口腔微生物分子生物学
武汉大学口腔医学院
边 专
什么是遗传物质？
蛋白质 20种氨基酸
DNA 四种碱基
转化实验的结果说明 ……
生命的主要遗传物质
脱氧核糖核酸（ DNA）
DNA结构的推衍
Chargaff,T+C=A+G
A=T
G=C
X线衍射,
DNA在两条链组成，相互平行
核酸的组成
DNA RNA
脱氧核糖 核糖
腺嘌吟 胞嘧啶 腺嘌呤 胞嘧啶
鸟嘌呤 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 尿嘧啶
双链 单链
DNA复制
? 半保留复制
DNA复制
? 半不连接复制
由于 DNA多聚酶只能从 5’ → 3’ 方向
合成 DNA,因而半保留复制不能完全
解释。
DNA复制的特点
新合成的子代 DNA与亲
代 DNA完全一样，保证
了遗传的稳定性。
RNA
? 信使 RNA（ mRNA)
? 核蛋白体 RNA（ rRNA)
? 转运 RNA（ tRNA)
RNA的生物合成 —— 转录
? 以 DNA为模板合与 RNA
? 由 RNA多聚酶合成
? 从 DNA上特定起始序列（启动子）
开始，至终止信号结束
蛋白质的生物合成 —— 翻译
? 遗传密码
由 3个连续的核苷酸组成
蛋白质的生物合成 —— 翻译
? 蛋白质合成过程
Ⅰ,氨基酸活化
Ⅱ,蛋白质合成的起始
AUG→ 甲酰化甲硫氨酸（ fMet)
Ⅲ,蛋白质合成的终止
终止码 UAA,UGA,UAG
蛋白质的生物合成 —— 翻译
? 新生多肽的加工
Ⅰ, fMet水解
Ⅱ, 磷酸化、糖基化、甲基化修饰
Ⅲ, 信号肽 蛋白质向细胞外分泌
基因表达
DNA → RNA→ 蛋白质
丰
富
的
生
命
现
象
基因表达的调节
? 机体的每一个细胞都有一套完全
相同的基因
? 共同表达的基因
? 特异性表达的基因
基因表达的调节
? 共同表达的基因
维持细胞基本结构、功能
基因表达的调节
? 特异性表达的基因
红细胞产生血红蛋白
B淋巴细胞产生抗体
成牙本质细胞分泌牙本质蛋白
基因表达调控的原因动力
? 细胞内、细胞间，或细胞与外界
环境间关系的变化。
基因表达调节的方式
? 启动子
强启动子与 RNA多聚酶有较强的
结合能力，转录水平较高；弱启
动子则反之。
基因表达调节的方式
? 调节蛋白的作用
— 负向调节
— 正向调节
负向调节
? 乳糖操纵子学说
正向调节
原核生物基因表达的调节
? 主要在转录水平
真核基因生物调节
? 多层次
? 复杂性
分子克隆技术
限制性内切酶
? 特定的识别序列,4~6个碱基对
? 在识别序列内固定位置切割,5’
–端磷酸基因,3’ -端羟基基团
? 切割后形成粘性或平滑末端
DNA连接酶
催化 DNA中相邻 3’ 羟基和 5’ 磷酸
基团之间形成 3’, 5’ –磷酸二酯
键。
质 粒
? 细胞内独立于染色体外的环状 DNA，
能自我复制
? 其上基因可借助宿主细胞的转录、
翻译系统得以表达
? 分子 2000~50000bp
T
pGEM?-T
Vector
(3003bp)
Ampr
lacZ
ori
XmnI 1994
ScaI 1875 NaeI
2695 ApaI
AatII
SphI
BstZI
NcoI
SacII
T7
SpeI
NotI
BstZI
PstI
SaLI
NdeI
SacI
BstXI
NsiI
SP6
T
1 start
14
20
26
31
37
46
55
62
62
73
75
82
94
103
112
126
pGEM-T vector map
XhoI
SmaI
XhoI SmaI
XhoI
SmaI
pCI
pCIA-P
pGEM-T/A-P A-P fragment
Sub-cloning construction of recombinant pCIA-P
insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCI
XhoI SmaI
T4 Ligase
A-P fragment
构建质粒的特点
? Ori区：复制起点
? Par区：保证质粒均匀分布于子细胞
? 多克隆区：人为构建，便于克隆操作
? 选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，
使克隆后便于挑选
接 合
在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混
合时形成配对的雄性 -雌性菌，并有遗
传物质的单向转移。
雄性菌：含 F性因子，染色体外环状
DNA
转 化
外源 DNA能进入细胞内并通过整合至
宿主 DNA中或独立复制保存于宿主细
胞内。
转 录
利用噬菌体为媒介，将供体 DNA转移
到受体菌内的现象，能在自然状态下
发生。
分子克隆常用技术
? DNA电泳
? 基因转移
? 核酸杂交
? 聚合酶链反应 PCR
DNA电泳
可分离不同分子量的 DNA
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder
对临床菌株的第二次 PCR 扩增产物电泳图谱分析
Lane 1~7,临床菌株 S,sobrinus;
Lane 8~14:临床菌株 S.mutans,
(Kb)
2.0
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
MW
核酸杂交
原理,
? 在一定条件下（温度,pH值等）
DNA双股螺旋可解开并分离
? 在一定条件下，两股游离的互补
的核苷酸可自行配对形成双股
Southern Blot
? 电泳、转移、杂交
? 确定分子量
斑点杂交
? 目标序列的存在
? 目标序列的量
聚合酶链反应 PCR
与龋病相关微生物的定量检测方法
? 细菌形态
? 生化反应
? 免疫反应
? 分子生物学方法
----分子探针杂交
----RFLP
----PCR
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
? 在人类口腔中检出率很高
? 茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损
活跃性之间的关系更密切
变形链球菌和茸毛链球菌
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
套式 PCR快速检测人类唾液中变形链
