植物生理学实验指导 莱阳农学院生命科学学院 植物生理学教研室 2005年8月21日 前 言 植物生理学是研究植物生命活动规律和机理的一门实验科学。它的一切结论都是通过严格的科学实验得出的。近年来现代生物技术的发展日新月异，新的实验技术、方法和仪器设备层出不穷，我校的实验装备水平也有明显改善。因此，原用实验教材中的不少内容异显得陈旧，为了适应课程建设的要求我们编了这本实验指导。 本实验指导由莱阳农学院生命科学学院植物生理学教研室的刘新、车永梅、杨德翠、柏素花、战淑敏、马晓柯、刘洪庆和赵方贵负责编写完成。莱阳农学院研究生处的郑国生对全书进行了审读、修改和补充。全部编写人员均具有多年从事植物生理学教学和研究的实践经验，曾经多次编写此类教材，在使用中反应良好。 鉴于编者的水平有限，编写时间较仓促，本指导难免有不足之处，敬请读者和专家指正。 编者 2005 年 8月 目 录 1. 实验基本常识………………………….…………………………………………………...3 1.1 几种常用实验仪器操作方法介绍………………………………………………………3 1.2 实验材料的采取、处理与保存…………………………………………………………9 1.3 实验数据的处理……………………………………………………………………….12 2. 水分生理……………….………………………………………………………………….14 2.1 气孔运动及其影响因素……………………………………………………………...14 2.2 露点法测定植物叶片水势和渗透势………………………………………………….16 2.3 液体交换法测定植物组织水势（小液流法、折射仪法、电导法）……………….18 3. 矿质营养……………….………………………………………………………………….20 3.1 植物溶液培养和缺素培养………………….………………………………………………20 3.2 植物伤流液的成分分析………………………………………………………………...22 3.3 根系活力的测定(TTC法)………….................................................................................24 3.4 硝酸还原酶(NR)活性的测定…….…………………………………………………….25 4. 光合作用和呼吸作用…….……………………………………………………………….26 4.1 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和定量测定………………………………….26 4.2 红外线CO2气体分析仪法测定植物光合与呼吸速率………………………………..30 4.3 抗坏血酸氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定………………………………………..39 4.4 水溶性碳水化合物的测定………………………………………………………..……41 5. 植物激素………………………………………………………………………………….44 5.1 植物组织培养技术…………………………………………………………………….45 5.2 酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量……………………………………….….50 6. 植物生长发育…………………………………………………………………………….54 6.1 种子萌发和活力测定……………………………………………………………………54 6.2 花粉活力测定……………………………………………………………………………56 7. 逆境生理……………….……………………………………………………………...……58 电导法测定植物细胞透性………………………………………………......................58 植物组织中超氧物歧化酶活性的测定………………………………………………..59 7.3 植物体内游离脯氨酸含量的测定……………………………………………………..60 7.4 植物组织中丙二醛含量的测定………..........................................................................62 7.5 植物体内氧自由基的测定和清除…..................................................................……....63 8. 综合性实验............……………………………………………………………………….64 1. 实验基本常识 1.1 几种常用实验仪器操作方法介绍 一、WAY-1/2S阿贝折射仪 测定原理 数字阿贝折射仪测定透明或半透明物质的折射率原理是基于测定临界角，由目视望远镜部件和色散校正部件组成的观察部件来瞄准明暗两部分的分界线，即瞄准临界角的位置，并由角度二数字转换部件将角度量转换成数字量，输入微机系统进行数据处理，而后数字显示出被测样品的折射率或锤度。 仪器结构 操作步骤及使用方法 1. 按下"POWER"波形电源开关(4)，聚光照明部件(10)中照明灯亮，同时显示窗(3)显示00000。有时显示窗先显示"-"，数秒后显示00000。 2. 打开折射棱镜部件(11)，移去擦镜纸，这张擦镜纸(单层)是仪器不使用时放在两棱镜之间，防止在关上棱镜时，可能留在棱镜上细小硬粒弄坏棱镜工作表面。 3. 检查上、下棱镜表面，并用水或酒精小心清洁其表面。测定每一个样品后也要仔细清洁两块棱镜表面，因为留在棱镜上少量的原来样品将影响下一个样品的测量准确度。 4. 将被测样品放在下面的折射棱镜的工作表面上。如样品为液体，可用干净滴管吸1-2滴液体样品放在棱镜工作表面上，然后将上面的进光棱镜盖上。如样品为固体，则固体样品必须有一个经过抛光加工的平整表面。测量前需将这抛光表面擦净，并在下面的折射棱镜工作表面上滴1-2滴折射率比固体样品折射率高的透明的液体，然后将固体样品抛光面放在折射棱镜工作表面上，使其接触良好(测固体样品时不需将上面的进光棱镜盖上)。 5. 旋转聚光照明部件的转臂和聚光镜筒使上面的进光棱镜的进光表面(测液体样品)或固体样品前面的进光表面(测固体样品)得到均匀照明。 6. 通过目镜(1)观察视场，同时旋转调节手轮(9)，使明暗分界线落在交叉线视场中。如从目镜中看到视场是暗的，可将调节手轮逆时针旋转。看到视场是明亮的，则将调节手轮顺时针旋转。明亮区域是在视场的顶部。在明亮视场情况下可旋转目镜，调节视度看清晰交叉线。 7. 旋转目镜方缺口里的色散校正手轮(2)，同时调节聚光镜位 置，使视场中明暗两部分具有良好 的反差和明暗分界线具有最小的色散。 8. 旋转调节手轮，使明暗分界线准确对准交叉线的交点。 9. 按"READ"读数显示键(5)，显示窗中00000消失，显示"-"，数秒后"-"消失，显示被测样品的折射率。 如要知道该样品的锤度值，可按"BX"未经温度修正的锤度显示键(8)或按"BX-TC"经温度修正锤度(按IGUMSA)显示键(6)。"nD(7)"、BX-TC(6)"及"BX(8)"三个键是用于选定测量方式。经选定后，再按"READ"键，显示窗就按预先选定的测量方式显示。有时按"READ"键，显示"-"，数秒后"-"消失，显示窗全暗，无其他显示，反映该仪器可能存在故障，需进行检查修理。当选定测量方式为"BX-TC"或"BX"时，如果调节手轮旋转超出锤度测量范围(0-95%)，按"READ"后，显示窗将显示"-"。 10. 检测样品温度，可按"TEMP"温度显示键(12)显示窗将显示样品温度。除了按"READ"键后，显示窗显示"-"时，按"TEMP"键无效，在其它情况下都可以对样品进行温度检测。显示为温度时，再按"nD(7)"、"BX-TC(6)"或"BX(8)"键，显示将是原来的折射率或锤度。为区分显示值是温度还是锤度，在温度前加"t"符号，在"BX-TC"锤度前加"C"符号，在"BX"锤度前加"b"符号。 11. 样品测量结束后，必须用酒精或水(样品为糖溶液)进行小心清洁。 12. 本仪器折射棱镜部件中有通恒温水结构，如需测定样品在某一特定温度下的折射率，仪器可外接恒温器，将温度调节到你所需温度再进行测量。 13.计算机可用RS232连接线与仪器连接。首先，送出一个任意的字符，然后等待接收信息(参数：波特率2400，数据位8位，停止位1位，字节总长18)。 二、752型紫外可见分光光度计 测定原理 利用物质对不同波长光的选择性吸收现象对物质进行定性和定量分析，通过对吸收光谱分析，判断物质的内部结构及化学组成。 仪器结构 操作步骤及使用方法 1. 开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。 2. 打开电源开关，使仪器预热20分钟；仪器接通电源后，仪器即进入自检状态，自检结束后波长自动停在546nm处，测量的方式自动设定在透射比方式(%T)，并自动调100%T和0%T。 透射比参数测定样品时(透射比方式)： 3. 按"方式键"(MODE)将测试方式设置为透射比方式：显示器显示"XXXnm，XXX.X%T" 4. 按"波长设置"键(▼▲)设置分析波长，如340nm；按波长设置键"▼"或"▲"直到显示器显示340nm为止。此时显示器显示"340nmXXX.X%T"。每当波长被重新设置后，请不要忘记调整100.0%T。 5. 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中；比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约2.5毫升，被测试的样品中不能有气泡和漂浮物，否则，会影响测试参数的精确度。 6. 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。被测样品的测试波长在340nm-1000nm范围内时，建议使用玻璃比色皿，190nm-340nm范围内时，建议使用石英比色皿。 仪器所附比色皿的透射率已经过测试和匹配，未经匹配处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿的透光部分表面不能有指印、溶液痕迹。否则，将影响样品的测试精度。 7. 将参比溶液推入光路中，按"100%T"键调整100%T。仪器在自动调整100%T的过程中，显示器显示"340nmBlank...."，100.0%T调整完成后，显示器显示"340nm，100.0%T" 8. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的透射比参数。 注意：测定时要将比色皿的光面对准光路。 吸光度参数测定样品时(吸光度方式)： 1. 2.（同上） 3. 按"方式键"(MODE)将测试方式设置为吸光度方式：显示器显示"XXXnm，X.XXXAbs" 4. 按"波长设置"键(▼▲)设置分析波长，如340nm；按波长设置键"▼"或"▲"直到显示器显示340nm为止。此时显示器显示"340nmX.XXXAbs"。每当波长被重新设置后，请不要忘记调整零ABS。 5. 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中；比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约2.5毫升，被测试的样品中不能有气泡和漂浮物，否则，会影响测试参数的精确度。 6.（同上） 7. 将参比溶液推入光路中，按"100%T"键调整零ABS。仪器在自动调整100%T的过程中，显示器显示"340nmBlank...."，100.0%T调整完成后，显示器显示"340nm，0.000Abs" 8. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数。 浓度值参数测定样品时(浓度直读方式)： 1）已知标准样品浓度值： 1. 2(同上) 3. 按"方式键"(MODE)将测试方式设置为浓度直读方式：显示器显示"XXXnmXXXXC" 4. 按"波长设置"键(▼▲)设置分析波长，如340nm；按波长设置键"▼"或"▲"直到显示器显示340nm为止。此时显示器显示"340nmX.XXXC"。每当波长被重新设置后，请不要忘记调整零ABS。 5. 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中；比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约2.5毫升，被测试的样品中不能有气泡和漂浮物，否则，会影响测试参数的精确度。 6.（同上） 7. 将参比溶液推入光路中，按"100%T"键调整零ABS。仪器在自动调整100%T的过程中，显示器显示"340nmBlank...."，100.0%T调整完成后，显示器显示"340nm，0000C"。 8. 按"功能键"，直至显示器上显示"STD/CONC=1000"。 9. 按参数设置键（▼▲）直至显示器上显示的参数与标准样品的浓度值相等，如标准样品浓度值为200；此时显示器显示"STD/CONC=0200"。 10. 按确认键，此时显示器显示"STD/CONC=0200"。 11. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的浓度值。 2）已知标准样品K因子： 1~7步，如方法1）。 8. 按"功能键"，直至显示器上显示"STD/FACTOR=1000"。 9. 按参数设置键（▼▲）直至显示器上显示的参数与标准样品的浓度值相等，如标准样品浓度值为200；此时显示器显示"STD/FACTOR=0200"。 10. 按确认键，此时显示器显示"STD/FACTOR=0200"。 11. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的浓度值。 三、GXH-3051型红外线CO2气体分析仪（IRGA） 工作原理 许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69μm、2.77μm、4.26μm和14.99μm处，其中只有4.26μm的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26μm红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯一比尔定律。分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。 目前应用于光合作用研究的红外线CO2气体分析仪，按照测量气室的数量一般分为两种类型：单气室类型和双气室（或多气室）类型。单气室红外仪一般用于CO2浓度绝对值的测定；在双气室（或多气室）红外仪中，一个气室为分析气室，另一个作为参比气室，可测定参比气与分析气中CO2浓度之差。 仪器结构 仪器启动及操作 1. 将仪器从包装箱内取出，接上外接电源，或者切换到内部蓄电池。打开仪器的电源。注意：仪器接通电源后，将发出2~3秒钟低电压峰呜报警声音，然后仪器正常运转。如果仪器使用蓄电池连续工作若干小时后，仪器将再次长时间发出报警声音，则说明蓄电池电能已快用完，此时应停止使用，待蓄电池充足电后再使用或改用市电220VAC经直流电源转换成l2V给仪器供电。一般充足电的蓄电池可使仪器连续工作4~5h。 2. 仪器接通电源后必须预热15min，这时数显表头显示值为环境空气中CO2的浓度值，约为300~350ppm。 3. 仪器预热15min后，第一步要校准仪器零点。将仪器后面板的切换阀旋到左侧的调零位置上，打开泵的开关。约lmin后，数显表头的显示值趋向零点附近。此时，旋下零点电位器上的保护盖，调节零点电位器，将显示值调至零点上。 4. 第二步要校准仪器跨度。在仪器零点校准结束后，关上气泵的开关，待仪器前面板的切换阀旋到右侧的测量位置上，将l升标准气瓶的出气嘴插入仪器的进气嘴内，轻轻压3次，每次约1秒，然后等待1min左右，待显示值稳定以后，调节跨度电位器使显示值与标准气浓度值一致(若使用带减压阀的高压标准气瓶，应将标准气以0.5 L/min的流量进入仪器内，约1min左右，待显示值稳定以后再进行跨度校准)。 5. 测量：用橡胶软管将取样手柄与仪器进气嘴连接上，开泵即可抽取样气进行测量。不取样时可把泵关闭。 6. 测量完毕以后，关上电源开关及泵开关，拔下稳压电源插头，将仪器前面板的切换阀打到右侧的测量状态；将仪器后面板的外接供电和电池供电切换开关旋到"外接"方向。 7. 用橡胶管短接样气的进出气口，将其他各连接器件卸下，并整理归位。 四、高速离心机 测定原理 将装有等量试液的离心管对称放置在转头四周的孔内，启动机器后，电动机带动转头高速运转所产生的相对离心力(RCF)使试液分离，相对离心力的大小取决于试样所处的位置至轴心的水平距离即旋转半径r和转速n，其计算公式如下： RCF=1.118×10-5n2r×g；n-转速(转/分)；r-旋转半径(厘米) 仪器结构 操作步骤 1. 将样品等量放置在试管内，并将其对称放入转头。 2. 拧紧转轴螺母，盖好盖门，将仪器按上电源后，打开仪器后面的电源开关，此时数码管显示"0000"，表示仪器已接通电源； 3. 如需调整仪器的运行参数(运转时间和运转速度)，可按功能键，使相应的指示灯点亮，数码管即显示该参数值，此时可用"▼，▲，?"键调整该参数至需要的值，按记忆键确认贮存。 4. 按开键启动仪器。仪器运行过程中数码管显示转速，当需要查看其他参数时，可按功能键，使该参数对应的指示灯点亮，数码管即显示该参数值。当仪器到达设定的时间或中途停机，停机过程中数码管闪烁显示转速，属正常现象。 注意事项： 1. 为确保安全和离心效果，仪器必须放置在坚固水平的台面上，塑料盖门上不得放置任何物品；样品必须对称放置，并在开机前确保已拧紧螺母； 2. 应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹，老化等现象，如有就应及时更换； 3. 试验完毕后，需将仪器擦试干净，以防腐蚀； 4. 如样品比重超过1.2g/cm3，最高转速n按下式计算：n=nmax×(1.2g/样品比重)1/2 5. 当电机碳刷长度小于6mm时，必须及时更换； 6. 在离心机未停稳的情况下不得打开盖门； 7. 仪器必须有可靠接地； 8. 实验结束后，关闭后面电源开关，拔掉电源插头，下次实验插上电源插头时，勿忘打开后面电源开关。 五、DDSJ-308A型电导率仪 DDSJ-308A型电导率仪是一台智能型的实验室常规分析仪器，适用于实验室精确测量水溶液的电导率及温度、总溶解固态量(TDS)及温度，也可用于测量纯水的纯度与温度，以及海水及海水淡化处理中的含盐量的测定(以NaCl为标准)。 本仪器具有以下特点： (1)仪器可进行电导率、TDS、盐度及温度测量，测量范围： 电导率：0~1.999×105μs/cm；TDS：0~19990mg/L 盐度：0.0~80.0ppt；温度：-5.0~105.0度 (2)仪器采用微处理器技术，使仪器具有自动温度补偿、自动校准、量程自动切换等功能。仪器具有断电保护功能，在仪器使用完毕关机后或非正常断电情况下，仪器内部贮存的测量数据和设置的参数不会丢失。 (3)仪器的测量结果可以贮存、删除、查阅、保持、打印或传送到PC机。仪器最多可贮存各50套电导率、TDS或盐度测量的实验数据，并提供两套打印模式供用户选择。 (4)具有标定功能，用户可用此功能标定电极常数或TDS转换系数。 (5)为方便操作，开机后，仪器将直接进入上次关机时的测量状态。 (6)仪器带有RS-232接口，可接TP-16型打印机打印测量结果或与计算机通讯。 (7)仪器采用点阵式液晶显示，全中文操作界面，使用简单方便。仪器采用新颖轻触键，可靠性好。 仪器结构 仪器面板上共有15个操作键，其功能如下： "打印1"键：用于打印当前的测量数据。 "打印2"键：用于打印贮存的测量数据。 "查阅"键：用于查阅仪器所贮存的测量数据。 "贮存"键：用于贮存测量数据。 "删除"键：用于删除全部贮存的测量数据。 "标定"键：用于标定电极常数或TDS转换系数。 "电极常数"键：用于设置电极常数或TDS转换系数。 "温补系数"键：用于设置温度补偿系数。 "▼，▲"键：用于调节参数。 "保持"键：用于锁定本次测量数据。 "确认"键：用于确认仪器当前的操作数据或操作状态。 "取消"键：用于从各种工作状态返回到测量状态。 "ON/OFF键：用于仪器的开机或关机。 仪器安装及使用 安装： 1. 将多功能电极架(9)插入电极梗座(3)内。 2. 将电导电极(10)和温度传感器(12)夹在多功能电极架（9）上。 3. 分别将电导电极(10)和温度传感器(l2)的插头插入测量电极插座(5)和温度传感器插座(7)内。 4. 用蒸馏水清洗电导电极和温度传感器，然后将电导电极和温度传感器浸入被测溶液中。 5. 将通用电源器(11)输出插头插入仪器的电源插座(4)内。然后，接通通用电源器的电源，仪器可以进行正常操作。 盐度测量电导电极选用 盐度测量时，一般选用电极常数10的电导电极； 10ppt以下盐度也可选用电极常数1的铂黑电导电极。 测定操作 1. 开机：按下"ON/OFF"键，仪器将显示厂标、仪器型号、名称，即"DDSJ-308A型电导率仪"。几秒后，仪器自动进入上次关机时的测量工作状态，此时仪器采用的参数为用户最新设置的参数。如果用户不需改变参数，则无需进行任何操作，即可直接进行测量。 2. 按"模式"键可以在三种模式间进行转换（电导率-TDS-盐度）。 3. 调节电极常数 每支电导电极出厂时，都标有一定的电极常数值，用户需将此值输入仪器。 如电导电极的常数为0.98，则具体操作步骤如下： 在电导率测量下，按"电极常数"键，用"▼，▲"键调节常数至0.98值，按"确认"键，仪器自动将电极常数值0.98存入并返回测量状态，在测量状态中即显示此电极常数值。 4. 调节温度系数 在电导率或TDS状态下，按"温补系数"键，仪器进入温补系数调节状态。