实验四、蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝 G250法，紫外吸收法
一、基本原理
? 利用某些物质的分子吸收紫外光、可见光、
红外光和激光 200 ~ 800 nm光谱区的辐射来进行
定性定量分析和物质结构分析测定的方法。称为
分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分
光光度计。
? 这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，
应用范围广，其中的紫外 /可见分光光度技术更是
生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
?紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外
（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、
比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小
于 190nm波长的光，因此常规紫外测定集
中在近紫外区，即 200nm-400nm。可见光
区为 400nm -800nm。
? 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线, 可与已
知标准的紫外光谱图相对照, 对照时须注意测定的
条件, 如溶剂, 浓度等 。
常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验
公司编制的, Sadtler”紫外标准图谱集, 到七十年
代末为止已收集 28585个化合物紫外光谱图, 此外
还有药物和非极性溶剂紫外光谱图 2000多幅 。
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很
宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸
收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相
同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不
一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色
团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
1,Beer-Lambert 定律
朗伯 -比尔光吸收定律,
A＝－ lgT＝ εb c
A,吸光度, 又称光密度, O.D”。
T,透光度, T＝ I / I。 （ I。 为照射到吸收池上的光强,
I为透过吸收池的光强 ）
ε,摩尔吸光系数或克分子吸光系数 （ L·mol－ 1·cm－ 1） 。
b,样品光程 （ cm）, 通常使用 1,0cm 的吸收地,
b=1cm。
c,样品浓度（ mol/L）。
由上式可以看出：吸光度 A与物质的吸光系数, ε”和
物质的浓度, C”成正比。
? 摩尔吸光系数：, 是物质对某波长的光的吸收能
力的量度。 ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法
测定的灵敏度就越高。 ε值越大，说明电子跃迁的几率大，
通常 ε＝ 10-105,一般认为 ε＞ 104为强吸收； ε＝ 103-
104 为较强吸收； ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不
灵敏。
? 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度 A＝
0.001,所以，当 b＝ 1cm,ε＝ 105时，可检测的溶液最小
浓度是 C＝ 10-8 mol/L。
吸光度, A”有一个重要性质是其具有加和性,
即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光
度的算术和 。 这是多元混合物分光光度法定量分析的基础 。
若溶液中各溶质的吸光系数 ε相同，则各溶质吸光度的大小
与溶质浓度成比例。
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用 1cm石英吸收池测定 260nm处的吸
光度为 0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为 0.070，
计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 =
8.2× 103 M－ 1cm－ 1（ M＝ mol / L）。
∵ A＝ εbC ∵ A＝ （ 溶剂加样品的吸光度 ） － （ 溶剂的吸光度 ）
∴ A＝ 0.650－ 0.070＝ 0.580
∵ b＝ 1cm
∴ C==7.1× 10－ 5 mol / L
3,影响吸光系数的因素
ε的大小取决于物质的本性和光的波长
化学因素,
溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶
剂间的作用等等原因而发生偏离 Beer定律的现
象。
化学因素引起的偏离，有时可控制溶液浓度设
法减免。比如在强酸性溶液中滴定铬酸溶液就
可以避免偏离现象。
光学因素,
非单色光、杂散光、散射光、反射光以及非平
行光等都会造成偏离现象。
考马斯亮蓝 G250法
? 原理：考马斯亮蓝 G250与蛋白质结合后，其最大
吸收波长从 465nm改变为 595nm,该蛋白－染料复合
物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测
定 1μ g /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要 2分
钟，颜色在 1小时内稳定。操作简便，快速，是常
用的蛋白含量测定方法之一。
? 去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定
? 试剂,标准蛋白质溶液（ 0.5 mg/ml）
考马斯亮蓝 G250蛋白染色剂
操作步骤
? 标准曲线的绘制,取 8只试管，分别加入 0,0.4，
0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6mL标准蛋白质溶液，
用水补足体积至 3mL,然后加入 5ml考马斯亮蓝试剂，
震荡混匀,2分钟后于 595nm测定吸光值，以蛋白质
浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
? 样品测定,样品液 1mL,用水补足体积至 3mL,然后
加入 5ml考马斯亮蓝试剂,595nm测定吸光值。从
标准曲线中查出相应的浓度。
? 计算 样品中蛋白质的含量
紫外吸收法测定核酸蛋白质的含量
? 原理：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含
有共轭双键，在 280nm处有吸收峰。其吸收值与
含量成正比关系。可用作定量测定。
? 紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共
轭双键中的 π电子和未共享的电子对的激发所产
生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质
取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共
轭情况等。
? 蛋白质浓度（ mg/mL )=1.45A280-0.74A260；
? DNA 浓度（ μ g/mL )＝ A260 × 稀释倍数 ／
（ 0.024 × L）
? 试剂：标准蛋白质溶液（ 1mg/ml)
操作步骤
? 取两只小试管，甲管加入 1.5mL 样品（蛋白质或
核酸） 1.5mL蒸馏水，乙管加入 3mL蒸馏水,(注
意：此实验与书上步骤不同，直接测试按公式计
算即可 ) 测定样品在 280nm,260nm的吸收值。
? 计算 蛋白质浓度（ mg/mL )=1.45A280-0.74A260；
? DNA 浓度（ μg/mL )＝ A260 × 稀释倍数 ／
（ 0.02＊ L）
