第九章 维生素类药物的分析 [教学目的] 掌握维生素A、B1、C、D、E的结构、性质和鉴别、检查、含量测定方法。 熟悉本类药物其它的含量测定方法以及杂质检查方法。 了解维生素A三点校正法的推导过程。 [本章分配学时数] 2学时 [教学环节与教学内容] [复习引入] 2分钟 在上节课,我们进行了杂环类药物的分析,要求同学们通过上一章的学习不仅要掌握吡啶类、喹啉类、托烷类、吩噻嗪类、苯并二氮杂卓类药物的鉴别和含量测定的基本原理与方法,熟悉本类药物中典型药物国外药典收载的鉴别和含量测定方法,还要了解本类药物的体内分析方法。那么,这节课我们就要对维生素类药物进行分析,经过本章的学习后,要求同学们不仅要掌握维生素A、B1、C、D、E的结构、性质和鉴别、检查、含量测定方法,熟悉本类药物其它的含量测定方法以及杂质检查方法,还要了解维生素A三点校正法的推导过程。 [教授新课] 维生素(vitamins)是维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质,主要用于机体的能量转移和代谢调节,体内不能自行合成,须从食物中摄取。 从化学结构上看,都是有机物,但并非同属一类化合物,有醇、酯、酸、胺、酚和醛。按其溶解度可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。  维生素A的分析 维生素A包括有维生素A1、去氢维生素A(A2)和去水维生素(A3)。其中A1活性最高,A2是A1的30%~40%,A3是A1的0.4%。通常所说的维生素A是指维生素A1。维生素A1是一种不饱和脂肪醇,在自然界中主要来自鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油(鱼肝油),目前主要采用人工合成方法制取。在鱼肝油中维生素A1多以各种酯类混合物的形式存在,其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。 结构与性质 结构 维生素A的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环已烯,因而具有许多立体异构体,共轭多烯结构具有紫外吸收,可采用紫外吸收光谱法进行鉴别,采用紫外分光光度法进行含量测定。天然维生素A主要是全反式维生素A,尚有多种其它异构体,R不同则可以是维生素A醇或其酯,见表9-1,临床上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。其它异构体具有相似的化学性质,但各具不同的光谱特性和生物效价,见表9-2。  性质 溶解性 与氯仿、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合,在乙醇中微溶,在水中不溶。 不稳定性 维生素A中有多个不饱和键,性质不稳定,易被空气中氧或氧化剂氧化,易被紫外光裂解,特别在加热和金属离子存在时,更易氧化变质,生成无生物活性的环氧化合物维生素A醛或维生素A酸。因此,维生素A及其制剂除需密封在凉暗处保存外,还需充氮或加入合适的抗氧剂。 紫外吸收特性 维生素A分子中具有共轭多烯醇的侧链结构,在325nm~328nm的范围内有最大吸收,可用于鉴别和含量测定。 与三氯化锑呈色 维生素A在氯仿中能与三氯化锑试剂作用,产生不稳定的蓝色。可以此进行鉴别或用比色法测定含量。 鉴别试验 三氯化锑反应(Carr-Price反应) 原理 维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色,渐变成紫红色。其机制为维生素A和氯化锑(Ⅲ)中存在的亲电试剂氯化高锑(Ⅴ)作用形成不稳定的蓝色碳正离子。 注意事项 反应需在无水、无醇条件下进行。因为水可使三氯化锑水解成氯化氧锑,而乙醇可以和碳正离子作用使其正电荷消失。所以仪器和试剂必须干燥无水,氯仿中必须无醇。 紫外吸收光谱法 在300nm~400nm的波长范围内进行扫描,应仅在326nm的波长处有单一的吸收峰,经水浴加热30s,则应在348、367和389nm的波长处有三个尖锐的吸收峰。 薄层色谱法 比较供试品溶液和对照品溶液所显蓝色斑点位置。 含量测定 紫外分光光度法:维生素A法定的含量测定方法 三氯化锑比色法:反应专属性差、呈色极不稳定,但由于操作较为简便、快速,目前仍为食品或饲料中维生素A含量测定的常用方法。 紫外分光光度法(三点校正法) 为何要采用三点校正法? 维生素A原料药中常混有杂质,如维生素A2、维生素A3、维生素A的氧化产物、鲸醇以及维生素A的异构体,这些杂质在维生素A的最大吸收波长附近有吸收,以致在维生素A的最大吸收波长处测定的吸收度并非是维生素A所独有的吸收,干扰维生素A的测定。