球菌和茸毛链球菌,
谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵,
中华口腔医学杂志,2003,38,223-226
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
套式 PCR(Nested PCR )
5′ 3′ Template
Outer primer2
Outer primer1 The first PCR
5′ 3′
Inter primer2
Inter primer 1
Next template
The second PCR
5′ 3′
The second PCR product
本套式 PCR的引物是分别根据变形链球菌 gtfB基因
和茸毛链球菌 gtfI基因设计的内、外两套引物
（ outer primer,inter primer）
gtfB gene of S.mutans Outer primer thp4
Outer primer thp3 The first PCR
Inter primer thp8
Inter primer thp7
Outer primer thp6
gtfI gene of S.sobrinus
Outer primer thp5 The first PCR
Inter primer thp10
Inter primer thp9 The second PCR The second PCR
? 抽提细菌染色体 DNA(Igarashi et al.1996)
----细菌
----唾液
? PCR反应过程
第一次 PCR反应
预变性, 94℃ 4min
变性, 94℃ 1min
退火, 51℃ 1min 30cycles
延伸, 72℃ 2min
最后延伸, 72℃ 5min
第二次 PCR反应
a b c d e f g h
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8
选择外引物行第一次 PCR后扩增产物电泳图谱分析
以变链菌组 (Mutans Streptococci)染色体 DNA为模板
Lane 1,S.cricetus AHT; 2.S,rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt;
4,S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7; 6,S.mutans OMZ175;
7,S.sobrinus 6715; 8,S.downei Mfe28,
MW
(Kb)2.0
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
a b c d e f g h
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8
选择内引物行第二次 PCR后扩增产物电泳图谱分析
Lane 1,S.cricetus AHT; 2.S,rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt;
4,S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7,6,S.mutans OMZ175;
7,S.sobrinus 6715; 8,S.downei Mfe28,Marker,DL2,000 Ladder
MW
(Kb)2.0
0.75
0.5
1.0
0.25
0.1
Ladder 1 2 3 4 5 6
第一次 PCR的灵敏度
变形链球菌 S.mutans Ingbritt 的数量
Lane1,108 CFU; Lane 2,107 CFU;
Lane3,106CFU; Lane 4:105 CFU
MW
(Kb)
2.0
0.75
0.5
1.0
0.25
2.0
0.5
Ladder 1 2 3 4 5 6
1.0
0.75
0.25
MW
(Kb)
第二次 PCR的灵敏度
变形链球菌 S.mutans Ingbritt 的数量
Lane 1,104 CFU,Lane 2,103 CFU
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder
对临床菌株的第二次 PCR 扩增产物电泳图谱分析
Lane 1~7,临床菌株 S,sobrinus;
Lane 8~14:临床菌株 S.mutans,
(Kb)
2.0
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
MW
Ladder 1 2 3 4 5 Ladder MW
1.0(Kb)
0.75
0.5
0.25
0.1
Ladder 1 2 3 4 5
Ladder
MW
2.0(Kb)
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
A B
Lane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt; 2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715;
3.saliva sample from subject A; 4.saliva sample from subject B;
5.saliva sample from subject C,
利用 PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌 S.mutans和茸
毛链球菌 S.sobrinus(图 A)利用外引物 (图 B)利用内引物
分子克隆的主要步骤
? 基因文库的建立
? 目的基因的筛选
? 目的基因的分析
原核生物基因文库的建立
? 提取细胞 DNA
? 限制性内切酶酶切
? DNA片段连接至质粒或噬菌体
? 转化宿主细胞（大肠杆菌）
目的基因的筛选
? 核酸杂交
? 免疫学检测
目的基因的分析
? DNA序列
? 启动子分析
? 推测蛋白质一级结构
? 推测蛋白质二级结构
武汉大学口腔医学院
边 专
什么是遗传物质？
蛋白质 20种氨基酸
DNA 四种碱基
转化实验的结果说明 ……
生命的主要遗传物质