根据测量溶液的温度系数，按"▼，▲"键修改，最后按"确认"键，仪器自动将修改好的温度补偿系数存入并返回测量状态。 5. 测定 将电导电极浸入待测溶液中，待仪器读数稳定后，记录结果即可。 6. 测量结束后，按"ON/OFF"键，仪器关机。将电极卸下，清洗干净后，放回仪器保存箱中。 1.2 实验材料的采取、处理与保存 植物材料的采集、处理和保存是否恰当是完成植物生理学研究的重要环节之一。植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料(如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等)和人工培养、选育的植物材料(如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等)两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料(如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等)和干材料(小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等)两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 一、植物材料的采集 植物生理研究测定结果和结论的可靠性(或准确性)，在很大程度上取决于材料的选用是否具有广泛的代表性，如果采样方法不科学，样品不具有广泛代表性，即使结果的分析准确无误，也不可能得出正确的结论。样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。为了保证植物材料的代表性，必须运用科学方法采取材料。从大田或实验地、实验器皿中采取的植物材料，称为“原始样品”，再按原始样品的种类(如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等)分别选出“平均样品”，然后根据分析的目的、要求和样品种类的特征，采用适当的方法，从“平均样品”中选出供分析用的“分析样品”。 (一)原始样品的取样法 1. 随机取样 在试验区(或大田)中选择有代表性的取样点，取样点的数目视田块的大小而定。选好点后，随机采取一定数量的样株，或在每一个取样点上按规定的面积从中采取样株。 2. 对角线取样 在试验区(或大田)可按对角线选定5个取样点，然后在每个点上随机取一定数量的样株，或在每个取样点上按规定的面积从中采取样株。 (二)平均样品的取样法 1. 混合取样法 一般颗粒状(如种子等)或已碾磨成粉末状的样品可以采取混合取样法进行。具体的做法为:将供采取样品的材料铺在木板(或玻璃板、牛皮纸)上成为均匀的一层，按照对角线划分为4等份。取对角的两份为进一步取样的材料，而将其余的对角两份淘汰。再将己取中的两份样品充分混合后重复上述方法取样。反复操作，每次均淘汰50%的样品，直至所取样品达到所要求的数量为止。这种取样的方法叫做“四分法”。 一般禾谷类、豆类及油料作物的种子均可采用这种方法采取平均样品，但注意样品中不要混有不成熟的种子及其他混杂物。 2. 按比例取样法 有些作物、果品等材料，在生长不均等的情况下，应将原始样品按不同类型的比例选取平均样品。例如，对甘薯、甜菜、马铃薯等块根、块茎材料选取平均样品时，应按大、中、小不同类型的样品的比例取样，然后再将每一单个样品纵切剖开，每个切取1/4、1/8或1/16，混在一起组成平均样品。 在采取果实的平均样品时，如桃、梨、苹果、柑橘等果实，即使是从同一株果树上取样，也应考虑到果枝在树冠上的各个不同方位和部位以及果实体积的大、中、小和成熟度上的差异，按各自相关的比例取样，再混合成平均样品。 (三)取样注意事项 1. 取样的地点，一般在距田埂或地边一定距离的株行取样，或在特定的取样区内取样。取样点的四周不应该有缺株的现象。 2. 取样后，按分析的目的分成各部分(如根、茎、叶、果等)，然后捆齐，并附上标签，装入纸袋。有些多汁果实取样时，应用锋利的不锈钢刀剖切，并注意勿使果汁流失。 3. 对于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等样品，因含水分较多，容易变质或霉烂，可以在冰箱中冷藏，或进行灭菌处理或烘干以供分析之用。 4. 选取平均样品的数量应当不少于供分析用样品的2倍。 5. 为了动态地了解供试验用的植物在不同生育期的生理状况，常按植物不同的生育期采取样品进行分析。取样方法系在植物的不同生育时期先调查植株的生育状况并区分为若干类型，计算出各种类型植株所占的百分比，再按此比例采取相应数目的样株作为平均样品。 二、分析样品的处理和保存 从田间采取的植株样品，或是从植株上采取的器官组织样品 一般测定中，所取植株样品应该是生育正常无损伤的健康材料。取下的植株样品或器官组织样品，必须放入事先准备好的保湿容器中，以维持试样的水分状况和未取下之前基本一致。否则，由于取样后的失水，特别是在田间取样带回室内的过程中，由于强烈失水，使离体材料的许多生理过程发生明显的变化，用这样的试材进行测定，就不可能得到正确可靠的结果。对于器官组织样品，如叶片或叶组织，在取样后就应立即放入铺有湿纱布带盖的瓷盘中，或铺有湿滤纸的培养皿中。对于干旱研究的有关试材，应尽可能维持其原来的水分状况。 采回的新鲜样品(平均样品)在做分析之前，一般先要经过净化、杀青、烘干(或风干)等一系列处理。 (1)净化 新鲜样品从田间或试验地取回时，常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦净，不应用水冲洗。 (2)杀青 为了保持样品化学成分不发生转变和损耗，应将样品置于105℃的烘箱中烘15~20 min以终止样品中酶的活动。 (3)烘干 样品经过杀青之后，应立即降低烘箱的温度，维持在70~80℃，直到烘至恒重。烘干所需的时间因样品数量和含水量、烘箱的容积和通风性能而定。烘干时应注意温度不可过高，否则会把样品烤焦，特别是含糖较多的样品，更易在高温下焦化。为了更精密地分析，避免某些成分的损失(如蛋白质、维生素、糖等)，在条件许可的情况下最好采用真空干燥法。 此外，在测定植物材料中酶的活性或某些成分(如植物激素、维生素C、DNA、RNA等)的含量时，需要用新鲜样品。取样时注意保鲜，取样后应立即进行待测组分提取；也可采用液氮中冷冻保存或冰冻真空干燥法得到干燥的制品。放在0~4℃冰箱中保存即可。在鲜样已进行了匀浆，尚未完成提取、纯化，不能进行分析测定等特殊情况下，也可加入防腐剂(甲苯、苯甲酸)，以液态保存在缓冲液中，置于0~4℃冰箱即可。但保存时间不宜过长。 已经烘干(或风干)的样品 可根据样品的种类、特点进行以下处理: (1)种子样品的处理 一般种子(如禾谷类种子)的平均样品清除杂质后要进行磨碎，在磨碎样品前后都应彻底清除磨粉机(或其他碾磨用具)内部的残留物，以免不同样品之间的机械混杂，也可将最初磨出的少量样品弃去，然后正式磨碎，最后使样品全部无损地通过80~100目的筛子，混合均匀作为分析样品贮存于具有磨口玻塞的广口瓶中，贴上标签，注明样品的采取地点、试验处理、采样日期和采样人姓名等。长期保存的样品，贮存瓶上的标签还需要涂蜡。为防止样品在贮存期间生虫，可在瓶中放置一点樟脑或对位二氯甲苯。 对于油料作物种子(如芝麻、亚麻、花生、蓖麻等)需要测定其含油量时，不应当用磨粉机磨碎，否则样品中所含的油分吸附在磨粉机上将明显地影响分析的准确性。所以，对于油料种子应将少量样品放在研钵内研碎或用切片机切成薄片作为分析样品。 (2)茎杆样品的处理 烘干(或风干)的茎杆样品，均要进行磨碎，磨茎杆用的电磨与磨种子的磨粉机结构不同，不宜用磨种子的电磨来磨碎茎杆。如果茎杆样品的含水量偏高而不利于磨碎时，应进一步烘干后再进行磨碎。 (3)多汁样品的处理 柔嫩多汁样品(如浆果、瓜、菜、块根、块茎、球茎等)的成分(如蛋白质、可溶性糖、维生素、色素等)很容易发生代谢变化和损失，因此常用其新鲜样品直接进行各项测定及分析。一般应将新鲜的平均样品切成小块，置于电动捣碎机的玻璃缸内进行捣碎。若样品含水量不够(如甜菜、甘薯等)可以根据样品重加入0.1~1倍的蒸馏水。充分捣碎后的样品应成浆状，从中取出混合均匀的样品进行分析。如果不能及时分析，最好不要急于将其捣碎，以免其中化学成分发生变化而难以准确测定。 有些蔬菜(如含水分不太多的叶菜类、豆类、干菜等)的平均样品可以经过干燥磨碎，也可以直接用新鲜样品进行分析。若采用新鲜样品，可采用上述方法在电动捣碎机内捣碎，也可用研钵(必要时加少许干净的石英砂)充分研磨成匀浆，再进行分析。 在进行新鲜材料的活性成分(如酶活性)测定时，样品的匀浆、研磨一定要在冰浴上或低温室内操作。新鲜样品采后来不及测定的，可放入液氮中速冻，再放入-70℃冰箱中保存。 供试样品一般应该在暗处保存，但是，对于供光合、蒸腾、气孔阻力等的测定样品，在光照下保存更为合理。一般可先将这些供试样品保存在室内自然光强下，但从测定前的0.5~1.0 h开始，应对这些材料进行测定前的光照预处理，也叫光照前处理。这不仅是为了使气孔能正常开放，也是为了使一些光合酶类能预先被激活，以便在测定时能获得正常水平的值，而且还能缩短测定时间。光照前处理的光强，一般应和测定时的光照条件一致。 测定材料在取样后，一般应在当天测定使用，不应该过夜保存。需要过夜时，也应在较低温度下保存，但在测定前应使材料温度恢复到测定条件的温度。 对于采集的籽粒样品，在剔除杂质和破损籽粒后，一般可用风干法进行干燥。但有时根据研究的要求，也可立即烘干。对叶片等组织样品，在取样后则应立即烘干。为了加速烘干，对于茎秤、果穗等器官组织应事先切成细条或碎块。 1.3 实验数据的处理 做好实验记录是进行实验结果处理和分析的前提，在实验中观察到的现象及数据，应当及时、准确地记在记录本上，切勿写错，更不能涂改。科学研究要求做到一丝不苟，严谨刻苦，实事求是，这不仅是做学问，而且也是做人的基本准则。 在植物生理生化定量测定中，对实验数据进行统计分析，正确运用统计方法非常重要。首先遇到的是实验测定结果中有效数字位数的确定问题。记录数据时，只应保留一位不定数字，计算结果中过多的无效数值是没有意义的，在去掉多余尾数时，以“四舍五入”为原则。在运算过程中，也可以暂时多保留一位不定数字，得到计算结果后，再去掉多余的尾数。 其次，在待测组分定量测定中，误差是绝对存在的，因此必须善于利用统计学的方法，分析实验结果的正确性，并判断其可靠程度。实验中，每种处理至少要有三次重复，定量测定数据也要有三次重复，否则，无法进行统计检测。而且，在统计分析之前，不能单就数据进行选择统计。由于取材误差、仪器误差、试剂误差、操作误差等一些经常性的原因所引起的误差称为系统误差；由于一些偶然的外因所引起的误差，称为偶然误差。前者影响分析结果的准确度，后者影响分析结果的精密度。所谓准确度是指测得值与真实值符合的程度，它用误差来表示。误差分为绝对误差和相对误差。所谓精密度是指几次重复测定彼此间符合的程度，显示其重现性状况，它用偏差来表示。偏差也分为绝对偏差和相对偏差。准确度和精密度共同反映测定结果的可靠性。误差小表示可靠性好，误差大表示可靠性差。 在对实验结果进行分析时，对同一待测组分所得到的多个实验数据，最简单的办法是计算其算术平均值，但这还不能很好地反映测定结果的可靠性，尚需要计算出偏差或相对偏差。在分析中，如果实验数据不多，则可采用算术平均偏差或相对平均偏差表示精密度即可；但当实验数据较多或分散程度较大时，用标准偏差即均方差S或相对标准偏差即变异系数Cv表示精密度更可靠。还可用置信区间表示指定置信度α的偏差。 1. 算术平均值= 2. 平均偏差＝ 相对平均偏差=×100% 4. 标准偏差(均方差)S= 5. 变异系数Cv= ×100% 6. 置信区间的界限P= 置信区间=土P 在科学研究中，为了检测某一样品所属总体平均数和某一指定的同类样品的总体平均数之间，或者两种处理取样所属的总体平均数之间有无显著差异时，在总体方差未知，又是小样本情况下，可以用t检验求得t值，再根据设定显著水平和自由度大小，从t值表中查得概率值(P)，即可推断不同样品或同一样品的不同处理之间是否具有显著性差异及其差异水平。 所谓t检验，实质上是差数的5%和1%置信区间，它只适用于检验两个相互独立的样品平均数。要明确多个平均数之间的差异显著性，还必须对各平均数进行多重比较。多重比较的方法，过去沿用最小显著差数法(简称LSD法)，但此法有一定的局限性。近来多采用最小显著极差法(简称LSR法)，这一方法的特点是不同平均数间的比较采用不同的显著差数标准，可用于平均数间的所有相互比较，其常用方法有新复极差检验和q检验两种。各平均数经多重比较后，常采用标记字母法表示。在平均数之间，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具有不同标记字母的即为差异显著，用小写字母a、b、c等表示α=0.05显著水平，大写字母A、B、C等表示α=0.01显著水平。差异显著性也可用标“*”号的方法表示，凡达到α=0.05水平(差异显著)的数据，在其右上角标一个“*”号，凡达到α=0.01水平(差异极显著)的数据，在其右上角标两个“*”号，凡未达到α=0.05水平的数据，则不予标记。 在科学实验中，方差分析可帮助我们掌握客观规律的主要矛盾或技术关键。方差分析的基本步骤可概括为：①将资料总变异的自由度及平方和分解为各变异因素的自由度及平方和，进而算得其均方差；②计算均方比，做出F测验，以明确各变异因素的重要程度；③对各平均数进行多重比较。具体的方法可参考有关专业书籍。 思考题 如何做到采取的植物材料具有广泛的代表性? 如何做到对实验结果进行科学的统计和分析 2. 水分生理 2.1 气孔运动及其影响因素 气孔是陆生植物与外界环境交换水分和气体的主要通道及调节机构。它既要让光合作用需要的CO2通过，又要防止过多的水分损失，因此气孔在叶片上的分布、密度、形状、大小以及开闭情况显著地影响着叶片的光合、蒸腾等生理代谢的速率。因而研究气孔状况很有必要，特别是在研究化学物质及环境因素对气孔运动的影响时，经常需要观察或测定气孔开闭的程度。本实验介绍观察气孔状况的一些方法。 显微镜下观察气孔运动 原理 气孔的开闭运动是由组成气孔器的两个保卫细胞的膨压控制的，将叶片表皮放在高渗溶液中，保卫细胞失水，气孔关闭；置换成低渗溶液后，保卫细胞吸水，气孔开启。气孔的开闭运动可在显微镜下直接观察。 仪器与用具 显微镜1台；尖头镊子1把；载玻片；盖玻片；滤纸；滴管等。 试剂 5％甘油溶液。 方法 选用气孔较大的植物，如鸭跖草、蚕豆等进行实验。实验前先把植株放在湿润的空气中照光，促使气孔张开。观察时摘下叶片，用尖头镊子撕取一小片下表皮，浸入有水滴的载玻片上，盖上盖玻片后立即在显微镜下观察。尽可能找到开得最大的气孔，然后在盖玻片的一端用滤纸吸去水；而从另一端滴上5％甘油溶液，使甘油溶液取代水，继后可观察到保卫细胞因失水而质壁分离，致使气孔关闭。当按上述方法再用水取代甘油时，保卫细胞吸水便呈现质壁分离复原现象，气孔张开，而且张得比实验开始时还大。 注意事项 本方法适用对气孔大且易撕下表皮的植物进行气孔运动的观察。 二、光、CO2对气孔运动的影响 原理 光下植物叶片的气孔开启，暗中气孔关闭。一般情况下，高CO2抑制气孔张开，而低CO2诱导气孔开放。气孔的形态，大小及气孔开度可在显微镜下直接观察。 仪器与用具 　有光源的显微镜1台；显微聚光灯1盏；载玻片；镊子；滴管；吸水纸；测微尺等。 试剂 1mol/L NaOH 方法 1. 光对气孔的开启 将不离体的叶片(鸭跖草或蚕豆等)冲洗干净，放置暗中数小时，使气孔关闭，然后把一张平展的叶片固定在显微镜的载物台上，有气孔的一面朝上，开启显微镜的内藏式光源或在叶的斜上方安置一显微聚光灯，照射叶片，视野中选择数个气孔，调焦后，每隔5～10min观察一次，并用显微测微尺测量气孔开度。也可用显微摄影仪定时定点拍摄光诱导的气孔开启过程。 2. 气孔对CO2的反应 将盛有表皮条和少量水的小培养皿放在一盛有1 mol/L NaOH 溶液的大培养皿中，用烧杯罩住，其中CO2被NaOH所吸收，放在室温、光照下30min，处理前后测量气孔孔径。 注意事项 1.观察的叶片最好是在温室中生长的，叶表面沾污的尘粒少。 2.事先对叶遮光处理。 3.样品下表皮朝向光源。 三、钾离子对气孔开度的影响 原理 保卫细胞的渗透系统受钾离子调节。光下，保卫细胞中的叶绿体通过光合磷酸化生成ATP，ATP驱动质膜上的K+-H+泵，使保卫细胞能逆浓度梯度从周围表皮细胞吸收钾离子，或从外界溶液中吸收钾离子，从而降低其渗透势，使气孔开放。 仪器与用具 显微镜1台；尖头镊子1把；光源灯(1000W碘钨灯)；培养皿 3个，载玻片与盖玻片若干。 试剂 0.5％KNO3；0.5％NaNO3；须用分析纯试剂配制。 方法 1. 将三个培养皿中各放15ml的0.5％KNO3、0.5％ NaNO3与蒸馏水。 2. 在同一蚕豆叶上撕表皮若干，分放在上述的三个培养皿中。 3. 将培养皿置于人工光照条件下照光l2 h左右，光照强度在40001x左右。 4. 分别在显微镜下观察气孔的开度。 注意事项 1. 供试材料除蚕豆外，还可选用鸭跖草和紫鸭跖草，实验前，要给材料预照光，促使气孔适度开放，这样可缩短实验时间，提高处理效应。 2. 室温低时，将照光培养皿放置得离光源稍近一些，使培养皿中溶液温度能上升至30～35℃。 四、ABA等植物激素对气孔关闭的作用 原理 植物内源激素ABA(脱落酸)、SA（水杨酸）、JA（茉莉酸）、IAA（生长素）等均能够影响气孔的开闭运动。可以用称量法、镜检法直接或间接地测量气孔开度，以检验外源ABA、SA、JA、IAA的作用，加深了解ABA、SA、JA、IAA的生理功能。 仪器与用具 显微镜1台(附接目镜测微尺)；温箱1台；感量0.001g天平；25ml 烧杯6只；10ml 移液管3支；剪刀1把；尖头镊子1把；光源；载玻片和盖玻片等。 试剂 1mmol ABA；1mmol SA；1mmol IAA；1mmol 6-BA；pH6.1的10mmol/L Tris或MES缓冲液：蒸馏水；无水乙醇； 方法 1. 取3~4周龄蚕豆幼苗最上端刚展开的叶片，放在光下照光（做ABA、SA）或暗处（做IAA）2~3h，诱导气孔关闭或张开。在显微镜下记录气孔孔径。 2. 用pH6.1的10mmol/L Tris缓冲液配制不同浓度的IAA、6-BA和ABA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。 3. 取气孔下表皮，分别放入以上缓冲液中，在散射光下2~3 h，测量各处理和对照的气孔孔径，作出激素浓度和孔径的关系图。 4. 根据测量结果，分析各激素对气孔开度的影响。 注意事项 1. 测量前为何要进行照光或暗处理? 2. ABA为何能影响气孔开度? 五、Ca2+在ABA调节气孔运动中的作用 原理 Ca2+是ABA调节气孔运动信号转导的重要组分之一。激光共聚焦显微镜技术（Conforcal）证明在ABA诱导蚕豆气孔关闭会出现 [Ca2+]i(胞质钙浓度)升高现象，Ca2+通道阻断剂EGTA、钌红、LaCl3和异博定（verapamil ）可阻断ABA所引起的[Ca2+]i(胞质钙浓度)升高，抵消或减弱ABA诱导气孔关闭的效应。 仪器与用具 有光源的显微镜1台；载玻片；镊子；滴管；吸水纸；测微尺等。 试剂 100 mmol/L KCl溶液； pH6.1的10mmol/L Tris或MES缓冲液；100 mmol/L CaCl2溶液；20 mmol/L EGTA；10mmol/L LaCl3 方法 1. 取3~4周龄蚕豆幼苗最上端刚展开的叶片，放暗处或在光下照光2～3h，诱导气孔关闭或张开。在显微镜记录气孔孔径。 2. 用pH6.1的10mmol/LTris缓冲液配制不同浓度的ABA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）、Ca2+（0.1、1、10mmol/L）溶液、含有2 mmol/L EGTA的ABA系列浓度溶液，含有1 mmol/L LaCl3的ABA系列浓度溶液。 3. 取气孔下表皮，分别放入以上缓冲液中，在散射光下2～3 h，测量各处理和对照的气孔孔径，作出激素浓度和孔径的关系图。 4. 根据测量结果，分析钙在ABA调控气孔运动中的作用。 思考题 气孔的开闭是由什么控制的? 为什么供试材料在实验前要放在湿润的空气中照光? 当水取代甘油时，气孔开度为什么比实验开始时还大? 试比较在何种溶液中气孔的开度最大?为什么? 如何进一步证明钙参与ABA诱导气孔关闭的过程？ 2.2 露点法测定植物叶片水势和渗透势 水势和渗透势是植物水分状况的重要参数。水势与渗透势的测定方法可分为三大类：液相平衡法（包括小液流法、重量法测水势，质壁分离法测渗透势）和压力平衡法（压力室法测水势）外，还有一类是气相平衡法，包括热电偶湿度计法、露点法等。液相平衡法所需仪器设备简单，但手续繁琐、效率低，难以自动记录；压力平衡法适于测定枝条或整个叶片的水势，对于小型样品如叶圆片等则无能为力。气相平衡法能广泛用于各种植物叶片水势和渗透势的测定，所需样品量极少、测量精度高，是近年来发展起来的一类较好的植物水势及其组分的测定技术。 原理 将叶片或组织汁液密闭在体积很小的样品室内，经一定时间后，样品室内的空气和植物样品将达到温度和水势的平衡状态。此时，气体的水势（以蒸气压表示）与叶片的水势（或组织汁液的渗透势）相等。因此，只要测出样品室内空气的蒸气压，便可得知植物组织的水势（或汁液的渗透势）。由于空气的蒸气压与其露点温度具有严格的定量关系，本仪器便通过测定样品室内空气的露点温度而得知其蒸气压。该仪器装有高分辨能力的热电偶，热电偶的一个结点安装在样品室的上部。测量时，首先给热电偶施加反向电流，使样品室内的热电偶结点降温（Peltier效应），当结点温度降至露点温度以下时，将有少量液态水凝结在结点表面，此时切断反向电流，并根据热电偶的输出电位记录结点温度变化。开始时，结点温度因热交换平衡而很快上升；随后，则因表面水分蒸发带走热量，而使其温度保持在露点温度，呈现短时间的稳衡状态；待结点表面水分蒸发完毕后，其温度将再次上升，直至恢复原来的温度平衡。记录下稳衡状态的温度，便可将其换算成待测样品的水势或渗透势。 