高级生物化学：高级生物化学

高级生物化学 第一章 绪 论 发展中的生物化学 生物化学是在生物学发展的基础上融合了化学、物理学、生理学等学科的理论和方法形成的科学，是研究动物、植物、人体、微生物等生命物体的化学组成和生命过程中的化学变化的一门学科，所以人们认为生物化学是生命的化学。 生命是发展的。生命起源、生物进化、人类起源等等均已说明生命是发展的，因此人们对生命化学的认识也是在发展之中的，生物化学的发展可以追寻到18世纪下半叶（在约是乾隆年间），要从拉瓦锡研究燃烧和呼吸说起。 法国著名的化学家拉瓦锡（Attoine—Laureut Lavoisier，1743----1794），他曾经钻研燃烧现象。并进而研究了呼吸作用。在他29岁时开始燃烧的科学试验，发现磷燃烧后成为磷酸，硫燃烧后成为硫酸；磷酸和硫酸分别比磷和硫重，这表明燃烧并不是失去了“燃素”，而是跟氧结合的过程。他又利用天平和量热器，测量了豚鼠等动物在一定时间内的呼吸，定量测定了CO2和释放的热量，从而证实动物的呼吸作用就好象物体的燃烧一样，只不过动物体的燃烧是缓慢和不发光的燃烧。他的研究成果彻底地推翻了“燃素说”，为生命过程中的氧化奠定了基础。 瑞典化学家舍勒（Carl Wilhelm Scheele，1742----1786）从14岁开始就随一位药剂师作了8年学徒，在此期间，他废这寝忘食的学习化学，并利用业余时间进行化学实验。在1770年他28岁时从酒石里分离出酒石酸，以后他又分析了膀胱结石获得了尿酸，分析研究了柠檬酸、苹果酸、没食子酸或称为五倍子酸，分析研究了甘油。舍勒在无机化学方面也有很多贡献，曾经拒绝了柏林大学和英国要他担任化学教授职务的邀请，一生乐于他的化学实验。 这是18世纪的成果，是由化学家通过科学实验，发现了生物体的呼吸作用，发现了生物体的中间代谢产物。所以拉瓦锡和舍勒是两位生物化学的先驱，是生物化学的奠基人。 进入19世纪后，在物理学、化学、生物学方面有了极大的进展，如1804年道尔顿的原子论，1869年门捷列夫的元素周期律，1895年伦琴发现了X—射线，1835年贝采利乌斯说明了催化作用，1859年达尔文发表了《物种起源》，1865年孟德尔的碗豆杂交试验和遗传定律，1848年亥姆霍兹（Helmholtz）找到了肌肉中热能来源，贝尔纳（Bernard）发现了肝脏生糖功能等等。如此多的发现和进展极大的促进了生物化学的发展，而且也是现代生物化学发展的前提。此外，生产的发展，工业的发达和社会的进步也极大地推动了生物化学的发展。 德国化学家李比希（Liebig）是农业化学的奠基人，也是生理化学和碳水化合物化学的创始人之一，他于1826年在德国吉森（Giessen）大学建立了李比希实验室，并首创了在大学进行化学实验的教学。1842年撰写的《有机化学在生理学和病理学上的应用》专著，首次提出了“新陈代谢”这个学术名词。他研究了许多有机化合物，并对脂肪、血液、胆汁和肌肉提取物进行了研究。他有很多杰出的学生，有位叫施洛斯比尔格尔（Julins Schlossberger），是第一位担任生理化学教授职务的人，他于1840—1859年间在德国蒂宾根（Tübingen）大学教授有机化学和生理化学。施洛斯比尔格尔逝世后，蒂宾根大学生理化学的盛名延续了一个世纪。历任的生理化学教授都是当时第一流的生理化学专家，具有医学和有机化学的基础，如霍佩—赛勒（Hoppè—Seyler）、Gustav、Han Thierfelder（研究脂肪氧化）和Franz—Knoop（研究脂肪氧化，尿中排出马尿酸）等。 霍佩—赛勒（1825—1859）是德国医生，因将生理化学（即生物化学）建立成一门独立的科学而著名。1877年他首次提出了“生物化学”这个名词，创办和编辑了第一种《生理化学杂志》，出版了《生理化学及病理化学分析手册》，首次获得了纯的卵磷脂，并曾获得晶体状的血红素。首创“蛋白质”一词，又研究过代谢、叶绿素及血液。他研究病理液体和脓细胞，从而导致他的一位学生Friedrich Miescher（1844—1895）从脓细胞核中分离出了脱氧核糖核蛋白，另一位学生Albrecht Kossel（1853—1927）因对蛋白质、细胞及细胞核化学的研究而获得1910年诺贝尔生理学或医学奖。霍佩—赛勒建立了著名的斯特拉斯堡研究所，并在此担任过生理化学教授，在科学研究和培养学生方面都做出了巨大的贡献。总之，自1840—1900年间，德国的生理化学跟其他领域的科学一样，处于开拓和领先地位。并对美国的生理化学的发展起了非常重要的推动作用。例如，池廷登（Russel Henry Chittendlen）是美国留德学生，回到美国纽黑文的耶鲁大学教授生理化学，是全美第一位任生理化学教授职务的留德归美学生。他在生理化学方面任教达30年，居美国生理化学的领导地位。他与他的德国老师寇南（Willy Kühne）合作对胃液和肠液消化过程的产物进行了化学研究，发现了不少新东西。也进行了蛋白质的分解试验。再如，艾贝尔（John Jacob Abel，1857—1938）曾在德国留学7年，获斯特拉斯堡大学医学博士，返美后在密西根大学和约翰斯·霍普金斯大学任教，他分离了肾上腺素。1962年制成了胰岛素晶体。1932年领导内分泌研究室。 总的说来，美国生理化学初始阶段受德国的影响较深。 20世纪后，生物化学有了很大的发展。德国、美国、英国、法国都有了生物化学的学术中心。就生物化学来说，20世纪前半叶，在蛋白质、酶、维生素和物质代谢及生物氧化方面都有了很大的发展。 霍普金斯（Sir Frederick Gowland Hopkins，1861—1947）是英国剑桥大学生物化学教授，因发现维生素而与荷兰的艾克曼（C.Eijkman，1858—1930）共获1929年的诺贝尔生理学或医学奖。霍普金斯创建了剑桥大学普通生物化学学派和中心，从事教学和研究的人员都是生物化学方面的精英，为生物化学的发展做出了较大的贡献。 20世纪初直至二战前夕，德国在生物化学方面仍占领先地位，如埃米尔·费歇尔（Emil Fischer，1852—1919），普鲁士化学家，研究糖和嘌吟类物质，获1902年诺贝尔化学奖。汉斯·费歇尔（Hans Fischer，1881—1945），德国生物化学家，因对血红素和叶绿素的研究而获诺言贝尔化学奖。迈尔霍夫（Otto Meyerhof，1884—1951），德国生物化学家，因研究肌肉代谢的糖原—乳酸循环与英国的A.V.Hill共获1922年的诺贝尔生理学或医学奖。威尔施泰特(Richard Willstatter，1872—1942)，德国化学家，研究叶绿素及其植物色素结构而获得1915年诺贝尔化学奖。温道斯（Adolf Windaus，1876—1959），德国有机化学家，因研究维生素等有重要生物学作用的物质而获得1928年的诺贝尔化学奖。瓦尔堡（Otto Warburg，1883—1970），德国生物化学家，因对细胞呼吸的研究而获1931年诺贝尔生理学或医学奖。 在留德学生的推动下，20世纪前半叶，美国的生物化学方面也的很大发展。如耶鲁大学池廷登的后继者门德尔（Lafayette Benedict Mendel，1872—1935），美国生物化学家，发现了维生素和蛋白质的营养价值，建立了现代营养学概念。20—30年代营养和维生素的研究在美国比较突出。再如哈佛医学院的福林（Otto Folin），于1909年任生物化学教授，1915时福林教授将哈佛大学生物化学系办成了有影响的学术中心，重点放在分析方法和临床应用研究上。福林建立了尿中肌酸和肌酸酐的测定方法，氨基酸测定方法，尿氮测定方法。福林和吴宪（我国生物化学家）于1919—1922年设计了血液分析的颜色测定方法。 大约从20世纪中叶起，生物化学得到了突飞猛进地发展，并且生物化学的领域也向深度和广度发展，其原因是：①物理学家、化学家以及遗传学家等参加到生命化学的领域中来了。②研究人员迁居和交往频繁。③研究方法有了突破和改进。④信息交流量增大。 从研究方法的改进上来说，相继出现了色谱技术、电泳技术、超速离心技术、荧光分析技术、同位素示踪技术以及电子显微镜的应用等。可以说生物化学的分离、纯化和鉴定的方法向微量、快速、精确、简便和自动化的方向发展。 从不同学科专家的参与上来看，英国物理学家肯德鲁（John Cowdery Kendrew）测定了肌红蛋白的结构。英国物理学家佩鲁茨（Max Ferdinand Perutz）用X—射线衍射技术分析了血红蛋白的结构，二人共获1962年的诺贝尔化学家。美国化学家鲍林（Linus Pauling）因确定了氢键在蛋白质结构中及大分子间相互作用的重要性，并认为某些蛋白质具有类似螺旋的结构，研究了镰刀型贫血病，提出了“分子病”的名称，获得了诺贝尔化学奖和和平奖。桑格（Frederick Sanger）英国生物化学家，经过10年的研究，于1955年确定了牛胰岛素的结构，获得了1958年的诺贝尔化学奖。1980年他又设计出了一种测定DNA核苷酸排列顺序的方法，而与吉尔伯特（Walter Gilbert）、伯格（Pall Berg）共获1980诺贝尔化学奖。麦克林托克（Barbara Mc Clintock）美国遗传学家，从事玉蜀黍遗传研究40年，发现了可移动的遗传成分，因而获得了1983年的诺贝尔生理学或医学奖。 生物化学领域中，在20世纪获得诺贝尔奖的成果还有：克雷布斯（Sir Hans Adolf Krebs，英籍德裔生物化学家，犹太人，1933年被迫迁居英国）1937年发现三羧酸循环。李普曼（Fritz Albert Lipmann，美籍德裔生物化学家）1947年成功的分离出了CoA，1953年确定了其分子结构。克雷布斯和李普曼二人共获1958年诺贝尔生理学或医学奖。奥乔亚（Severo Ochoa，美籍西班牙生物化学家）发现细菌内的多核苷酸磷酸化酶，并合成了核糖核酸。科恩伯格（Arthur Korberg，美国医师、生物化学家）发现DNA在细胞内及试管内的复制方式。奥乔亚和科恩伯格二人共获1959年诺贝尔生理学或医学奖。威尔金斯（Maurice Wilkins，新西兰出生的英国物理学家）完成了对DNA的X—射线衍射分析，沃森（James Dewey Watson）和克里克（Francis Harry Compton Crick）提出了DNA的双螺旋结构，三人共获1962年的诺贝尔生理学或医学奖。尼伦伯格（Marshall Warren Nirenberg，美国生物化学家）破译遗传密码，霍利（Robert William Holly）阐明酵母丙氨酸tRNA的核苷酸的排列顺序，并证明所有tRNA的结构类似，科拉纳（Har Gobind Khorana，美籍印度裔生物化学家）首次人工复制出酵母基因，三人共获1969年诺贝尔生理学或医学奖。莫诺（Jàcques Momod，法国生物化学家、遗传学家）和雅各布（Francois Jacob，法国生物学家）发现了操纵子而获得1965年诺贝尔生理学或医学奖，等等。 我国生物化学的主要先驱是吴宪，他曾留学美国哈佛大学，回国后于1924—1942年担任私立北京协和医学院生物化学教授，兼生物化学系主任教授。我国在生物化学研究中最突出的成就是1965年人工合成了牛胰岛素，1983年人工合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸。此外我国在酶的作用机理、血红蛋白变异、生物膜结构与功能等方面都做出了国际水平的研究成果。 生物化学在蛋白质、核酸、酶及代谢等方面已有理论方面的成就，理论成果必将导致应用，所以生物化学的发展推动了生物技术的进步，从80年代开始，生物工程和生物高技术得到了迅速发展。生物工程有遗传工程或基因工程，蛋白质合成的分子生物学，或称蛋白质工程、酶工程，还有组织培养、细胞培养，以及其他体外技术，以求生产出对人类有用的产物。有工业微生物学，利用合适原料经过发酵，生产酶类或人类食品和动物饲料。生物工程的远景包括应用于人类健康、动物疾病治疗与预防、污水和废物处理、以及生物电子学等等。由于生物工程对人类社会目前效益的广阔的前景，世界各国，特别是欧洲、澳洲、日本等国家比较重视，发展较快。我国也已重视生物工程的理论研究和应用研究，特别重视生产方面的开发研究。 生物化学虽然有近二百年的历史，但是还在发展之中。目前看得到的一些未知领域正受到日益的重视，例如：地球上的生命是怎样起源的？地球以外的天体上有没有生命？遗传物质是怎样进化的？一个受精卵中的遗传物质怎样发生成个体？怎能样发生为各种器官和组织的？细胞器的进化途经还有争论，癌的问题、病毒问题、人体自身免疫问题、大脑的记忆、推理的分子生物学、生物行为有什么规律，其分子的基础又是什么？还有环境生态等问题。总之，生物化学是在发展之中。 生物化学方面的主要期刊 中文： 中国科学 科学通报 生物化学与生物物理学进展 生物化学与生物物理学学报 生命的化学 生物化学与分子生物学学报 微生物学报 遗传学报 实验生物学报 生物科学动态 日文： 科学 自然 生化学 蛋白质、核酸、酵素 英文： Nature（London） Science（Washington） Analytical Biochemistry（New York） Bidchemical Journal（London） Archives of Biochemistry and Biophysics（New York） Biochemical and Biophysical Research Communications（New york） Biochimica et Biophysica Acta（Amsterdam） Biochemistry（USA） Bioorganic Chemistry（London） Biopolymers（New York） Biotechnology and Bioengineering（New York） Canadian Journal of Biochemistry（Canada） Cancer Research（USA） Chromosoms（Berlin） Comparative Biochemistry and Physiology（Oxford） Current Advances in Genetics and Molecular Biology（U.K.） European Journal of Biochemistry（Heidelberg） Enzyme（Basel） Experimental Cell Research（New York） Federation Proceedings（New York） General Cytochemical Methods（New York） Immunology（Oxford） Indian Journal of Biochemistry（Indian） International Journal of Biochemistry（Oxford） International Journal of Peptide and Protein Research（Copenhagen） Journal of the Americal Society（Washington） Journal of Bacteriology（USA） Journal of Biochemistry（Tokyo） Journal of Biological Chemistry（USA） Journal