课后题
? 请指出这两种蛋白质含量测定方法的优缺
点。
考马斯亮蓝 G250法，紫外吸收法
一、基本原理
? 利用某些物质的分子吸收紫外光、可见光、
红外光和激光 200 ~ 800 nm光谱区的辐射来进行
定性定量分析和物质结构分析测定的方法。称为
分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分
光光度计。
? 这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，
应用范围广，其中的紫外 /可见分光光度技术更是
生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
?紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外
（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、
比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小
于 190nm波长的光，因此常规紫外测定集
中在近紫外区，即 200nm-400nm。可见光
区为 400nm -800nm。
? 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线, 可与已
知标准的紫外光谱图相对照, 对照时须注意测定的
条件, 如溶剂, 浓度等 。
常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验
公司编制的, Sadtler”紫外标准图谱集, 到七十年
代末为止已收集 28585个化合物紫外光谱图, 此外
还有药物和非极性溶剂紫外光谱图 2000多幅 。
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很
宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸
收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相
同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不
一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色
团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
1,Beer-Lambert 定律
朗伯 -比尔光吸收定律,
A＝－ lgT＝ εb c
A,吸光度, 又称光密度, O.D”。
T,透光度, T＝ I / I。 （ I。 为照射到吸收池上的光强,
I为透过吸收池的光强 ）
ε,摩尔吸光系数或克分子吸光系数 （ L·mol－ 1·cm－ 1） 。
b,样品光程 （ cm）, 通常使用 1,0cm 的吸收地,
b=1cm。
c,样品浓度（ mol/L）。
由上式可以看出：吸光度 A与物质的吸光系数, ε”和
物质的浓度, C”成正比。
? 摩尔吸光系数：, 是物质对某波长的光的吸收能
力的量度。 ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法
测定的灵敏度就越高。 ε值越大，说明电子跃迁的几率大，
通常 ε＝ 10-105,一般认为 ε＞ 104为强吸收； ε＝ 103-
104 为较强吸收； ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不
灵敏。
? 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度 A＝
0.001,所以，当 b＝ 1cm,ε＝ 105时，可检测的溶液最小
浓度是 C＝ 10-8 mol/L。
吸光度, A”有一个重要性质是其具有加和性,
即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光
度的算术和 。 这是多元混合物分光光度法定量分析的基础 。
若溶液中各溶质的吸光系数 ε相同，则各溶质吸光度的大小
与溶质浓度成比例。
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用 1cm石英吸收池测定 260nm处的吸
光度为 0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为 0.070，
计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 =
8.2× 103 M－ 1cm－ 1（ M＝ mol / L）。
∵ A＝ εbC ∵ A＝ （ 溶剂加样品的吸光度 ） － （ 溶剂的吸光度 ）
∴ A＝ 0.650－ 0.070＝ 0.580
∵ b＝ 1cm
∴ C==7.1× 10－ 5 mol / L
3,影响吸光系数的因素
ε的大小取决于物质的本性和光的波长
化学因素,
溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶
剂间的作用等等原因而发生偏离 Beer定律的现
象。
化学因素引起的偏离，有时可控制溶液浓度设
法减免。比如在强酸性溶液中滴定铬酸溶液就
可以避免偏离现象。
光学因素,
非单色光、杂散光、散射光、反射光以及非平
行光等都会造成偏离现象。
考马斯亮蓝 G250法
? 原理：考马斯亮蓝 G250与蛋白质结合后，其最大
吸收波长从 465nm改变为 595nm,该蛋白－染料复合
物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测
定 1μ g /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要 2分
钟，颜色在 1小时内稳定。操作简便，快速，是常
用的蛋白含量测定方法之一。
? 去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定
? 试剂,标准蛋白质溶液（ 0.5 mg/ml）
考马斯亮蓝 G250蛋白染色剂
操作步骤
? 标准曲线的绘制,取 8只试管，分别加入 0,0.4，
0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6mL标准蛋白质溶液，
用水补足体积至 3mL,然后加入 5ml考马斯亮蓝试剂，
震荡混匀,2分钟后于 595nm测定吸光值，以蛋白质
浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
? 样品测定,样品液 1mL,用水补足体积至 3mL,然后
加入 5ml考马斯亮蓝试剂,595nm测定吸光值。从
标准曲线中查出相应的浓度。
? 计算 样品中蛋白质的含量
紫外吸收法测定核酸蛋白质的含量
? 原理：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含
有共轭双键，在 280nm处有吸收峰。其吸收值与
含量成正比关系。可用作定量测定。
? 紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共
轭双键中的 π电子和未共享的电子对的激发所产
生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质
取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共
轭情况等。
? 蛋白质浓度（ mg/mL )=1.45A280-0.74A260；
? DNA 浓度（ μ g/mL )＝ A260 × 稀释倍数 ／
（ 0.024 × L）
? 试剂：标准蛋白质溶液（ 1mg/ml)
操作步骤
? 取两只小试管，甲管加入 1.5mL 样品（蛋白质或
核酸） 1.5mL蒸馏水，乙管加入 3mL蒸馏水,(注
意：此实验与书上步骤不同，直接测试按公式计
算即可 ) 测定样品在 280nm,260nm的吸收值。
? 计算 蛋白质浓度（ mg/mL )=1.45A280-0.74A260；
? DNA 浓度（ μg/mL )＝ A260 × 稀释倍数 ／
（ 0.02＊ L）
课后题
? 请指出这两种蛋白质含量测定方法的优缺
点。