仪器组成 本试验所用仪器为美国Wescor 公司生产的HR-33T型露点微伏压计，该微伏压计实际上就是一个精密的电位计，能准确测出热电偶两端点温度差异而产生的细微的电位变化。仪器配套的C-52（图1）和L-51型样品室的基本结构都是由一个灵敏的热电偶和一个铝合金制的隔热性很好的叶室组成。前者用于离体叶片水势测定，后者主要用于活体测定。 方法 样品室空白系数测定 （1）使FUNCTION旋钮位于SHORT位置。打开主机预热10分钟。 （2）将功能旋钮（FUNCTION）旋转到Read位置，将量程（RANGE）旋钮位于30的位置上，调节ZERO OFFSET旋钮使指针读数为零。 （3）将FUNCTION旋钮调到COOL位置，此时表头的指针向右偏转，当指针移动到最大时，将FUNCTION旋钮调到DP位置，此时表头的指针会向左或向右偏转，调整πv Set旋钮(指针向右偏转，πv Set旋钮就向右转动，反之向左)使指针稳定不动。 （4）指针稳定后，按下πv按钮，此时在100刻度上的读数便为该探头的空白值（πv值）。空白系数一般不需要每次测定，如温度恒定，该系数一般不会变化。 2. 植物组织水势的测定 （1）离体测定法： ① 根据所测定植物样品的大小，选择合适的样品槽。然后切取大小合适的植物组织，迅速放入样品槽中（样品室中的植物材料一定不要高出样品槽），将样品槽推入样品室，旋转样品室顶端的螺旋盖使样品室密闭，然后平衡数分钟（平衡时间视材料水势高低与测定时的温差而定）。 ② 将样品室与主机连接，按住左边的πv键，用πv set旋钮调节指针至样品室的空白读数值。 ③ 调节量程（RANGE）旋钮位于预期的位置上，调节FUNCTION旋钮位于READ位置，然后调节ZERO OFF SET旋钮使指针读数为零。 ④ 将FUNCTION旋钮调到COOL位置，此时表头的指针向右偏转，当指针偏转到最大时，将FUNCTION旋钮调到DP位置，此时表头的指针向左偏转，当表头的指针稳定后，从表头上读取测定值。如果（RANGE）旋钮位于10或100的位置，按表头的上排刻度读数；如果（RANGE）旋钮位于30或300的位置，按表头的下排刻度读数。 ⑤ 表头读数为电势差，该电势差是水势的线性函数，比例系数为-0.75μv/bar。表头读数除以-0.75μv/bar便为被测样品的水势（bar）。 （2）活体测定法：将植株上的叶片插入L-51型样品室，密封样品室，平衡一段时间后测定，测定步骤同以上操作步骤②～⑤。注意：夹叶片的L-51型样品室一定要密闭，在夹上叶片之前可以适当涂抹凡士林，以达到密闭的目的。 3. 叶片渗透势测定 （1）取供试植株叶片，去中脉，迅速放入一尖底离心管，封口，于-40℃下冰冻１h后，取出融化，用一平头玻棒挤压叶片以榨出汁液。或者使用专用的榨汁器直接将细胞汁液榨取到圆形滤纸片上待测。 （2）在C-52样品槽中放入一片圆形滤纸片，然后吸取10μl叶片汁液置于圆形滤纸片上，样品室密封，平衡一段时间（数秒至几分钟）联接到主机上进行测定。 注意事项 1.当连接或拔出探头时，应始终把FUNCTION开关打到SHORT位置上，把探头插入主机相应的接口。当测定温度时，把℃/μv开关置于℃的位置。 2.在使用C-52样品室时，切勿将样品放得高出或大于样品室小槽；测定完毕后，一定要将样品室顶部的旋钮旋起足够高以后才可将样品室的拉杆拉出，否则将损伤热电偶。 3.主机长期放置后，重新使用时须将电池充电14~16h。 4.在不同温度下测定时，应同时记录下测定时探头的温度，然后按照下列公式把所有测定值校正为25℃时的测定值： 校正读数＝实际测定读数/(0.325+0.027T) 式中：T为测定时记录的温度℃。 5.样品水势不同，所需平衡时间不同，样品水势越低，所需平衡时间越长。正常供水的植物材料平衡时间需几分钟到数十分钟；而严重干旱的小麦叶水势在-22.7巴左右，平衡时间需2小时以上。平衡时间过短，不能测出正确结果；平衡时间太长，也会造成实验误差。 6.一般认为从叶圆片边缘的水分散失和离体期间的淀粉水解会造成测定的一定误差，但只要合理取样并迅速将叶圆片密封到样品室中，可把误差减少到最小。 思考题 1.测定植物叶片水势的三大类方法各有哪些主要优缺点？ 2.用同一仪器测定，露点法为何比湿度法灵敏度高一倍？ 3.如何理解叶片水势越低，所需平衡时间越长？ 2.3 液体交换法测定植物组织水势（小液流法、折射仪法、压力室法） 植物组织的水分状况可用水势来表示。植物体细胞之间、组织之间以及植物体与环境之间的水分移动方向都由水势差决定。将植物组织放在已知水势的一系列溶液中，如果植物组织的水势(Ψcell)小于某一溶液的水势(Ψout)，则组织吸水，反之组织失水。若两者相等，水分交换保持动态平衡。组织的吸水或失水会使溶液的浓度、密度、电导率以及组织本身的体积与质量发生变化。根据这些参数的变化情况可确定与植物组织等水势的溶液。 液体交换法测定水势的方法有多种，下表是所列三种方法的原理。 液体交换法测定水势的种类和原理 判据依据 ΔΨ=Ψout-Ψcell 组织水分 得失变化 外液密度 变化 外液浓度 变化 外液电导度 变化  ΔΨ<0 吸水 升高 增加 增高  ΔΨ>0 失水 降低 降低 降低  ΔΨ=0 平衡 不变 不变 不变  测定方法  小液流法 折射仪法 电导仪法  使用器材  毛细移液管 折射仪 电导仪  适用材料  叶片或碎组织 叶片或碎组织 叶片或碎组织  一、小液流法 原理 小液流法是由俄国人夏尔达可夫修改而成。实验中常用甲烯蓝着色，有人称为着色法(Dye Method)。此法是以比重大小测定蔗糖溶液浓度变化，因此又称为比重法(Densitometril Method)。 当植物组织与外界溶液接触时，若组织水势小于外液水势，水分进入植物组织，外液浓度增高；相反，组织水分进入外液，使外液浓度降低；若二者水势相等，组织不吸水也不失水，外液浓度不变。溶液浓度不同，比重不同。取浸过组织的蔗糖溶液一小滴(为便于观察加入少许甲烯蓝)，放入未浸植物组织的原浓度溶液中，观察有色溶液的沉浮。若液滴上浮，表示浸过样品后的溶液浓度变小；液滴下沉，表示浸过样品后的溶液浓度变大；若液滴不动，表示浓度未变，该溶液水势即等于植物组织水势。实际测定时，常常不易找到有色液滴不动的溶液，而是取接近组织水势的相邻两种溶液浓度的平均值。 仪器设备 水势测定取样箱；小试管；大试管；毛细移液管；试管架；打孔器；干净硬纸片；镊子 试剂 1. 蔗糖溶液：按重量法试剂配制不同浓度蔗糖溶液，或按附表配成不同水势蔗糖溶液。 2. 甲烯蓝(研成粉末)。 附表：100ml蒸馏水中加入不同蔗糖配成不同水势溶液 蔗糖溶液 水势(-巴) 100毫升蒸馏水 加入蔗糖克数 蔗糖溶液 水势(-巴) 100毫升蒸馏水 加入蔗糖克数  2 4 6 8 10 12 14 2.74 5.45 8.11 10.74 13.34 15.91 18.44 16 18 20 22 24 26 28 20.99 23.42 25.86 28.28 30.68 33.04 35.38  材料 欲测的植物组织 方法 1. 取5-6个干净的小试管和相同数量的大试管(15×180mm)，贴上不同浓度(或水势)标签。向大试管中加入不同蔗糖溶液4~5ml。 2. 剪取欲测叶片，迅速放入取样箱，用打孔器打成圆片，混匀，分别装入小试管底部，每管装10片左右。向各管分别加入不同水势或浓度蔗糖溶液1ml，加盖，摇匀，放少许甲烯蓝，静置15~20min。 3. 用干净的毛细移液管，吸挤小试管底部蓝色溶液，使其充分混合均匀，并吸取1~2滴，小心地插入装着相对应同浓度蔗糖溶液大试管溶液的中部，轻轻地挤出一小滴蓝色溶液，慢慢转动毛细管头部，抽出毛细移液管，观察蓝色液滴流动方向。蓝色溶液不动的试管或蓝色液滴上浮、下沉的两个相邻试管蔗糖浓度的平均值，即为等势点。 结果计算 如蔗糖溶液按水势值配制，测出的结果不必再进行运算。 若蔗糖溶液按摩尔浓度配制，按下式计算植物组织水势。 Ψcell=Ψout=-iCRT 式中，Ψcell-植物组织水势 Ψout–外界溶液渗透势 单位为大气压，最后换算成标准单位Pa 1大气压=1.013巴=1.013×105Pa C-等势点的蔗糖浓度（摩尔/升） R-气体常数[0.082大气压·升/(摩尔·度)] T-绝对温度，即273+t (t为当时温度) i-解离常数（蔗糖为1） 二、折射仪法 原理 植物组织和蔗糖溶液组成的渗透体系中，水分总是从水势高的一方流向水势低的一方。将植物组织放入一系列不同浓度蔗糖溶液中，有的植物组织吸水，蔗糖浓度增加，有的植物组织失水，蔗糖浓度降低，若植物组织不吸水又不失水，蔗糖浓度不变。此法利用折射仪测定其折光系数(或蔗糖浓度百分数)，与原蔗糖溶液折光系数(或蔗糖浓度百分数)比较找寻折光系数无变化的糖浓度，或者是相邻两种浓度平均数，最后折算为水势值。 仪器设备 阿贝折射仪；试管；试管架；镜头纸；滴管；吸水纸 试剂 蔗糖溶液：配制方法同小液流法。 材料 欲测的各种植物组织。 方法 1. 向试管中依次加入不同浓度蔗糖溶液2ml，加盖。用阿贝折射仪测定每种蔗糖浓度溶液的折光系数。 2. 用打孔器，钻取植物叶片，每管装20片摇匀，加盖。 3. 放置30min以后，在折射仪上测定各试管溶液折光系数。 4. 将两次测定结果比较，寻找折光系数未变的蔗糖浓度，或将相邻两试管(折光系数一个增加，一个降低)浓度的平均值。 5. 此蔗糖浓度可按小液流法计算方法，算出植物组织水势。 注意事项 1. 小液流法中，用滴管挤出液滴及向外抽出滴管时，用力一定要小，要慢。 2. 折射仪法前后两次测定溶液的折光系数时的温度必须一致。 思考题 1.比较这两种水势测定方法的优越性？测定材料为叶片时，用其小圆片与外液进行水分交换，有何缺点？ 2.用小液流法测定植物组织的水势与质壁分离法测定植物细胞的渗透势都是以外界溶液的溶质势算出植物组织的水势，它们之间的区别何在？ 3. 矿质营养 3.1 植物溶液培养和缺素培养 植物正常生长发育需要多种矿质元素。但要确定各种元素是否为植物所必需，必需借助无士培养法(溶液培养和砂基培养法)才能解决。近年来，无士栽培不仅作为一种研究手段，而且成为新的生产方式，在蔬菜、花卉生产中开始大规模应用。本实验学习溶液培养的技术，并证明氮、磷、钾、钙、镁、铁诸元素对植物生长发育的重要性。 原理 用植物必需的矿质元素按一定比例配成培养液来培养植物，可使植物正常生长发育，如缺少某一必需元素，则会表现出缺素症；将所缺元素加入培养液中，缺素症状又可逐渐消失。 仪器与用具 　　25ml和500ml烧杯；移液管lml，5m1；1000ml量筒；培养瓶(可用600~1000ml塑料广口瓶或瓷质、玻璃质培养缸)；黑色蜡光纸或报纸适量；塑料纱网纱布(15cm×15cm)1块；精密pH试纸(pH5.4~7)；搪瓷盘(带盖)；石英砂适量；陶质花盆；500ml试剂瓶。 试剂 硝酸钾，硫酸镁，磷酸二氢钾，硫酸钾，硫酸钠，磷酸二氢钠，硝酸钠，硝酸钙，氯化钙，硫酸亚铁，硼酸，氯化锰，硫酸铜，硫酸锌，钼酸，盐酸，乙二胺四乙酸二钠，以上试剂均需分析纯。 附表1 大量元素贮备液配制表 营养盐 浓度（g/L）  Ca(NO3)2?4H2O KNO3 MgSO4?7H2O KH2PO4 K2SO4 CaCl2 NaH2PO4 NaNO3 Na2SO4 EDTA-Na FeSO4?7H2O 236.0 102.0 98.0 27.0 88.0 111.0 24.0 170.0 21.0 7.45 5.57  备注：EDTA-Fe的配制，将EDTA-Na2和硫酸亚铁分别溶解，然后合在一起煮沸，用蒸馏水定溶至1000ml。 方法 1. 精选高活力玉米（或番茄）种子为试验材料。 2. 培苗：用搪瓷盘装入一定量的石英砂或洁净的河砂，将已浸种一夜的玉米（或番茄）等种子均匀地排列在砂面上，再覆盖一层石英砂，保持湿润，然后放置在温暖处发芽。第一片真叶完全展开后，选择生长一致的幼苗，小心地移植到各种缺素培养液中。移植时注意勿损伤根系。 3. 配制大量元素及铁贮备液：用蒸馏水按表2配制。微量元素贮备液按以下配方配制：称取H3BO3 2.86g，MnC12·4H2O 1.81g，CuSO4·5H2O 0.08g，ZnSO4·7H2O 0.22g，H2MoO4·H2O 0.09g，上述药品分别溶解后用蒸馏水定溶至1L容量瓶中。 配好以上贮备液后，再按表2配成完全培养液或缺乏某元素的培养液(用蒸馏水)。调节pH至5.5~5.8。 4. 取7个600~1000ml塑料广口瓶，分别装入配制的完全培养液及各种缺素培养液600~900ml，贴上标签，写明日期。然后把各瓶用黑色蜡光纸或黑纸包起来（黑面向里），或用报纸包三层，用纸壳或0.3mm的橡胶垫做成瓶盖，并用打孔器在瓶盖中间打一圈孔，把选好的植株去掉胚乳，并用棉花缠裹住根基部，小心地通过圆孔固定在瓶盖上，使整个根系浸入培养液中，装好后将培养瓶放在阳光充足、温度适宜(20~25℃)的地方，培养3~4周。 5. 实验开始一周后，开始观察。并用精密pH试纸检查培养液的pH值，如高于6，应用稀盐酸调整到5~6之间。为了使根系氧气充足，每天定时向培养液中充气，或在盖与溶液间保留一定空隙，以利通气。培养液每隔一周需更换一次。注意记录缺乏必需元素时所表现的症状和最先出现症状的部位。待各缺素培养液中的幼苗表现出明显症状后，可把缺素培养液一律更换为完全培养液，观察症状逐渐消失的情况，并记录结果。 附表2 完全培养液和各种缺素培养液配制表 〔每100ml培养液各种贮备液的用量（ml）〕 贮备液 完全 缺N 缺P 缺K 缺Ca 缺Mg 缺Fe  Ca(NO3)2 0.5  0.5 0.5  0.5 0.5  KNO3 0.5  0.5  0.5 0.5 0.5  MgSO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5  0.5  KH2PO4 0.5 0.5   0.5 0.5 0.5  K2SO4  0.5 0.1      CaCl2  0.5       NaH2PO4    0.5     NaNO3    0.5 0.5    Na2SO4      0.5   EDTA-Fe 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5   微量元素 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1  注意：蒸馏水的电导率不能超过40μΩ-1，否则影响实验效果。 思考题 1. 为什么说无土培养是研究矿质营养的重要方法? 2. 比较溶液培养和砂基培养的优缺点。 3. 进行溶液培养或砂基培养有时会失败， 主要原因何在? 3.2 植物伤流液的成分分析 原理 植物根系不仅是吸收水分和矿质元素的重要器官，而且还是重要的合成器官，植物吸收的无机盐，有一部分即在根中进行初级同化，转变为有机物并向地上部运输。当植物地上部被切去时，从伤口处就会有液体流出，这种现象称为伤流，所流出的汁液称为伤流液。伤流反映了根系的活动情况，测定伤流液中各种营养成份的种类和数量，可以评价根的吸收能力和合成能力。本实验通过点滴分析鉴定伤流液的几个成份。 材料与设备 玉米苗或丝瓜苗 弯曲玻璃管(内径3-4mm、弯曲角度45)；弯乳胶管、刀片、烧杯、白瓷板、滴管 试剂 二苯胺试剂：0.05g二苯胺溶于5.4ml 浓硫酸中。 0.5%联苯胺：0.5g联苯胺溶于100ml 50%的乙醇中。注：联苯胺先用少量醋酸溶解。 5%钼酸铵溶液：5g钼酸铵溶在100ml蒸馏水中。 0.1%茚三酮试剂：0.lg茚三酮溶于100ml 95%乙醇中。 0.1%蒽酮试剂：0.1 g蒽酮溶在l00ml浓硫酸中。 饱和醋酸钠溶液： 固体亚硝酸钠 步骤 1.收集伤流液 (l)将乳胶管的一端紧套在玻璃管的短头，以防漏水。玻璃管的另一端接一试管用于收集伤流液。 (2)挑选健壮待测植株，在距地面3cm处切去地上部分，将乳胶管的另一端套在植物的断茎上，以防漏气。将试管位置放得稍低于地面，在植物根际浇足水，第二天伤流液自动流入试管中。就可收取伤流液。 2.点滴分析 (l)硝态氮 在NO3-存在时，二苯胺被硝酸氧化而显深兰色 .二苯胺（无色） 缩二苯胺氧化物（蓝色） 取一滴伤流液在瓷板上，加一滴二苯胺试剂，呈兰色。 (2)无机磷 钼酸铵((NH4)2MoO4遇磷酸盐生成磷钼酸铵[(NH4)3PO4·12MoO3·2H2O]，它的氧化能力极强，可氧化自由钼酸或钼酸盐难以氧化的联苯胺生成联苯胺兰和钼兰两种物质。 取一滴伤流液于白瓷板上，加一滴钼酸铵溶液，加热干燥后再加一滴联苯胺溶液和一滴醋酸钠饱和溶液，如有磷存在，就呈现兰色。 (3)钾离子 中性或微碱性的钾盐溶液加入亚硝酸钴纳生成黄色晶状沉淀亚硝酸钴钠钾。 Na3Co(NO2)6+2K+→K2Na(Co(NO2)6)↓+2Na+ 铵盐能干扰这个反应。 取一滴伤流液于白瓷板上，放在70℃烘箱中片刻，使NH3逸出，再加少许固体亚硝酸钴钠有黄色浑浊出现，指示钾的存在。 (4)氨基酸 凡含有自由氨基的化合物，与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物。 取一滴伤流液于白瓷板上，加一滴茚三酮溶液，置于70-80℃恒温箱中5-10min后取出观察颜色，红紫色出现指示氨基酸存在。 (5)可溶性糖 蒽酮与糖反应显兰紫色。 取一滴伤流液于白瓷板上，加2~3滴蒽酮试剂，放入70~80℃恒温箱中5~10min后取出观察，兰紫色出现则指示糖的存在，紫色深浅与糖的含量一致。 思考题 1.伤流是怎样产生的? 2.伤流液成份分析结果说明了什么? 3.3 根系活力的测定(TTC法) 原理 氯化苯基四氮唑(TTC)是标准氧化还原电位为80毫伏的氧化还原物质。溶于水中为无色溶液，但还原后生成红色不溶于水的三苯基甲 （TTF）。反应如下： 生成的三苯基甲 呈稳定的红色，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作脱氢酶的氢受体。植物根系中脱氢酶可引起TTC还原，此反应可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等得到加强；而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。在幼根中，脱氢酶活性的强弱与根系活力成正比。所以，通过测定脱氢酶的活性，可由脱氢酶活性代表根系活力。此法既可定性，又可定量测定。 仪器 1. 分光光度计； 2. 分析天平； 3. 托盘天平； 4. 温箱； 5. 研钵； 6. 漏斗； 7. 量筒10毫升； 8. 刻度移液管； 9. 10ml试管； 10. 试管架； 11. 药勺； 12. 石英砂适量； 13. 称量瓶(30×60mm) 14.容量瓶（100ml） 试剂 1. 乙酸乙酯(分析纯)。 2. 连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，分析纯，粉沫． 3. 1%TTC溶液：准确称取TTC 1.0 g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml。 4. 0.4%TTC溶液：准确称取TTC 0.4g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml。 5. 磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)。 6. 1mol/L硫酸：用量筒量取比重l.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。 7．0.4mol/L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠(含6个结晶水)10.81g，溶于蒸馏水中，定容至l00ml。 方法 1.定性测定 (1) 配置反应液：把1%TTC溶液，0.4mol/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。 (2〉把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放lh，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。 2.定量测定 (1)TTC标准曲线的制作：吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTC25、50、100、150、200μg的标准比色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。 (2) 称取根样品0.5g，放入称量瓶(空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同)，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5m1，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温lh，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。 (3) 把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提取液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2~3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出TTC还原量。 (4)计算：将所得数据带入公式，求出TTC还原强度。 TTC还原强度(TTC还原量μg/g˙h)=TTC还原量(μg)/[根重(g)×时间(h)] 思考题 反应中加入硫酸、琥珀酸或延胡索酸、苹果酸各起何作用? 3.4 硝酸还原酶(NR)活性的测定 原理 硝酸还原酶是植物氮代谢中的关键性酶。植物吸收的硝酸根离子，首先通过硝酸还原酶的催化，被还原成亚硝酸根离子。其反应如下： NO3-+NADH+H+ NO2-+NAD++H2O 产生的亚硝酸根离子可以从组织内渗到外界溶液中，测定反应液中亚硝酸含量，通过一定公式计算就可得硝酸还原酶活性的大小。 