第三章 药物的杂质检查 [教学目的] 一、掌握一般杂质检查的原理、方法和计算。 二、熟悉特殊杂质检查的方法和原理。 [本章分配学时数] 2学时 [教学环节与教学内容] [复习引入] 2分钟 在上节课里，我们介绍了药物一般鉴别试验的原理，主要有有机氟化物、有机酸盐、芳香第一胺类、托烷生物碱类、-无机金属盐、无机酸根的鉴别原理；并且还介绍了一般鉴别试验的基本方法有化学鉴别法、光谱鉴别法、色谱鉴别法、生物学法等几个大类；最后还介绍了有关鉴别试验灵敏度的知识点。通过上节课，同学们已经掌握了药物一般鉴别试验的基础知识，那么今天这节课，我们就要开始介绍有关药物杂质检查的知识。 [教授新课] 什么是药物的杂质？ 药物的杂质是指药物中存在的无治疗作用、或影响药物的稳定性和疗效、甚至对人体健康有害的物质。杂质的存在不仅影响药物质量、还反映出生产中存在的问题。进行药物的杂质检查既可保证用药的安全、有效，同时也为生产、流通过程的质量保证和企业管理的考核提供依据。 概述 药物的纯度要求 药物纯度的概念：即药物的纯净程度，是反映药品质量的一项重要指标。 在药物的生产和贮藏过程中会引入杂质，如药物的生产中常常要使用盐酸、硫酸等，若洗涤不够，在成品中就会引入氯化物、硫酸盐等无机杂质。 药物纯度的评价 应把药物的性状、理化常数、杂质检查、含量测定等作为一个有联系的整体来评价药物的纯度。 人类对药物纯度的认识是在防治疾病的实践中积累起来，并随着分离、检测技术的提高而进一步发现药物中存在的杂质，从而不断提高对药物纯度的要求。 举例：盐酸哌替啶（度冷丁，I） 杂质的来源与种类 杂质的来源 生产过程引入的杂质 在合成药的生产过程中，未反应完成的原料、反应的中间体和副产物，在精制时未能完全除去，就会成为产品中的杂质。 药物在制成制剂的过程中，也可能产生新的杂质。 在药物的生产过程中，常需用到试剂、溶剂。这些化合物若不能完全除去，也会引入有关杂质。 药物中还可能存在一些生物活性与有效成分有很大差异的无效、低效异构体或晶型。 贮藏过程引入的杂质 药品因保管不善或贮藏时间过长，在外界条件如温度、湿度、日光、空气的影响下或因微生物的作用可能发生水解、氧化、分解、异构化、晶型转变、聚合、潮解和发霉等变化，产生有关杂质。 水解反应是药物容易发生的一种变质反应。 杂质的种类 按来源分 一般杂质 一般杂质是指在自然界中分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程中容易引入的杂质，如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、重金属等。 特殊杂质 特殊杂质是指在特定药物的生产和贮藏过程中引入的杂质。如阿司匹林中的游离水杨酸，甲硝唑中的2－甲基－5－硝基咪唑等。 按结构分 a．无机杂质 氯化物、硫酸盐、硫化物、氰化物、重金属等。 b. 有机杂质 有机药物中引入的原料、中间体、副产物、分解产物、异构体和残留溶剂等。 按性质分 a．信号杂质 信号杂质本身一般无害，但其含量的多少可以反映出药物的纯度水平，如含量过多，表明药物的纯度差，提示药物的生产工艺不合理或生产控制存在问题。氯化物、硫酸盐就属于信号杂质。 b. 有害杂质 有害杂质如金属盐、砷盐、氟化物等，对人体有毒害，在质量标准中应严格加以控制，以保证用药安全。 杂质的限量检查 杂质限量的概念 药物中所含杂质的最大允许量，叫做杂质限量。通常用百分之几或百万分之几（ppm）来表示。 杂质限量检查的方法 进行杂质的限量检查时，可取一定量被检杂质的标准溶液与一定量供试品在相同条件下处理后，比较反应结果，以确定杂质含量是否超过规定。使用此方法时，需注意平行原则。即供试品和标准溶液应在完全相同的条件下反应，所加入的试剂、反应的温度、放置的时间等均应相同。只有这样，反应的结果才有可比性。 不与标准溶液进行对比，而在供试品溶液中加入试剂，在一定条件下反应，观察有无正反应出现，以不出现正反应为合格，即以该检测条件下反应的灵敏度来控制杂质限量。 