采用三点校正法可以消除这些杂质的干扰。 测定原理 本法是在三个波长处测得吸收度,根据校正公式计算吸收度A校正值后,再计算含量,故本法称为“三点校正法”。 杂质的无关吸收在310nm~340nm的波长范围内几乎呈一条直线,且随波长的增大吸收度下降。 物质对光吸收呈加和性的原理。即在某一样品的吸收曲线上,各波长处的吸收度是维生素A与杂质吸收度的代数和,因而吸收曲线也是二者吸收的叠加。 波长选择 一点选在维生素A的最大吸收波长处(λ1),其它两点选在λ1的两侧各选一点(λ2和λ3) 第一法(等波长差法):使λ3-λ1=λ1-λ2。中国药典规定,测定维生素A醋酸酯时,λ1=328nm,λ2=316nm,λ3=340nm,△λ=12nm。 第二法(等吸收比法):使Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1。中国药典规定,测定维生素A醇时,λ1=325nm、λ2=310nm、λ3=334nm。 杂质的吸收 维生素A2和维生素A3:维生素A2在345nm~350nm波长范围内有吸收。 维生素A的氧化产物:环氧化物、维生素A醛和维生素A酸。 维生素A在光照下产生的无活性的聚合物:鲸醇。 维生素A的异构体等。 以上这些杂质在310nm~340nm的波长范围内有吸收,所以干扰维生素A的测定。因此,在测定维生素A的含量时,必须排除这些杂质的干扰,三点校正法即可消除这些杂质的影响。 测定方法 首先判断用哪个吸收度进行含量计算。 第一法:供试液浓度为9~15IU/ml,溶剂为环己烷,在300、316、328、340、360nm五个波长处测定吸收度。 如果最大吸收波长在326~329nm之间,计算吸收度比值Ai /A328,并与规定值相减,差值不超过±0.02,则用A328计算含量: E 1cm1% =A/CL IU/g = E 1cm1%× 1900 A×D×1900×W 标示量% = ------------------- ×100% W×100×L×标示量 如果最大吸收波长在326~329nm之间,5个波长下的差值有一个或几个超过±0.02,这时先计算A328(校正): A328(校正)=3.52(2 A328 - A316 - A340) A328(校正)- A328 再计算 ------------------×100% A328 若所得的数值在±3%之间,则仍用A328计算含量; 若所得的数值在-15%~-3%之间,则需用A328(校正)计算含量; 若所得的数值小于-15%或大于+3%,或最大吸收波长不在326~329nm之间,则应采用第二法(皂化法)测定。 讨论 维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法(即代数法)推导而来:维生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法(几何法或6/7定位法)推导而来。 在应用三点校正法时,除其中一点在最大吸收波长处测定外,其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时,会产生较大误差。因此,在测定前务必要校正波长,并可用全反式维生素A进行测定,比较测定结果和比值是否与对照品相符合,以进一步核对仪器波长是否准确。测定的样品应不得少于两份。 中国药典(2000年版)收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素AD胶丸等均采用三点校正法测定。 三氯化锑比色法 原理 维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用,产生不稳定的蓝色,在618nm~620nm的波长处有最大吸收,符合Beer定律。 方法 见教材P214。 注意事项 本法产生的蓝色不稳定,要求操作迅速,一般规定加入三氯化锑后应在5s~10s内测定。 反应介质需无水,否则使三氯化锑水解产生SbOCl而使溶液混浊,影响比色。 温度对呈色强度的影响很大,样品测定时的温度与绘制标准曲线时温度相差应在±1℃以内。否则,需重新绘制标准曲线。 本反应并非维生素A专属,在相同条件下,某些有关物质均与三氯化锑显蓝色,干扰测定,常使测定结果偏高。 三氯化锑试剂有强的腐蚀性,易损坏皮肤和仪器,使用时应严加注意。 高效液相色谱法 见教材P215~216。  维生素B1的分析 维生素B1广泛存在于米糠、麦麸、酵母中,此外来源于人工合成。本品具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能,主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病。