亚硝酸离子的测定用比色法。此法灵敏，能检测出每毫升含0.5微克的NaNO2。其反应如下： 对氨基苯磺酸(或磺胺)+2H++NO2- 叠氮化合物 叠氮化合物+α-萘胺（或盐酸萘乙二胺） 偶氮化合物(红色) 生成的红色偶氮化合物在520nm波长比色，其光密度值与NO2-含量成正比。 仪器设备 1. 分光光度计； 2. 真空泵； 3. 扭力天平； 4. 保温箱； 5. 真空干燥器； 6. 试管9支； 7. 移液管； 8. 烧杯； 9. 吸水纸。 试剂 1. 0.2 mol/L硝酸钾：溶解10.11克硝酸钾于蒸馏水中，定容至500ml。 2. 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH7.5。 a液：0.2 mol/L NaH2PO4。取NaH2PO4 27.8克，配成1000ml。 b液：0.2 mol/L Na2HPO4。取Na2HPO4·12H2O 71.7克，加蒸镏水配成1000ml。 取a液16ml，B液84ml，混合，用蒸馏水稀释至200ml。 3. 对氨基苯磺酸(或磺胺)1克，加3N盐酸溶解后，用蒸馏水稀释至100ml。 4. 盐酸萘乙二胺万分之二水溶液。 5. 亚硝酸钠标准液：称取AR级NaNO2 0.1克，用蒸馏水溶解并定容至100ml。然后吸取5ml，再用蒸馏水稀释至1000ml，即为每毫升含NaNO25微克的标准液。 材料 待测植物组织 方法步骤 1. 取样： 随机取样5-10株，选取叶片，剪下，水洗，用吸水纸擦干表面水分，用剪刀剪成长约0.5cm的切段，在蒸馏水中冲洗2-3次，吸干水分，迅速称取4份各0.5g，分别置于4支试管，编号，以1、2管作对照，各加5ml pH7.5缓冲液和5ml蒸馏水，以3、4管作处理，各加5ml pH7.5缓冲液和5ml 0.2mol/L的硝酸钾，然后将试管置于真空干燥器中，接上真空泵，抽气10~15min，放气后，叶片浸入溶液中，将试管置于35℃恒温培养箱中，准确记时使酶在暗处反应30min。 2. NaNO2 含量测定： 反应30min后，分别取出反应液1ml于试管中，加入对氨基苯磺酸或磺胺2ml，混匀。再加入盐酸萘乙二胺或α-萘胺2ml，再混匀。在35℃恒温培养箱中保温30min。用分光光度计以绘制标准曲线的1号管作空白，在520nm波长比色。记录光密度，从标准曲线上查NaNO2 含量；换算为NO2- 含量，再按一定公式计算酶的活性，以每小时每克鲜重生成的NO2-微克数表示。 3．绘制标准曲线： 取7支试管，编号，按下表顺序加入试剂，每加完一种试剂，摇动试管，使之均匀。待所有试剂加完后，将各试管置于35℃恒温箱中保温30min，立即于520nm波长进行比色，1号管为空白。记录光密度，以光密度为纵坐标，NaNO2含量为横坐标，绘标准曲线。 试管号 试剂（ml）  1  2  3  4  5  6  7   NaNO2标准液(5微克／ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1  蒸馏水 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0   对氨基苯磺酸(或磺胺) 2 2 2 2 2 2 2   盐酸萘乙二胺(或α-萘胺) 2 2 2 2 2 2 2   每管含NaNO2的微克数 0 0.5 1 2 3 4 5  注意事项 1. 亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影响。因此，标准液与样品液的测定应在相同条件下进行，方可比较。 2. 取样前，叶子需进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，否则酶活性偏低。水稻中缺乏硝酸还原酶，可在取样前一天用50mmol/L KNO3或NaNO3加在培养液中，以诱导硝酸还原酶的生成。 思考题 NR活性测定时取材前为什么要进行一段时间光合作用？测定酶促反应时为什么要在暗处保温？ NR活性测定时加入磺胺、盐酸萘乙二胺和KNO3的作用各是什么？ 4. 光合作用和呼吸作用 4.1 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和定量测定 一、叶绿体色素的提取分离及理化性质 原理 提取分离 植物叶绿体色素是吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。从植物叶片中提取和分离色素是认识叶绿体色素的前提。利用叶绿体色素不易溶于水而溶于有机溶剂的特性，可用丙酮等有机溶剂提取。 色素分离 分离叶绿体色素的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，因而使样品混合物分离。 荧光现象 叶绿素分子吸收光量子，由基态上升到激发态，激发态不稳定，有回到基态的趋向，当由第一单线态回到基态时发射出的光称为荧光。 取代反应 叶绿素中的镁可以被H+所取代而形成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应 叶绿素是一种二羧酸叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。 仪器设备 1. 大试管；2. 软木塞；3. 大头针；4. 滤纸；5. 天平；6. 漏斗；7. 烧杯；8. 量筒；9. 研钵；10. 毛细管；11. 分光镜；12. 分液漏斗；13. 表面皿；14. 吸耳球；15. 试管；16. 移液管；17.剪刀 试剂 丙酮；汽油或四氯化碳；无水碳酸钠；碳酸钙；石英砂；苯；乙醚；氢氧化钾；甲醇；.醋酸铜；.醋酸；氢氧化铵 步骤 1. 提取 称取新鲜植物叶片2g，放入研钵中加丙酮5ml及少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮5ml，然后以漏斗过滤之，即为叶绿体色素提取液。 2. 纸层析分离 (1) 取准备好的滤纸条（2×22cm），将其一端剪去二侧，中间留一长约1.5~2cm，宽约0.5cm窄条，见图。 (2) 用毛细管取叶绿素浓缩液(吸取提取液1ml，加入适量无水Na2CO3)点于窄条上端，注意一次所点溶液不可过多，如色素过淡，用电吹风吹干后再点5~7次,至深绿色。 (3) 在大试管中加入3-5ml汽油，再加入几滴苯。然后将滤纸固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中(色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁)。软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。 (4) 0.5~1h后，观察色素带分布。最上端橙黄色（胡萝卜素），其次鲜黄色（叶黄素），再次蓝绿色（叶绿素a），最后是黄绿色（叶绿素b）。 3. 叶绿素的荧光现象 取上述色素丙酮提取液于试管中，在反射光和透射光下，观察提取液的颜色，反射光观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光颜色。 4. 光对叶绿素的破坏作用。 取上述色素丙酮提取液少许，分装在两只试管中，一只试管置于暗处(可用黑纸包裹)，另一只试管置于强光下(太阳光)，经2~3h后，观察两只试管中溶液的颜色有何不同。 5. (H+和Cu2+)对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 取上述色素提取液少许于试管中，一滴一滴加入50%醋酸，直至溶液出现褐色，此时叶绿素中Mg2+被H+所取代，形成去Mg叶绿素。加入醋酸铜晶体一小块，渐渐加热溶液，则又产生鲜亮的绿色，即表明铜又替代去Mg叶绿素分子中氢的位置，形成了铜代叶绿素。 6.黄色素和绿色素的分离。 (1)取上述色素丙酮提取液10ml，加到盛有20ml乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入30ml蒸溜水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层，色素全部转入上层乙醚时，弃去下层丙酮和水，再用蒸溜水冲洗乙醚溶液一、二次。再往色素乙醚溶液中加入约5ml 30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置约10min。然后再加入蒸溜水约10 ml及乙醚5ml(乙醚可以不加)，摇动后静置分离，则得黄色素层和绿色素层，分别置于试管中保存。 （2）a.用刻度吸管吸取叶绿体色素提取液5ml放入试管中，再加入5ml 20%的KOH甲醇溶液，充分摇匀。 b.片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5ml蒸溜水，轻轻混匀(勿激烈摇动)，于试管架上静置，可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化叶绿素a和b(以及少量叶黄素)；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 7. 观察色素溶液的吸收光谱。 (1) 调节分光镜，观察电灯光的光谱。 (2) 观察色素丙酮提取液，稀释一倍比较之。 (3) 观察黄色素乙醚溶液，稀释一倍比较之。 (4) 观察皂化叶绿素甲醇溶液，稀释一倍比较之。 (5) 观察被光破坏的色素丙酮提取溶液。 (6) 观察铜取代镁的色素溶液。 8. 植物中的花色素(花青素、花黄素)。 (1)取红色或蓝色花瓣，置于表面皿中，用玻璃棒将表皮轻轻刮破，然后加碱液(10%NH4OH)或酸液(10%醋酸)数滴，观察其颜色变化，用蒸溜水洗去溶液，再换上酸液或碱液，观察是否能变回到原来的颜色。 也可以将花瓣置于蒸溜水中加热，把色素提取出来，再加酸或碱观察溶液颜色的改变。 （2）取白色或黄色花瓣，同样作上面试验，观察颜色的变化。 注意事项： 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层，可激烈摇荡，放在30~40℃水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变的清澈透明。 思考题： 1. 用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？ 2. 研磨提取叶绿素时加入CaCO3、石英砂各有什么作用？ 二、 叶绿体色素的定量测定 原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定定波长下测定其光密度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即 D=kCL 式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为lcm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b及类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收蜂分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： D663=82.04Ca+9.27Cb (1) D645=16.75Ca+45.60Cb (2) 式（1）、(2)中的D663和D645：为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。解方程组（1）、（2），得： Ca=12.72D663—2.59D645（3） Cb=22.88D645—4.67D663（4） 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT=Ca+Cb=20.2D645+8.05D663（5） 另外，由于叶绿素a、b在D652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次（D652）而求出叶绿素a、b总量： CT=(D652×1000)/34.5 (6) 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Amon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式： Ca=12.21D663－2.81D645（7） Cb=20.13D645－5.03D663（8） Cx·c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 (9) 式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx·c为类胡萝卜素的总浓度；D663、D645、D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm、470nm下的光密度。 由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式： Ca=13.95D665－6.88D649 (10) Cb=24.96D649－7.32D663 (11) Cx·c=(1000D470－2.05Ca－114.8Cb)/245 (12) 仪器与用具 分光光度计；研钵2套；剪刀1把；玻璃棒；25ml棕色容量瓶3个；小漏斗3个；直径7cm定量滤纸；吸水纸；擦镜纸；滴管；电子顶载天平（1/100g感量）。 试剂 95%乙醇（或80%丙酮）；石英砂，碳酸钙粉沫。 方法 1. 取新鲜植物叶片（或其他绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混均。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3m1 95％乙醇(或80％丙酮)研成匀浆，再加95％乙醇(或80％丙酮)乙醇10ml；继续研磨至组织变白，静置3~5min。 3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。 6. 按公式(10)、(11)、(12)(如用80％丙酮，则按公式7、8、9)分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度(mg/L)，(10)、(11)式相加即得叶绿素总浓度。 7. 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量(用mg/g鲜重或干重表示)： 叶绿体色素含量= 注意事项 1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。 2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710nm或750nm波长下测量光密度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时光密度值的5％，否则应重新过滤。 3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差lnm，则叶绿素a的测定误差为2％，叶绿素b为19％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。 4. 在使用低档型号分光光度计(如：72型、125型、721型等)测定叶绿素a、b含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低(±5~7nm)，与高中档仪器如岛津UV-120、UV-240等测定结果相比，叶绿素a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，a／b比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。 思考题 1. 叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析?为什么? 2. 为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取? 4.2 红外线CO2气体分析仪法测定植物光合与呼吸速率 光合作用是地球上最重要的生命现象，它是唯一能把太阳能转化为稳定的化学能贮藏在有机物中的过程，是维持地球上物质循环的关键环节，也是农作物产量形成的决定性因素。在植物科学研究中，经常需要测定光合作用。 在光合作用（及呼吸作用）测定方法的发展过程中，曾经有过多次革新，其中包括测定干物质积累的称重法，测定CO2吸收（和释放）的滴定法，测氧气释放的检压法和氧电极法等。与这些方法相比，红外线气体分析仪（IRGA）堪称最先进的方法。它不但快速、准确，而且可将测定信号变为电信号输出，便于仪器的自动化和智能化。 近年来，国际上一些生理生态仪器公司生产了全自动光合作用测定仪，如英国PPSystems公司生产的CIRAS-1、CIRAS-2型便携式田间光合测定仪和美国拉哥公司生产的LI-6400型光合作用测定仪，都是当前国际上最先进的仪器，但价格较高。近几年也生产了一些价格相对低廉、适合教学使用的便携式光合作用测定系统，如TPS-1便携式光合作用测定系统。 本实验密闭式气路系统以我国北京分析仪器厂生产的QGD-07或GXH-305 型红外线CO2气体分析仪为主机组成的系统进行光合和呼吸速率测定；开放式气路系统应用TPS-1光合作用测定系统。 1、红外线CO2气体分析仪（IRGA）工作原理 许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69μm、2.77μm、4.26μm和14.99μm处，其中只有4.26μm的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26μm红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯一比尔定律。分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。 目前应用于光合作用研究的红外线CO2气体分析仪，按照测量气室的数量一般分为两种类型：单气室类型和双气室（或多气室）类型。单气室红外仪一般用于CO2浓度绝对值的测定；在双气室（或多气室）红外仪中，一个气室为分析气室，另一个作为参比气室，可测定参比气与分析气中CO2浓度之差。 2、IRGA法测定光合速率的气路系统 IRGA是测定CO2浓度的专用仪器，不能直接测定植物叶片的光合速率，必须根据IRGA的性能和测定目的，将IRGA与同化室组成一定的气路系统，才能进行叶片光合速率的测定。 常用的气路系统有密闭式和开放式两种。 (1) 密闭式气路系统：被测定植物 或叶片密闭在同化室中，不与同化室外 发生任何的气体交换，同化室内的CO2 浓度因光合作用而逐渐下降，可用IRGA 连续监测同化室内CO2浓度的下降速 率，根据叶片面积，同化室体积计算光 合速率。 (2)开放式气路系统：该系统用双气 室IRGA，以气泵为动力，将流经同化室 前的空气(参比气)泵入一个气室，流经 同化室后的空气(样本气)泵入另一个气 室(分析气室)，最后将气体排空，由仪器 指示参比气和样本气的CO2浓度差，根据 流量、同化室中叶片的面积，求出叶片的 光合速率。 密闭系统斜率法 原理 把IRGA与光合作用同 化室连接成密闭的气路系 统。将植物材料密封在透明 的同化室内，给以适当的光 照，同化室内CO2浓度将因 植物光合而下降，用IRGA 配以适当的记录仪可绘出 同化室内CO2浓度随时间 下降的曲线。在同化室不漏气、光强度稳定、室内空气不断得到搅动的情况下，该曲线将是一条平滑曲线，在曲线的任一点作切线，即可根据切线的斜率，密闭系统的容积和同化室中叶片的面积求出在该点CO2浓度下的光合速率。 密闭气路光合测定装置：将QGD-07型红外线CO2气体分析仪、XWT-2~型自动记录仪、MXQ型气体取样器(图3)、光合作用同化室、温度转换器(测温探头可放在同化室内，输出信号接记录仪)或半导体点温计、橡皮管(内径6~7mm)、塑料气球，按图4所示连接成套，放在一辆医用小推车上。 量子辐射照度计：叶面积仪；铁架台(带万能夹)；0~50℃温度计(用以校正叶室温度)；剪刀；带盖搪瓷盘；纱布；小纸牌数个；记号笔；2号干电池(放在同化室手柄内，用作同化室风扇电源)或3V直流变压器。 试剂 无水氯化钙(或无水硫酸钙)；烧碱石棉(10目)或碱石灰。 方法 (一)光合速率的测定 图4 XMB—1型光合测定仪气路连接示意图 1．安装仪器 (1)将安装好的密闭气路光合测定装置安放在靠待测植株1~2m处，接通红外仪、记录仪、取样器、温度转换器的供电电源。打开红外仪电源开关预热1~2h，红外仪量程开关置于I档(0-500?l/L)。把红外仪和温度转换器的信号输出与记录仪的两个信号输入接线柱用导线接通。旋转记录仪第一支笔量程选择开关于10mV位置(与红外仪输出信号电压匹配)，旋转记录仪第二支笔量程选择开关于2V位置(与温度转换器输出温度0~50℃信号电压匹配)。 (2)打开取样器顶部面板，取出过滤管装满烧碱石棉后复原，取出干燥管装满无水氯化钙后复原，取下连接取样器的气球，用口吹气至半满后复原。 (3)将同化室用试管夹固定在铁架台上，置待测植株前。 2．调、校仪器 (1) 红外仪预热完毕后，开启记录仪电源开关、记录仪信号输入开关和取样器前面 板上的气泵开关，将取样器F1旋钮置“零气”位置，F2旋钮置“测量”位置，开始调整红外仪的零点(此时无CO2无水分的零气循环经过红外仪)，约1~2min，调节红外仪的 调零旋钮使指针稳定在“0”点位置，稳定后，调节记录仪第一支笔的“调零”旋钮使记录笔到零点位置，红外仪调零完毕。 (2) 拔下红外仪进气口处的橡皮管，改接CO2标准气(已知准确CO2浓度)钢瓶，出气口放空，让标准气流经红外仪分析气室(流量以1L／min左右为宜)开始校正，此时红外仪指针应指在标准气浓度所对应的刻度(μA值)上，否则可调节红外仪“校正”旋钮，使其达到。校正完毕后恢复原气路。 (3) 把玻璃温度计感温端与叶室内的温度转换器探头放在一起(注意遮荫)，从玻璃温度计上读出温度，迅速旋转记录仪第二支笔的调零旋钮，使记录笔置该温度所对应的位置，校正温度。 3．测定 (1) 旋转取样器面板上F1旋钮至“测量”位置，把叶片平展放入同化室后关闭同化室(注意勿让操作者呼出的气体进入叶室)，开启叶室风扇。观察记录笔开始左移时，迅速旋转记录仪“走纸变速”开关至合适档(以所划曲线与走纸方向的夹角45°左右为宜)，开始记录CO2浓度变化(此时记录笔应从350μl／L左右开始记录)和温度变化，用铅笔在记录纸上记下所测叶片的编号、走纸速度，用量子辐射照度计测量所测叶片的受光强度(光子通量密度)并记录，待记录笔左移至310μl／L左右时，关闭走纸开关，停止记录，第一次测定完毕。 (2) 旋转取样器面板上的F2旋钮至“补充”位置后，迅速复原，让气球内的高浓度 CO2气进入同化室以补充CO2浓度至350μl／L左右，观察记录笔左移后迅速开启走纸开 关，进行第二次重复测定，测量光照强度并记录，当记录笔左移至310μl／L左右时，关 闭走纸开关，第二次重复测定完毕。如此再进行第三次重复测定。 (3) 三次重复测定完毕后，关闭同化室内风扇，用记号笔在叶片的叶室内外相交处 作标记，打开叶室，剪下叶片的测定部分，用纸牌编号后包在湿纱布内并放置于带盖搪 瓷盘内，待测叶面积。然后再测定第二张叶片的光合速率。 (4) 测定结束后，用叶面积仪测定各叶片面积(如有便携式叶面积仪，可在测定光 合后，立即测出叶面积)。 4．计算 (1)IRGA的μA-CO2μl／L-CO2μl／(L·μA)对照表的制作(该部分可由教师预先完成)。 QGD-07型IRGA表头读数(μA)与CO2浓度(μL/L)为非线性关系，厂方提供的标定曲线使用不方便，为了计算需要，需求出标准曲线各点上每变化1μA所代表的CO2浓度变化率[CO2μl／(L·μA)，即曲线在各点的斜率]。用配方程法将厂方标定仪器时取得的μA（X）- CO2μl/L（Y）对应数据进行多项式回归，配以理想方程，并求该方程的一阶导数方程，然后将X值（μA）1～50的整数代入理想方程和导数方程，分别计算Y和Y’值，即可求出各μA值所对应的μL/L值和斜率[CO2μl／(L·μA)]。 将各X、Y、Y’值列成对照表备计算用。 北京分析仪器厂新研制的GXH-305型红外线CO2气体分析仪已将表头输出与CO2浓度的关系线性化，可免去这一步计算。 (2)计算任一CO2浓度下的CO2 浓度变化率 首先确定计算光合速率时的环境 CO2浓度，一般可确定为大气CO2浓度 320~340μl／L，在记录纸的每张叶片 所记录的三次重复曲线上分别找出所确 定的浓度点P(图5)，在该点对每条曲 线作切线(若该点前后记录线是一直线， 则可画一条与其重合的线)，将切线延 长，使其跨越一固定的μA值，标出线段 AB，由A及B点分别作平行和垂直于基 线的线段AC及BC，使相交于点C，构成直角三角形ABC，其中BC为走纸长度L(mm)，L除以走纸速度v(mm／min)，即得时间t(min)。三角形AC边代表在时间t内表头读数的变化n(μA值)，由制好的对照表中查出P点(μA值)所对应的斜率r[CO2μl／(L·μA)]，则在该P点CO2浓度变化率R为：  (3)计算光合速率 光合速率可用下列公式求得：  式中 Pn一净光合速率(单位为μmol·m-2·s-1)； V一系统容积(包括同化室、红外仪气室、管路等的容积，单位为升)； R—P点的CO2浓度变化率[单位为μl／(L·min)]； S一叶面积(单位为m2)； P—气压(单位为MPa)； t--同化室内温度(由记录纸上读出，℃)。 计算出同一叶片三次重复的光合速率后，求其平均值可作为该叶片的净光合速率。 5.注意事项 (1)密闭系统的最基本要求是严格密闭，不能漏气，否则无法测定。 (2)红外仪的滤光效果并不十分理想，水蒸汽是干扰测定的主要因素，因此，取样器干燥管内的CaCl2要经常更换，更要避免CaCl2吸水溶解进入分析气室。分析气室是红外仪的要害部件，价格昂贵，一旦被具有腐蚀性的CaCl2饱和溶液污染便无法正确测量，应特别注意保护。 (3)该方法也可用于测定植物群体的光合速率，但需将单叶同化室换成群体同化室。 可用钢筋焊成长方体框架，覆以两端开口的透明塑料薄膜(上端的一侧要长出一段，以 便测定时密封顶部)，框架的顶部吊2-4个玩具风扇用以混匀室内空气，将进出气管和测温探头吊在室内(管口勿靠在一起)。测定时，底部的塑料薄膜用土埋好，顶端一侧长出的薄膜覆盖好顶部后，用铁夹将四周夹好(注意不能漏气)即可，其他与单叶光合测定方法相同。 (二)呼吸速率的测定 1、2同“光合速率测定方法”1、2。 3．测定：旋转取样器面板上F1旋钮至“测量”位置，把叶片平展放入叶室并关闭叶室(勿让操作者的呼吸气进入叶室)，用黑布将叶室包严密并用铁夹夹紧使其不透光，开启叶室风扇。观察记录笔开始右移时，迅速旋转记录仪的“走纸变速”开关至合适档，开始记录(此时记录笔应从320 μl/L左右开始，若CO2浓度太高，可旋转取样器面板上F1旋钮至“调零”位置，使空气流经烧碱石棉管，将叶室内CO2吸收至320μl／L以下，再恢复至“测量”位置)，待记录笔右移至360 μl／L左右时，停止记录。以下同上述光合测定方法(3)、(4)。 4．计算 呼吸速率(Rr)计算同光合速率测定方法4 (三)CO2-光合曲线的测定 利用密闭气路CO2斜率法，测定CO2-Pn曲线十分方便，步骤如下： 1、2同“光合速率测定方法”l、2。 3．测定 旋转取样器面板上的F1，旋钮至“测量”位置，把叶片平展放入同化室并关闭同化室。开启风扇，红外仪量程开关至Ⅱ档(0-1000 μl／L)，旋转取样器面板上F2旋钮至“补充”位置，向同化室内补充CO2气体，观察记录笔右移至近满刻度时，恢复F2至“测量”位置。待记录笔缓慢均匀左移时，开启走纸开关至合适档，每隔2~3min测量记录一次光强度，待记录笔画出的曲线大致与基线平行时，停止记录，关闭风扇。打开叶室，剪下叶片的测量部分，挂牌编号后包于湿纱布中，并置搪瓷盘内。如此测量5个叶片。在叶面积仪上测量、记录各叶片面积。 4. 计算 按光合速率测定方法4(2)所述，在记录纸的每一条长曲线上，选10个以上的点，分别计算各点斜率R值与光合速率Pn，再根据各点的μA值在对照表上查得相应的CO2浓度，即可得到10组以上的CO2-Pn对应值。以CO2浓度为横坐标，Pn为纵坐标即可画出CO2-Pn曲线。该曲线的直线部分之初始斜率，称为叶片导度，也可近似地看作羧化效率；将曲线内推找出曲线与横坐标的交点，即净光合速率为零时的CO2浓度，此浓度即为CO2补偿点；再内推至与纵坐标相交，此交点为无CO2空气中的CO2释放速率，可代表光呼吸速率(严格地讲应为光、暗呼吸之和)。也可在曲线的直线部分用计算机建立直线回归方程，求得直线方程的斜率为叶片导度；x=0时的y值(负值) 为光呼吸速率；y=0时的 x值为CO2补偿点。 图 6 CO2同化速率对光强度的响应曲线 5．注意事项 (1)测定CO2一Pn曲线要求光强度和温度稳定，可在人工光源和控温条件下进行。 (2)若专为测定CO2补偿点及光呼吸，可不必从高CO2浓度做起，除红外仪改用I档外，还可通过取样器的F1旋钮，将同化室内CO2浓度降低。 密闭系统落差法 原理 在密闭的系统中，由于同化室中的叶片进行光合作用后，系统中的CO2浓度不断下降，可用固定时间内同化室中CO2浓度的减少量或CO2浓度减少某一固定量所需的时间表示叶片对CO2的吸收速率，最后根据叶片面积和同化室体积计算光合速率。此法每一次测定仅须在数字万用电表上进行两次读数，省去了记录仪，大大减轻了成套设备的重量。 仪器 GXH-305型红外线CO2分析仪(或QGD-07型红外仪，使用该红外仪需要配用MXQ-气体取样器和数字万用电表)；电子秒表；同化室(根据需要自制，内装两个小风扇和一个测定温度的传感器)；量子辐射照度计。 试剂 烧碱石棉或碱石灰。 方法 1．按要求将气路系统的各部分连接起来，若使用QGD-07型红外仪，把数字万用电表上选择开关旋至200mV电压档上，与红外仪0~200mV输出相连接。 2．接通电源，打开红外仪电源预热1~2h，打开气泵电源，将红外仪后面板的切换阀旋到“0”状态，此时红外仪通入无CO2气体，调节红外仪“调零”旋钮，显示在“零点”位置，并观察零点的稳定性。待仪器稳定后，将切换阀旋到“1”状态。 3．将待测叶片放入同化室，密闭后开启同化室内的风扇，当CO2浓度稳定下降时，开始测定，读取开始的CO2浓度值C1，开始计时，CO2下降至C2(约下降20~30ppm)，终止计时，记录C1、C2、△t(或固定测定时间，记录CO2变化值)，并同时用量子辐射照度计测量叶片受光强度，记录同化室内的温度。一次测定完成之后，向同化室内补充CO2，进行重复测定(使用MXQ取样器，补充CO2操作见密闭气路斜率法)。 4．测定结束，用叶面积仪测量叶片的面积。 5．计算光合速率  式中 Pn一光合速率(单位μmol·m-2·s-1)； △C—CO2浓度落差（C1一C2）(μL/L)； △t—测定时间(单位s)； S一叶片面积(单位m2)； V一同化室(包括气路系统)体积(单位L)； T—同化室的温度（单位℃）； P—大气压(单位MPa)。 密闭气路落差法测定装置除了进行光合速率测定外，也能够进行呼吸速度，CO2-光合速率曲线的测定。测定步骤同光合速率测定方法。更换群体同化箱，可以进行群体光合速率的测定，测定步骤略。 开放式气路系统 原理 把双气室红外仪与同化室连接成开放式气路系统，供给同化室CO2浓度稳定的气源，将叶片夹入同化室，给以适当的光照，待仪器测定的参比与分析气室CO2差值稳定后，记录CO2差值，精确测量同化室的流量，再根据叶片面积求出光合速率。 仪器与用具 双气室IRGA；开放式同化室；气泵；量子辐射照度计。 也可应用以开放式气路原理设计制造的成套光合作用测定系统，目前使用的型号主要有：TPS-1、CIRAS-l、LI-6400、LCA-3、LCA-4等。 方法 (一) 光合速率的测定 1．预热红外仪，用参比气体调节两气室平衡。 2．供给同化室CO2浓度稳定的气源，选取代表性叶片夹入同化室，调节供给同化室的流量。流量的大小根据叶片面积和光合速率来确定，一般把CO2差值控制在5~30μL／L的范围内较好。 3．选取待测叶片夹入同化室，40秒钟之后观察参比气与分析气CO2差值，当△C稳定后记录结果。 4．根据△C值、流量(F)和叶片面积计算光合速率：  式中 Pn一光合速率(单位μmol·m-2·s-1)； △C—CO2浓度落差（C1一C2）(μl／L)； F—叶室流量(ml／min)： S—叶片面积(单位m2)： t—同化室的温度（单位℃）； P—大气压(单位MPa)。 ［附注］ TPS-1光合作用测定系统操作方法 (1)．连接叶室，气路R、A与主机上的接口(R、A)对应连接。 (2)．打开主机电源时显示的第一个菜单是主菜单： 1REC 2CAL 3DMP  4CLR 5CLK 6DIAG  按1进入测定模式显示： SET PLC 1：BROAD  2：UNIVERSAL   1 REC：M/A 2 INT：001  FLO：300   1 LIGHT=SUN (or LAMP)  2 LEAF AREA=05.0   1P：01 R：01  FREE RECORDS nnn   Cnnnn +/-nnn Qnnnn  Hnn.n +/-nn.n Tnn.n   Enn.nn Gnnnn Tnn  A+/-nn.n CInnnn   在测定状态下按1/2/3返回到设置菜单；1用于改变记录方式；2用于改变光源或叶面积；3用于改变小区号。修改完毕，返回测定状态，按“Y”键。 (3)选择待测叶片夹入同化室，给以适当的光照，观察△CO2值变化，待△CO2值稳定后(40秒左右)按X(转换键)观察记录结果，或按[0/R]，存储测定结果。一个叶片的测定结束，进行另一叶片的测定。 测定结束，按N键返回到主菜单，关机。 表1 测定结果记载表 实验材料        CO2浓度        光强度        温度        蒸腾速率        气孔导度        叶片温度        光合速率        细胞间隙CO2浓度         (二) 光-光合曲线和表观量子效率的测定 选取叶片夹入同化室，用不同层数纱布控制照射到叶室上的光子通量密度(PFD)，光照由强至弱，每改变一次PFD测定一次光合速率，用PFD与对应的Pn绘制响应曲线。该曲线在弱光区(约为200??mol·m-2·s-1以下，因不同植物而异)应为直线。用作图法或配直线方程法求出直线线段的斜率即表观量子效率。 光响应曲线的初始斜率可以看作为表观量子效率，“表观”这个词很重要，因为这个数值是根据入射的光强度制做的，而不是实际叶片吸收的光合有效辐射。只有把反射和透射光除去，才能得到真正的量子效率。 进行光-光合曲线测定时，必须由强光到弱光，否则，每增加一定的光强，叶片需在该光强下适应较长的时间才能达稳衡值。 (三)光呼吸速率的测定 植物的光呼吸是消耗O2释放CO2的过程，只有在照光的情况下发生，其底物是新形成的光合产物，代谢途径和反应所在的细胞器与暗呼吸不同。过去曾认为光呼吸是单纯消耗光合产物的过程，有害无益；现在已有越来越多的研究证明，在强光和其他逆境同时存在的情况下，光呼吸有耗散过剩能量、加快碳同化及相关过程的运转、保护光合器免受逆境伤害的作用。 测定光呼吸的方法很多，较理想的方法是低氧下CO2同化法。光呼吸是需氧代谢过程，随氧浓度的增加，光呼吸受到促进：而在低氧(2％)条件下光呼吸被抑制。因此，测定叶片在低氧空气(O2 2％，CO2 350u1/L)中与正常空气(O2 21％、CO2 350u1／L)中CO2同化速率之差即为光呼吸速率。 操作方法 (1)低氧(2％)气体的配制：取市场销售的塑料薄膜，制成大的气袋。用空气、N2和CO2气体配制低氧气体贮藏于气袋中。取9分N2，加正常的空气1分，再补入CO2，把配制的气体通入IRGA测定CO2浓度，如果CO2低于空气中含量，再补充纯的CO2，最终凋节CO2浓度使与正常空气中的浓度相等。 (2)选取叶片测定正常空气下的光合速率与低氧下的光合速率，二者之差为光呼吸速率。 开放式气路除进行以上测定内容外，也可以调节供给气体中的CO2浓度，进行CO2-Pn曲线的测定，方法略。 思考题 1．在光合速率的测定过程中，哪些步骤容易出现误差?应怎样避免? 2．利用开放式气路，怎样测定植物叶片的CO2-光合曲线、CO2饱和点与补偿点， 计算羧化效率? 3．密闭式气路同化室的大小对室内CO2下降速度、气孔反应的滞后、同化室内的微 环境和光合速率有何影响?设计同化室应注意哪些方面的问题? 附录： GXH-305、3051型红外线分析器的使用： 由交流220v50Hz ，经12v1A直流稳压电源供电时的启动操作步骤如下： a. 将后面版左上角开关打向外接电源，并将直流12V1A电源插头插入外接电源插座内。 b. 按下前面版右上角电源开关（红色），左下角泵开关（绿色）为关状态，预热15min，此时液晶数显表头显示值为残留在气室内的CO2气体浓度值。显示单位PPm（ul）CO2。 c. 调零：将后面版上的切换阀旋到“0”状态，开泵约1-2min 液晶数显表头的显示值趋于零点附近，此时打开调零电位器上的锁紧开关将显示值调到0.000。 d. 校跨度：关上泵，将切换阀旋到“1”状态并将标准气以0.5-1L/min的流量通入进气咀内，经出气咀排出，约一分钟左右显示值稳定后，打开灵敏度（跨度）旋钮上的锁紧开关，将显示值调到与标准气一致，然后将灵敏度旋钮锁紧。 e. 气路连接： 开路系统 大气→叶室（或呼吸室）→干燥管→进气咀（切换阀3—2—过滤→气泵 →流量计→气→切换阀）→出气咀→放空 闭路系统 叶室→干燥管→进气咀→出气咀→储气瓶→叶室 f. 测量： 测大气中的CO2浓度：打开前面版上的电源开关和气泵开关数分钟，待液晶数显表头数值稳定后，记录此值为C1，将待测叶加入叶室，测量数分钟后 数显稳定后记为C2，然后将数据代入公式进行计算。 4.3 抗坏血酸氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定 原理 1．抗坏血酸氧化酶在有氧情况下，能把抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，同时促使其氢与空气中的氧结合成水。 抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适pH及适宜的温度下，向反应瓶中加入一定量的底物(抗坏血酸)及酶提取液，让酶作用一段时间，然后测定底物被消耗的数量来计算酶的活性。 抗坏血酸被消耗的量，则可用碘液滴定剩余的抗坏血酸而测定之。 KIO3+5KI+6HPO3 3I2+6KPO3+3H2O 2．多酚氧化酶在氧的存在下，可将多酚类物质氧化为相应的醌，醌又能进一步氧化抗坏血酸。这种氧化还原关系是由于酚类物质与抗坏血酸之间的氧化还原电位差异而决定的。酚类物质比抗坏血酸的氧化还原电位高；因而邻醌能夺取抗坏血酸上的氢使自身得以还原。 因此，多酚氧化酶的测定与抗坏血酸氧化酶的测定类似，除了向反应体系中加入多酚氧化酶的底物（多元酚类），还要加入抗坏血酸。多酚氧化酶的活性，可以间接由抗坏血酸的消耗量求得。 仪器设备 研钵：1个； 2. 50ml量瓶：1个； 3. 50ml三角瓶：6个；4. 微量滴定管：1支； 5. 5ml移液管2支，2ml1支，1ml1支；6. 恒温水浴锅 试剂 pH6.0的磷酸盐缓冲液：A液为1/15mol/L磷酸氢二钠溶液；B液为1/15mol/L磷酸二氢钾溶液。取A液10ml与B液90ml混匀即可。 0.1%抗坏血酸，试验当天配制。 0.02mol/L焦儿茶酚：称取0.22g焦儿茶酚溶于100ml水中，试验当天配制。 10%偏磷酸（按纯偏磷酸计算）。 1%淀粉溶液。 5/6mmol/L碘液，碘化钾2.5g溶于200ml的蒸馏水中，加冰醋酸1ml，再加0.1mol/L碘酸钾（0.3567g碘酸钾溶于水中，定容至100ml）12.5ml，最后加蒸馏水成250ml。 材料 马铃薯块茎、甘薯块根、植物叶片。 方法步骤 1．酶液提取： 称取新鲜样品(叶子用2g，马铃薯块茎用2g)剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH6.0的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆(事先将缓冲液冷却，不使研磨时温度增高)，把全部材料用缓冲液洗入25ml量瓶中，并用缓冲液定容至刻度。放在18-20℃水浴上浸堤30min，中间摇动数次。将上清液(酶浸提液)倾入干净的三角瓶中备用。 2．酶活性的测定： 取6个50ml洗净干燥的三角瓶，标上号码。按下表先在各瓶中加缓冲液、抗坏血酸及焦儿茶酚；并向3及6号瓶加入1ml偏磷酸。将三角瓶放入18-20℃水浴中，使内外温度平衡。然后每隔2min向各瓶中依次加入酶液2ml，准确记录加入酶液的时间。将各瓶在18-20℃水浴保温5-10min后，立即按原次序向1、2、4、5号瓶各加入偏磷酸1ml，以终止酶的活动。待反应瓶冷却后，各加淀粉溶液3滴作指示剂，用微量滴定管以5/6mmol碘液进行滴定至出现浅蓝色为止。记录滴定值。 试剂 （ml） 瓶 号 缓冲液 抗坏血酸 焦儿茶酚 偏磷酸 酶溶液 偏磷酸 (保温一定时间后) 备 注  1 4 2   2 1 测抗坏血酸 氧化酶  2 4 2   2 1 同上  3 4 2  1 2  空白测定  4 3 2 1  2 1 测定抗坏血 酸氧化酶及 多酚氧化酶  5 3 2 1  2 1 同上  6 3 2 1 1 2  空白测定  3．酶活性的计算： 酶活性以每克鲜组织每分钟氧化抗坏血酸的毫克数表示。计算方法如下。 (1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算： 抗坏血酸氧化酶活性[氧化抗坏血酸毫克数/(克鲜重·分)] =0.44 V× [ V′-( V 1+V 2)/2] ×(awt)-1 式中：V′=滴定3号空白所用去的碘液毫升数； V1=滴定1号瓶所用去的碘液毫升数； V2=滴定2号瓶所用去的碘液毫升数； 0.44=每毫升5/6mmol碘液氧化抗坏血酸毫克数； V=提取液总体积（ml）； a=测定时所用提取液的ml数 w＝样品鲜重(g) t＝测定时间(分)。 (2)多酚氧化酶活性：由于酶提取液中，包含有抗坏血酸氧化酶，在测定多酚氧化酶的反应系统中(4、5、6号瓶)抗坏血酸的消耗量是两种酶作用的结果，因而在计算多酚氧化酶活性的时候，必须减去抗坏血酸氧化酶的活性。 多酚氧化酶的活性按下式计算： 多酚氧化酶活性[氧化抗坏血酸毫克数/(克鲜重·分)] 式中，V〞＝滴定6号空白用去的碘液毫升数； V3 ＝滴定4号瓶用去的碘液毫升数； V4 ＝滴定5号瓶用去的碘液毫升数； 其余符号意义同前。 思考题 多酚氧化酶活性测定实验中计算多酚氧化酶活性时为什么要减去抗坏血酸氧化酶活性？ 测定多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性时加入偏磷酸的作用是什么？ 多酚氧化酶的活性对果品的品质有无影响？为什么？ 4.4 水溶性碳水化合物的测定 一、蒽酮法 原理 糖在浓硫酸的作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，如： 生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成兰绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测定所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣，加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。 