脱氧核糖核酸（ DNA）
DNA结构的推衍
Chargaff,T+C=A+G
A=T
G=C
X线衍射,
DNA在两条链组成，相互平行
核酸的组成
DNA RNA
脱氧核糖 核糖
腺嘌吟 胞嘧啶 腺嘌呤 胞嘧啶
鸟嘌呤 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 尿嘧啶
双链 单链
DNA复制
? 半保留复制
DNA复制
? 半不连接复制
由于 DNA多聚酶只能从 5’ → 3’ 方向
合成 DNA,因而半保留复制不能完全
解释。
DNA复制的特点
新合成的子代 DNA与亲
代 DNA完全一样，保证
了遗传的稳定性。
RNA
? 信使 RNA（ mRNA)
? 核蛋白体 RNA（ rRNA)
? 转运 RNA（ tRNA)
RNA的生物合成 —— 转录
? 以 DNA为模板合与 RNA
? 由 RNA多聚酶合成
? 从 DNA上特定起始序列（启动子）
开始，至终止信号结束
蛋白质的生物合成 —— 翻译
? 遗传密码
由 3个连续的核苷酸组成
蛋白质的生物合成 —— 翻译
? 蛋白质合成过程
Ⅰ,氨基酸活化
Ⅱ,蛋白质合成的起始
AUG→ 甲酰化甲硫氨酸（ fMet)
Ⅲ,蛋白质合成的终止
终止码 UAA,UGA,UAG
蛋白质的生物合成 —— 翻译
? 新生多肽的加工
Ⅰ, fMet水解
Ⅱ, 磷酸化、糖基化、甲基化修饰
Ⅲ, 信号肽 蛋白质向细胞外分泌
基因表达
DNA → RNA→ 蛋白质
丰
富
的
生
命
现
象
基因表达的调节
? 机体的每一个细胞都有一套完全
相同的基因
? 共同表达的基因
? 特异性表达的基因
基因表达的调节
? 共同表达的基因
维持细胞基本结构、功能
基因表达的调节
? 特异性表达的基因
红细胞产生血红蛋白
B淋巴细胞产生抗体
成牙本质细胞分泌牙本质蛋白
基因表达调控的原因动力
? 细胞内、细胞间，或细胞与外界
环境间关系的变化。
基因表达调节的方式
? 启动子
强启动子与 RNA多聚酶有较强的
结合能力，转录水平较高；弱启
动子则反之。
基因表达调节的方式
? 调节蛋白的作用
— 负向调节
— 正向调节
负向调节
? 乳糖操纵子学说
正向调节
原核生物基因表达的调节
? 主要在转录水平
真核基因生物调节
? 多层次
? 复杂性
分子克隆技术
限制性内切酶
? 特定的识别序列,4~6个碱基对
? 在识别序列内固定位置切割,5’
–端磷酸基因,3’ -端羟基基团
? 切割后形成粘性或平滑末端
DNA连接酶
催化 DNA中相邻 3’ 羟基和 5’ 磷酸
基团之间形成 3’, 5’ –磷酸二酯
键。
质 粒
? 细胞内独立于染色体外的环状 DNA，
能自我复制
? 其上基因可借助宿主细胞的转录、
翻译系统得以表达
? 分子 2000~50000bp
T
pGEM?-T
Vector
(3003bp)
Ampr
lacZ
ori
XmnI 1994
ScaI 1875 NaeI
2695 ApaI
AatII
SphI
BstZI
NcoI
SacII
T7
SpeI
NotI
BstZI
PstI
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NdeI
SacI
BstXI
NsiI
SP6
T
1 start
14
20
26
31
37
46
55
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94
103
112
126
pGEM-T vector map
XhoI
SmaI
XhoI SmaI
XhoI
SmaI
pCI
pCIA-P
pGEM-T/A-P A-P fragment
Sub-cloning construction of recombinant pCIA-P
insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCI
XhoI SmaI
T4 Ligase
A-P fragment
构建质粒的特点
? Ori区：复制起点
? Par区：保证质粒均匀分布于子细胞
? 多克隆区：人为构建，便于克隆操作
? 选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，
使克隆后便于挑选
接 合
在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混
合时形成配对的雄性 -雌性菌，并有遗
传物质的单向转移。
雄性菌：含 F性因子，染色体外环状
DNA
转 化
外源 DNA能进入细胞内并通过整合至
宿主 DNA中或独立复制保存于宿主细
胞内。
转 录
利用噬菌体为媒介，将供体 DNA转移
到受体菌内的现象，能在自然状态下
发生。
分子克隆常用技术
? DNA电泳
? 基因转移
? 核酸杂交
? 聚合酶链反应 PCR
DNA电泳
可分离不同分子量的 DNA
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder
对临床菌株的第二次 PCR 扩增产物电泳图谱分析
Lane 1~7,临床菌株 S,sobrinus;
Lane 8~14:临床菌株 S.mutans,
(Kb)
2.0
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
MW
核酸杂交
原理,
? 在一定条件下（温度,pH值等）
DNA双股螺旋可解开并分离
? 在一定条件下，两股游离的互补
的核苷酸可自行配对形成双股
Southern Blot
? 电泳、转移、杂交
? 确定分子量
斑点杂交
? 目标序列的存在
? 目标序列的量
聚合酶链反应 PCR
与龋病相关微生物的定量检测方法
? 细菌形态
? 生化反应
? 免疫反应
? 分子生物学方法
----分子探针杂交
----RFLP
----PCR
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
? 在人类口腔中检出率很高
? 茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损
活跃性之间的关系更密切
变形链球菌和茸毛链球菌
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