杂质限量的计算 杂质限量的计算公式  当供试品（S）中所含杂质的量是通过与一定量杂质标准溶液进行比较来确定时，杂质的最大允许量可由杂质标准溶液浓度（C）与体积（V）的乘积获得，上式又可以表达为： ，或  杂质限量计算举例 对乙酰氨基酚中氯化物检查 已知：S = 2.0g×25/100；C = 10μg/ml；V = 5.0ml 求： L = ？ 解：L = C×V/S×100% = 10×5.0/2.0×10-6×25/100×100% = 0.01% 葡萄糖中重金属检查 已知：S = 4.0g；C = 10μg/ml；L = 5×10-6 求： V = ？ 解：V = L×S / C = 5×10-6×4.0/10×10-6 = 2.0(ml) 磷酸可待因中吗啡检查 已知：V = 5.0ml；C = 2mg/100ml； S = 0.10g 求： L = ？ 解： L = C×V / S = 2.0/100×5.0/0.1×103 = 0.1% 一般杂质的检查方法 氯化物检查法 原理 利用氯化物在硝酸酸性溶液中与硝酸银试液作用，生成氯化银白色沉淀物，与一定量标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银浑浊液比较，浊度不得更大。以此来判断供试品中氯化物是否超过限量。  条件 [Cl-] 0.05mg～0.08mg/50ml, 即相当于标准氯化钠溶液5ml～8ml 酸度 稀硝酸10ml/50ml 温度 30～40℃ 干扰的排除 供试品溶液混浊 可用含硝酸的蒸馏水洗净滤纸中的氯化物后滤过，以消除混浊对氯化物检查的干扰。 供试品溶液有颜色 可采用内消色法，按中国药典附录规定的方法处理。即取两份供试品溶液，于其中一份中先加入硝酸银试液1.0ml，摇匀，放置10min，如显浑浊，可反复过滤，至滤液澄清，即得无氯化物杂质又具有相同颜色的澄清溶液，再在其中加入规定量的标准氯化钠溶液与水适量使成50ml，作为对照溶液；另一份中加入硝酸银试液1.0ml与水适量使成50ml，作为供试品溶液，将两液在暗处放置5min后比较，即可消除颜色的干扰。 硫酸盐检查法 原理 药物中存在的微量硫酸盐与BaCl2在盐酸酸性介质中生成BaSO4白色沉淀，与一定量标准KaSO4溶液在相同条件下生成的混浊比较，浊度不得更大。以此来判断供试品中硫酸盐是否超过限量。 条件 [SO42-] 0.1mg～0.5mg/50ml, 即相当于标准硫酸钾溶液1.0～5.0ml 酸度 稀盐酸2ml/50ml,pH≈1 干扰的排除 供试品溶液如需滤过，应先用加盐酸使成酸性的水洗净滤纸中硫酸盐，再滤过。 有色供试品如富马酸亚铁处理的方法与氯化物检查法相同。采用内消色法。 铁盐检查法 原理 铁盐在盐酸酸性溶液中与硫氰酸铵生成红色可溶性硫氰酸铁配位离子，再与一定量标准铁溶液用同法处理后所呈的颜色进行比较，颜色不得更深。以此来判断供试品中铁盐是否超过限量。  条件 [Fe3+] 0.01mg～0.05mg/50ml, 即相当于标准硫酸钾溶液1.0～5.0ml 酸度 稀盐酸4ml/50ml 干扰的排除 当有Fe2+存在时，可加入氧化剂过硫酸铵氧化供试品中的Fe2+成Fe3+。 当供试液管与对照溶液管色调不一致时，或所呈硫氰酸铁的颜色较浅不便比较时，可分别移入分液漏斗中，各加正丁醇或异戊醇提取，分别醇层比色。 重金属检查法 重金属是指在实验条件下与S2-作用显色的金属杂质，如银、铅、汞、铜、镉、锡、锑、铋等，由于药品生产过程中遇到铅的机会较多，铅在体内又易积蓄中毒，故检查时以铅作为代表。 中国药典（2000年版）对重金属的检查一共收载了四种方法： 第一法为硫代乙酰胺法；第二法是将供试品在500~600℃炽灼破坏后，再按第一法检查；第三法是检查能溶入碱溶液，而不溶于酸溶液的药物，在碱性条件下用硫化钠作显色剂；第四法为微孔滤膜法，通过微孔滤膜过滤，使试验条件下生成的硫化铅沉淀富集于滤膜上，形成铅斑，比较供试溶液和对照溶液铅斑的颜色，来判断供试品种的重金属是否超过限量。以下重点讨论第一法。 