仪器与用具 分光光度计；水浴锅及水浴试管架；电炉；大试管（2.5×20cm），大试管架；刻度吸管5ml、1ml；记号笔；吸水纸适量。 试剂 1．蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中。在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。 2．浓硫酸（比重1.84） 3．1%蔗糖标准液：将分析蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000克，加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。 4．100mg/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水至刻度。 方法 1．标准曲线的制作 取大试管11支，从0~10分别编号，按表1加入100mg/L蔗糖溶液和水，配成从10~15mg/L的系列标准液，除空白外，各浓度均重复二次。 加完溶液后，按顺序向试管内加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸。浓硫酸要沿管壁缓缓加入，然后将试管轻摇一下，待乙酸乙酯水解后，再充分摇动试管数次（注意勿将硫酸浅出），使液体混匀，立即放入沸水浴中准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。并求出标准曲线的直线的方程。 表1各试管加入试剂量 管 号 0 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10  100mg/L蔗糖（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0  水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0  蔗糖加入量（μg） 0 20 40 60 80 100  2. 可溶性糖的提取：取新鲜植物叶片，擦净表面污物，称取0.1~0.3 g叶片，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5~10 ml 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 3．样品测定：准确吸取样品提取液或水解液2ml于大试管中，2ml样品液中总含糖量应在20-100μg之间，若超出此值，则应稀释样品液（或减少样品液用量，然后加水使液体总量达到2ml），以下步骤与标准曲线测定相同。根据所测光密度查标准曲线，即可得出每ml样品液中碳水化合物总量。 4.计算可溶性糖含量： 可溶性糖含量（％）＝C×V/(106×a×n×W) 式中C－标准方程求得糖量（?g） V－提取液量（ml） a－吸取样品液体积（ml） n－稀释倍数 W－组织重量（g） 二、苯酚法 原理 苯酚法的测定原理与蒽酮法相同。糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糖醛，能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。在10-100μg范围内颜色的深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 与苯酚法相比，蒽酮比色法有许多缺点，蒽酮试剂较贵，而且蒽酮在硫酸中不稳定，也不能用于甲基化的糖和戊糖的测定。而苯酚比色法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的比色测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，因而简化了糖的提取程序，而且苯酚法产生的颜色稳定，可以稳定在160min以上。 试剂 1．90%苯酚溶液 称取90g苯酚，加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月。 2．9%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现用现配。 3．浓硫酸 其它试剂见蒽酮法。 方法 1．标准曲线的制作 取大试管11支，从0~10分别编号，用100μg/ml的蔗糖溶液，按表1配制一系列浓度的蔗糖溶液，每一浓度设两个重复。然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面在5~20秒时间内加入5ml浓硫酸，摇匀比色液总体积为8ml。在室温下放置30min显色，然后以空白为参比，在485nm波长下比色，测定光密度，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准线性方程。 表1各试管加入试剂量 管 号 0 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10  100ug/ml蔗糖液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0  蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0  蔗糖加入量（μg） 0 20 40 60 80 100  2. 可溶性糖的提取：同蒽酮法 3．样品的测定 取2ml样品提取液，加入20ml大试管中，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的含量，计算可溶性糖的酚含量。 4.计算可溶性糖含量：同蒽酮法 水溶性碳水化合物的测定程序： 1．配制试剂及标准蔗糖溶液。 2．制作标准曲线或建立直线回归方程。 3．植物样品中碳水化合物的提取与测定步骤： 称取磨碎烘干的小麦茎鞘材料200mg，2份 ↓ 分别放入两支大试管中，加蒸馏水10～20ml于沸水中提取30分钟（提取2次） ↓ 提取液分别过滤入100ml容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度 ↓ ↓ ↓ 吸取5ml样品液加入50ml容量瓶中定容 全部残渣用2%HCl洗回原大试管中总体积20ml ↓ ↓ 吸取样品液2ml于大试管中（重复4次） 沸水中分解3h ↓ ↓ 两重复为一组，分别用苯酚法与蒽酮法 过滤于100ml容量瓶中，用蒸馏水漂 测定还原糖 洗残渣数次，于容量瓶中定容至刻度 ↓ ↓ 计算单位糖含量（水溶性糖） 吸取5ml提取液加入50ml容量瓶中，定容 ↓ 每份样品取2ml于大试管中（4次重复）， 每两重复为一组，分别用苯酚法及蒽酮法 测定还原糖 ↓ 计算单位糖的含量（稀酸溶性糖） 5. 植物激素 5.1 植物组织培养技术 一、植物组织培养的一般技术 原理 植物细胞具有全能性，即每个植物细胞包含着能产生完整植株的全部遗传基因。从理论上讲，只要条件合适，包含着全部遗传基因的细胞都能分裂分化，产生完整的植株。 仪器及试剂 为了便于工作，最好设有专门的实验室（供器具洗涤、干燥、配制药剂及培养基等用）、无菌室（或接种室）、培养室（培养材料用）和灭菌室等，以及各室工作所需要的各种设备和仪器，如培养室中有自动调温和照明设备，实验室有冰箱、保温箱、分析天平、蒸馏水器、离心机、细菌过滤器和玻璃器皿及用具等。 本次实验所用仪器和用具有： 1.天平（药物天平、单盘天平和分析天平）；2. 高压灭菌锅；3. 三角瓶；4. 容量瓶；5. 移液管；6. 酒精灯；7. 长柄镊子8. 解剖刀；9. 烧杯；10. 剪刀；11. 培养皿；12. pH试纸；13. 超净工作台；14. 棉花、线绳、吸水纸、纱布、油纸若干 试剂： 通常植物组织培养工作中所用化学药品有两种、一类是消毒剂；另一类是作为培养基组成成分的化学药品。 消毒剂有 ①新洁尔灭（2%），它是用于无菌室的地面、墙壁、桌面和椅子等用具的消毒灭菌； ②高锰酸钾和甲醛，一般用于接种室的熏蒸； ③用于材料表面消毒剂有升汞、硝酸银、次氯酸钙、次氯酸钠、溴水、H2O2及75%酒精等。培养基组成成分的各种无机盐类和有机化学试剂等，详见培养基配制一节。 材料 大田或温室等生长的植物部分（根、茎、叶、花、幼果或子叶胚轴等）皆可。 步骤 1. 培养基的种类、成分及配制 培养基的成分：植物组织培养所采用的培养基大体包括五类成分。 （1）无机盐，这是满足植物生长所要求的必需大量元素如N、P、K、S、Ca、Mg及微量元素Cl、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co、Fe等。 （2）碳源：一般以2~4%蔗糖为好。 （3）维生素类物质：维生素B1（即盐酸硫胺素）似乎是必要的维生素，常用的还有VB6（盐酸吡哆醇）、烟酸和肌醇等。这类物质的常用量为：VB1 0.1~10mg/L；VB6 0.1~1.0mg/L；肌醇一般用量为50~100mg/L；烟酸、叶酸一般为0.5~5.0mg/L。 （4）生长调节剂：最常用的是低浓度的生长素（IAA）、α-萘乙酸（NAA）、2，4-D和激动素（KT）、BA等。这些物质的适宜浓度为：IAA10-5~10-10mol/L、以1~10mg/L为最常用；2,4-D是10-5~10-7mol/L；萘乙酸（NAA）适宜浓度范围比前者高，常用10-3~10-7mol/L；激动素（KT、BA）的最适浓度为10-6~10-7mol/L。 表1：植物组织培养常用培养基的矿质成分（mg/L） 矿质盐类 MSa ERb HEc N6d 改良Whitee   大 量 元 素 NH4NO3 1，650 1，200  463    KNO3 1，900 1，900  2，830 80   CaCl2·2H2O 440 440 75 166    MgSO4·7H2O 370 370 250 185 720   KH2PO4 170 340  400    Ca(NO3)2·4H2O     300   Na2SO4     200   NaNO3   600     NaH2PO4·H2O   125  16.5   KCl   750  65   微 量 元 素 KI 0.83  0.01 0.8 0.75   H3BO3 6.2 0.63 1.0 1.6 1.5   MnSO4·4H2O 22.3 2.23 0.1 4.4 7   ZnSO4·7H2O 10.6  1.0 1.5 3   Zn(螯合的)  15      Na2MOO4·2H2O 0.25 0.025      CuSO4·5H2O 0.025 0.0025 0.03  0.001   COCl2·6H2O 0.025 0.0025      AlCl3   0.03     NiCl2·6H2O   0.03     FeCl3·6H2O   1.0     Na2EDTA 37.3 37.3  37.3    FeSO4·7H2O 27.8 27.8  27.8    Fe2(SO4)3     2.5   (5)有机附加物：包括蛋白质水解物、酵母提取物、麦芽提取物和椰子乳等，它们不是一切组织培养所必需的；但加入以后，可以起较好的作用。 培养基的种类：在长期的组织培养中根据不同材料和目的，科学工作者设计了许多不同种类的培养基，最常用的培养基名称及其成分见下表：(表2) 表2 常用培养基有机成分（mg/L） 药剂 MS ER HE N6 改良White  肌醇 100  100  100  烟酸 0.5 0.5  0.5 0.3  盐酸吡哆醇 0.5 0.5  0.5 0.1  盐酸硫胺素 0.4 0.5 1.0 1.0 0.1  甘氨酸 2.0 2.0  2.0 3  D—泛酸钙   2.5    半胱氨酸   10    尿素   200    氯化胆碱   0.5    吲哚乙酸 1~30   0.2   萘乙酸  1.0     激动素 0.04~10 0.02 0.25 1.0   2，4—D   1.0 2.0   蔗糖 30000 40000 20000 50000 20000  琼脂 10000   10000 10000  pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.6  注：a、MS(MurashigeSkoog)培养基(1962年)，原来是为培养烟草细胞设计的，目前应用较广泛。 b、ER(Eriksson)培养基(1965年)，与MS培养基相似。 c、HE(Heller)培养基(1953年)，在欧洲得到广泛使用。 d、N6培养基(1974年)，是中国科学院植物研究所的科研人员自行设计的，适于禾谷类植物花药和花粉的培养。 e、改良White培养基（1963年），在早期多采用，它是为培养离体根而设计的。 本次实验选用MS培养基的无机成分作为基本培养基，蔗糖为3％，琼脂为0.5~1％，pH5.8；附加成分有α-萘乙酸、激动素和VB1、VB6、烟酸和肌醇。 经常使用的培养基，可先将各种药品配制成10倍或100倍的母液，放入冰箱中保存，用时按比例稀释，一般配成大量元素、微量元素、维生素、铁盐母液，植物激素的配制先配制一定浓度，用时按量吸取。母液的配制原则：是将能合并的合并起来，不能合并的则单独配制，配成一定的浓度，便于保存。这次共配九种母液。 ①3.4g KH2PO4；0.124g H3BO3；16mg KI；5mgNa2MoO4?2H2O用无离子水溶解后定容至200ml。 ②0.5mg CoCl2?6H2O；7.4g MgSO4?7H2O；0.446g MnSO4?H2O；0.172g ZnSO4?7H2O； 0.5mg CuSO4?5H2O 用无离子水溶解后定容至200ml。 ③0.746g Na2-EDTA；0.556g FeSO4?7H2O用无离子水溶解后定容至200ml。 ④33g NH4NO3在蒸馏水中溶解后定容至200ml。 ⑤38g KNO3在蒸馏水中溶解后定容至200ml。 ⑥8.8g CaCl2?H2O用少量蒸馏水溶解后定容至200ml。 ⑦2g 肌醇；10mg烟酸；10mg VB1；5mg VB6用少量蒸馏水溶解后定容至200ml。 ⑧α-萘乙酸：精确称取α-萘乙酸20mg，先用少量乙醇溶解，然后逐滴加水定容至200ml。 ⑨激动素：精确称取激动素（KT）20mg溶于少量1mol/LHCl中，再加蒸馏水定容至200ml。 母液配好后，应放在冷凉无光的条件下或冰箱中保存。每次配制的母液最好在一月内用完，生长素类试剂最好随配随用，存放时间不得超过10天。 培养基的制作：在制作培养基时，先吸取上述母液①-⑦号各5ml置容量瓶中再加入15g蔗糖，溶解后，加母液⑧10ml⑨10ml，混匀后加蒸馏水至450ml左右，用0.5N NaOH调pH至5.8并用试纸检验。pH调好后，加水定容至500ml。然后将混匀的溶液倾入烧杯中，加入琼脂5g，在电炉上加热融化（如果琼脂质量不好，含杂质较多时，可事先在水中浸泡，清洗后使用）。待琼脂彻底融化后，就可以开始分装。 培养基的分装：将制作好的培养基分装到组织培养用的三角瓶中，分装时，应在三角瓶口放—漏斗，小心地将培养基倒入三角瓶中，以免瓶口沾上培养基容易引起污染。分装量可根据三角瓶大小而定，一般使培养基体积占瓶体的1/4到2/5比较合适。500ml培养基大约可装100~125ml的三角瓶20~25瓶。装好后，塞上棉塞，用羊皮纸包严，线绳扎紧，准备消毒灭菌。 2. 灭菌 培养基作好后，应该很快灭菌，一般采用湿热消毒法，即高温高压消毒。灭菌时一般培养基不宜压力过大，时间过长，以防高温高压引起培养基成分的改变，尤其是激素类物质超过一定的温度范围易于分解，常用压力为lkg/cm2时间为15~20min。 本次实验培养基消毒压力为0.9~lkg／cm2消毒20min。玻璃器皿及用具、无菌水消毒应适当增加压力和延长时间，一般为1.2~1.3kg/cm2，30~50min。在消毒用具前，每人应准备好蒸馏水，用棉塞塞好，纸包严，线绳扎紧，同时再准备两套培养皿、皿底内铺两张与培养皿大小相应的滤纸，盖好皿盖，用羊皮纸分别包好，两包合起来，再用一块纱布包好，扎上线绳，一起灭菌。为了消毒彻底，应使蒸汽充分达到各个部分。现在已知的微生物在115℃下一分钟内即被杀死，其所以需要稍长时间消毒，是因为可能在消毒物品的包装尚有冷空气未全部排除或蒸汽还未达到各个部分的缘故。蒸汽消毒锅在气压升高前，应先让蒸汽达到各个部分，并使冷空气完全排除。关闭排气阀后，使气压升高至所要压力，然后开始计时并以减低火力来维持压力至所需时间。为避免培养基或蒸馏水因改变压力而沸腾冲出瓶口，压力下降的速度必须缓慢，故在灭菌完毕不能立即打开排气阀门而要等压力下降后才可揭开灭菌锅，取出消了毒的无菌水、培养基等。 3. 接种： 植物组织培养的接种是指从把植物体取下的器官、器官切段等部分经过表面消毒，冲洗和切碎或分离出组织、细胞，并将它们转移到无菌培养基上的全部操作过程。整个过程是无菌操作。 接种室的消毒：接种要求无菌的条件，但一般接种操作的时间都比较长，所以容易污染。为了避免污染最好在专门的接种室进行接种。理想的接种室，墙壁应当光滑，地面平坦无缝，避免灰尘积累而且便于清洁，同时也要防止空气对流，避免灰尘入内、如果没有专门的接种室，可用接种箱代替，如果连接种箱也没有，只好因陋就简，在一般实验室的实验台上接种。目前我国科研单位已普遍应用超净工作台代替专门的接种室。超净工作台可过滤空气中较大的尘粒(大小50um的)，可使每升空气中的尘粒数减少到50粒以下。接种室或接种箱和接种台，在使用前都要用新洁尔灭(2％)擦净，然后用紫外灯(一般在3~4m2内安1~2支)照射20分钟杀菌。接种前再用70％的酒精喷雾，使室内灰尘沉降。为了避免工作人员的出入带菌，一般在接种室外面最好设有准备室(放工作服、拖鞋、帽子等)，准备室也应当安装紫外灯随时可以杀菌。 接种的程序：植物组织培养的接种，在原则上与微生物的接种过程相同，每步骤的开始，用具都要经过酒精消毒。所不同的是植物材料在接种时也要经过表面消毒，接种的具体步骤如下： (1)把从大田或温室内选取的植物器官(根、茎、叶子或植物幼苗)用水冲净。 (2)用70％的酒精漂洗材料半分钟，再用无菌水冲洗材料。 (3)将材料放入0.1％的升汞或1％的漂白精(次氯酸钙溶液)中进行表面消毒，消毒时间的长短，因所用消毒剂的种类和植物材料的不同而异，如表3所示。因此在组织培养中要针对具体的植物材料决定采用合适的消毒剂(包括浓度)和决定消毒时间的长短。 用消毒后的解剖刀将材料切成小块，切块的大小和形式没有严格限制，但不能太小，否则细胞分裂难以发生。切块的大小也可因材料的多少而定，如果材料不多，切块尽量小些，就能得到大量的外植体.但是切块的最小限度与亲本组织细胞的平均大小有关。实验证明细胞大的植物材料，切块要适当的大些，否则就难以成活。根据报道，番茄和杨树叶子切成大约5×5mm2的小块，马铃薯块茎切成4×2.5×lmm3，幼苗切成4-5mm的小块容易成活。 表3 常用消毒剂效果的比较 消毒剂 使用浓度 去除难易 消毒时间（分） 效果  次氯酸钙 9-10％ 易 5-30 很好  次氧酸钠 2％ 易 5-30 很好  过氧化氢 10-12％ 最易 5-15 好  溴水 1-2％ 易 2-10 很好  AgNO3 l％ 较难 5-30 好  HgCl2 0.1-1％ 较难 2-10 最好  抗菌素 4-50mg 中 30-60 较好  (4)用消毒后的镊子将切好的材料块转移到培养瓶中的培养基上，每瓶中放置小块数，根据切块的大小而定，一般为1-4或5块。放置小块过多会影响到成活，因固体培养基中的营养物质，不易移动。而导致营养不足，放置好材料的培养瓶，立即塞好瓶塞。 (5)用一小块锡铂纸包好瓶口；并用线绳或橡皮绳缠两圈结成活头，便于以后解开。 上述接种的每个步骤都要进行用具的消毒，通常在接种时，用具（刀子、镊子），都插在盛有酒精的瓶子中并点酒精灯，用的时候先把用具在酒精灯上燃烧灭菌后才利用。同样道理，在打开培养瓶时瓶口也要在酒精灯火焰上倾斜转动进行灭菌和防止外菌落入瓶内，否则，接种后容易污染。植物不同器官消毒顺序的参考材料(表4)： 本次实验接种程序与上述的接种程序完全相同，材料的消毒剂用的是5％漂白粉，消毒时间为7min。 表4植物不同器官的消毒 组织 消毒前 消毒 消毒后 备注  种子 纯酒精浸10min，再用无菌水漂洗。 用10％的次氯酸钙浸20-30min，再用1％的溴水浸5min，无菌水洗三次，在无菌水中发芽或无菌水洗5次；在滤纸上发芽 用幼根或芽来发生愈伤组织   果实 用纯酒精迅速漂洗。 用2％的次氯酸钠浸10min。 用无菌水反复冲洗再剖除种子或内部组织 获得无菌苗  茎切段 用自来水洗净，再用纯酒精漂洗，用2％的次氯酸钠浸15-30min 无菌水洗三次 直立在琼脂培养基上或切取出组织进行培养   贮藏器官 用自来水洗净 用2％的次氯酸钠浸20-30min 用无菌水洗三次再用滤纸吸干从消毒材料内部取出组织来培养   叶片 用自来水洗净吸干，再用纯酒精漂洗 用0.1％的氯化汞浸15min或用2％次氯酸钠15-20min 用无菌水反复冲洗再用滤纸吸干 选用嫩叶(叶片均匀放在培养基上)或叶柄（插在培养基上）。  4. 保温培养 接有植物组织的三角瓶或试管等，应放在清洁的托盘内送到保温箱或培养室中去培养，培养室一般采用人工光照，其强度一般为1000~2000 lx，还应根据不同植物组织对光强度的不同要求进行选择；有的植物组织生长时不需要光照，就应在暗室内培养或用黑色材料包裹在容器的周围。培养室的温度一般是在25~27℃的恒温条件下，有些植物材料在低于或高于该温度范围也能很好生长，这可以根据不同材料适当提高或降低室温。本次实验培养室温度20~25℃，用40W日光灯提供光源。 在上述条件下，一般经过2~3周，在组织切口处就可以产生大量愈伤组织(例如大豆子叶经过7天以后就能产生愈伤组织)。愈伤组织从开始产生到停止生长期间，有一个生长盛期，此时生长速度和生长量迅速增加，过了这个时期以后，生长逐渐减慢。为了获得足够的愈伤组织用于器官分化和保存愈伤组织，要进行继代培养。