of Cell Biology（New York） Journal of Chromatography（USA） Journal of Electron Microscopy（Tokyo） Journal of Experimental Biology（London） Journal of General Microbiology（london） Journal of General Virology（London） Journal of Histochemistry and Cytochemistry（USA） Journal of Immunology（USA） Journal of Lipid Research（New York） Journal of Molecular Biology（London） Journal of Neurochemistry（London） Journal of Theoretical Biology（London） Journal of the Chemistry Society I.Organic and Bioorganic Chemistry（London） Journal of Virology（Washington）] Metabolism，Clinical and Experimental（USA） Molecular and Cellular Biochemistry（Hague） Molecular and Cellular Genetics（Berlin） Molecular Pharmacology（New York） Methods of Biochemical Analysis（New York） Nucleic Acids Research（USA） Plant Physiology（USA） Peptides（USA） Preparative BIOchemistry（USA） Proceeding of the National Academy of Sciences（Washington） Proceedings of the Royal Society of London，Series B（London） Protoplasma（Vienna） Steroids（San Fradsisco） TBS（USA） Virology（New York） 德文： Die Naturwissenschaften（Berlin） Biochemische Zerischrift（Berlin） Zeritschrift fur Naturforschung 法文： Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L′Academie des Sciences（Paris） 蛋白质生物化学 蛋白质生物化学研究的是蛋白质的结构、性质、和功能及结构与功能的关系。生物体最重要的组成物质是蛋白质和核酸。核酸是遗传大分子，负责遗传信息的储存与传递。蛋白质是功能大分子，是生物体的结构、性质与功能的具体体现者。例如：遗传信息的复制、传递和表达要依靠各种蛋白质才能完成；细胞的骨架是由许多种蛋白质构成的三维网状结构，而细胞的各种生命活动都是在细胞骨架上进行的；生命的运动依赖于各种运动蛋白；氧的运输要靠血红蛋白来完成；动物体对疾病的抵抗力是由免疫球蛋白执行的；细胞能够认识“自己”与“非己”，是靠糖蛋白的特殊功能；机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成，酶是蛋白质，激素中有相当一部分是肽类。可见蛋白质在生命活动中无所不在，无时无刻不在发挥着重要功能。近年来发现的羊的瘙痒病（Scrapie）的病因是一种最简单的具有感染性的蛋白因子（Prion）引起的，它是比类病毒还小的微生物，未检查出其含有核酸物质，而只是一种蛋白质颗粒。这是值得人们思考的问题。 要研究蛋白质的功能，首先必须深入了解它们的结构，特别是空间结构（三维结构），因为结构决定功能，生命物质的功能和它的结构二者是统一的，有什么样的结构必有什么样的功能，反之亦然。例如，酶蛋白的催化功能只有在彻底弄清酶的活性中心与底物如何结合，并如何反应，才真正了解那种酶的作用机理。再如，在彻底弄清楚血红蛋白的分子构象及与氧分子结合后的构象的变化之后，才能完整地阐述动物机体中氧和二氧化碳的运载过程。因此，我们本章中首先介绍蛋白质结构原理的最新进展，然后再介绍几类蛋白质的结构与功能的关系及其它的有关问题。 蛋白质的结构很早就受到科学家的关注，但在50年代以前一直未能得到满意的结果。直到1952年丹麦生物化学家林德斯洛姆—兰（Linderstrom—lang）第一次提出蛋白质结构的三级结构的概念，才使蛋白质结构的研究走上了正确的道路。Linderstrom—lang的三级结构概念是：一级结构是指多肽链中氨基酸的顺序，而不涉及其空间排列状态；二级结构是指多肽链骨架（主链）的局部空间结构，不涉及侧链构象，也不考虑与其它肽链片段之间的关系及整个肽链的空间排列状况；三级结构是指整个肽链的折迭情况，或者说是指肽链中全部原子在空间的排列状态。这一概念一提出来，立即得到了科学家的认同。1958年，英国晶体学家在研究蛋白质晶体时发现，有些蛋白质是由几条相同或不同的肽链组成，每条肽链都有完整的三级结构，称之为亚基，几个亚基排列成空间几何状态，并靠非共价键结合在一起。他将这种结构称为四级结构。现在蛋白质的一、二、三、四级结构的概念已由国际生化协会（IUB）的生化命名委员会采纳并作出正式定义。到目前为止已有2000多种蛋白质的一级结构被搞清楚。据1990年4月的统计，有488种蛋白质的三级结构利用X—射线衍射技术在不同分辨率水平上得到了阐明。蛋白质三维结构的研究资料大大丰富了人们对蛋白质空间结构规律的认识，同时，蛋白质四级结构水平的概念也已不能满足人们的要求。因此，近年来蛋白质化学家又在四级结构水平的基础上增加了两种新的结构水平，即超二级结构和结构域。超二级结构是1973年罗斯曼（Rossman）提出的，是指蛋白质结构中存在的各种二级结构组合物，是构成三级结构的构件。结构域的概念是由免疫化学家波特（Porter）提出的，是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。例如，动物的免疫球蛋白（IgG）含有12个结构域。现已证明许多蛋白质含有明显的结构域。这两种新的蛋白质结构概念目前已被生物化学家及分子生物学家所公认。所以，我们所提到的蛋白质结构应包括六级水平的结构。即： 一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构 蛋白质三维结构的深入研究，不仅从分子水平上深入揭示了生命的奥秘，而且可用于生产实践。例如，80年代兴起的蛋白质工程技术，就是利用现代生物技术改造蛋白质的分子结构，提高其生物活性，使其更加符合人类的需要。所以，将蛋白质生物化学的理论知识应用于生产实践，必将对人类做出更大的贡献。 蛋白质的一级结构 蛋白质一级结构的内容 蛋白质是不分枝的生物大分子，由20种氨基酸组成（从各种生物体中发现的氨基酸有180种，参与蛋白质组成的基本氨基酸有20种，称为蛋白氨基酸，其它的称为非蛋白氨基酸），氨基酸在多肽链中有一定的排列顺序，蛋白质的一级结构就是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质一级结构也称为蛋白质的共价结构。当然，蛋白质一级结构中还应包括二硫键的定位。蛋白质一级结构包括以下几个内容： 蛋白质分子中多肽链的数目； 每一条多肽链末端氨基酸的种类； 每一条多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序； 链内二硫键的位置和数目； 链间二硫键的位置和数目。 研究蛋白质一级结构就是要研究这些内容。 蛋白质一级结构的表示方法一般是从左到右表示多肽链从氨基端到羧基端。氨基酸的种类和排列顺序通常用三字母表示，即氨基酸英文名称的前三个字母。但为了更加方便，国际生化委员会推荐了一套单字母表示法。 蛋白质一级结构的测定 1955年，英国生物化学家桑格（Sanger）首先完成了胰岛素一级结构的分析，为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。但这项工作花费了他整整十年的时间。随后，唉德曼（Edman）液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱—质谱（GC—MS）等方法相继出现，使蛋白质一级结构的分析速度大大加快。现在分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天的时间就可完成。蛋白质一级结构分析的综述和专著文献很多，在此我们只作简要的概述。 蛋白质一级结构分析的基本步骤如下； 蛋白质样品的纯化； 测定N—末端和C—末端氨基酸； 至少以两种方式裂解肽链成肽段； 肽段的分离纯化； 肽段的顺序分析； 肽段重迭重组以确定肽链的全部氨基酸顺序； 二硫键的定位。 (一)、蛋白质的纯化（均一） 在测定蛋白质的一级结构之前，首先必须保证被测蛋白质样品的纯度，只有均一的蛋白质样品，才能保证顺序测定结果准确可靠；其次要了解它的分子量和亚基数。如果某些蛋白质分子是由两个以上的肽链组成的，第一步必须将多肽链分开。蛋白质多肽链之间有非共价键和共价键（二硫键）作用力。如果只有非共价键，可用脲或盐酸胍等变性剂将其分开。如果肽链之间有二硫键，则需要用拆开二硫键的方法进行处理。拆开二硫键的化学方法主要有以下两种： 过甲酸氧化法 用过甲酸（过氧化氢+甲酸）可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在0℃下进行2小时左右，就能使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。反应如下： CH2 S S CH2 HCOOOH、0℃、2h CH2—SO3H 2 —NHCHCO— —NHCHCO— —NHCHCO— 如果蛋白质分子中同时存在半胱氨酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外，甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加了分析的复杂性。 巯基乙醇原法 利用巯基乙醇亦可使蛋白质中二硫键断裂。高浓度的巯基乙醇在pH8—9、室温下作用数小时后，可二硫键定量的还原为—SH。在此反应系统中还需加入8M脲或6M盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构象，从而有利于巯基乙醇作用于二硫键。此反应是可逆的，因此要使反应完全，巯基乙醇的浓度必需保持在0.1—0.5M。反应如下： CH2 S S CH2 CH2SH pH8-9、室温、数小时 CH2—SH CH2 S S CH2 +2 2 + —NHCHCO- -NHCHCO— CH2OH 8M脲或6M盐酸胍 —NHCHCO— CH2OH HOCH2 被还原生成的—SH不稳定，极易被重新氧化生成—S—S—，故需要稳定。稳定—SH的方法通常是用碘乙酸（ICH2COO-）使—SH羧甲基化（—SHCH2COO-），或者用氰乙烯（CH2=CH—CN）使—SH氰乙基化（—SHCH2CH2CN）。 蛋白质多肽链被拆开后，要将它们分离纯化。常用的分离纯化方法通常有凝胶过滤法、离子交换层析法、电泳法等。分离纯化后的每条肽链再进行末端分析。 (二)、末端分析 分析肽链末端氨基酸的方法很多，常用的有以下几种。 1．N—末端氨基酸分析 ①二硝基氟苯法（DNP或FDNB或DNFB） 此方法是1945年由Sanger提出的，其反应过程如下： NO2 R1 R2 O2N F + H2N—CH—CO—NH—CH—CO—肽 二硝基氟苯 肽链 NO2 R1 R2 O2N HN—CH—CO—NH—CH—CO—肽 + HF 二硝基苯肽（DNP—肽） 6MHCl NO2 R1 R O2N HN—CH—COOH + H2N—CH—COOH DNP—氨基酸 氨基酸混合物 DNP—氨基酸可用有机溶剂抽提后，通过层析法来鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此法成功地测定出胰岛素的N—末端氨基酸分别为甘氨酸和苯丙氨酸。 ②二甲基氨基萘磺酰氯法（NDS—Cl） 此方法是1956年由哈特利（Hartley）等人提出的。二甲基氨基萘磺酰氯又称丹磺酰氯，简称DNS—Cl。其反应过程如下： CH3—N—CH3 CH3—N—CH3 R1 PH9.5—10.5 + H2N—CH—CO—肽 + HCl R1 SO2Cl SO2—HN—CH—CO—肽 丹磺酰氯 丹磺酰—肽 CH3—N—CH3 6MHCl + 氨基酸混合物 R1 SO2—HN—CH—COOH 丹磺酰—氨基酸 丹磺酰—氨基酸具有强烈的黄色荧光，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析法进行鉴定。此法的优点是灵敏度高（比DNP法高100倍），且丹磺酰—氨基酸的稳定性好。 2．C—末端氨基酸分析 ①肼解法 这是分析C—末端氨基酸的最常用方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，可使C—末端氨基酸以游离状态释放出来，而其它氨基酸都与肼反应生成氨基酰肼化合物，此类化合物可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。游离的C—末端氨基酸可采用DNS—Cl或DNP等方法进行鉴定。 ②羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可分为羧肽酶A、B、C和Y（A和B来自胰脏，C来自柑桔叶，Y来自面包酵母）。应用羧肽酶水解C—末端氨基酸时，首先要进行动力学实验，以便选择合适的酶浓度和反应时间，以保证释放出的氨基酸主要是C—末端氨基酸。 (三)、氨基酸组成分析 在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先要了解它是由哪些氨基酸组成的，每种氨基酸有多少。分析组成的方法有层析法和离子交换层析法两种。层析法是将多肽链用酸完全水解成游离氨基酸，然后进行DNS（Dansyl）标记，聚酰胺薄膜层析。这是一种超微量的分析方法，但用于定量分析尚不够准确。离子交换层析是一种精确的氨基酸组分分析的定量方法 ，它是将多肽链完全水解后，通过离子交换法使各种氨基酸相互分开，再分别进行定量测定。氨基酸自动分析仪就是在此基础上发展起来的。 (四)、多肽链的降解 多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂的，因此直接分析多肽链的氨基酸顺序还是很困难的，多采用将多肽链进一步降解成肽链片段，先分析各片段的氨基酸顺序，再重迭重组确定肽链的全部氨基酸排列顺序。肽链的裂解是蛋白质一级结构研究中的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，反应产率高。