原理 硫代乙酰铵在弱酸性（pH3.5 醋酸盐缓冲液）条件下水解，产生硫化氢，与微量重金属离子生成黄色到棕黑色的硫化物均匀混悬液，与一定量标准铅溶液经同法处理后所呈颜色进行比较，颜色不得更深。以此来判断供试品中重金属是否超过限量。   条件 [Pb2+] 0.01mg～0.02mg/27ml，即相当于标准铅溶液1～2ml 酸度 pH3.0～3.5时，硫化氢沉淀较完全 干扰的排除 供试品有色：可采用外消色法消除干扰。即在加硫代乙酰铵试液前在对照溶液管中滴加少量稀焦糖溶液，使之与供试品溶液管的颜色一致，然后再加硫代乙酰铵试液比色。 供试品中如有微量Fe3+：在弱酸性溶液中将氧化硫化氢析出硫，产生混浊、影响比色。可先加Vc或盐酸羟铵使Fe3+还原成Fe2+再检查。 砷盐检查法 《中国药典》采用古蔡氏法和二乙基二硫代氨基甲酸银法（Ag－DDC）检查药物中微量的砷盐。 古蔡氏法 原理 金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，颜色不得更深。以此来判断供试品中砷盐是否超过限量。      试剂的作用 碘化钾和氯化亚锡的主要作用是将五价的砷还原成三价的砷；醋酸铅棉的作用是消除供试品可能含有的少量的硫化物。 干扰的排除 供试品若为硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等，在酸性溶液中生成硫化氢或二氧化硫气体，与溴化汞作用生成黑色硫化汞或金属汞，干扰砷斑检查。应先加硝酸处理，使氧化成硫酸盐，除去干扰，如硫代硫酸钠中砷盐的检查。 供试品若为铁盐，能消耗碘化钾、氯化亚锡等还原剂，影响测定条件，并能氧化砷化氢干扰测定。如检查枸橼酸铁铵中砷盐，需先加酸性氯化亚锡试液，将高铁离子还原为低铁离子后再检查。 含锑药物，如葡萄糖酸锑钠，用古蔡氏法检查砷时，锑盐也可被还原为锑化氢，与溴化汞试纸作用，产生灰色锑斑，干扰砷斑的检出。  Ag－DDC法 原理 金属锌与酸作用，产生新生态的氢，与微量砷盐反应，生成具有挥发性的砷化氢；砷化氢遇二乙基二硫代氨基甲酸银，使其还原产生红色的胶态银，用目视比色法或在510nm波长处测定吸收度，再与一定量标准砷溶液用同法处理后得到的有色溶液进行比较。  其中Ag(DDC)的结构为：  （2） 试剂的作用 同古蔡氏法 溶液颜色检查法 溶液颜色检查法是控制药物中有色杂质含量的方法。中国药典（2000年版）收载有三种方法： 目视比色法 分光光度法 色差计法 易炭化物检查法 易炭化物检查法是检查药物中遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有机杂质。常采用与标准比色液比色的方法进行检查。 溶液澄清度检查法 澄清度检查法是检查药物中的微量不溶性杂质。常采用与浊度标准液比浊的方法进行检查。 炽灼残渣检查法 中国药典和美国药典对炽灼残渣（residue on ignition）的定义：有机药物经炭化或挥发性无机药物加热分解后，高温炽灼，所产生的非挥发性无机杂质的硫酸盐。英国药典称之为硫酸灰分（sulphated ash）。炽灼残渣检查用于控制有机药物和挥发性无机药物中存在的非挥发性无机杂质。常采用重量方法进行检查。 干燥失重测定法 干燥失重是指药品在规定的条件下，经干燥后所减失的量，以百分率表示。干燥失重的量应恒重。由干燥至恒重的第二次及以后各次称重均应在规定的条件下继续干燥1h后进行。 干燥失重检查法主要检查药物中的水分及其它挥发性的物质。常采用重量方法进行检查。常用的方法有三种： 常压恒温干燥法 干燥剂干燥法 减压干燥法 热分析法 有机溶剂残留量测定法 有机溶剂残留量测定法主要检查药物在生产过程中引入的有害的有机溶剂。常采用气相色谱法进行检查。常用的方法有二种： 溶液直接进样法 顶空进样法 特殊杂质的检查方法 利用药物和杂质在物理性质上的差异 臭味及挥发性的差异 药物中如存在具有特殊气味的杂质，可以由气味判断该杂质的存在。 例如黄凡士林中异性有机物检查。异性有机物主要是指非烃类有机物，利用其灼烧时产生异味可检查黄凡士林精制的程度。 