也就是说，愈伤组织在培养基上生长一段时间之后，由于营养物质的枯竭，水分的散失，以及累积了一些代谢产物，因此，必须将组织转移到新的培养基上，再次产生新的愈伤组织，这个转移的过程，就叫做继代培养。一般在25~28℃下进行固体培养时，每隔4~6周进行一次继代培养。在组织块较小的情况下，继代培养时可将整块组织转移过去；若组织块较大，可先将组织分成几个小块再转移。继代培养必须及时进行，长期不继代，会由于代谢产物的累积对组织起毒害作用。当然，若在培养基中加入0.5％活性炭，可以吸附代谢产物，减轻对植物组织的毒害。 5. 由愈伤组织分化出芽和根的培养 将愈伤组织转移到含有适当组合和适当浓度的生长调节物质的培养基上，进行培养便能产生出芽和根并逐渐形成植物幼苗。 通常进行组织培养时所用的生长调节物质有生长素类的物质(2，4-D、IAA和NAA)和细胞分裂素类物质(6-BA和KT)，在培养基中分别各加入上述两类物质中的一种。 注意事项 1. 本实验为无菌培养，要特别注意消毒和清洁工作，否则将引起严重污染； 2. 高压消毒要严格按规定进行，压力过高和时间过长不仅会使琼脂变成溶胶状态，而且易出危险。 3. 本实验周期长，一定要坚持观察和记录。 二、烟草叶组织培养中的形态发生和器官形成 原理 植物组织在离体状态下给以一定条件，则已经分化并停止生长的细胞，又能重新分裂生长，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程常称之为“脱分化作用”。已经“脱分化”了的愈伤组织，在一定条件下，又能“再分化”形成根和芽。植物激素在“再分化”中起着主要作用。培养基成份中生长素和细胞分裂素的比例决定了根或芽的分化。 仪器设备 见上一实验 试剂 75%乙醇；0.1%HgCl2；无菌水；1mol/L NaOH；1mol/L HCl；200 ppm的6-BA；200ppm的NAA；200ppm的IAA；蔗糖；琼脂。 方法 1. 培养基： MS培养基作为基本培养基，其激素处理如下： （1）MS0（不加激素） （2）MS+BA1mg/1+NAA2mg/1 （3）MS+BA0.5mg/l+IAA0.1mg/l 以上处理均加入蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH调至5.8。分装入50ml的三角瓶，每升60瓶，在高压锅内121℃~126℃恒温灭菌20min。 2.材料及材料的处理 （1）材料：生长盛期的烟草叶片 （2）叶片的处理：叶片取下后，先用自来水冲洗干净，然后用0.1%的HgCl2消毒8min，在无菌条件下用无菌水冲洗3~4次，置无菌培养皿中备用。 （3）接种：用火焰灭菌的解剖刀将叶片的主脉除去，将叶组织切成5×5mm2的小方块，每瓶接种3~4块（注意叶片放入培养基时，上表皮仍朝上，下表皮与培养基接触）。 3．培养： 接种完后将培养瓶放入培养室（温度控制在25~28℃）的培养架上进行培养，培养2周后开始观察记载，每5天1次，至出现明显的结果。 注意事项： 进接种室前，每人都必须把手洗干净，换上拖鞋，操作前用酒精棉擦手，不准把与实验无关的物品带进接种室，以免引起污染。 思考题 1. 植物激素对愈伤组织形成及器官分化有何影响？ 2. 在组织培养过程中应注意什么？ 3. 植物组织培养的主要类型有哪些？选择不同培养方法的主要依据是什么？ 4. 在三种培养基（(1) MS 0 (2) MS+BA 0.5 mg/l +NAA 2mg/l (3) MS+BA 0.5mg/l +NAA 0.1mg/l ）上组织的生长分化状况有什么不同？为什么？ 5.2 酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量 原理： 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。是70年代初期由Engva11等人首先建立的，目前被广泛应用于医学研究及临床检测上。它应用于植物激素测定则是由Weiler(1980)建立的ABA ELISA开始的，比放射免疫分析(Radio immunoassays，简称RIA)应用于植物激素的测定要晚。但是由于ELISA灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉，而日益取代RIA被广泛应用于植物激素测定，极大地促进了植物激素的研究进展。目前，几大类植物激素如IAA，ABA，GAs，CTKs等以及其它生长调节物质如玉米赤霉烯酮、壳孢菌素、茉莉酸、水杨酸等都建立了相应的ELISA方法。 ELISA是建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。 EISA有很多类型，但常用于植物激素测定的有两种：固相抗原型（间接法）和固相抗体型（直接法）。ELISA的基本过程包括固相载体吸附抗体(或抗原)，加待测抗原(或抗体)，再与相应的酶标抗体(或酶标抗原)进行抗体抗原的特异免疫反应，生成抗体(抗原)一待测抗原(抗体)一酶标抗体(抗原)的复合物，最后再与该酶的底物反应生成有色产物。因此可以借助于光吸收率计算抗原(或抗体)的量。 间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。 图A表示间接酶联免疫方法的基本原理： A.间接酶联免疫原理示意图 示反应板（固相载体） 示激素特异抗体（一抗） 示激素（抗原） 示非特异二抗 示蛋白质·激素复合物 示标记酶 直接酶联免疫法是先将抗体吸附在固相支持物上，然后加入酶标抗原(实验前将待测植物激素与酶相连成复合物)和待测植物激素，产生抗体-激素-酶复合物，最后加入底物，生成有色产物，根据产物吸光率的大小可以计算出待测植物激素的量。如果吸附抗体和酶标抗原的量恒定，并且酶标抗原与待测激素之和大于抗体的量，则形成的抗体-激素-酶复合物量受待测激素的限制，因此待测激素的量将与有色产物的量成反比。 图B表示直接酶联免疫方法的基本原理： B.直接酶联免疫原理示意图 本文所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示: Ab十H十HP==AbH十AbHP 其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素-蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H量的多少。 仪器和试剂: 1、仪器 聚苯乙烯微量反应板(40孔或96孔)，可调式微量吸液器(200μl)，烧杯，试管，37℃恒温箱，酶联免疫测定仪(微量分光光度计)，吸水纸。 2、试剂 包被缓冲液： 0.3g Na2CO3 ；0.586 g NaHCO3 ；0.04g NaN3 (有毒 ) ；定容DW200ml， pH 9.6 磷酸盐缓冲液(PBS): 8.0g NaCl；0.2g KH2PO4 ；2.96 Na2HPO4?12 H2O ；定容DW 1000 ml，pH 7.5 样品稀释液：0.1g 白明胶 ( 稍加热) ；0.1ml Tween-20 ；100ml PBS 底物缓冲液：5.10g C6H8O7?H2O (柠檬酸) ；18.43g Na2HPO4?12 H2O定容 DW 1000ml，再加1ml Tween-20，pH 5.0 洗涤液：PBS 2000 ml 再加2ml Tween-20 终止液：4~6N H2SO4 5ml×10 提取液； 80％甲醇，内含1m mol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚) 注意： 缓冲液均放入4℃冰箱储存( 最多一周 ) 抗原、抗体、二抗及标准物保存在-20℃下，尽量缩短取样时间。 操作步骤： 样品中激素的提取： 称取1g 左右材料，( 不马上测定时用液氮速冻后保存在-20℃的冰箱中)，加2ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆(一定要磨细)，转入10ml试管，再用2ml 提取液分次冲洗研钵并转入试管中，摇匀。 在 4℃下提取4h，3000~4000 rpm 离心15~20min，取上清液，沉淀中加1ml 提取液，摇匀，置4℃下再提取1hr，离心，合并上清液。记录体积，残渣弃去。 将一定体积的上清液转入5ml离心管中，用N2吹干，用样品稀释液定容(一般1g样品用1.5~2.0ml样品稀释液定容)，摇匀后再用于测定。 2、样品测定： 包被：在10ml包被缓冲液中加入一定量的各个激素包被抗原(激素蛋白复合物)，混匀(按最适稀释倍数)，每孔加100?l。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。 IAA、 ABA、iP+iPA 、GA4 37℃ 3h 注意：包被时切记包被缓冲液不要被表面活性剂 Tween-20等污染。 将边缘孔也加包被液。 将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。 洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。用洗涤液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。 2、3、4次放置1min，洗板后在吸水纸上甩干。 竞争：a、配标样： 在小试管中取样品稀释液0.98ml，加20?l待测激素的标样试剂(100?g/ml)， 即为2000ng/ml标准液，然后2倍稀释成一系列浓度(2000 ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250、125、62.5、31.25、0) 8个。 b、加标样及样品：每个浓度加3孔，每孔50?l， 每个样品重复3孔，每孔50??l，边缘孔不加。 C、加抗体：在5ml 样品稀释液中加入最佳稀释倍数的抗体，混匀后，每孔加 50??l，然后将酶标板放入湿盒内开始竞争。 竞争条件：GA4 37℃ 15min IAA 、ABA，iPA+iP 37℃ 0.5h 洗板：( 同上次 ) 加IgG-HRP(二抗)：在10ml样品稀释缓冲液中按最佳稀释倍数加入酶标羊抗兔抗体，混匀后，每孔加100??l，然后将其放入湿盒内，37℃下温育30min。 洗板：5次(同4) 加底物显色：底物要现配现用。称取10~20mg邻苯二胺(OPD)溶于10ml底物缓冲液中(小心勿用手接触)，完全溶解后加 4??l 30％H2O2。混匀，每孔加100??l(在暗处操作)，然后放入湿盒内，当显色适当后，即0 ng/ml 孔OD490nm为1.2~1.5，而本底即完全抑制孔不超过0.1~0.2，( 两者之差为1左右 ) 。每孔加入50??l 2~3 mol/L硫酸终止反应。 注：ABA、IAA、GA4 37℃显色15~25min。IPA在室温下5~10min。 比色：用标准曲线最高浓度孔调0，测定OD490nm 结果计算 用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。我们可根据logit曲线求得样品中激素的浓度(ng/ml)，然后再计算激素的含量(ng/g?fw)，具体做法如下。 曲线的横坐标用激素标样各浓度(ng/ml)的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。logit值的计算方法如下： Logit(B0/B)=In 其中B。是o ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色。 作出的logit曲线在检测范围内应是直线。待测样品可根据其显色值的logit从图上查出其所含激素浓度(ng/ml)的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度〈ng/ml〉。 影响ELISA测定结果的两个主要问题： 线性检测范围，是指logit标准曲线中的线性测定范围。在样品测定过程中，应选择合适的稀释倍数，使测定结果落在logit标准曲线前线性范围之内。 交叉反应，是指抗体与被测定激素以外的物质所起的反应。在样品测定过注中，要注意与抗体有较高交叉反应的物质，并尽量将其在提取液中排除。 实验的误差来源: 1. 加样误差是ELISA误差的主要来源，保持加样操作的一致和准确是其关键。每次加完样后要轻敲反应板，以保证孔内液面的水平。 2. 在测定样品时尽量做到温育条件(时间和温度)一致，这样可以使板间的变异|缩小到最小值。 3. 各种缓冲液的配制要尽量准确，尤其是标准激素系列浓度更要仔细，加样顺序要从低而高进行。 4. 尽量清除祥品中的干扰物，包括待测激素的类似物以及抗体和酶活性的抑制剂(如酚类物质和有机酸等)。并且可以进行以下质量控制实验来鉴别干扰的存在与否，以确保测定工作的正确性。（1）稀释试验:将待测样品稀释2倍，4倍和8倍，相应的测出值也应是原样品测出值的1/2，1/4，1/8。如果偏差太大，表明有干扰物存在，尚需做进一步的提纯。(2)平行试验:即在待测样品中加入己知量的标准激素，将其ELISA测出值减去待测样品本身测出值后，应是加入标准激素的值，如果偏差太大，亦表明干扰存在。(3)回收率测定：将样品分成完全等量的两份，在其中的一份加入己知量的标准激素，然后进行下面的提取和测定步骤。两份样品最后的测定值之差与加入量之比，即为回收率。 思考题 l.在将含有激素的提取液送行真空浓缩干燥时，为什么不宜将提取液(80%甲醇)完全干燥? 2.用什么方法可以发现提取液中有干扰物质存在? 3.为什么要预先测定包被抗原、抗体、二抗的最适稀释倍数及标准物的最佳范围? 4.在ELISA操作过程中，快速加样有什么好处? 5.在测定过程中，样品在490nm处的比色值在什么范围内较为理想? 6. 植物生长发育 6.1 种子萌发和活力测定 一、TTC法快速鉴定植物种子生活力 原理 TTC的水溶液浸泡种子，使之渗入种胚的细胞内，如果种胚具有生活力，其中的脱氢酶就可以将氧化态无色的TTC作为受氢体使之还原成不溶性的红色三苯甲 (TTF)，如果种胚死亡便不能染色，种胚生活力衰退或部分丧失生活力，则染色较浅或局部被染色，因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生活力。 材料、仪器设备及试剂 1.材料 玉米种子、大豆种子、小麦种子等。 2.仪器设备. 小烧杯；刀片；镊子；恒温箱。 3.试剂 0.2%~0.5%TTC溶液(TTC可直接溶于水，溶于水后，呈中性，pH6.5~7.5(不宜久藏，应随用随配)。 方法 1. 将种子用温水(30~35℃)浸泡2~6h，使种子充分吸胀。 2. 随机取种子100粒，水稻种子要去壳，豆类种子要去皮，然后沿种胚中央准确切开，取其一半备用。 3. 将准备好的种子放入培养皿，浸于TTC试剂中，于恒温箱(30~35℃)中保温30min。也可在20℃左右的室温下放置40~60min。 4. 倒出TTC溶液，再用清水将种子冲洗1~2次，观察种胚被染色的情况。 注意事项： 1. TTC溶液最好现配现用，如需储藏则应放入棕色瓶中，在阴凉黑暗处。 2. 染色结束后要立即进行鉴定，因放久会褪色。 3. 判断无生活力的种子应具备的特征：胚全部或大部分不染色；胚根不染色部分不限于根尖；子叶不染色或丧失机能的组织超过1/2；胚染成很淡的紫红色或淡灰红色；子叶与胚中轴的连接处或在胚根上有坏死的部分；胚根受伤以及发育不良的未成熟的种子。 二、染料染色法快速鉴定植物种子生活力 原理 有生活力种子胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失生活力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可自由进入细胞内使胚部染色，所以可根据种子胚部是否被染色来判断种子的生活力。 材料、仪器设备及试剂 1. 材料 种子 2. 仪器设备 小烧杯；刀片；镊子。 3. 试剂 0.5%红墨水(酸性大红G)或0.02%～0.2%靛红溶液。 方法 同TTC法快速鉴定植物种子生活力。 注意事项 1. 染料的浓度要适当，染色时间不能太长(如用红墨水染色，只需5~l0min即可)，否则不易区别染色与否。 2. 染料法测定种子生活力，以靛红染色法应用较广，它适用于禾谷类、豆类、麻类、瓜类、十字花科、棉花、果树、乔灌木种子的生活力测定。 三、荧光法快速鉴定植物种子生活力 原理 植物种子中常含有一些能够在紫外线照射下产生荧光的物质，如某些黄酮类、香豆素类、酚类物质等，在种子衰老过程中，这些荧光物质的结构和成分往往发生变化，因而荧光的颜色也相应地有所改变。有些种子在衰老死时，内含荧光物质虽然没有改变，但由于生活力衰退或已经死亡的细胞原生质透性增加，当浸泡种子时，细胞内的荧光物质很容易外渗。因此，可以根据前一种情况观察种胚荧光的方法来鉴定种子的生活力，或根据后一种情况观察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生活力。 材料、仪器设备 1.材料 禾谷类、松柏类及某些蔷薇科果树的种子 2.仪器设备 紫外光灯；白纸(不产生荧光的)；刀子；镊子；培养皿；烧杯。 方法 1.直接观察法 这种方法适用于禾谷类、松柏类及某些蔷薇科果树的种子生活力的鉴定，但种间的差异较大。 用刀片沿种子的中心线将种子切为两半，使其切面向上放在无荧光的白纸上，紫外光灯下观察。有生活力的种子产生蓝色，无生活力的种子多呈黄色、褐色以至暗淡无光，并带有多种斑点。 随机选取20粒待测种子，按上述方法进行观察并记载有生活力及丧失生活力的种子的数目，然后计算有生活力种子所占百分数。与此同时也作常规发芽试验，计算其发芽率作为对照。 2.纸上荧光 随机选取50粒完整无损的种子，置烧杯内，加蒸溜水浸泡10～15min，令种子吸胀，然后将种子沥干，再按0.5cm的距离摆放在湿滤纸上(滤纸上水分不宜过多，防止荧光物质流散)，以培养皿覆盖静置数小时后将滤纸(或连同上面摆放的种子)风干(或用电吹风吹干)。置紫外光灯下照射，可以看到摆过死种子的周围有一圈明亮的荧光团，而具有生活力的种子周围则无此现象。根据滤纸上显现的荧光团的数目就可以测出丧失生活力的种子的数量，并由此计算出有生活力种子所占的百分率。此外，可与此同时作一平行的常规种子萌发试验，计算其发芽率作为对照。 这个方法应用于白菜、萝卜等十字花科植物种子生活力的鉴定效果很好。但对于一些在衰老、死亡后减弱或失去荧光的种子便不适用此法，因此，对它们只宜采用直接观察法。 思考题 1. TTC法快速鉴定种子活力的实验操作中应注意什么？ 2. 红墨水染色鉴定种子生活力与TTC法鉴定种子生活力有何不同? 6.2 花粉活力测定 一、花粉萌发法测定花粉活力 原理 在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常涉及花粉活力的鉴定。掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的基础。正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。 材料、仪器设备及试剂 1. 材料 成熟花朵 2.仪器设备 载玻片；显微镜；玻璃棒；恒温箱；培养皿；滤纸。 3.试剂 培养基(10%蔗糖，l0mg/L硼酸，0.5%的琼脂)：称l0g蔗糖、lmg硼酸、0.5g琼脂与90ml水放入烧杯中，在100℃水浴中熔化，冷却后加水至100ml备用。 方法 1. 将培养基熔化后，用玻棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润滤纸的培养皿中，保湿备用。 2. 采集丝瓜、南瓜或其他葫芦科植物刚开放或将要开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱(或室温20℃条件下)中培养，5～l0min后在显微镜下检查5个视野，统计其萌发率。 注意事项 1. 不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变培养条件。 2. 此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度、离体时间、环境条件等因素对花粉活力的影响。 3. 不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的葫芦科等植物花粉活力的测定。 二、TTC法测定花粉活力 原理 具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的NADH2（NADH+H）或NADPH2（NADPH+H）可将无色的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)还原成红色的TTF(三苯基甲 而使其本身着色，无活力的花粉呼吸作用较弱，TTC的颜色变化不明显，故可根据花粉吸收TTC后的颜色变化判断花粉的生活力。 材料、仪器设备及试剂 1. 材料 成熟花药 2. 仪器设备 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；恒温箱；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。 3. 试剂 0.5%TTC溶液：称取0.5gTTC放入烧杯中，加入少许95%酒精使其溶解，然后用蒸溜水稀释至l00ml。溶液避光保存，若发红时，则不能再用。 方法 采集任何植物的花粉，取少许放在干洁的载玻片上，加1~2滴0.5%TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，置35℃恒温箱中，10~l5min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。观察2~3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。 