套式 PCR快速检测人类唾液中变形链
球菌和茸毛链球菌,
谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵,
中华口腔医学杂志,2003,38,223-226
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
套式 PCR(Nested PCR )
5′ 3′ Template
Outer primer2
Outer primer1 The first PCR
5′ 3′
Inter primer2
Inter primer 1
Next template
The second PCR
5′ 3′
The second PCR product
本套式 PCR的引物是分别根据变形链球菌 gtfB基因
和茸毛链球菌 gtfI基因设计的内、外两套引物
（ outer primer,inter primer）
gtfB gene of S.mutans Outer primer thp4
Outer primer thp3 The first PCR
Inter primer thp8
Inter primer thp7
Outer primer thp6
gtfI gene of S.sobrinus
Outer primer thp5 The first PCR
Inter primer thp10
Inter primer thp9 The second PCR The second PCR
? 抽提细菌染色体 DNA(Igarashi et al.1996)
----细菌
----唾液
? PCR反应过程
第一次 PCR反应
预变性, 94℃ 4min
变性, 94℃ 1min
退火, 51℃ 1min 30cycles
延伸, 72℃ 2min
最后延伸, 72℃ 5min
第二次 PCR反应
a b c d e f g h
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8
选择外引物行第一次 PCR后扩增产物电泳图谱分析
以变链菌组 (Mutans Streptococci)染色体 DNA为模板
Lane 1,S.cricetus AHT; 2.S,rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt;
4,S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7; 6,S.mutans OMZ175;
7,S.sobrinus 6715; 8,S.downei Mfe28,
MW
(Kb)2.0
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
a b c d e f g h
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8
选择内引物行第二次 PCR后扩增产物电泳图谱分析
Lane 1,S.cricetus AHT; 2.S,rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt;
4,S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7,6,S.mutans OMZ175;
7,S.sobrinus 6715; 8,S.downei Mfe28,Marker,DL2,000 Ladder
MW
(Kb)2.0
0.75
0.5
1.0
0.25
0.1
Ladder 1 2 3 4 5 6
第一次 PCR的灵敏度
变形链球菌 S.mutans Ingbritt 的数量
Lane1,108 CFU; Lane 2,107 CFU;
Lane3,106CFU; Lane 4:105 CFU
MW
(Kb)
2.0
0.75
0.5
1.0
0.25
2.0
0.5
Ladder 1 2 3 4 5 6
1.0
0.75
0.25
MW
(Kb)
第二次 PCR的灵敏度
变形链球菌 S.mutans Ingbritt 的数量
Lane 1,104 CFU,Lane 2,103 CFU
Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder
对临床菌株的第二次 PCR 扩增产物电泳图谱分析
Lane 1~7,临床菌株 S,sobrinus;
Lane 8~14:临床菌株 S.mutans,
(Kb)
2.0
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
MW
Ladder 1 2 3 4 5 Ladder MW
1.0(Kb)
0.75
0.5
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0.1
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Ladder
MW
2.0(Kb)
1.0
0.25
0.1
0.75
0.5
A B
Lane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt; 2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715;
3.saliva sample from subject A; 4.saliva sample from subject B;
5.saliva sample from subject C,
利用 PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌 S.mutans和茸
毛链球菌 S.sobrinus(图 A)利用外引物 (图 B)利用内引物
分子克隆的主要步骤
? 基因文库的建立
? 目的基因的筛选
? 目的基因的分析
原核生物基因文库的建立
? 提取细胞 DNA
? 限制性内切酶酶切
? DNA片段连接至质粒或噬菌体
? 转化宿主细胞（大肠杆菌）
目的基因的筛选
? 核酸杂交
? 免疫学检测
目的基因的分析
? DNA序列
? 启动子分析
? 推测蛋白质一级结构
? 推测蛋白质二级结构