再如浓过氧化氢溶液中不挥发性物质的检查：取本品10ml，置水浴上蒸干，并在105℃干燥至恒重，遗留残渣不得超过15mg。 颜色的差异 某些药物自身无色，但从生产中引入了有色的有关物质，或其分解产物有颜色。采用检查供试品溶液的方法，可以控制药物中有色杂质的量。 例如磺胺嘧啶中有色杂质的检查：取本品2.0g，加氢氧化钠试液10ml溶解后，加水至25ml，溶液应澄清无色；如显色，与黄色3号标准比色液比较，不得更深。 溶解行为的差异 有的药物可溶于水、有机溶剂或酸、碱中，而其杂质不溶；或反之，杂质可溶而药物不溶。例如吡哌酸中不溶物的检查：双吡哌酸甲酯（I）和吡哌酸甲酯（II）均不溶于氢氧化钠试液，因此可通过溶液的澄清度来控制这些杂质。 旋光性质的差异 具有旋光性的物质称为光学活性物质。 比旋度（或旋光度）的数值可以用来反映药物的纯度，限定杂质的含量。 例如硫酸阿托品中莨菪碱的检查：供试品水溶液（50mg/ml）的旋光度不得超过－0.4℃。 对光吸收性质的差异 若药物和杂质对光的吸收存在着显著差异，可利用这些差异对药物中存在杂质及其量加以控制。 紫外分光光度法 当杂质在某一波长处有最大吸收，而药物在此无吸收时，可以通过控制供试品溶液在此波长处的吸收度来控制杂质的量。 有的杂质紫外吸收光谱与药物的紫外吸收光谱重叠，但可以通过控制供试品溶液的吸收度比值来控制杂质的量。 若药物在紫外区有明显吸收，而杂质吸收很弱或没有吸收，可以根据吸收度大小限制杂质的量。 原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是通过测定药物中所含待检元素的原子蒸气，吸收发自光源的该元素特定波长光的程度，以求出供试药物中待检元素含量的方法。 主要用于药物中金属盐等杂质的检查，如曾用于测定丹参、维生素C、硫酸庆大霉素和安痛定等注射液中的Na、K、Ca、Mg含量。 红外分光光度法 红外分光光度法在杂质检查中主要用于药物中无效或低效晶型的检查。某些多晶型药物由于其晶型结构不同，一些化学键的键长、键角等发生不同程度的变化，从而导致红外吸收光谱中某些特征峰的频率、峰形和强度出现显著差异。利用这些差异，一检查药物中低效（或无效）晶型杂质，结果可靠，方法简便。 如甲苯咪唑中A晶型的检查。 荧光分析法 某些物质受紫外光或可见光照射后能发射出比激发光波长长的荧光。利用物质的激发和发射光谱，对物质进行分析的方法即为荧光分析法。荧光分析法灵敏度高，专属性强，在药物的鉴别、检查和含量测定中均有应用。 例如利血平中氧化产物的检查，就是根据利血平纯品无荧光，其氧化产物有荧光。 吸附或分配性质的差异 薄层色谱法（TLC法） 杂质对照品法 适用于已知杂质并能制备杂质对照品的情况。 供试品自身对照法 适用于杂质的结构不能确定，或无杂质对照品的情况。要求供试品与所检杂质对显色剂所显的颜色应相同，显色灵敏度也应相同或相近。 对照药物法 当无适合的杂质对照品，尤其是供试品显示的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异，难以判断限量时，可用与供试品相同的药物作为对照品，此对照药物中所含待检杂质需符合限量要求，且稳定性好。 纸色谱法（PC法） 用于极性较大物质的分离、分析。有时也用于检查发射性药物注射液（或溶液）中的放射化学物质。纸色谱法较薄层色谱法展开时间长，斑点较扩散，不能用强酸等腐蚀性显色剂等，因而应用不如薄层色谱法广泛。 例如地高辛、盐酸苯乙双胍、羟基脲中有关杂质的检查。 高效液相色谱法（HPLC法） 峰面积归一化法：通常用于粗略考察供试品中的杂质。 不加校正因子的主成分自身对照法：用于没有杂质对照品时杂质的限量检查。 加校正因子的主成分自身对照法：用于有杂质对照品时杂质的含量测定。 内标法加校正因子测定供试品中杂质的含量：用于有杂质对照品时，杂质的含量测定。 外标法测定供试品中某个杂质或主成分的含量：用于有杂质对照品或杂质对照品易制备的情况。 