目前主要有化学法和酶解法两种方法。多肽链的降解至少要用两种对肽链有不同裂解点的方法，降解生成两套以上不同的肽段。否则，将给下一步的重迭重组造成极大的困难。 化学法 最常用的化学法是溴化氢法，此法能选择性地断裂甲硫氨酸的羧基端肽键。溴化氢化学降解法的优点是：①一般蛋白质中含甲硫氨酸较少，因此裂解点少，可获得较大的肽链片段；②产率在80%以上；③作用条件温和，在室温下作用几到十几个小时即可。 近年来有一种羟胺法开始受到人们的重视。羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨酸之间的肽键（Asn—Gly）。在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键（Asn—Pro）。现已有人将这种方法用在某些蛋白质一级结构的分析上。 酶解法 酶解法比化学法有更多的优越性，使用也更广泛。因其具有较高的专一性，而且水解产率较高，所以可选择各种不同专一性的酶进行专一地裂解。常用的酶及其专一性如下： 氨基酸顺序分析常用蛋白酶及其专一性 酶 名 称 水 解 的 肽 键  胰蛋白酶 Lys（赖氨酸）、Arg（精氨酸）羧基端肽键  胰凝乳蛋白酶 Trp（色氨酸）、Tyr(酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）羧基端肽键  弹性蛋白酶 Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Ala（丙氨酸）羧基端肽键  胃蛋白酶 Tyr(酪氨酸)、Trp（色氨酸）、Phe（苯丙氨酸）氨基端肽键  木瓜蛋白酶 Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）、Gly（甘氨酸）、Leu（亮氨酸）等羧基端肽键  嗜热菌蛋白酶 Phe（苯丙氨酸）、Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Tyr(酪氨酸)、Trp（色氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Val（缬氨酸）的氨基端肽键  枯草杆菌蛋白酶 疏水侧链氨基酸残基之间的肽键   在酶法裂解肽链时，可适当的选取用一些化学药品来修饰某些氨基酸，以控制酶的专一性，使所得的肽链片段更大一些。例如，用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸酐修饰赖氨酸，则胰蛋白酶仅使精氨酸的羧基端肽键断裂，若用1,2或1,3—二羰基化合物修饰精氨酸，则胰蛋白酶仅能裂解赖氨酸羧基端肽键。当然，修饰后的氨基酸还可以解封闭，解封闭后，酶仍能选择性的作用于这些氨基酸的肽键。目前倾向于采用这种裂解方式。 (五)、肽段的分离 肽段的分离方法主要是凝胶过滤法，但单靠凝胶过滤法分离的肽段一般纯度不够，常需辅以离子交换层析法进行纯化。将裂解后的肽段分离纯化后就逐一地进行分析。 (六)、肽段的顺序分析 肽段的氨基酸顺序分析有化学法和酶解法两种。 1．化学法—Edman降解法 这是目前用于顺序分析最主要的方法。它的原理是从N—端开始，逐步降解，降解一个，分析一个。先将肽段与异硫氰酸苯酯（PTH试剂）在pH8—9的条件下作用，肽段的游离—NH2末端连接到异硫氰酸苯酯的C原子上，生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC—肽。在强酸（三氟乙酸）作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物(APZ0和一个失去末端氨基酸的肽链，此肽链不被破坏，因而又出现一个新的N—末端氨基酸。重复上述步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析。苯氨基噻唑啉酮衍生物用有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转变为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH—氨基酸），此化合物比较稳定，便于分析鉴定。反应过程如下： R1 R2 N=C=S + H2N—CH—CO—NH—CH—CO—肽 异硫氰酸苯酯（PTH） 肽段 偶联反应 pH8—9 S R1 R2 NH—C—NH—CH—CO—CH—CO—肽 苯异硫甲氨酰肽（PTC—肽） 环化断裂 CF3COOH（无水） R2 NH—C S + H2N—CH—CO—肽 HN+ C O CH R1 噻唑啉酮苯胺（ATZ） 肽段（少一个氨基酸） 转化反应 NH—C S N C S 1M HCl HN+ C O O C NH CH CH R1 R1 ATZ 苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH—氨基酸） 这些步骤通常称为Edman逐步降解法。Edman逐步降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。PTH—氨基酸可用各种层析法进行鉴定，如纸层析、薄层层析等。虽然此方法具有很多优点，但由于操作繁琐，工作量大，所以，有人根据Edman降解法的原理作了一系列的改进。例如，1967年形成的液相顺序自动分析仪和1970年形成的固相顺序分析仪都是在Edman降解法的基础上进一步改进而成的。再如，1976年有人将Edman降解法的异硫氰酸苯酯试剂改为甲氨偶氮苯—异硫氰酸盐（简称DABITC），这是一种有色试剂，产物DABTH—氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时不需要染色，用肉眼即可分辩。此方法灵敏度高，是目前一种很可取的方法。 2．酶解法 蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分别从肽链的N端和C端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。但这种方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。 另外，质谱法和气谱—质谱（GC—MS）联用法也已用于肽链的氨基酸顺序分析。这是一种不同于Edman降解法和酶解法的物理化学方法，具有一定的发展前途，但目前应用还不十分普遍，其原理我们不再介绍。 (七)、肽段的重迭重组 一但获得用两种不同方法断裂的肽段的全部氨基酸顺序后，就可用重迭重组的方法确定出整条肽链的氨基酸排列顺序。肽段的重迭重组方法我们可通过下面的例子来说明。实际工作中所得到的肽段远比下面的例子中的肽段大的多，但原理是一样的。 例如，有一个肽链，通过末端分析已知N—末端为丙氨酸，C—末端为缬氨酸，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，得一套肽段（A）；再以胰蛋白酶水解，则得到另一套肽段（B）。肽段的顺序分析结果如下： A：丙—苯丙 + 甘—赖—天冬酰胺—酪 + 精—色 + 组—缬 B：丙—苯丙—甘—赖 + 天冬酰胺—酪—精 + 色—组—缬 推理如下： A—1 丙—苯丙 B—1 丙—苯丙—甘—赖 A—2 甘—赖—天冬酰胺—酪 B—2 天冬酰胺—酪—精 A—3 精—色 B—3 色—组—缬 A—4 组—缬 此十肽氨基酸顺序为：丙—苯丙—甘—赖—天冬酰胺—酪—精—色—组—缬 (八)、二硫键的定位 蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中含二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽段的顺序，将这两个肽段的顺序与测出的一级结构比较，就能找出二硫键的位置。含二硫键肽段的检出方法如下： 凝胶过滤或离子交换层析 用凝胶过滤或离子交换层析法分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽段。 对角线电泳或层析 1966年布朗（Brown）和哈特莱（Hartlay）用对角线电泳进行二硫键的定位。此方法是将水解后的肽段混合物先进行第一向电泳，样品点在中间，电泳完毕后，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸汽处理2小时，使二硫键断裂。此时含二硫键肽段的静电荷发生了改变。然后，将纸条缝在另一张纸上，进行第二向电泳，电泳条件均与第一向相同，因此，电泳后各个不含二硫键的肽斑均坐落在纸的对角线上。而那些含二硫键的肽段由于被氧化，电荷发生了改变，在第二向电泳中，其迁移速度不同于在第一向电泳中的速度，所以就此肽斑就偏离对角线。肽斑可用茚三酮显色。对角线法速度快，操作简便，并适用于小分子样品，是直接分离含二硫键肽段的好方法。 二硫键断裂产生的肽段 蛋白质一级结构的分析正向着自动化、 快速化和微量化的方向发展，关键的问题 + 仍然是进一步寻找蛋白质裂解和肽段分离 的方法。近年来又有许多新的方法和思路 第 出现，如X—射线衍射法测定蛋白质一级 二 结构；分离出相应蛋白质的mRNA，测定出 向 mRNA的核苷酸排列顺序，再由mRNA的核 苷酸排列顺序通过密码子排出蛋白质的一 - 级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋 + - 白质一级结构研究工作的发展，使人们掌 第一向 握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。 对角线电泳图解 三、研究蛋白质一级结构的意义 研究蛋白质一级结构对我们了解蛋白质结构与功能的关系、生物进化、预测蛋白质构象等生物学问题都具有重要的意义。在此我们做以简要概述。 (一)、蛋白质一级结构与分子进化 自然界中的蛋白质有1010—1012种之多。不同的生物体各有自己的一套蛋白质，但是自然界中还存在着许多同源蛋白质。所谓同源蛋白质是指不同种属的生物体中执行同一功能的蛋白质，如动物体的血红蛋白都具有运输氧的功能，细胞色素C都具有传递电子的功能。从不同生物体的同源蛋白质一级结构的比较研究中发现，它们之间在氨基酸排列顺序上有许多异同，由此反映出了物种的进化，也证实了达尔文进化论的正确。例如，从低等生物到高等生物细胞色素C一级结构的比较中以及从脊椎动物血红蛋白一级结构的比较中绘制出的“进化树”，与分类学研究的结果完全相同。 同源蛋白质一级结构的比较研究工作开展最多的是细胞色素C。细胞色素C是从微生物到植物、动物以及人体都具有的一种最古老的蛋白质，是传递电子的载体。脊椎动物的细胞色素C由104个氨基酸残基组成，昆虫类的细胞色素C由108个氨基酸残基组成，植物的细胞色素C则有112个氨基酸残基，所有生物的细胞色素C都含有一个辅基—血红素。比较不同生物的细胞色素C的一级结构发现有35个氨基酸残基是完全不变的，这35个氨基酸残基正是完成细胞色素C的生物学功能必不可少的。这就是说，虽然生物不断进化，但只要细胞色素C仍然担负着传递电子的作用，那么，为了完成这一功能所必须的氨基酸就始终不会改变。 比较目前研究过的近百种生物的细胞色素C的氨基酸顺序，我们可以看出差异的大少与亲缘关系密切相关。如下表： 各种有机体细胞色素C中氨基酸顺序的差异 相互比较生物种类 氨基酸顺序 中差异的数目 相互比较的生物种类 氨基酸顺序 中差异的数目  人—黑猩猩 0 哺乳动物内部 平均5.1  人—恒河猴 1 猪—牛—羊 0  人—其它哺乳动物 平均约10 马—牛 3  人—禽类 平均约13 哺乳动物—禽类 平均9.9  人—昆虫 平均约30 哺乳动物—爬虫类 平均14.3  人—植物 平均约40 陆生脊椎动物—鱼类 平均18.5  人—微生物 平均约50 脊椎动物-无脊椎动物 平均26.0   同源蛋白质分子中氨基酸排列顺序的种属差异部分系生物进化过程中基因突变的结果。如果基因突变导致蛋白质一级结构改变，但不影响功能，这种蛋白质就被保留下来，这正是同源蛋白质种属差异的原因。 分子进化研究是随着蛋白质一级结构的研究发展起来的一个课题。我们知道生物均由古生物进化而来，也就是说任何生物都有其祖先，那么，蛋白质是否也有祖先蛋白的问题呢？从对几种不同蛋白质一级结构相似性的分析，可以说祖先蛋白的概念是成立的。例如，丝氨酸蛋白水解酶与胰蛋白酶、糜蛋白酶A、弹性蛋白酶以及凝血酶原的氨基酸顺序极其相似，虽然它们的祖先蛋白质的结构还不清楚，但是人们认为这些蛋白质是来自于一个共同的祖先。再如，动物的肌红蛋白与血红蛋白的α、β链的一级结构和三级结构是非常相似的，甚至植物的豆血红蛋白的结构也与它们很相似，这是因为它们有共同的祖先。它们是由同一祖先（珠蛋白）的基因发生变异形成的。又如，含有51个氨基酸残基的胰岛素是由84个氨基酸残基的的胰岛素原经酶作用切去C链后生成。而神经生长因子（NGF）是由118个氨基酸残基组成的，它与胰岛素的一级结构极其相似，因此可以认为胰岛素与神经生长因子均由祖先蛋白胰岛素原进化而来。这种从一个共同祖先蛋白质发展出另一种新蛋白质的现象称为分叉进化。分叉进化形成的两种不同蛋白质都保留着过去历史的痕迹，反映在氨基酸顺序上就有相同之处。因此，蛋白质一级结构的研究是推动分子进化研究的一个重要方面。 (二)、一级结构与功能的关系 蛋白质的氨基酸顺序与生物功能具的密切的关系，特别是蛋白质与其它生物大分子物质之间的相互作用及其作用方式都是由氨基酸顺序决定的。例如： 细胞膜上的血型糖蛋白的一级结构就与膜结构有着重要关系。血型糖蛋白的分子量为31000，含糖量为60%，由131个氨基酸残基组成，它的分子中含有16条寡聚糖链。血型糖蛋白分子一部分位于细胞外面，为N—末端部分，含有糖残基，是亲水的肽段；中间的一部分跨过细胞膜 ，这部分是由疏水氨基酸组成的；还有一部分位于细胞的内部，也是亲水的肽段。这三部分氨基酸顺序不同，分别与它们的功能有关。细胞外的部分含有寡聚糖链，与细胞的识别有关，血型糖蛋白的跨膜部分由疏水氨基酸组成，故与生物膜的脂质双层能以疏水作用力结合在一起。细胞内的部分由于是亲水的，故能溶于细胞质中。 2．蛋白质与核酸的结合也与蛋白质的氨基 血型糖蛋白的跨膜结构示意图 酸顺序有密切的关系。 例如，真核细胞染色体 DNA 与组蛋白相结合,作用力是蛋白质分子中氨 基酸残基上的正电荷与 DNA 分子中磷酸基上的 1+ + + + + 36 129 负电荷之间的静电引力.小牛组蛋白含有129个 - - - - - - DNA 氨基酸残基。 在前36个氨基酸中有12个带正 电荷(如Lys、Arg等)，而不含负电荷氨基酸。 小牛组蛋白与DNA结合状态示意图 因此，这部分肽段能与 DNA双螺旋中带负电荷 的磷酸基团通过静电引力相结合，而其它部分则折迭成球状。 3．有些激素是简单的多肽，它们各自具有特殊的功能，大多数的结构也已研究清楚，我们可以通过比较来了解肽链一级结构与功能的关系。例如，牛的催产素和抗利尿素的结构相似，都是环八肽，但有两个氨基酸不同。结构如下： S S 甘—精—脯—半胱—天冬酰胺—谷氨酰胺—苯丙—酪—半胱 （牛抗利尿素） S S 甘—亮—脯—半胱—天冬酰胺—谷氨酰胺—异亮—酪—半胱 （牛催产素） 由于结构相似，两者在生理功能上也有相似之处，但活性差别很大。