中国药典收载有维生素B1及其片剂和注射剂。 结构与性质 结构 维生素B1(盐酸硫胺)是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵类化合物,噻唑环上季铵及嘧啶环上氨基,为两个碱性基团,可与酸成盐。 结构图见教材P219。 性质 溶解性 维生素B1为白色结晶或结晶性粉末,干燥品在空气中可迅速吸收4%的水分。本品在水中易溶,在乙醇中微溶,在乙醚中不溶。本品的水溶液显酸性。 硫色素反应 噻唑环在碱性介质中可开环,再与嘧啶环上的氨基环合,经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素,后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光。 紫外吸收特性 本品的12.5ug/ml盐酸溶液,在246nm的波长处测定吸收度,其吸收系数为421,故本品的吸收系数规定为406~436。 与生物碱沉淀试剂反应 分子中含有两个杂环(嘧啶环和噻唑环),故可与某些生物碱沉淀试剂(如碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液和硅钨酸等)反应生成组成恒定的沉淀, 可用于鉴别和含量测定。 氯化物的特性 维生素B1是一种盐酸盐,故本品的水溶液显氯化物的鉴别反应。 鉴别试验 硫色素反应 原理 维生素B1在碱性溶液中,可被铁氰化钾氧化生成硫色素。硫色素溶于正丁醇(或异丁醇)中,显蓝色荧光。反应式见教材P220。 方法 取本品约5mg,加氢氧化钠试液2.5ml溶解后,加铁氰化钾试液0.5ml与正丁醇5ml,强力振摇2min,放置使分层,上面的醇层显强烈的蓝色荧光;加酸使成酸性,荧光即消失;再加碱使成碱性,荧光又重现。 硫色素反应为维生素B1所特有的专属性反应,中国药典以此用于本品的鉴别。 沉淀反应 维生素B1与碘化汞钾生成淡黄色沉淀 维生素B1与碘生成红色沉淀 维生素B1与硅钨酸生成白色沉淀 维生素B1与苦酮酸生成扇形白色结晶 氯化物反应 本品的水溶液显氯化物的鉴别反应。 硝酸铅反应 维生素B1与NaOH共热,分解产生硫化钠,可与硝酸铅反应生成黑色沉淀,可供鉴别。 含量测定 维生素B1及其制剂常用的含量测定方法有非水滴定法、紫外分光光度法和硫色素荧光法。中国药典用非水溶液滴定法测定原料药,而片剂和注射液则采用紫外分光光度法测定;USP(24)采用硫色素荧光法。 非水滴定法 原理 维生素B1分子中含有两个碱性的已成盐的伯胺和季铵基团,在非水溶液中(在醋酸汞存在下),均可与高氯酸作用。根据消耗高氯酸的量即可计算维生素B1的含量。 方法 见教材P221。 讨论 有机碱的氢卤酸盐在用高氯酸滴定前,须加入醋酸汞溶液。 维生素B1具有两个碱性基团,故与高氯酸反应的摩尔比为1:2。 本法可用于弱酸性特别是弱碱性药物及其盐类的含量测定。 紫外分光光度法 原理 维生素B1分子中具有共轭双键结构,在紫外区有吸收,测定其最大吸收波长处的吸收度即可计算含量。 维生素B1片的测定 方法 见教材P221 计算  A-供试品在246nm的波长处测得的吸收度 D-供试品的稀释倍数 -维生素B1片的平均片重 W-称取维生素B1片粉的量 维生素B1注射液的测定 方法 见教材P221。 计算  供试品在246nm的波长处测得的吸收度 D-供试液的稀释倍数 V-维生素B1注射液的取样量 讨论 中国药典规定维生素B1原料药采用非水滴定法,而片剂和注射液采用分光光度法。由于维生素B1的紫外吸收峰随溶液的pH的变化而变化,pH=2时,最大吸收波长在246nm处,吸收系数为421;pH=7时,有两个吸收峰,在232nm~233nm处吸收系数为345;在266nm处吸收系数为255。故可采用差示分光光度法测定其含量,可消除背景和辅料的干扰。 硫色素荧光法 原理 维生素B1在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素,用异丁醇提取后,在紫外光照射下呈现蓝色荧光,通过与对照品比较荧光强度,即可测得供试品含量。 硫色素反应为维生素B1的专属性反应,虽非定量完成,但在一定条件下形成的硫色素与维生素B1浓度成正比,可用于维生素B1及其制剂的含量测定。 方法 见教材P222。 讨论 硫色素反应为维生素B1的专属性反应,虽非定量完成,但在一定条件下形成的硫色素与维生素B1浓度成正比,可用于维生素B1及制剂的含量测定。 本法以维生素B1特有的硫色素反应为原理,故不受氧化破坏产物的干扰,测定结果较为准确。但操作繁琐,且荧光测定受干扰因素较多。 本法中使用的氧化剂,除铁氰化钾外,尚可用氯化汞或溴化氰。其中,溴化氢能将维生素B1完全定量地氧化为硫色素,在较宽的浓度范围内与荧光强度成正比。