气相色谱法（GC法）：同HPLC法 利用药物和杂质在化学性质上的差异 酸碱性的差异 若杂质具有酸、碱性，可采用如下方法检查： 规定消耗滴定液的体积；pH值法；指示剂法 氧化还原性的差异 利用药物与杂质之间的氧化还原电位的差异进行检查。 如氯化钠中碘化物或溴化物的检查。 杂质与一定试剂反应产生沉淀 如生物碱中其它生物碱的检查，多采用此法。 杂质与一定试剂反应产生颜色 利用药物中的杂质与某些试剂发生氧化、络合、偶合等显色反应，进行药物中杂质的鉴别。 杂质与一定试剂反应产生气体 利用此法可检查药物中的砷、硫、碳酸盐、氨或胺盐、氰化物等。例如氰化物的检查中国药典采用：改进普鲁士蓝法、气体扩散－三硝基苯酚法。 药物经有机破坏后检查杂质 硒检查法；氟检查法 [新课小结] 一般杂质检查（重点） 氯化物检查法 硫酸盐检查法 铁盐检查法 （原理、条件、干扰的排除） 重金属检查法 砷盐检查法 溶液颜色检查法（目视比色法、分光光度法、色差计法） 易炭化物检查法（常采用与标准比色液比色的方法） 溶液澄清度检查法（常采用与浊度标准液比浊的方法） 炽灼残渣检查法（常采用重量方法） 干燥失重测定法（常压恒温干燥法、干燥剂干燥法、减压干燥法、热分析法） 有机溶剂残留量测定法（溶液直接进样法、顶空进样法） 特殊杂质检查（难点） 利用药物和杂质在物理性质上的差异 臭味及挥发性的差异 颜色的差异 溶解行为的差异 旋光性质的差异 紫外分光光度法 原子吸收分光光度法 对光吸收性质的差异 红外分光光度法 荧光分析法 薄层色谱法 吸附或分配性质的差异 纸色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法 利用药物和杂质在化学性质上的差异 酸碱性的差异 氧化还原性的差异 杂质与一定试剂反应产生沉淀 杂质与一定试剂反应产生颜色 杂质与一定试剂反应产生气体 药物经有机破坏后检查杂质 概念（重点） 药物的杂质、药物纯度、一般杂质、特殊杂质、信号杂质、杂质限量、炽灼残渣、光学活性物质 [作业] 掌握一般杂质检查的原理、方法和计算 熟悉特殊杂质检查的方法和原理 牢记相关概念 [练习题与答案] 一、思考题 1．药物中的杂质是如何引进的？药物中的杂质有哪些类型？ 2．何谓药物中杂质的限量？应如何检查？ 3．简述药物中重金属、砷盐、铁盐的检查原理与检查方法。 4．药物中特殊杂质的检查方法主要有哪些？ 二、练习题 [A型题] 1．含锑药物的砷盐检查方法为 A.古蔡法 B.碘量法 C.白田道夫法 D.Ag-DDC E.契列夫法 2．药物中杂质的限量是指 A.杂质是否存在 B.杂质的合适含量 C.杂质的最低量 D.杂质检查量 E.杂质的最大允许量 3．中国药典中收载的砷盐检查方法为 A.摩尔法 B.碘量法 C.白田道夫法 D.Ag-DDC E.契列夫法 [B型题] A. 稀HNO3 B.硫代乙酰胺试液 C. BaCl2试液 D. Ag-DDC试液 E. NH4SCN试液 1. 铁盐检查 2. 硫酸盐检查 3. 氯化物检查 4. 砷盐检查 A. AgNO3试液 B.硫代乙酰胺试液 C. BaCl2试液 D. KI-SnCl2试液 E. NH4SCN试液 5. 重金属检查 6. 硫酸盐检查 7. 氯化物检查 8. 砷盐检查 [X型题] 1．一般杂质检查包括 A. 氯化物检查 B. 硫酸盐检查 C. 重金属检查 D. 砷盐检查 E. 铁盐检查 2．干燥失重检查法有： A. 压恒温干燥法 B. 燥剂干燥法 C. 减压干燥法 D. 摩尔法 E. 白田道夫法 二、答案精讲 [A型题] 1．C 因为含锑药物的砷盐检查方法为白田道夫法，因为锑可被还原成锑化氢，可与溴化汞试纸生成题斑，干扰砷斑的检查，不能用古蔡法检查。 2. E 3. D [B型题] 1.E 2.C 3.A 4.D 5.B 6.C 7.A 8.D 因为AsO43-还原成AsH3比较慢, KI-SnCl2试液可将AsO43-还原成AsO33-, 然后再还原成AsH3。 [X型题] 1.A B C D E 2.A B C 因为干燥失重检查方法只有三种，即只能选A，B，C。