催产素主要是促进子宫收缩的催产作用，但同时也具有微弱的抗利尿活性；抗利尿素的主要作用是抗利尿和增血压，但也具有微弱的催产活性。这说明由于结构相似也引起功能上互有另一种激素的微弱活性；同时也说明只要结构有差异，那怕是相差一两个氨基酸，其生物学活性就有较大的差别。 4．蛋白质一级结构改变，往往会导致功能的改变。例如，正常人血红蛋白β链从N—端开始第6位氨基酸是谷氨酸，当此氨基酸被缬氨酸取代时，将导致镰刀型贫血病。谷氨酸的侧链是带有负电荷的亲水羧基，而缬氨酸的侧链是不带电荷的疏水基团。当谷氨酸被缬氨酸取代后使Hb的表面电荷性质发生了改变，于是等电点改变，溶解度降低和不正常聚合增加，以致红细胞收缩变形而成为镰刀状，且输氧能力下降，细胞脆弱，容易溶血，严重的可导致死亡。就正是我们所说的分子病中的一种，是由于基因突变引起的，具有遗传性。 5．在动物体内的某些生化过程中，蛋白质分子的肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现生物活性。蛋白质分子的这一特性具有重要的生物学意义。这是蛋白质分子结构与功能具有高度统一性的表现。例如，在酶的调控中，早就发现，许多酶有一个无活性的前体，经专一的酶（或其它物质）作用切去一段肽链后，才成为有活性的酶（如胃肠道中的几种蛋白酶及血液中的凝血酶等）。再如，血液凝固过程中，纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程。纤维蛋白原是无活性的前体，呈细长的纤维状，由6条肽链组成，2条Aα链，2条Bβ链，2条γ链，所以可表示为（AαBβγ）2。血液凝固过程中，在凝血酶的作用下，分别从Aα链和Bβ链的N—端水解下来4个肽段，即2个A肽和2个B肽。A肽为19肽，B肽为21肽。从一级结构上讲，它们都含有较多的酸性氨基酸。当切除A、B肽后，使蛋白质分子的负电荷减少，促进了纤维蛋白分子的聚合，进而在凝血因子的作用下，形成网状结构的纤维蛋白，使血液凝固。其过程如下： 2A+2B(血液纤维蛋白肽) 凝血酶 (AαBβγ)2 自发聚合 交联作用 纤维蛋白原 (αβγ)2 [(αβγ)2]n {[(αβγ)2]n}m 转谷氨酰胺酶 纤维蛋白单体 纤维蛋白多聚体 纤维蛋白 近年来发现许多肽类激素也都存在着前体。例如，胰岛素的前体—胰岛素原是由84个氨基酸残基组成的一条长链，即在胰岛素和A、B两链之间连接着一段由30多个氨基酸组成的C链。经专一的酶水解切除C链后，才形成通过二硫键使A、B两链相连的活性胰岛素。 蛋白质在初合成或分泌运输阶段或贮存阶段是无活性的前体，在到达其发挥作用的部位或在需要其发挥作用时，才转变成有生理功能的蛋白质，这是生物体内一种十分巧妙的调控过程。 从上面几个问题人们可以清楚地看到，蛋白质一级结构的研究对阐明生命现象的本质是非常重要的。 (三)、从蛋白质一级结构预测其二、三级结构 研究蛋白质一级结构的一个重要目的是利用氨基酸顺序的资料预测蛋白质的二级以至三级结构，甚至还可以预测蛋白质的某些功能。因为蛋白质一级结构包含着蛋白质分子的所有结构信息，我们可以利用这些信息预测出蛋白质的空间结构。许多科学家在这方面已做了不少工作。例如，1975年利维特（Levitt）和沃谢尔（Warshel）从胰蛋白质抑制剂的氨基酸顺序之间的热力学相互作用数据（最小能量和热能化）模拟了该蛋白质的折迭结构，其结果与X—射线衍射的结果有相当好的一致性。1979年仇（Chou）和费思曼（Fasman）根据蛋白质中氨基酸残基形成α—螺旋、β—折迭或β—转角的倾向，预测了由一级结构折迭成二级结构、超二级结构构象，也得到了很好的结果。1982年索尔（Sauer）等人曾经指出：“顺序的同源性反应出结构的同源性。”这是很有意义的概念。现在，人们已经能够利用微电脑来研究蛋白质的分子构象。英国成立了生物化学微电脑组织，我们可以相信，随着电子计算机在生物化学中的广泛应用，今后这方面的进展将会更加神速。 蛋白质的二级结构 蛋白质二级结构是指多肽链主链上局部原子的空间排列状态。二级结构是靠肽链中 >N—H与 >C＝O之间所形成的氢键而得到稳定的。所以二级结构只涉及肽链主链的局部原子及其链内的氢键，而不涉及侧链构象和与其它肽段之间的关系。 肽键 在蛋白质分子中氨基酸靠肽键连接成多肽。肽键的结构如下： 波林（Pauling）和 莫曼奈（Momany）分别 于1951年和1975年测定了肽的键长和键角。发 H Cα 现肽键（即C′—N）的长度为0.133nm (1.33Ao )。 N C′ 而正常的C—N键长为0.149 nm (1.49Ao )，C=N Cα O 键长为0.127nm (1.27Ao )。可见,肽键的长度介于 单健和双键之间。并且C＝Ｏ比正常的醛或酮中的C＝Ｏ长了0.0012nm (0.012Ao )，Pauling解释这个现象是由于下列两个极端结构（Ⅰ和Ⅱ）之间的共振引起的。 Cα H Cα H C′ N C′ N+ O Cα O- Cα Ⅰ Ⅱ Cα H C′ N O Cα Ⅲ 肽键的实际结构是一个共振杂化体（如结构Ⅲ），这是介于结构Ⅰ和结构Ⅱ的中间状态，可以看作是结构Ⅰ和结构Ⅱ的“杂交结构”（ 结构Ⅰ和结构Ⅱ的比例为3:2）。肽键的C—N单键有40%的双键性质，肽键中C=N双键有40%的单键性质，因此，肽键具有部分双键的性质（约40%），不能自由旋转，所以肽键是一个刚性平面，称为肽平面（酰胺平面）。结构Ⅲ中的6个原子差不多处于同一平面内。在肽平面内，两个Cα处于顺式构型或反式构型。在反式构型中，两个Cα原子及其取代基团相互远离，而顺式构型中它们彼此接近，引起Cα上R之间的空间位阻。所以反式构型比顺式构型稳定，但也有例外，如脯氨酸的肽键是反式的，也可以是顺式的，因为四氢吡啶环引起的空间位阻消去了反式构型的优势。 多肽链的折叠 前面已经讲过，肽健实际上是一个共振杂化体，形成刚性的肽平面。肽平面是肽链上的重复单位，称为肽单位或肽基。肽链主链的构象可以用“二面角”来描述。两个肽平面由Cα的四面体键相连接。Cα—N1键和Cα—C2键都有是单键，所以相邻的两个肽平面可分别绕Cα—N1键和Cα—C2键旋转。绕Cα—N1键旋转的角度称φ（psi角），绕Cα—C2键旋转的角度称ψ（phi角）。原则上φ和ψ可以取-180°-- +180°之间的任一值。 当φ的旋转键N1—Cα两侧的N1—C1 和Cα—C2呈顺式时，规定φ=0°;同样， ψ 的旋转键Cα—C2 两侧的Cα—N1 和 C2—N2呈顺式时,规定ψ=0°。从Cα向 N1看，沿顺时针方向旋转Cα—N1键形成 的φ角度规定为正值， 反时针旋转为负 值；从Cα 向C2 看， 沿顺时针旋转 Cα 完全伸展的肽链构象(φ=180°ψ=180°) —C2键所形成的ψ角度规定为正值，反时针旋转为负值。 虽然φ和ψ可以在-180°-- +180°范围内自由旋转，但并不是任意二面角所决定的肽键构象都是立体化学所允许的。例如，当φ=0°、ψ=0°时的构象不可能存在。因为两个相邻平面上的酰胺基H原子和羧基O原子的接触距离比其范德华半径之和小，因此将发生空间位阻。二面角所决定的构象能否存在，主要取决于相邻肽单位中非键合原子之间接近时有无阻碍（或者说能量是否达到最低）。 Ramachandran（拉姆陈德莱）等到人在1963年研究多肽链的立体化学时，对这一复杂问题作了近似的处理。 Ramachandran等人将原子看作简单的硬球，根据范德华半径可以确定非键合原子之间的最小接触距离。 非键合原子范德华半径距离与最小接触距离（Ao） C N O H  C 3．20 2．90 2．80 2．40   （3．00） （2．80） （2．70） （2．20）  N  2．70 2．70 2．40    （2．60） （2．60） （2．20）  O   2．70 2．40     （2．60） （2．20）  H    2．20      （1．90）  （上行为Van der Waals半径距离，下行带括号的数据为Ramachandran测得的非键合原子的最小接触距离） Ramachandran根据非键合原子之间的最小接触距离，确定哪些二面角（φ、ψ）决定的相邻的二肽单位的构象是立体化学允许的，哪些是不允许的。用φ对ψ作图，得到φψ图（φψmap），或者称为Ramachandran图。 Ramachandran等人将13种球蛋白的2500个残基的主链的二面角作出分布图。在分布图中有两个最密集的区域。一个的最大密度接近（-60°， -60°），它反映球蛋白的右手α—螺旋的位置，另一个的最大密度位于（-60°， +120°），相当于β—折叠的区域。 在Ramachandran图上表现出了“允许区”、“最大允许区（临界限制区）”和“不允许区”。实线封闭区为允许区，在此区域内任何二面角所决定的肽链构象都是立体化学允许的。因为在此肽链构象中，非键合原子之间的距离不小于标准接触距离，二者之间没有斥力，构象的能量最低，所以这种构象是最稳定的。位于允许区的有α—螺旋、平行β—折叠、反平行β—折叠及胶原螺旋。虚线以内的区域为部分允许区，在此区域内φψ所决定的肽链构象也是立体化学允许的，但是不够稳定。如310螺旋、π—螺旋及αL—螺旋等。虚线以外的区域为不允许区，因为在这些肽链的构象中，非键合原子之间的距离小于极限值（比标准接触距离小0.1—0.2 Ao ），二者产生很大的斥力,构象的的能量很高。例如：当φ=0°，ψ=180°时两个肽链平面上的羧基氧原子之间的距离太近， 是不允许的。 当φ=180°，ψ=0°时，两个肽链平面上的氢原子之间的距离太近，也是立体化学所不允许的。 Ramachandran构象图 C=胶原螺旋；β=反平行β—折叠；βP=平行β—折叠；αR=右手α—螺旋； αL=左手α--螺旋；310=310螺旋；π=4.416螺旋。 由于上述原因，使肽链的折叠具有相当大的局限性，肽链的折叠只能以不发生空间障碍为标准，形成若干允许构象。但值得一提的是甘氨酸和天冬酰胺偏离允许构象很远。甘氨酸缺乏侧链的制约，常以此满足肽链急剧转折的需要，这是允许的，也是可以理解的；但天冬酰胺为何有此表现，至今未得到圆满的解释。 如果肽链规则折叠，在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，也就是具有相同的（φψ）角，这时肽链就构成一种线性组合，形成二级结构。目前已肯定下来的二级结构主要有以下几种：α—螺旋、β—折叠、三股胶原螺旋、回折结构、310螺旋、π—螺旋等。 α—螺旋 α—螺旋是人们首先肯定的一种蛋白质空间结构形式，也是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。20—30年代，X--射线衍射技术创始人布拉格(W.L.Bragg)创立了一个强有力的学派，他们一方面利用这一技术去测定无机分子的结构，同时对生命物质也表现出了极强的兴趣。这个学派的代表人物如阿斯特伯瑞(Astbury)、贝尔纳（Bernal）、克鲁福特（Croufoot）等，从30年代开始对蛋白质和核酸的X—射线衍射进行了大量的研究。Astbury首先获得了毛发纤维的衍射照片，并且发现拉伸的毛发和不拉伸的毛发衍射图样不同。这两种衍射图样代表了两种不同的空间结构，他提出不拉伸的称α结构，拉伸的称为β结构，并肯定前者比后者的结构更致密。到1951年，波林（Pauling）和科里（Correy）提出了α—螺旋和β—折叠。α—螺旋和β—折叠就是Astbury的α结构和β结构。衍射实验和以后大量的事实证明，α—螺旋的确是广泛存在于蛋白质中的一种基本的二级结构。 α—螺旋的特征是：①肽链中的肽键平面绕Cα相继旋转一定的角度形成α—螺旋，并沿中心轴盘曲前进。②螺旋上升时，每个氨基酸残基围绕中心轴盘旋100°(360/3.6)，二面角分别为：φ=-65°，ψ=-41°。③螺旋每绕一圈（360°）经过3.6个氨基酸残基(肽单位)，每个重复单位沿中心轴上升，0.15nm(1.5 Ao),螺距为0.54nm(0.15*3.6=0.54)(5.4 Ao)。五圈螺旋形成一个周期，含18个氨基酸残基，周期长为2.665nm(26.65 Ao)。④肽链中的全部 >C＝O和 >N—H几乎都平行于螺旋轴，每个氨基酸残基的>N—H与前面第四个残基上的 >C＝O靠近而形成氢键。即借氢键闭合为环，此环的原子数目为13 个原子。⑤所有的氨基酸测链 均伸向螺旋的外侧。⑥酰胺基 的3个原子N、C、O与螺旋轴 的距离分别等于0.157、0.161、 r 0.176nm(1.57、1.61、1.76 Ao),此 0.54nm 0.15nm 距离仅比范德华半径小0.01nm r=0.23nm Ao ),因此可以认为α—螺 旋是具有原子密堆积的结构， 中心腔附近没有空腔。这是它 稳定的一个重要因素。 任何一个螺旋结构都可以用3个符号S.m.R(或l)来表示。S代表螺旋每旋转一圈的氨基酸残基数，m代表由氢键连接形成的闭合环中的原子数目，R或L代珍右手或左手。因此，一个螺旋可表示为SmR或SmL。如右手α—螺旋可表示为3.613R，左手α—螺旋则为3.613L。 以α—螺旋作为基本结构的最典型实例是毛发的α—角蛋白。毛发是一种坚韧的纤维，α—螺旋作为它的基本结构单位，就好象棉纱和绳子之间的关系一样。这里有复杂的结构组织，一些细节还不能十分肯定。其基本景象如下：首先，三股右手α—螺旋向左缠绕，拧成原纤维（在这个过程中，α—螺旋沿轴线有相应的倾斜，重复距离从0.54nm缩短到0.51nm），直径为2.0nm。原纤维纵向穿过毛发。然后，9股原纤维排列成一个圆圈，围绕着另2股原纤维，构成“9+2”的电缆式结构，称为微纤维，直径为8nm。这种“9+2”的结构在其它蛋白质中也曾发现过。微纤维被包埋在含硫量很高的无定形基 质中。成百根这样的微纤维又结合成不 规则的纤维束， 称为粗纤维， 直径为 200nm。 一根典型的羊发纤维横截面直 径为20μm，由直径大约为2μm的细胞 堆积而成。在这些细胞中粗纤维沿轴纵 向排列。所以一根看似简单的毛发，具 有高度有序的结构（α—螺旋→原纤维 →微纤维→粗纤维→细胞→毛发纤维）。 毛发的性能就决定于α—螺旋以及这样 的组织方式。α—角蛋白有非常好的伸 缩性，一根毛发可以拉长到原来长度的 2倍,这时α—螺旋被撑开,各圈间的氢 键被破坏，过渡为β结构。当张力去除 后，氢键本身并不足以使纤维返回到原 来的状态。但螺旋是被包埋在基质中的， 螺旋中的半胱氨酸与基质中的半胱氨酸 之间是以众多的二硫键交联起来的。一 般认为每四圈就有一个交联。这种交联 既可抵抗张力，又形成了外力去除后使 纤维复原的恢复力。结构的稳定性主要 是由这些二硫键保证的。从任何意义上 讲，毛发都不是一个活泼的或活性很高 的蛋白质，但它仍具有这样复杂的结构， 而且分子的性能直接决定于分子的结构 及其特殊的组织方式。 根据含硫量的大小，α—角蛋白可 以分成“硬型”角蛋白和“软型”角蛋 白两种类型。蹄、爪、角、甲中的角蛋 白是高硫硬型角蛋白，质地硬，难拉伸。 皮肤和胼胝组织中的角蛋白属于软型角 蛋白，它的伸缩性比前者好。同时，α —角蛋白也具有很好的抗挠性，这也与 二硫键的交联有很大的关系。如果没有 二硫键的交联，在突然碰到外力的情况 头发（B）和头发角蛋白（A）的结构 下，α—螺旋就会断裂，而且彼此错开散乱起来。这样即使外力去除，也不能恢原。 β—折叠 早在20—30年代人们就设想，在蛋白质中存在一种近乎完全伸展的肽链构象。