在体内药物分析中,尿液中某些代谢产物不干扰测定,故亦适用于临床体液分析。  维生素C的分析 维生素C又称L-抗坏血酸,在化学结构上和糖类十分相似,有四种光学异构体,其中以L-构型右旋体的生物活性最强。各国药典收载的都是L-抗坏血酸。中国药典收载有维生素C原料及其片剂、泡腾片、颗粒剂和注射液。 结构与性质 结构 维生素C分子结构中具有二烯醇结构,具有内酯环,且有两个手性碳原子(C4、C5),不仅使维生素C性质极为活跃,且具旋光性。结构见教材P223。 性质 溶解性 维生素C在水中易溶,水溶液呈酸性;在乙醇中略溶,在氯仿或乙醚中不溶。 酸性 维生素C分子结构中的二烯醇基,尤其是C3-OH由于受共轭效应的影响,酸性较强;C2-OH的酸性极弱,故维生素C一般表现为一元酸,可与碳酸氢钠作用生成钠盐。 还原性 分子中的二烯醇基具极强的还原性,易被氧化为二酮基而成为去氢抗坏血酸,加氢又可还原为抗坏血酸。在碱性溶液或强酸性溶液中能进一步水解为二酮古络糖酸而失去活性,此反应为不可逆反应。 旋光性 分子中有两个手性碳原子,故有四个光学异构体,其中L(+)-抗坏血酸活性最强。本品的比旋度为+20.5°~+21.5°。 水解性 维生素C和碳酸钠作用可生成单钠盐,不致发生水解,因双键使内酯环变得较稳定;但在强碱中,内酯环可水解,生成酮酸盐。 糖类的性质 维生素C的化学结构与糖类相似,具有糖类的性质和反应。 紫外吸收特性 维生素C具有共轭双键,其稀盐酸溶液在243nm波长处有最大吸收,吸收度为560,可用于鉴别和含量测定。若在中性或碱性条件下,则红移至265nm处。 鉴别试验 与硝酸银反应 原理 维生素C分子中有二烯醇基,具有强还原性,可被硝酸银氧化为去氢抗坏血酸,同时产生黑色银沉淀。 方法 取本品0.2g,加水10ml溶解。取该溶液5ml,加硝酸银试液0.5ml,即生成金属银的黑色沉淀。中国药典和BP(2000)均采用该法鉴别。 与2,6-二氯靛酚反应 原理 2,6-二氯靛酚为一染料,其氧化型在酸性介质中为玫瑰红色,碱性介质中为蓝色。与维生素C作用后生成还原型的无色的酚亚胺。 方法 取本品0.2g,加水10ml溶解。取该溶液5ml,加2,6-二氯靛酚试液1~2滴,试液的颜色即消失。 中国药典采用该法鉴别;USP(24)则用斐林液反应进行鉴别。 与其它氧化剂反应 维生素C还可被亚甲蓝、高锰酸钾、碱性酒石酸铜试液、磷钼酸等氧化剂氧化为去氢抗坏血酸,同时,抗坏血酸可使这些试剂褪色,产生沉淀或呈现颜色。 糖类的反应 维生素C可在三氯化醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖,再失水,转化为糠醛,加入吡咯,加热至50℃产生蓝色。 紫外分光光度法 维生素C在0.01mol/L盐酸液中,在243nm波长处有唯一的最大吸收,利用此特征进行鉴别。本法在BP(1998)采用,并规定其吸收系数应为545~585之间。 杂质检查 中国药典规定应检查维生素C及其片剂、注射液的澄清度与颜色,另外对维生素C原料中铜、铁离子进行检查。 溶液的澄清度与颜色检查 维生素C及其制剂在贮藏期间易变色,且颜色随贮存时间的延长而逐渐加深。这是因为维生素C的水溶液在高于或低于pH5~6时,受空气、光线和温度的影响,分子中的内酯环可发生水解,并进一步发生脱羧反应生成糠醛聚合成色。为保证产品质量,须控制有色杂质的量。具体方法见教材P226。 维生素C制剂加工过程中有色杂质增加,故其限量比原料药宽一些。注射液和片剂中所含有色杂质的吸收峰略有不同,故测定限量时,所用波长也不同。 铁、铜离子的检查 见教材P226。 含量测定 维生素C的含量测定大多是基于其具有较强的还原性,可被不同氧化剂定量氧化。因容量分析法简便快速、结果准确,被各国药典所采用,如碘量法、2,6-二氯靛酚法等。为适用于复方制剂和体液中微量维生素C的测定,又相继发展了比色法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。 碘量法 原理 维生素C在醋酸酸性条件下,可被碘定量氧化。根据消耗碘滴定液的体积。即可计算维生素C的含量。 方法 见教材P227。 注意事项 操作中加入稀醋酸10ml使滴定在酸性条件下进行。因在酸性介质中维生素C受空气中氧的氧化速度减慢,但样品溶于稀酸后仍需立即进行测定。 加新沸过的冷水目的是为减少水中溶解的氧对测定的影响。 中国药典采用本法对维生素C原料、片剂、泡腾片和注射液进行含量测定。为消除制剂中辅料对测定的干扰,滴定前要进行必要的处理。如片剂溶解后应滤过,取续滤液测定;注射液测定时要加2ml丙酮,以消除注射液中含有的抗氧剂亚硫酸氢钠对测定结果的影响。 2,6-二氯靛酚滴定法 原理 2,6-二氯靛酚为一种染料,其氧化型在酸性溶液中显红色,碱性溶液中为蓝色。当与维生素C反应后,即转变为无色的酚亚胺(还