
并且代谢流控制分析只能在对反应速度实施微扰的
情况下进行评估，所确定的控制系数也只对该稳定
态有效，因此利用代谢控制分析指导各种状态下的
代谢系统调节问题还存在疑问的
展望：
(1)近年来, 生物化学和分子生物学知识的倍
增使生物技术的应用领域更加广阔, 与此同
时, 依靠传统的理论和方法分析, 理解生物
分析与细胞整体功能之间的复杂关系也变得
越来越困难 。 考察和改造细胞代谢不仅需要
从组成细胞代谢的各个要素之间的相互关系
方面入手, 而且还必须从系统整体特性的角
度上理解代谢网络和生物分子功能之间的有
机联系 。 代谢控制分析从系统的角度考察并
高度概括了复杂的代谢现象, 从这个意义上
说, 该理论具有明显的系统论的概念 。 另一
方面, 代谢控制分析把代谢的控制事件形式
化, 演绎出代谢系统中一系列的重要原理,
(2)另一方面, 代谢控制分析把代谢的控制事
件形式化, 演绎出代谢系统中一系列的重要
原理, 并设计了许多研究代谢系统控制的实
验模型 。 在此基础上, 代谢控制分析将理论
与实验结果相结合, 将代谢系统的特征描述
与单一酶的动力学特性相结合, 使得代谢途
径的研究不至于沉没在浩瀚分散的零碎生物
学知识中, 这对分析复杂的代谢现象, 有目
的地改进细胞代谢以及促进细胞代谢多学科
研究的交汇等, 都具有非常重要的意义 。 因
此可以预期, 代谢控制分析在发酵工程领域
中将会得到更加广泛的应用
四, 代谢工程技术在发酵工程中的应用
代谢工程在发酵工业中的应用领域主要包括,(1)
通过加速限制反应, 改变分叉代谢途径的流向,
构建代谢旁路和改变能量代谢途径等策略来改
变代谢流, 并阻断副产物的合成途径 。
(2)代谢工程在发酵工业中的应用还涉及到引入
外源基因来延伸原来的代谢途径, 产生新的末
端代谢产物, 或者利用新的底物作为生物合成
的原料, 也可构建新的代谢途径合成具有新化
学结构的代谢产物 。
代谢工程的最终目标 是改变代谢流提高产物
产率，其依据是代谢节点的判断。
根据对不同代谢要求的可调控程度，可将
节点分为柔性节点、刚性节点和柔刚性节点。
代谢流分析是代谢分析的一个重要手段，
它通过对细胞在不同情况 (如改变培养环境、
增加或减少酶活等 )下的代谢流分析，可确
定节点类型、确定最优途径、估算基因改造
结果、计算最大理论得率等。
例如：在赖氨酸发酵过程中, 赖氨酸产率变化时,
其合成途径中多节点的代谢流量分配的明显改变仅
发生在 3个节点,6-磷酸葡萄糖 （ G6P）, 磷酸烯醇
式丙酮酸 （ PEP） 和丙酮酸 （ Pyr） 。
Vallino等以葡萄糖酸盐代替葡萄糖进行赖氨酸发酵,
发现 G6P节点的 NADP 代谢流降低 50%时, 赖氨酸的
产率可保持不变；通过 DNA技术消减 6-磷酸葡萄糖
异构酶 90%的活性, 赖氨酸代谢流分布不变, 但总代
谢流降为原来的 75%。 由此, 确定 G6P节点是柔性的,
磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸中定有刚性节点存在；
随后的分析表明丙酮酸为柔性, PEP为刚性 。