直到50年代初，人们才认识到，由于侧链之间的范德华斥力使这种完全伸展的肽链构象不可能存在，当然多聚甘氨酸除外。1951年Pauling和Corey提出一种稍有折叠肽链构象，称为β—折叠层。以后证实，这又是一种广泛存在于蛋白质分子中的二级结构。 β—折叠层的结构特征为：①多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向使相邻的Cα为侧链腾出了空间，从而避免了任何空间障碍。②在这种构象中Cα—Cβ键几乎垂直于折叠层平面，使相邻的侧链交替的分布在层的两侧而远离折叠层。③β—折叠为两股平行或多股平行，分为平行折叠层和反平行折叠层。如果相邻两股链的方向相同，为平行β—折叠；如果相邻两股链的方向相反，则为反平行β—折叠。反平行β—折叠在纤维轴上的重复距离等于0.7nm(7.0Ao),而平行β—折叠在纤维轴上的重复距离则为0.65nm(6.5Ao)。在纤维蛋白中, β—折叠层主要取反平行方式。在球蛋白中，反平行和平行β—折叠均广泛存在。④在β—折叠的两个肽段之间，>Ｃ＝Ｏ和 >Ｎ－Ｈ形成氢健，这是稳定β—折叠层的主要力量。⑤β—折叠有的是平面的，有 的是非平面的。大多数球蛋白中的 0.7 nm β—折叠是非平面的，具有右手的 扭曲，这种扭曲有利于围绕α—螺 旋紧紧地组装起来。扭曲的右手β —折叠也可能与生物大分子间的相 互作用有关，如象扭曲的六股右手 β—折叠适合DNA螺旋的大沟，而 反平行β—折叠 扭曲的两股反平行β—折叠则适合 ( 代表羰基氧, 代表酰胺基氢, 代表R基) DNA或RNA的小沟。因此，扭曲的 β—折叠结构可能在蛋白质与DNA（或RNA）相互作用中有着重要的意义。 丝蛋白是具有β—折叠层结构的典型代表。Marsh于1955年提出丝蛋白分子的结构模型，在此结构模型中，反平行的β—折叠片再以平行的方式堆积起来形成多层结构，链间以氢键连接，层间主要以范德华力维系。将丝水解后的化学顺序研究表明，在丝的多肽链中有一种基本的六残基单位在长距离范围内重复。这个基本单位是（Gly—Ser—Gly—Ala—Gly—Ala）n（Gly为甘氨酸、Ser为丝氨酸、Ala为丙氨酸），这是丝的独特氨基酸组成。这意味着Gly位于β层的同一侧，而所有的Ser和Ala则位于β层的另一侧。在多肽链中，两个残基的重复距离为0.7nm（7.0 Ao），反平行链间的距离为0.472nm(4.72 Ao）。许多这样的β—折叠片按Gly对Gly、Ala（或Ser）对Ala（或Ser）的方式堆积起来，这种交替堆积层之间的距离分别是0.35nm(3.5 Ao)和0.57nm(5.7 Ao）。结构中相邻的Gly取代片层表面或Ala（或Ser）取代片层表面彼此联锁起来。这样一种结构方式使得丝所承担的张力并不直接放在多肽链的共价键上，因而使这种纤维具有非常高的强度，但它没有多少延伸性，因为肽链已经在不断裂氢键的前提下处于相当伸展的状态。不过，由于堆积层是由非键合侧链原子间的范德华力维系的，又使得丝具有十分柔软的特性。 0.35nm 0.57nm 0.35nm 0.57nm 丝心蛋白的β—折叠层堆积方式（ 代表Ala或Ser、 代表Gly） 胶原螺旋 胶原是广泛存在于动物体内的重要纤维蛋白，它具有十分独特的结构形式，是由三股平行而伸展的左手螺旋按右手方向拧成的超螺旋。即形成胶原的单股链为左手螺旋，再由三股这样的左手螺旋平行排列拧成一右手螺旋，所以是一个螺旋的螺旋。每条左手螺旋的螺距为0.95nm，相邻两个氨基酸之间的距离为0.29nm，每旋转一圈需要经过3.3个氨基酸残基。右手三股螺旋的螺距为1.04nm，每旋转一圈需要经过36个氨基酸。氨基酸顺序分析表明，胶原肽链的96%遵守 （Gly—X—Y）n的三联体重复顺序。X常为Pro（脯氨酸），Y常为Hyp（羟脯氨酸）或Hyl（羟赖氨酸）。Hyp和Hyl在其它蛋白质很少发现，它们是由相应的Pro（脯氨酸）和Lys（赖氨酸）在翻译后经羟化修饰转变而来。稳定三股螺旋的主要作用力一是链间的范德华力；二是三联体之间的氢键；三是三联体之间的共价交联键。（Gly—X—Y）n的三联体重复顺序是稳定三股螺旋必不可少的条件。因为单股螺旋在形成超螺旋的过程中，大约每三个氨基酸残基中就有一个必须与超螺旋的中心轴靠近。只有在轴上没有侧链出现，才能得到致密的有氢键键合的稳定结构。只有Gly符合这个条件。因为它的侧链位置只有一个H原子。这也就解释了为什么胶原螺旋中遵守着（Gly—X—Y）n的氨基酸排列顺序。氢键主要在一条链Gly上的 >N—H与另一条链X上的 >C＝O之间形成。链间的共价交联主要在赖氨酸或羟赖氨酸残基之间形成。X和Y残基的侧链均伸向超螺旋的外侧，所以胶原螺旋的外表有突起。 胶原纤维中原胶原蛋白分子的排列方式 胶原螺旋是胶原纤维的基本结构。三股胶原螺旋又叫做原胶原，原胶原分子定向排列聚合为胶原微纤维，胶原微纤维再聚合并参入糖蛋白形成胶原小纤维，后者再进一步聚合为胶原纤维（胶原蛋白）。胶原蛋白是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，属于结构蛋白，主要存在于骨胳、肌腱、软骨、皮肤以及血管等组织中。由于胶原纤维是由这样一种伸展的多肽链组成，所以具有很强的机械强度。例如，肌腱中的胶原纤维的抗张力强度约为20—30Kg/mm2，相当于12号冷拉铜丝的拉力。 六、回折结构 近年来，在球蛋白中发现了另一种广泛存在的二级结构，即180°的转折，称之为回折，它是α—螺旋、β—折叠的连接结构。在球蛋白中回折是非常多的，可占到氨基酸残基数的四分之一。回折结构主要由亲水氨基酸残基组成，大多数存在于蛋白质的表面，以满足肽链转折的需要。在球蛋白中通常有两种回折结构，即β—转角和γ—转角。 1．β—转角 β—转角由4个氨基酸组成，第一个氨基酸残基的 >C＝O与第四个氨基酸残基的 >N—H之间形成氢键。 2．γ—转角 γ—转角由3个氨基酸残基组成，第一个氨基酸残基的 >N—H与第三个氨基酸残基的 >C＝O之间形成氢健，第一个氨基酸残基的 >C＝O与第三个氨基酸残基的 >N—H之间也形成氢键。 β—转角的两种类型 310螺旋（γ—螺旋） 这种螺旋每旋转一圈需要经过3个氨基酸残基，靠氢键形成的环由10个原子组成，螺旋的半径为0.2nm。310螺旋比较稀少，球蛋白中有时仅有一小段存在于α—螺旋末端的旋转中。 八、π—螺旋 π—螺旋每旋转一圈需要经过4.4个氨基酸残基，每个氨基酸残基沿螺旋轴上升0.11nm，螺旋的半径为0.28nm，靠氢键闭合成的环中有16个原子，故可表示为4.416螺旋。 此外，还有δ—螺旋，它和π—螺旋相似，为4.314L螺旋。 超二级结构与结构域 人们发现在蛋白质结构中有一些二级结构的组合物，充当三级结构的构件。1973年Rossman称之为超二级结构，1976年利维特（Levitt）和乔纱尔（Chothia）又称它们为折叠单元。在蛋白质结构中超二级结构比二级结构在更高一级水平上代表了蛋白质的折叠单位。超二级结构非常适合多肽链的折叠，所以在蛋白质结构中经常存在。但人们对超二级结构研究的历史还不常，积累的资料还不够多，有待进一步深入探讨。目前已发现的超二级结构有以下五种。 卷曲的卷曲α—螺旋（线圈的线圈α—螺旋） 1953年Crick提出的卷曲的卷曲α—螺旋是纤维蛋白中最常见的规则形式，在个别球蛋白中也已发现了这种结构 形式。其特征是两股（或三股）右手 α—螺旋彼此沿一个轴缠绕在一起， 形成一个左手的超螺旋，两股右手α —螺旋之间的作用角大约为18°,超 螺旋的重复距离为14nm.这种结构就 好象两根弹簧向左手方向扭在一起一 样。在球蛋白中，常常是两段这样的 超螺旋相互靠近，形成四股α—螺旋 的左手扭曲，每股螺旋和其它螺旋之 间的夹角都是18°左右,有人将其称 为“4--α—螺旋束”。 4—α—螺旋束 βξβ单元（β—片—β单元） 在多肽链的两股平行β—折叠中间以ξ连接起来，称为βξβ单元。在βξβ单元中，如果中间的连接为不规则的卷曲，就称之为βcβ单元；如果中间的连接是α—螺旋，就称为βαβ单元；如果中间连接为另一β结构，则称为βββ单元。在蛋白质中存在的βξβ单元的数量是比较多的。 蛋白质中常常还有两组βαβ组合成的一种更为复杂的超二级结构，这种结构称为Rossman折叠，它包括两个相邻的βαβ单元，即βαβαβ，有时还有ββααββ结构，这是βξβ单元的特殊形式。例如，在乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶以及丙酮酸激酶等蛋白质中都有典型的Rossman折叠—βαβαβ，在乳酸脱氢酶的结构域 2中有ββααββ形式的Rossman折叠片。 βαβ单元 βcβ单元 βββ单元 β—迂回 在蛋白质中有些β—折叠层是由3个或更多相邻的反平行β—折叠形成，它们中间以短链（大多数为β—转角）连接。1980年斯查尔（Schulz）称之为β—迂回。β—迂回也是蛋白质结构中比较常见的超二级结构。β—迂回又有多种，典型的有β—曲折和回形拓扑结构。 β—曲折 回形拓扑结构Ⅰ 回形拓扑结构Ⅱ [希腊钥匙结构（Greek Key）] [双希腊钥匙结构（double Greek Key）] β—折叠桶 蛋白质中的β—折叠层可以进一步折叠成桶状结构，1982年理查德森（Richandson）将其称为β—折叠桶，简称β—桶。 β—折叠桶由β—折叠片形成。一条长的反平行的β—折叠片全部地或部分地卷成一个桶状。但更多的β—折叠桶是由数个平行或反平行的β—折叠片组成的，少的时候可以是5个，多的时候可达到15个之多。例如，葡萄球菌核酸酶的β—桶由5个β—折叠片组成，免疫球蛋白（IgG）恒定区的β—折叠桶含有7个β—折叠片，超氧化物歧化酶的β—折叠桶由8个β—折叠片组成。β—折叠桶的中心是疏水氨基酸的侧链，而亲水氨基酸的侧链伸向外周。 Richandson将β—折叠桶的结构分为三类。 1．印地安花蓝结构 主要由β—曲折进一步折叠形成。木瓜蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂中存在着这种结构。 2．希腊钥匙结构 主要由希腊钥匙结构折叠形成。凝乳蛋白酶、超氧化物酶抑制剂等蛋白质存在着这种结构。 3．闪电结构 主要由βξβ单元进一步折叠形成。磷酸丙糖异构酶等蛋白质中存在着这种结构。 反平行β—折叠桶 平行β—折叠桶 α—螺旋—转角—α—螺旋 在1982年索尔（Sauer）等人研究蛋白质与DNA相互作用时发现，噬菌体λ434和P22的阻遏蛋白与DNA分子操纵子相结合的部位的结构都是α—螺旋—转角—α—螺旋，他们认为这也是一种超二级 结构，这种结构在蛋白质与DNA的相互作用 中占有重要的地位，这可能是与DNA相结合 α—螺旋 的蛋白质的共同特性。据测定噬菌体 λ434 和P22的阻遏蛋白的氨基酸顺序基本相同， 特别是在具有α—螺旋—转角—α—螺旋的 超二级结构的部位的氨基酸顺序完全相同。 所以，这种结构可能是许多与DNA结合的蛋 α—螺旋—转角—α—螺旋 白质的共同特点。 结构域的概念 生物化学家很早就已经注意到在蛋白质分子中存在着球状的亚结构。1959年、1966年、1968年科学家们先后分别从免疫球蛋白、溶菌酶和木瓜蛋白酶等蛋白质分子中发现了这种结构，1973年温特劳弗尔（Wetlaufer）将蛋白质中的这种亚结构称为结构域，认为蛋白质三维结构中存在的这些易于鉴别的球状亚结构具有重要的功能。目前已在大量的球蛋白、酶及结构蛋白（如肌球蛋白）中发现了结构域。 IgG分子及其结构域 IgG分子，每个圆圈代表一个氨基酸。b.可变区及恒定区结构域 大多数蛋白质分子都分裂成几个结构域，每个结构域含有40—400个氨基酸残基，但常见的为100—200个氨基酸残基，相当于直径为2.5nm的小球。形成结构域的原因可能是将蛋白质分子分隔成几个部分，使折叠过程变得简单一些，使每个独立折叠单位变得小一些。现在由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序已经了解到，每个结构域是由相应的外显子编码而成的。 结构域可以从蛋白质分子的电子密度图上看出。在进行蛋白质的X—射线衍射并计算电子密度图的过程中可以观察到，许多蛋白质分子中含有彼此连接松散的球状部分，它们的轮廓显示出这些蛋白质好象是由两个或多个裂片组成的。 目前，结构域的概念已被生物化学家普遍接受，在描述蛋白质结构时也普遍使用结构域这个名词。 结构域具有邻相关性，即在多肽链上离得比较近的氨基酸残基，在三维结构上离得也比较近，因而形成一个结构域，而哪些离得比较远的氨基酸残基在三维结构上可以形成另一个结构域。邻近相关性表明，一条多肽链的折叠行为好象一条绳子，手持绳子的一端，让另一端缓缓地落在地面上，在地面上所形成的绳子的折叠不是随意的，而是表现出邻近的部分折叠在一起，远离的部分彼此远离。绳子不是纠缠在一起的，而是提起绳子的一端很容易散开。根据这个原则，肽链不应当存在打结的结构，事实上在所有已知结构的蛋白质中都没有发现打结的结构。 酶分子的活性中心常常存在于两个结构域的交界面上，使各个结构域的功能集合起来，便于形成更特殊的分子，使之具有更特殊的功能。酶的构象变化是酶作用机理的一个重要部分，酶的构象变化就包括结构域的运动。1984年，生物化学家证明，当酶与底物结合时，酶的结构域之间的裂隙要开启或关闭。这实际上是结构域运动的结果。结构域的这种运动可使催化基团定向地包围底物，辩别出底物是否合适。结构域的运动已在柠檬酸合成酶、醇脱氢酶等许多酶分子中发现了。 蛋白质的构象变化与功能之间的关系被称为蛋白质动力学。目前，蛋白质动力学已经成为蛋白质化学或分子生物学的一个重要研究领域，它将对酶的作用机理、蛋白质的功能作出深入的、更进一步地解释，也将会使我们对生命现象的理解更加深入到分子水平。 第四节 蛋白质分子的三级结构 蛋白质分子的三级结构是指二级结构和非二级结构在空间进一步盘曲折叠，形成包括主、侧链原子在内的专一性三维排布。对单链蛋白质来说，三级结构就是分子特征性主体结构，对多链蛋白质来说，则是指各组成链的构象。所以，三级结构是蛋白质分子或蛋白质分子中亚基的所有原子在空间的排布，它不涉及与相邻分子或亚基间的相互关系。具有三级结构的蛋白质分子，都有近似球形或椭球形的物理外形，常称为球蛋白。它们虽然与纤维蛋白不同，但却含有构成纤维蛋白的许多二级结构，如α—螺旋、β—折叠，此外还有一些区段含有β—转角和不规则构象。 球蛋白的折叠原则 迄今为至，已经确定的蛋白质结构有400多种，显示出了球蛋白的一些结构规律。虽然每一种不同氨基酸排列顺序的蛋白质总是具有一种独特的三级结构。但仔细比较就可以看出，许多蛋白在基本结构上具有某些相似之处，顺序和功能很少相似的蛋白质之间也有共同的结构特点。这些共同的结构特点说明有共同的物理原因。蛋白质的结构特点反映出了两种不同的物理效应。第一种是手性效应，即蛋白质中肽链的排列是的手性的，分为左手和右手，这是由于多肽链是由手性的L—氨基酸组成的。第二种效应是α—螺旋、β—折叠这样的二级结构怎样才能最有效地组装在一起，使蛋白质与溶液接触的表面积达到最小。这对三级结构的形成是非常重要的。下面我们简要的介绍这两种效应。 手性效应对多肽链折叠的影响 根据蛋白质主要由手性的L—氨基酸组成的事实，从能量的计算上得知，多肽链最稳定的构象并不是直的，伸展的多肽链以稍向右手扭曲为好。这种扭曲的效应还可进一步使肽链以右手方式产生一个线圈。伸展的肽链扭曲的倾向使其构象在能量上达到最小。 