三、I2-KI染色法测定花粉活力 原理 多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I2-KI溶液染色呈黄褐色。因此，可用I2-KI溶液染色来测定花粉活力。 材料、仪器设备及试剂 1.材料 成熟花药 2.仪器设备 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。 3.试剂。 I2-KI溶液：取2g KI溶于5~10ml蒸馏水中，加入l g I2，待完全溶解后，再加蒸溜水300ml。贮于棕色瓶中备用。 方法 采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药，取一花药于载玻片上，加1滴蒸溜水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1~2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。活力较强的花粉粒被染成蓝色，发育不良的花粉粒呈黄褐色。观察2~3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。 注意事项 此法不能准确表示花粉的活力，也不适用于研究某一处理对花粉活力的影响。因为三核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘呈蓝色反应。 思考题 1. 哪一种方法更能准确反映花粉的活力? 2. 每一种方法是否适合于所有植物花粉活力的测定? 7. 逆境生理 7.1 电导法测定植物细胞透性 原理 植物组织在受到各种不利的环境条件(如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染)危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加。组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导值的变化，可反映出质膜受伤害的程度，也可以反映植物组织抗逆性的强弱。 仪器及试剂 仪器： 1. DDS—11型电导仪； 2. 真空泵； 3. 真空干燥器； 4. 水浴锅； 5. 打孔器； 6. 剪刀； 7. 洗瓶； 8. 试管； 9. 移液管； 10. 玻璃棒； 11. 滤纸； 12. 天平； 试剂： 无离子水 材料 所培养的材料。 步骤 1. 清洗器具： 由于电导值变化非常灵敏，稍有杂质即产生很大误差。因此所用玻璃器具均需予先用热肥皂水洗，再用洗液洗涤，然后用自来水冲洗干净，再用无离子水冲四、五遍（最好容器口向下用水冲）。向洗净的试管中加入无离子水，用电导仪测定电导值，检查是否洗净。然后倒立在洁净的滤纸上干燥，或烘干。 2. 处理材料 取一定叶位和叶龄的功能叶，先用无离子水冲洗，最后用洁净的滤纸擦去水分，每组用打孔器打成12个叶圆片，放入试管中，加10ml无离子水（设3-4个重复）。放于真空干燥器中，用真空泵抽气10min，以抽出细胞间隙空气。缓慢放入空气，水即渗入细胞间隙，叶片变成透明状，细胞内溶质易于渗出。取出试管，间隔几分钟振荡一次，在室温下保持30min。 3. 用电导仪测定外渗液的电导值。 测定之后，将试管放入沸水中10min以杀死组织。等冷至室温后，再次测定外渗液的电导值。 4. 结果计算  L1：叶片煮沸前外渗液的电导值； L2：叶片煮沸后外渗液的电导值；  C1：对照叶片杀死前外渗液的电导值； C2：对照叶片杀死后外渗液的电导值； T1：处理叶片杀死前外渗液的电导值， T2：处理叶片杀死后外溶液约电导值； 注意事项 1. 所用玻璃器皿一定要洗净。 2. 测电导时，烧杯外面要干燥。 思考题 电导法测膜透性的原理是什么？实验中为什么要抽真空？ 抗逆性强的植物材料外渗液中的电导率高还是低，为什么？ 7.2 植物组织中超氧物歧化酶活性的测定 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除生物体内具有强烈毒性的超氧阴离子自由基（ ）的酶，它催化下列反应： 2 +2H+ → H2O2 + O2 反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 原理 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ， 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm处有最大吸收，而SOD可清除 从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 考马斯亮兰G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm。在稀酸溶液中，当其与蛋白质的疏水区结合后变为青色，最大光吸收在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（1～100μg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。该反应迅速，形成的化合物稳定，而且很灵敏，可以测定微克级蛋白质含量。 仪器与用具 高速低温台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管或指形管数支。 试剂 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml； 750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存； 100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml； 20μmol/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml避光保存(当天配制)。 考马斯亮兰G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置一个月。 方法 　　1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，转移到5ml离心管中，加缓冲液使终体积为5ml。于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。 2、显色反应 取5ml试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。 表1 各溶液加入量 试 剂（酶） 用量(ml) 终浓度（比色时）  0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶液 蒸馏水 3 0.6 0.6 0.6 0.6 0.2 0.4  13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 对照管加缓冲液代替酶液  总体积 6.0   3、蛋白浓度的测定 吸取样品提取液（SOD粗提液）0.1ml，放入具塞刻度试管中（设2个重复，空白以0.1ml缓冲液代替），加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，封口，充分混合后放置20min，在595nm下比色，记录光密度值，计算蛋白浓度。 4、蛋白浓度的计算 蛋白浓度＝ 单位：mg蛋白/g样重 c－通过标准曲线查得的每管中蛋白含量（mg） v－样液总体积（ml） a－测定时提取液体积用量（ml） W－样重（g） 5、SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560nm下分别测定其它各管的光密度值，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性。 SOD总活性 = 单位：酶单位/g鲜重表示； SOD比活力 =  单位：酶单位/mg蛋白 Ack―照光对照管的光密度值； AE—样品管的光密度值； V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml）； W—样重（g）； 思考题 1、在SOD测定中为什么设暗中和照光两个对照管？ 2、影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？ 7.3 植物体内游离脯氨酸含量的测定 植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。 原理 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其光密度成正比。 仪器与用具 分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。 试剂 3%磺基水杨酸水溶液；甲苯； 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3d有效； 脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。 方法 1．标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按表1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热30min。 （2）取出、冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。 表1 各试管中试剂加入量 管 号 0 1 2 3 4 5 6  标准脯氨酸量(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0  H2O(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0  冰乙酸(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0  显色液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0  脯氨酸含量(μg) 0 2 4 8 12 16 20  （3）以光密度值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。 2．样品测定 （1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2~0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。 （2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热30min。 （3）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层，以空白管为对照，在波长520nm下比色测定。 （4）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数： 脯氨酸（μg/g FW或DW）=(C×V/a)/W 式中 C—提取液中脯氨酸含量（μg），由标准曲线求得； V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取提取液的体积（ml）； W—样品重（g）。 注意事项: 样品测定时若气温较低，萃取物分层不清晰，可将试管置于40℃左右的水浴中快速测定；或静置后测定。 思考题 1．植物体内游离脯氨酸测定有何意义？ 2．当改变萃取剂时，比色应做哪些改变？如何选择最适波长？如何选择最佳萃取剂？ 7.4 植物组织中丙二醛含量的测定 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反应植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 原理 丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的光密度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100~300μg/g DW，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5μmol/L。 1、直线回归法 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的光密度值为零。不同浓度的蔗糖（0-25 mmol/L）与TBA显色反应产物在450nm的光密度值与532nm和600nm处的光密度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的光密度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的光密度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0.00198+0.088D450 样品显色后测定450nm、532nm和600nm的吸光度，根据方程①求出该样品中糖分在532nm处的吸光值Y532，用532nm和600nm的吸光值之差再减去Y532，即可得MDA-TBA反应产物在532nm处的吸光值，用该值进一步计算植物样品中的MDA含量。 2、双组分分光光度计法 根据朗伯-比尔定律：D＝kCL，当液层厚度为1cm时，k=D/C，k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的光密度值等于此混合液在该波长下各显色物质的光密度之和。 已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40，7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式： C1(mmol/L)=11.71D450 C2(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 式中：C1为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度，D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。 仪器设备 紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵两套；试管4支；刻度吸管:10ml 1支，2ml 1支；剪刀1把。 试剂 10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氢氧化钠（1 mol/L）溶解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。 方法 1. 实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。 2. MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加适量TCA进一步研磨，匀浆转移到5ml离心管中，在4000rpm离心10min，上清液为样品提取液。 3. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml（空白加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的光密度。 4. 计算含量 (1) 直线方程法 按公式①求出样品中糖分在532nm处的光密度值Y532，用实测532nm的光密度值减去600nm非特异吸收的光密度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的光密度值。按MDA在532nm处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。 (2) 双组分分光光度法 按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。 用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量： MDA(μmol/g FW)＝ 7.5植物体内氧自由基的测定和清除 通过呼吸作用进入生物体内的氧分子，参与酶促或非酶促反应时，只接受一个电子后转变为超氧阴离子自由基( )， 既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍为 H2O2，羟自由基(·OH)，单线态氧(1O2)等。·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质(RH)过化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基(·R)、脂氧自由基(RO·)、脂过氧自由基(ROO·)和脂过氧化物(ROOH)。基团旁边的小圆点为不成对价的电子，这种基团即称为自由基，带有个-O-O-的是过氧化物，1O2的电子处于激发状态。这些含有氧而又比O活泼很多的化合物，称为活性氧，也有人将它们统统归纳为氧自由基类。一切需氧生物均能产生活性氧，在其体内有一套完整的活性氧清除系统(抗氧化酶和抗氧化剂)，能将活性氧转变为活性较低的物质，机体因此受到保护。利用羟胺氧化的方法可以检测生物系统中　含量，原理是： 　　　　　　　　　　　　　　　 超氧阴离子自由基与羟胺反应生成NO2- ，NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，染料在λ530nm有显著吸收，根据OD530可以算出样品中的　　含量。 仪器设备 ??? 低温离心机、恒温水浴锅、分光光度计。 操作方法 1. 植物提取液的制备：大豆，绿豆，花生3d龄黄化幼苗的下胚轴，按SOD活性测定中方法制备粗酶液。 2. 亚硝酸根标准曲线的制作：1ml系列浓度的NaNO2(0、5、10、15、20、30、40和50?mol?/L)分别加入l m1对氨基苯磺酸和lmlα-萘胺，于25℃中保温20min，然后测定OD550，以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图，制得亚硝酸根标准曲线。 3 O2-含量测定：0.5m1样品提取液中加入0.5m1 50mmo1/L磷酸缓冲液(pH7.8)，1ml的1mmo1／L盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温l h，然后再加人l m1 17mmo1/L对氨基苯磺酸(以冰醋酸：水＝3：1配制)和1m1 7mmol/Lα-萘胺(以冰醋酸：水＝3：1配制)，混合，于25℃中保温20min，取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。 ??? 根据测得的OD530，查NO2—标准曲线，将OD530换算成[NO2-]，然后依照羟胺与　　的反应式：NH2OH十2 十H+ ?? NO2-十H2O2十H2O从[NO2-]对[ ]进行化学计量，即将[NO2-]乘以2，得到[ ]根据记录样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，可求得产生速率(nmo1min-1mg-1蛋白)。 注意事项 1. 如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，然后再加入对氨基苯磺酸和α-萘胺作NO2-的显色反应。 2. 可参阅王爱国等。植物生理学通讯，1990，6 8. 综合设计实验 目的 此部分实验内容为植物生理学实验课教学改革项目。主要目的是强化学生的基本操作技能，使学生独立掌握实验材料培养、试剂配制、实验操作，了解植物生理学研究的基本规律，培养学生的综合应用能力、科研动手能力和科学写作能力。 方法 由学生自己查阅文献资料，设计实验路线、实验内容和实验步骤，由教师审查后进行实验，实验全部过程以学生为主体，教师只起指导作用，实验时间为3天。实验后记录实验结果、进行数据处理、分析实验结果、撰写实验论文。 内容 8.1 植物的溶液培养和缺素培养实验 材料：玉米浸种 20℃，2d 发芽 25℃，7d 出苗25℃，7d 出一片真叶后进行处理，经22d开始测定生理指标。 处理： 缺氮、缺磷、缺钾、缺镁、缺铁和完全培养 生理指标测定(参考)： (1)株高，(2)鲜重干重；(3)Chl含量；(4)根系活力；(5) 光合速率和呼吸速率；(6)可溶性糖含量 8.2 果实成熟期间的生理生化变化。 材料： 苹果、葡萄或西红柿 处理：不同浓度乙烯利涂抹 生理指标测定(参考)： (1) 呼吸速率变化；(2) 可溶性糖含量；(3) 蛋白质含量；(4) Vc含量；(5) 干重和鲜重变化等；（6）多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性的测定 8.3 CaCl2在提高作物抗旱性中的作用 材料：玉米或小麦 处理：浸种处理（培养材料）；浸苗处理（不同浓度PEG和CaCl2处理） 生理指标测定： (1) 植株的含水量；(2) 水势测定；(3) 蒸腾速率；(4) 脯氨酸含量；(5) 电导率；（6）丙二醛、含量。 8.4 盐胁迫对植物生长发育的影响 材料：玉米或小麦 处理：浸种处理（培养材料）；浸苗处理（不同浓度NaCl处理） 生理指标测定： (1) 种子发芽率的测定；(2) 根系活力的测定；(3) 叶片叶绿素含量的测定；(4) NR活性测定；(5) 植物细胞透性的测定；（6）SOD活性的测定