伸展的多肽链右手扭曲的效应表现在以下两个结构特征上。第一个特征是在平行β—折叠末端的连接方向上。在反平行的β—折叠链之间可以以简单的发夹回转的方式在片层的同一端相连。但在平行β—折叠中，则要求在片层的不同端相连，从而形成交叉连接。这种连接可以是右手方向，也可以是左手方向。但实际上在蛋白质分子中观察到的交叉连接都是右手方向。这可能是因为右手交叉连接方式在能量上有利。第二个特征反映在球蛋白平行β—折叠片的几何学上。当 发夹连接 右手交叉连接 左手交叉连接 沿着肽链方向观察时，球蛋白的β—折叠片总是向右手方向扭曲。β—折叠片这种上扭曲行为是蛋白质结构上的一个重要特性，因为扭曲的β—折叠片往往能构成蛋白质结构的骨架。当然，平行β—折叠片的扭曲也不可能是无限制的，因为在扭曲过程中会遇到氢键的抵抗，即存在着扭曲力和氢键之间的竞争。所以，在几何学上往往形成“马鞍状”或“柱状β—桶”结构。 手性效应影响平行β—折叠的连接，也影响它的几何形状。按上述原则，平行β—折叠之间的交叉连接都有是右手的。所以，在平行β—折叠桶中，连接肽段不能深入到桶的中心，使桶的中心足以容纳疏水侧链。多肽链骨架以简单的右手旋转围绕着β—桶缠绕起来，一次移动一个 β—折叠片，而把α—螺旋围在外面。因此， 虽然这些结构较大，而折叠方式则很简单。在 马鞍β—折叠中，β—折叠片的每一侧有一层 α—螺旋，用右手交叉连接来完成这种结构， 多肽链必须有时沿一个方向移动，有时沿另一 个方向移动。 在反平行β—折叠桶中，手性原则也影响 了桶的形状。β—折叠片之间的连接横穿桶的 马鞍形结构 顶部或底部，而不是直接连接到它的最邻近β —片上。如果将反平行β—折叠桶展开放平，从溶剂的一侧观察，则β—折叠片呈回形拓扑结构。 二级结构的有效组装 在蛋白质三级结构的形成过程中，另一个效应是如何有效地使二级结构组装成更大的单位，并使其与溶剂的接触面积最小。 首先必须肯定单层结构的蛋白质是不稳定的，因为在单层结构中会将疏水基团暴露在溶剂中。所以蛋白质至少需要两层才能把疏水基团掩盖起来，单层结构的蛋白质是不存在的。反平行β—折叠是典型的双层结构，即由两层β—折叠构成β—折叠桶。这样一来，使β—折叠片的一侧位于桶的内侧，这一侧包含了疏水侧链；另一侧位于桶的外侧，是亲水侧链，从而使疏水基团被有效的包裹在结构的内部而且远离溶剂，以便形成稳定的结构。也有一些反平行β—折叠蛋白质只有一层β—折叠片，但在其上面又覆盖了一层α—螺旋。平行β—折叠蛋白质至少有三层或者四层结构。因为平行β—折叠片之间必须由其它结构（如α—螺旋）交叉连接。β—折叠片总是在蛋白质的中心作为结构的骨架，外周则是另外的结构。最常见的组装之一就是一系列交叉连接的βαβ结构，这种方式的组装最终形成的结构可以看作是由β—折叠组成的内部桶又被α—螺旋组成的外部桶紧紧地包装起来，所以看上去是四层。我们曾经提到过的马鞍形结构则为三层，中间是一层扭曲的β—折叠片，两侧则是α—螺旋或其它结构。 反平行β—折叠片的装配 完全由α—螺旋作为二级结构的蛋白质也有一定的组装方式（如4—α—螺旋束）。总之，蛋白质在由二级结构装配成三级结构时，都必须有效地将氨基酸的疏水侧链包裹在分子的内部。为达到此目的，二级结构的组装必须紧凑，从而使其分子与溶剂的接触面积达到最小。 平行β—折叠片的装配（A. β—折叠桶，B.马鞍形结构） 稳定三级结构的主要作用力 蛋白质分子复杂的三级结构是由复杂的作用力体系来稳定的，而且具有与非生命物质分子极为不同的作用特征。从化学键的水平上来说，存在于蛋白质分子中的主要作用力包括：二硫键、氢键、疏水作用力、离子键和范德华引力。弱相互作用（非共价键）在蛋白质三级折叠中占有重要地位，这是蛋白质分子结构的一个重要特征。在这一水平上，蛋白质分子的主链与主链之间、侧链与侧链之间以及主链与侧链之间存在着错综复杂的相互作用，从而使蛋白质分子在三维水平上形成一个有机的整体。 二硫键 二硫键是蛋白质分子中稳定三维结构的唯一共价键。二硫键在蛋白质分子中存在和作用的情况有很大的差别，一般说来，在由单链组成的小蛋白质分子（如核糖核酸酶、溶菌酶、胰蛋白酶和胰岛素等）中，这些键的比例很大，特别是胞外空间中的蛋白质中较多，如牛血清清蛋白中有7对，r—球蛋白中有16对（分子量分别为66500和160000）。但是许多蛋白质，特别是哪些多亚基蛋白质中却完全没有二硫键，如血红蛋白、胶原蛋白以及许多酶分子中都不含二硫键。 在含二硫键的蛋白质中，二硫键对三级结构的稳定性有很大的影响。二硫键的高含量可使蛋白质抵抗变性，并在二硫键不断裂的前提下，结构易于再生。因此，在局部变性的情况下，保留二硫键的片段重新折叠的概率大，这是含二硫键蛋白质的一般特征。这种付加的稳定性对于在胞外变化较大的环境中维持蛋白质的正常功能可能是很重要的。但是，大量的实验证明，直接影响多肽链三级折叠的是非共价键，而不是二硫键。这些实验和发现支持了这样一个观点：在多肽链折叠成最后稳定构象的过程中，二硫键并不起主要作用，但这种键可以补充和完善非共价键的作用，增加肽链三级折叠的稳定性。 氢键 氢键是指连接着一个电负性原子（如N、O或S）的氢与另一电负性原子之间的相互作用，可表示为：X—H Y。这是一种类似于静电引力的相互作用力。一般来说，如果X和Y都是电负性较大、半径较小的原子（如F、N、O、S等），则在X—H Y之间都可以形成氢键。如肽链主链上的 >N—H O=C< 。 在蛋白质中含有许多可形成氢键的基团，所以有大量的氢键存在。一般说来，主链上的氢键比侧链基团形成的氢键多，前者更多地具有结构上的意义，后者在功能上常起着重要的作用。在蛋白质分子中存在着错综复杂的氢键网络，它们对于维持蛋白质的三级结构的完整性和功能的灵活性具有十分重要的意义。 氢键具有两个重要的特征，即方向性和饱和度。方向性是指氢的给供体原子以及氢一般都处于非常接近一条直线的位置上。饱和性是指一个X—H只能和一个Y原子形成氢键。在形成蛋白质三级结构时，在最大限度成氢键的原则下，这两个特征都起着重要的作用。但近年来在测定的蛋白质结构中，也发现有非直线的和分叉的氢键存在。 疏水作用力 蛋白质分子中有许多非极性侧链或基团，这些非极性侧链或基团出自避开极性溶剂的需要而相互聚集的趋势称为疏水作用力。疏水作用力是一种能量效应，非极性基团相互聚集，以避开水或者说远离水，这在能量上是有利的。所以，蛋白质分子内非极性基团之间相互作用形成一个疏水“内核”，位于三级折叠的内部空间，而极性侧链或基团大多分布在三级折叠的表面，形成亲水区。这对蛋白质构象的稳定具有十分重要的意义。现在越来越多的人认为，远距离残基间的疏水作用对蛋白质的特征构象具有关键性的影响。对于一个普通组分的蛋白质来说，它的主链原子（N、Cα、C、O、H）和侧链第一个原子Cβ约占原子总数的67%，而它们在所有的蛋白质中都是相同的，显然，各种蛋白质分子的三维结构特征是由其余33%的侧链原子决定的，这充分表明了远距离铡链之间相互作用的重要性。 离子键（盐键） 离子键是指带相反电荷的基团之间的静电吸引力。蛋白质分子中，这种吸引作用主要在荷负电的Asp、Glu（高pH条件下还有Cys的巯基和Tyr的酚基）侧链和荷正电的His、Lys、Arg侧链之间产生，当然末端羧基和质子化的氨基也可以参加这种作用。由于这里的荷电性能都是基团性的，在形式上和酸碱成盐类似，所以在蛋白质化学中，更常用的名称是“盐键”。蛋白质分子中的这些基团也都有成氢键的能力，当它们位于蛋白质结构的内部时，成氢键是更基本的形式，但在特定的表面位置或在配基结合位置上，这些荷电基团之间则形成离子键，从而对这些位置的构象和特征起着重要的作用。 范德华引力 范德华力是指分子与分子或原子与原子之间接近到很短距离时才明显出现的一种静电相互作用。范德华力包括三种较弱的作用力，即定向效应、诱导效应和分散效应。定向效应发生在极性分子或基团之间，它是永久偶极间的静电相互作用。氢键也可以认为属于这种范德华力。诱导效应是发生在极性分子或基团与非极性分子与基团之间，这是永久偶极与由它诱导产生的偶极之间的相互作用。分散效应是在多数情况下起主要作用的范德华力，这是非极性分子或基团间存在的范德华力，也称之为London分散力。它是由于分子或基团中电子密度的波动（即电子运动的不对称性）而造成瞬时偶极，是这种瞬时偶极间的相互作用。偶极的方向也是瞬时变化的。 + - + - + - + - + - 定向效应 诱导效应 分散效应 蛋白质分子的三级折叠具有专一性和可变性的辨证统一。由于共价键和大量的次级键的协同作用，维持了蛋白质分子三级折叠的专一性和稳定性。但由于单个次级作用是很弱的，它的破坏和改变极为容易。少数次级作用的破坏或改变将会引起构象上的一些变化，但并不影响蛋白质的总体结构和完整性。因此，次级作用就成为蛋白质三级结构可变性和灵活反应的基础。蛋白质的结构特征和功能表现是与其错综复杂的次级作用及其灵活的专一性变化密不可分的，蛋白质变性时，其共价结构基本保持不变，被破坏的主要是分子内的次级作用；蛋白质的变构也总是伴随着次级作用的变迁。所以，不论是研究蛋白质的结构，还是探讨其功能关系，都必须充分重视蛋白质分子内的这些重要特征。 蛋白质三级折叠的形成 蛋白质三级折叠的形成的研究是目前一个十分活跃的领域。所谓蛋白质折叠是指一个新合成（或变性）多肽链的开放构象，总体转化为天然蛋白质特征的三级折叠的过程。近年来，关于蛋白质折叠的主要成就是肯定了折叠的自发性，证实蛋白质分子的特征三级折叠唯一地决定于它的氨基酸排列顺序。简单地说，一级结构决定了高级结构。关于肽链转换为三级折叠的方式、机理和过程的研究不少，但至今肯定下来的东西不多。对于蛋白质的折叠机理，目前比较流行的是随机成核理论。该理论认为，折叠为两个时相，第一时相的半成期为55毫秒，代表了蛋白质多肽链的随机成核；第二时相的半成期是350毫秒，代表了以这一核心为基础，完成其余部分的折叠。现在已提出了一种三阶段随机成核理论，按照这一理论，蛋白质分子折叠的第一阶段是成核，即小部分的肽链迅速形成α—螺旋、β—折叠等二级结构，这是进一步折叠的核心和基础。第二阶段是折卷，即已成核的结构，随后形成较大的部件（超二级结构）。这一阶段的折叠已粗略的近似于最后的结构，但在原子水平上还缺乏最后的凝聚。第三阶段是凝聚，即已形成的较大组合结构，最后在原子水平上凝聚，形成天然的致密结构。 第五节 蛋白质的四级结构 基本概念 许多蛋白质作为一个活性单位时，系由两条以上的肽链组成的。这些肽链都有各自的一、二、三级结构，每个具有完整三级结构的单位称为亚基，通常一个亚基是一条肽链，但也存在由两条或多条肽链组成的亚基，亚基的聚合体称为寡聚体（寡聚蛋白），寡聚体中亚基的数目、类型、亚基的立体排布、亚基间的相互作用与接触部位的布局均属于蛋白质四级结构研究的内容。所以，四级结构就是指蛋白质分子中亚基在空间排列状态、亚基间的相互作用以及接触部位的布局。一般说来，亚基单独存在时是没有生物学活性，只有聚合成完整的四级结构之后才具有生物学活性。在四级结构中亚基可以是相同的，也可以是不同的。例如，过氧化氢酶是由4个相同的亚基组成的，而血红蛋白则是由不同的α亚基和β亚基各一对聚合而成的。在寡聚蛋白质中，亚基与亚基之间主要以弱作用力相联结，有些蛋白质中也有二硫键。球蛋白聚合成四级结构可以形成一个更加复杂的蛋白质结构，以便执行更为复杂的功能。 亚基的数目和种类的确定 确定蛋白质分子中亚基数目的方法通常是：先用超速离心法或凝胶过滤法测定天然寡聚体的分子量，然后用盐酸胍、脲等变性剂或其它方法使分子中的亚基相互分离，再测定亚基的分子量，由二者的比例来确定寡聚体中亚基的数目。例如，大肠杆菌β—半乳糖苷酶经超速离心法测定得知其分子量为540000；经SDS凝胶电泳法测定其亚基分子量为135000，二者的比值为4，说明该酶是由四个大小相同的亚基组成，是四聚体。再如，用Sephadex G—100凝胶过滤法测定出狗肝Cu、Zn—SOD分子量为33600，经SDS电泳法测定出其亚基的分子量为16845，二者成2倍关系，因此可以断定狗肝Cu、Zn—SOD是由两个大小相同的亚基组成。 确定亚基的种类的方法是：将天然蛋白质解离成亚基后，进行超速离心和肽结构分析，通过比较分析结果来确定蛋白质分子中亚基的种类。 到目前为止，使用上述方法已经发现大约有700多种蛋白质具有四级结构。其中酶就有500多种。 亚基的排布 应用X—射线衍射技术和电子显微镜可以确定亚基的排布情况。亚基的排布多为对称型，主要有两种方式的对称。 1．循环对称（Cn） 又称环状点群对称，这是最简单的排布方式，亚基按圆周周方式对称分布。例如，电子显微镜观察发现丙酮酸羧化酶和色氨酸酶均为C4对称，即排布在正四方形的各个角上。精氨酸脱羧酶为五聚体，亚基排布于五角形的各角上，属C5对称。 C2线形 C3正三角形 C4正方形 C5正五角形 2．二面体对称（Dn） 又称二面体点群对称。例如，异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶，血红蛋白都有是四聚体，它们的亚基呈正四面体分布，即分布在正四面体的四个角上，属D2对称排布；谷氨酰胺合成酶为12聚体，各个亚基位于六角锥体的各个顶点，属于D6 对称排布。 蛋白质的亚基数多为偶数，有2、4、 6、8、12、24 ···2130（烟草斑纹病毒） 等,其中以含2、4个亚基占多数。奇数亚 基构成的蛋白质比较少，目前所知只有十 多种。亚基的种类一般是1—2种。 D2正四面体 蛋白质结构与功能的关系 血红蛋白结构与功能的关系 血红蛋白和肌红蛋白是较早阐明空间结构的重要蛋白质分子。血红蛋白的结构比较复杂，它是由四个亚基聚合而成的四聚体，每项个亚基含有一个血红素作为辅基。正常人红细胞里存在着两种血红蛋白，HbA1占血红蛋白总量的96%，由2个α亚基和2个β亚基组合而成，即α2β2。 HbA2占血红蛋白总量的1.5%—4%，由2个α亚基和2个δ亚基组成，即α2δ2。胎儿的血红蛋白主要是HbF，即α2γ2 ，出生后不久即消失，接着出现HbA1和HbA2。α亚基是由141个氨基酸残基组成的肽链，β、δ和γ亚基各含146个氨基酸残基。这几种亚基的三级结构都与抹香鲸肌红蛋白的结构极为相似，其中约有75%的主链形成8段右手α—螺旋，各命名为A、B、C、D···H，各段之间有长短不等的非螺旋部分连接，分别命名为NA、AB、BC、CD···HC，其中N与HC中的C是相应的末端。因此，各个残基都有两个编号，一个是从N端开始的顺序号，另一个是它在螺旋中的位置编号。如64位的组氨酸又可编为E7。血红蛋白是由四个亚基聚合成的四聚体，在四聚体中，四个亚基成D2正四面体分布，即四个亚基分布在正四面体的四个角上。 (一)、血红蛋白与氧的结合 血红蛋白与氧的可逆性结合可表示为： Hb + O2 HbO2， 其平衡常数为：K=[HbO2]/[Hb][O2]。与氧结合的血红蛋白称为氧合血红蛋白（HbO2），没有与氧结合的血红蛋白称为脱氧血红蛋白（Hb）。氧合血红蛋白与血红蛋白总量的百分比称为氧饱和度。即：氧饱和度（Y）= HbO2/（ HbO2+ Hb）×100% 。若以氧饱和度对氧分压作图，则得到一“S”型曲线，称为血红蛋白的氧合曲线。这与肌红蛋白的氧合曲线明显不同，肌红蛋白的氧合曲线为双曲线。 1.0 1.0 饱 0.8 肌红蛋白确良 饱 0.8 和 和 度 0.6 血红蛋白 度 0.6 Y=0.5 0.4 0.4 0.2 0.2 Po2= 26(torr) 0 0 10 20 30 40 50 20 40 60 80 100 Po2(torr) Po2(torr) 活动肌肉时毛细血管中的Po2 肺泡中的Po2 从两者的氧合曲线图上我们可以看出，氧合肌红蛋白只有在氧分压极低的情况下才具有释放氧的能力，因此认为它有储备氧的功能。而氧合血红蛋白在氧分压为40（torr）时（静脉血的氧分压）已明显释放氧，而当氧分压到达20（torr）（肌肉运动时静脉血的氧分压）时血红蛋白只保留30%动脉血的氧含量。待氧分压到达4--5（torr）时，则供氧的任务已经由肌红蛋白所取代。 血红蛋白所表现出的特殊行为是它的四级结构以及由此而产生的变构效应所导致的。当一个α亚基与氧结合后，β亚基对氧的亲合力有所增加，而当一对αβ亚基与氧结合后，另一对αβ亚基对氧的亲合力增加。这一对亚基与氧反应的平衡常数可增加5倍。这种由一个亚基与氧结合时的构象改变而引起其余亚基构象和性能改变的作用叫做变构效应（别构效应）。许多蛋白质，尤其是酶都具有变构效应，变构效应是生物用以调节高分子功能（尤其是酶功能）极为普遍的方式。 (二)、氧合引起的血红蛋白构象变化 在脱氧血红蛋白中，四个亚基是通过如图所示的盐键相互联接起来的。 Asp His NH3+ COO- β2 94 146 Arg Asp Lys Val COO- NH3+ α1 141 126 40 1 Val Lys Asp Arg NH3+ COO- α2 1 40 126 141 His Asp COO- NH3+ β1 146 94 脱氧血红蛋白中不同亚基间的交联键（盐桥） 另外在两个β亚基之间还夹着一个2,3—二磷酸甘油酸（DPG），它带有高密度的负电荷，其荷负电基团与每个β亚基的三个正电荷基团[1位上Val的 α—NH3+，82位上Lys（EF6）的ε—NH3+和143位上His（H21）的咪唑基]相互吸引，共生成六个盐键。 由于上述这些盐键的作用，使脱氧血红蛋白的构象受到很大的束缚，致使它对氧的亲合力远比单独的α亚基、β亚基或肌红蛋白对氧的亲合力低。 血红蛋白与氧结合时，其分子构象要发生一系列的变化，主要的变化有以下几个方面： ①脱氧血红蛋白中Fe的配位数为5，其中4个来自卟啉环的N，另一个来自近侧组氨酸（F8）的第三位N。此时配位场较弱，Fe（Ⅱ）与卟啉环的四个N是通过电价配位键连接的，Fe（Ⅱ）采取高自旋结构，具有4个不成对电子，分布在4个轨道上，因此原子半径大，突出在卟啉环的中央空穴之外，与卟啉环平面保持0.06nm的距离。血红蛋白氧合后，Fe的配位数为6，O2是第六个配位体。分子氧使总配位场增强，此时，Fe（Ⅱ）是通过共价配位键与卟啉环的N结合的，Fe（Ⅱ）采取低自旋结构，4个不成对电子被挤到两个轨道内，原子半径比脱氧时缩小，于是能进入卟啉环平面的中央孔穴中，移动0.06nm的距离。这一移动通过与铁结合的组氨酸（F8）残基牵动残基所在的肽链。进而影响了亚基间的相互接触，以致整个分子的四级结构发生了变化。由于血红蛋白氧合时整个分子构象的变化都是由于Fe（Ⅱ）的位移牵引肽链所引起的，所以将血红素的铁看作是血红蛋白分子呼吸的“触发器”。 His（F8） C N HC CH O2 C N N HC CH Fe N 卟啉平面 Fe O O 氧合时铁原子进入血红素平面示意图 ②F8组氨酸的位移引起亚基三级结构的微小变化，螺旋F向H移动，使二者之间的间隙缩小，将“袋穴”内的HC2Tyr排挤出去。HC2Tyr的移动，拉断了维系脱氧血红蛋白四级结构的某些盐键。 ③两个β亚基间的空隙变小，挤出DPG分子，使DPG分子与两个β亚基间形成的盐键全部断裂。 ④盐键的断裂，引起β亚基的构象变化，排出了β链67位（E11）Val的侧链对氧结合部位的空间障碍，使β亚基能够顺利的与氧结合。 ⑤血红蛋白氧合时，其亚基间的相对位置发生相当剧烈地变化。血红蛋白可以看作是αβ二聚体的二聚体（即可以看作是α1β1和α2β2的聚合）。氧合时α1β1（或α2β2）接触区结构变化不大，但两个二聚体之间发生了相对位移，旋转了15°，使两个β亚基之间的距离彼此靠近。血红蛋白由T态（紧张态）变为R态（松弛态）。即血红蛋白由对氧的低亲合力型构象变成了对氧的高并合力型构象。 氧合时血红蛋白中亚基构象变化的图解 血红蛋白四级结构的旋转变化 血红蛋白四级结构的滑动变化 氧合时一个二聚体相对于另一个二聚体旋 氧合时α1和β2链彼此滑动并更 转15°，C2对称轴自身倾斜7.5°。 换氢键的供给体 (三)、H+、CO2、DPG对Hb与O2结合的影响 H+ 对Hb与O2结合的影响—Bohr效应 H+ 浓度或pH的变化可以影响血红蛋白对氧的亲合力。在肺组织中，CO2分压低、H+ 浓度低、pH较高的情况下，血红蛋白与氧的亲合力增加，所以易与氧结合成氧合血红蛋白。但在周围组织中，CO2分压高、H+ 浓度高、pH较低的情况下，血红蛋白与氧的亲合力降低，所以氧合血红蛋白易释放出氧成为脱氧血红蛋白。这就是Bohr效应，是由丹麦生理学家Bohr提出的。由此可见，H+ 具有促进HbO2释放O2的作用。 按照Bohr效应血红蛋白与氧结合的反应应写为：HHb+ + O2 HbO2 + H+ 可见O2和H+ 都能与血红蛋白结合，但是结合的方式相反。当氧浓度高时（肺组织中），O2与血红蛋白结合，H+ 被释放出来。当氧浓度低时（在周围组织中），H+ 与血红蛋白结合，而O2被释放出来。但O2和H+ 不是与血红蛋白的同一部位结合，O2结合在血红素的Fe原子上，而H+ 则结合在血红蛋白β链146位组氨酸咪唑基以及α1链的缬氨酸的侧链上，使它们带上正电荷，并与其它荷负电的基团形成盐键。 CO2对Hb与O2结合的影响 CO2对Hb的影响有两个方面：一是与血红蛋白起作用，即与血红蛋白各肽链的N—末端NH2结合成氨甲酰血红蛋白。一般认为CO2与Hb的直接结合对CO2的运输起着一定的作用，但更重要的作用可能还是降低血红蛋白对O2 的亲合力，这一作用可初步解释为：带负电荷的氨甲酰基（Hb—NH—COO-）与一个带正电荷的基团形成盐键，起到降低氧亲合力的作用，有利于HbO2释放O2。二是间接地通过H+ 参与Bohr效应。 DPG对Hb与O2结合的影响 DPG是血细胞中糖代谢的中间产物，它可以和脱氧血红蛋白以1:1的比例结合，使血红蛋白的构象发生变化，导致氧合能力下降。 Hb + DPG Hb—DPG Hb—DPG + O2 HbO2 + DPG 目前认为，脱氧血红蛋白分子中，在两个β亚基间有一空隙恰好容纳一个DPG分子，一分子DPG能与两个β亚基空隙处的一系列正电荷形成盐键，使脱氧血红蛋白的构象更为稳定，所以能降低血红蛋白对氧的亲合力。氧合时两个β亚基相互靠近，空隙变小，DPG被排挤出去，氧亲合力也随之增加。 DPG降低血红蛋白对氧亲合力的作用有着重要的生理意义。当血液流经氧分压较低的组织时，红细胞中DPG的存在能明显增加氧合血红蛋白对氧的释放，以供给组织。DPG的浓度越大则氧的释放量越多。红细胞中DPG的浓度变化是调节血红蛋白对氧亲合力的重要因素。在空气稀薄的高山上生存的人们和患有呼吸困难性疾病的人们，红细胞中的DPG代偿性增加，使为数不多的氧合血红蛋白尽量释放氧，以满足组织的需要。有些鸟类的红细胞中不含DPG，但含有六磷酸肌醇等化合物，它在降低血红蛋白与氧的亲合力上作用比DPG更强。 综上所述，H+、CO2、DPG均能使血红蛋白四聚体稳定于脱氧构象，造成血红蛋白分子对氧亲合力下降，从而有利于氧合血红蛋白在组织中释放氧。 免疫球蛋白与防御作用 动物体对病原微生物的侵袭有防御作用。它们的防御方式有两种：①白血球向受侵部位的微生物方向运动，吞噬并破坏掉此外来侵袭物。②某些细胞（浆细胞）产生抗体，分泌到血液中，抗体与侵入的病原物质进行专一性结合而使之失去侵袭力。 凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。抗体是在抗原刺激下产生并能与抗原发生特异性反应的蛋白质，又称为免疫球蛋白。抗体是具有高度专一性的蛋白质，主要存在于血清中。正常血清中含有大量的蛋白质，在电泳时按照迁移率大小可分为白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白和γ—球蛋白。动物经注射抗原后产生的含有一定数量抗体的血清称为抗血清或免疫血清。抗血清和正常血清比较，其电泳图谱有明显的变化，血清中的γ—球蛋白显著增加。所增加的球蛋白就是抗体，目前国际上统一命名为免疫球蛋白。简称Ig。 A A γ 蛋 蛋 白 白 质 质 浓 γ 浓 β 度 α β 度 α 迁移距离 迁移距离 正常血清电泳扫描曲线 抗血清电泳扫描曲线 抗原起作用的通常是蛋白质或多糖分子表面的某些部分，可以与微生物的表层结构结合在一起，所以细菌、病毒及细菌毒素的表面都有不及一个抗原部位，因而可以诱导出多种不同专一性的抗体分子。在血液中抗体与相应抗原结合就修改了微生物的表面结构，不但使白细胞容易吞噬微生物并将它们消化掉，而且多数抗原与抗体相连接成为沉淀而失去活力的复合物，使之失去侵袭力及毒力。抗原主要来自异种生物或同种生物的异体。抗体有识别“自己”与“非己”的能力。近年来由于分子生物学的进展，使我们对免疫球蛋白的三维结构及其与抗原的结合部位有了深入的了解，从而对免疫球蛋白识别“自己”与“非己”的本领有了一定的认识。下面我们简要介绍这方面的有关问题。 (一)、抗原 抗原一词最早的概念是指一种能在脊椎动物体内引起抗体产生并与相应抗体起反应的物质。但抗原诱发的动物反应是复杂的，不同抗原或同一抗原对不同种类或个体可能引起不同的反应，可以产生抗体，即体液免疫，也可以致敏免疫细胞，即细胞免疫。但无论如何，抗原能和抗体或致敏啉巴细胞在体内或体外发生特异性的结合。所以抗原的概念有两个重要的方面，即免疫原性和抗原专一性。免疫原性是指引起免疫反应的能力，而抗原专一性是指与抗体的反应特性，这种专一性是由抗原的化学结构即整个分子的空间构象以及局部基团决定的。 抗原专一性的分子基础 抗原分子中起主要作用的是分子表面化学基团的立体构型及其空间排列图式，这些化学基团称为抗原决定簇。天然抗原大多数是蛋白质，其结构复杂，且专一性的分子基础不易分析。所以可采用人工抗原来进行抗原专一性的研究。人工抗原是将已知结构的简单分子连接在蛋白质分子上，例如将苯胺的衍生物（如对氨基苯磺酸或对氨基苯甲酸等）先重氮化，再通过酪氨酸残基与蛋白质相联，形成的偶氮蛋白质就是人工抗原。 COOH COOH COOH NaNO2+ HCl 蛋白质 （重氮化） （偶联） OH NH2 N+ N N N CH2 （蛋白质） 对氨基苯甲酸与蛋白质偶联形成的人工抗原 这些简单分子称为半抗原，而与之结合的蛋白质称为载体。在人工抗原中，半抗原是抗原决定基，具有高度的免疫学专一性，即由这些简单的化学基团决定了抗原专一性。所以。可以利用半抗原分子结构上的变化来研究抗原与抗体反应的专一性。例如，可以将对氨基苯甲酸换成邻位氨基苯甲酸、间位氨基苯甲酸，也可以将对氨基苯甲酸换成对氨基苯磺酸、对氨基苯砷酸等等，再分别免疫动物，通过抗原抗体的反应来研究抗原的专一性。经研究发现，抗原与抗体的反应决定于抗原决定簇的空间构象与抗体空间构象之间互补的密合程度。可见抗原的专一性主要依赖于表面决定簇的形状和稳定性。这就证明抗体只和抗原分子表面的一定化学基团起反应，而不是和整个大分子起反应。这些化学基团就是抗原决定簇。 抗原免疫原性的分子基础 对于作为抗原的蛋白质大分子来说，它们的免疫原性和抗原专一性决定于暴露在大分子表面的各种决定基的空间排列图式。抗原专一性决定于分子的各级结构。但免疫原性除决定于分子构象之外，更重要的是决定于以下几个因素：①外源性。抗原分子表面应具有免疫活性细胞从来没有接触过的决定簇。②分子的大小。一般情况下，分子量应大于10000。例如，卵清蛋白的分子量是40000，是一个很好的免疫原。低分子多肽或蛋白质片段也能引起免疫反应，但应的一定的条件，例如，加佐剂才能成为很好的免疫原。③分子结构和立体构象的复杂性。分子结构和立体构象复杂者，抗原性强。例如，含芳香族氨基酸的蛋白质比不含芳香族氨基酸的蛋白质抗原性强。所以，抗原分子的大小、形状只有在反映出其分子结构的复杂性和有效决定簇的数目及其复杂的排列图式时才会具有免疫原性，才是良好的免疫原。 (二)、抗体 抗体是能与抗原专一结合并引起沉淀的蛋白质分子。抗体和其他蛋白质分子一样是细胞的产物，存在于体液中或表现在细胞的表面上。通常称其为免疫球蛋白，简称Ig。 免疫球蛋白的结构 正常动物血清中含有多种免疫球蛋白，其基本结构和化学性质都是相似的。含量最丰富的是IgG（丙种球蛋白）。化学研究表明，IgG分子是由两个相同的“重链”和两个相同的“轻链”组成，各链之间有二硫键相连。 Porter在1957年用木瓜蛋白酶处理IgG，将其断裂成三个片段，其中两个是相同的，各有一个抗原结合部位，命名为Fab片段（抗原结合片段），另一个片段在抗原结合时不起作用，易结晶，命名为Fc片段（可结晶片段）。但Fab片段与抗原结合后并不沉淀，因为它们是单价的，不能产生交联晶格。 Porter进一步用胃蛋白酶处理IgG，，将其断裂成一个Fc片段和一个二价抗原结合片段，命名为（Fab′）2，即由二硫键连接起来的两个Fab片段。（Fab′）2片段与抗原结合后能够沉淀，因为（Fab′）2片段是二价的，与抗原能形成交联晶格。 Fc Fc s s s s s s 木瓜蛋白酶 s s 胃蛋白酶 s s s s s s s s s s s s s s s s Fab Fab （Fab′）2 免疫球蛋白分子中只有很少的肽键对水解酶敏感，用酶处理时断裂的部分只限于暴露的肽链柔韧区（即绞链区），而肽链的其它部分均紧密盘绕，酶不易接近。 使用抗体抗原复合物为材料，可在电镜下观察到抗体分子的实际形状。格林（M.Green）和瓦伦丁（Valentine）曾在一个八碳链的两端各连接一个二硝基苯基，制成了二价半抗原，如图所示： O2N N N NO2 NO2 O2N 0.25nm 可表示为： 此二价半抗原可以和抗体结合。在电镜下观察游离抗体时，看不见确切的东西，但此二价半抗原和抗体结合成复合物时，在电镜下可见它们呈三角形或多角形结构，并在拐角处有突起。这说明半抗原分子与三个或更多的抗体分子交联。至于半抗原分子，由于太小，因而电镜下不易看到。 二价半抗原与抗体分子交联 二价半抗原与（Fab′）2交联 经胃蛋白酶处理IgG得到的（Fab′）2片段与二价半抗原分子反应时，在电镜下仍能看到类似的几何结构，但拐角处没有突起。因此，拐角处的突起可以断定是抗体分子的Fc片段。这就充分说明IgG有两个与抗原专一性结合的位点，分别在两个Fab 上 。 抗体分子的一级结构 抗体分子的氨基酸顺序是相当有趣的，因为这些顺序的稳定性和多样性是显示抗体稳定性和特异性、多样性的分子基础。蛋白质一级结构的确定必须使用纯净的蛋白质，即不得有任何其他蛋白质的污染。确定抗体分子的一级结构是十分复杂的过程，这是由于免疫球蛋白本身就是由很多不同类型的抗体分子组成的。一个免疫纯的抗体样品中所有抗体分子都有完全相同的抗原结合特异性，但它们在化学组成和结构上并不完全相同。换句话说，抗体分子的组成是十分不均一的。所以，具有相同抗原结合特异性的抗体分子，在它们的氨基酸组成上仍有微小的差异，目前的方法还不可能将它们区别开来。但幸运的是，有一种恶性疾病叫做多发性骨髓瘤，它实际上是一种合成免疫球蛋白的细胞（浆细胞）的肿瘤。这些肿瘤细胞能产生单一类型、化学结构相同的免疫球蛋白G。实际上这并不是一种真正的抗体，但它们与正常的免疫球蛋白G的结构相同，这就为其一级结构的研究提供了极大的方便。 免疫球蛋白G由四条肽链组成，其中两条的分子量为53000，称为重链（H），另两条的分子量为22000，称为轻链（L）。轻链由214个氨基酸残基组成，从C端开始到第107个残基的顺序在不同抗体间是完全相同的，但从N端开始到第107的氨基酸残基的顺序则随抗体的不同而异。因此轻链可分为两部分，即可变区（VL）和恒定区（CL）。重链也是这样，重链由446个氨基酸组成，从N端开始到第116个残基为可变区（VH），从C端开始到第330个氨基酸残基为恒定区（CH），其长度约为可变区的3倍，分别为CH1、CH2、CH3。IgG分子中共有16个二硫键，其中12个链内二硫键，4个链间二硫键（如图所示）。在可变区内有所谓的高变区，几乎所有的氨基酸顺序变化都发生在此区域内。可变区内其余的顺序比较恒定，这可能是形成免疫球蛋白的基本结构单位所要求的。VH的高变区和VL的高变区一起组成抗原结合部位，每种抗体的特异性决定于轻链和重链高变区的氨基酸顺序。恒定区与抗体的特异性无关，主要决定着抗体结构的稳定性。重链的CH1和CH2区通过一个“绞链区”（长约30个氨基酸残基）相连，绞链区有胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用位点。在CH2区还有补体结合位点，具有结合补体的能力。 免疫球蛋白IgG分子结构示意图 抗体分子的特异性和多样性的分子基础 IgG分子可为成12个结构域。每条轻链有2个结构域，一个在VL区，一个在CL区；每条重链可分成4个结构域 ，一个在在VH区，三个在CH区，CH1、CH2、CH3各一个。每个结构域由两层反平行β—折叠片组成，两层β—折叠片之间有二硫键相连。可变区中由3个高变圈排列成高变区，高变圈是β—折叠片之间的回折连接片段，重链和轻链的高变圈集合在一起形成抗原结合部位，此结构部位从分子的立体结构上看，是由重链和轻链可变区折叠盘曲成的开口向着N端的空穴，那些高变区的氨基酸就分布在空穴的表面。既然高变区的氨基酸是多变，因此，此空穴的形状也必然是多变的，将随抗体的不同而不同，从而有可能和成千上万的抗原进行特异性的结合。 柔韧的绞链区能使Fc和Fab之间相对移动。抗体分子在没有结合抗原时，分子形状呈T—形；但当Fab与抗原结合后，通过绞链区弯曲变形呈Y—形。抗体分子从T—形变成Y—形，使隐蔽的补体结合部位暴露出来，启动了一系列与补体有关的反应。 免疫球蛋白的种类 免疫球蛋白有五种，即IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。这五类免疫球蛋白在重链的恒定区有结构上的差异。比较CH区的氨基酸顺序，结果表明存在五类重链，即α、γ、δ、ε和μ，α和γ中分别含有α1、α2和γ1、γ2、γ3、γ4亚类。各类免疫球蛋白的组成如下： 各类免疫球蛋白和组成 类别 重链 亚类 轻链 分子式 含量  IgG γ γ1、γ2、γ3、γ4 κ或λ γ2κ2或γ2λ2 80—85%  IgA α α1、α2 κ或λ (α2κ2)2或(α2λ2)2 10%  IgM μ / κ或λ (μ2κ2)5或(μ2λ2)5 5—10%  IgD δ / κ或λ δ2κ2或δ2λ2 1%  IgE ε / κ或λ ε2κ2或ε2λ2 0.01%   各类球蛋白中含有数量不同碳水化合物：IgG含2.9%, IgA含7.5%, IgM含11.8%, IgE含10.7%。五类免疫球蛋白在功能上也有所差异，IgG是机体的主要免疫能力；IgA不能被消化道所消化，子代可从母乳中直接摄入体内，所以在获得性免疫中具有生要意义；IgM是动物免疫后最早出现的抗体；IgE与某些过敏反应有尽有关；IgD的功能目前还不清楚。 蛋白质的分离、纯化与鉴定 蛋白质（酶）的制备是一件十分细致的工作，有时制备一个较高纯度的蛋白质（酶），需要付出很艰巨和长时间的努力。制备工作涉及到的物理学、化学和生物学的知识面很广。根据物理或化学的某一原理建立起来的各种分离、纯化方法虽然在不断改进，但其主要原理不外乎两个方面。一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。由于蛋白质（酶）不能熔化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，可以在这两相之间互相交替进行分离纯化。 按照蛋白质（酶）的分子量大小、形状、带电性质及溶解度等主要理化性质建立起来的分离纯化方法如下： 性 质 具 体 方 法  分子大小和形态 超速离心、超滤、分子筛（凝胶过滤）、透析。  溶解度 盐析、有机溶剂抽提、分配层析、逆流层析、结晶  电荷差异 电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析、吸附层析  生物功能专一性 亲合层析   由于不同的生物大分子结构和理化性质不同，分离方法也不一样，就是同一种生物大分子，选用了不同的材料，使用的方法也差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何生物大分子都可以循用。所以在实验前要进行充分调查研究，查阅有关的文献资料，对自己所欲提纯物质的理化及生物学性质要先有一定的了解，然后才能着手进行实验工作。对一个未知结构和性质的试样进行创造性提纯时，更需要进行各种方法的比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。其次，在进行分离纯化工作之前，常常需要建立相应的分析鉴定方法，以便正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤和不断变换各种外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程中各种方法的优劣、所选条件的分离效果好坏，均需通过分析鉴定来判别。例如，分离纯化酶时，常需测定酶的比活力及溶液中蛋白质的浓度指标。 蛋白质（酶）的分离纯化过程一般可分为以下几个阶段： 材料的选择与处理 动物、植物及微生物都是制备蛋白质（酶）的材料，选什么材料主要依靠实验的目的而定，一般应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原材料。如果是为了科学研究，则不必全面考虑上述问题，取材只需符合实验预定的目标和要求即可。先材时，还应注意植物的季节性，微生物的生长期和动物生理状态之间的差异。动物在饥饿时，脂类和糖类含量减少，有利于蛋白质、酶和核酸的分离。微生物生长的对数期，酶和核酸的含量高，可获得较高的产量。各种生物或同一生物体的不同组织细胞中，蛋白质、酶和核酸的含量和分布情况亦有所不同。材料选定以后，通常要进行预处理，动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子应先行去壳，除脂；微生物材料需要将菌体和发酵液分开。如果所得材料不能立即进行实验，则应冷冻保存，尤其是动物性材料需要深度冷冻保存。制备某些在体内易被分解的活性生物大分子，一般宜用新鲜材料。 组织细胞的破碎 除了提取体液或细菌胞外的某些多肽类激素、蛋白质、酶等不需要破碎细胞外，对于细胞内各种生物大分子的分离提取都需要事先将组织和细胞破碎，以便使生物大分子释放到溶液中。不同的生物体或同一生物体的不同组织，细胞破碎的难易程度不一，使用的方法也不完全一样。组织细胞的破碎可选用机械法、物理法、化学及生物化学法等方法。 (一)、机械法 机械法是通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法。常用的器械有： ①高速组织捣碎机。适用于动物内脏组织、植物的肉质种子、柔嫩叶芽等材料的破碎。市售商品的转速成最高可达10000转/分。 ②细胞匀浆器。其细胞破碎的程度比组织捣碎机高，机械切力对生物大分子的破坏较少，常和组织捣碎机结合使用，即先用组织捣碎机进行初步的破碎之后，再用细胞匀浆器研磨。 ③研磨。适用于植物材料和细菌的破碎。 (二)、物理法 物理法是通过物理因素的作用使组织细胞破碎的方法。可用于生物大分子物质制备的方法主要有： ①反复冻融法。把待破碎的样品放在-15-- -20℃使其冻固，然后再缓慢熔化，如此反复操作，大部分动物性细胞及细胞内颗粒可被破碎。 ②热冷交替法。从细菌或病毒中提取蛋白质或核酸时可采用这一方法。操作时，将材料投入热水中，在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中迅速冷却，绝大部分细胞可被破碎。 ③超声波处理法。此法多用于微生物材料，处理效果与样品的浓度和使用的频率有关。提取对超声波敏感的酶和核酸时要慎重使用。 ④加压破碎法。加气压或水压使每平方英寸达3—5千磅时，可使90%以上的细胞破碎。此法多用于工业上微生物酶制剂的制备。 (三)、化学及生物化学法 ①自溶法。这是将待破碎的新鲜样品放在一定的pH及适当的温度下，利用组织细胞中自身酶系将细胞破环，使细胞内容物释放出来的方法。动物性材料的自溶温度常选用0--4℃，微生物材料则多在室温下进行。自溶时，需要加入少量的防腐剂（如甲苯、氯仿等）以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，所以制备具有活性的核酸或活性蛋白质时比较少用。 ②溶菌酶处理法。溶菌酶可用蛋清或微生物发酵制得，具有专一地破坏细菌细胞壁的功能。溶菌酶作用的专一性强，适用于多种微生物样品。除溶菌酶外，蜗牛酶、纤维素酶也可用于细菌和植物细胞的破碎。 ③表面活性剂处理法。使用表面活性剂破坏膜的疏水作用，以达到破碎细胞的目的。常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、脱氧胆酸等。 除上述方法外，通过改变细胞膜的通透性，破坏膜蛋白与脂质的结合也可达到破碎细胞的目的。这方面应用较多的是用丙酮处理样品制成丙酮粉的方法。在酶的制备中，用丙酮处理不仅能有效地破坏细胞膜，而且可做成具有酶活性的丙酮干粉，长时间保存。使用时再以水或缓冲液把酶提取出来。无论用哪种方法破碎细胞都必须在一定的稀盐溶液或缓冲液中进行。 三、蛋白质（酶）的提取 大部分蛋白质（酶）都可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂。因此可采用这两类溶剂来提取和分离蛋白质和酶。 (一)、水溶液提取 蛋白质的提取一般以水溶液为主，其中稀盐溶液和缓冲液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质的最常用的溶剂。用盐溶液及缓冲液提取蛋白质和酶时应注意以下几个因素：①盐浓度。常用等渗溶液，尤其是0.02—0.05M磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15M氯化钠溶液应用较广。②pH值。蛋白质提取溶液的pH值首先要保证在蛋白质稳定的范围之内，选择在偏离等电点两侧。如提取碱性蛋白质选择在偏酸的一侧，提取酸性蛋白质选择在偏碱的一侧。③温度。制备具有活性的蛋白质或酶，为了防止变性和降解，应在低温（5℃）下操作。但少数对温度耐受力较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和下一步的纯化工作。例如，在提取SOD的过程中，可将提取液加热到50--60℃，使杂蛋白变性沉淀，但对SOD的活性影响不大。所以，热变性除杂成为分离SOD的手段之一。④其他。提取酶时，加入酶的底物，改变酶分子表面电荷的分布，可提高提取的效果。 (二)、有机溶剂提取 一些与脂质结合比较牢固或分子中非级性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱中，可用不同比例的有机溶剂提取。如胰岛素可用60%—70%的酸性乙醇提取（当然，胰岛素既溶于酸性乙醇、酸性丙酮，也溶于水溶液）。动物组织中一些微粒体及线粒体上的酶常用丁醇提出取。丁醇提取法的pH值和温度选择范围较广，pH值的可选范围3—10，温度的可选范围取 -2℃--40℃，可根据不同蛋白质的稳定性进行选择。丁醇提取法适用于动物、植物及微生物材料。 蛋白质和酶的分离纯化 从细胞中提取出来的蛋白质和酶是不纯净的，常含有多种同类和异类物质，必须进一步分离纯化才能获得纯净的样品。分离纯化是一个比较复杂和重要的环节。对于异类物质，如提取蛋白质时混杂着核酸等，一般可用专一性酶降解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质在整个制备过程中经多次液相与固相的转化可被分离，或在最后用透析的方法除去。而对于同类物质，即杂蛋白质的分离则复杂得多，主要应用的方法的盐析法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、柱层析法、梯度离心法以及电泳法等等。 (一)、盐析法 1．原理 盐析法是最早但至今仍广泛应用于蛋白质和酶提纯工作中的方法。其原理是：蛋白质（酶）在低盐浓度下的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。这是由于蛋白质分子吸附了某些盐类离子后，带电表层使蛋白质分子相互排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却增加的原因。当盐浓度不断升高时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降而先后析出，称为蛋白质盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入，使原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，使水的活度降低，从而降低了蛋白质表面的极性基团与水分子间的相互作用，破坏了蛋白质分子表面的水化层，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。盐析法就是根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而彼此分离的方法。 2.盐的选择 蛋白质的盐析常用中性盐，如硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大，25℃时的饱和溶解度为4.1M，即767g/L；0℃时的饱和溶解度为3.9M，即676 g/L。在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来。而且硫酸铵廉价易得，分段效果比其它盐好，不易引起蛋白质变性。缺点是对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力也比较差。所以有时也选用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白用硫酸钠效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。其他中性盐，如磷酸钠的盐析效果比硫酸铵好，但也是溶解度太低，而且受温度的影响也大，所以应用不广。 硫酸铵溶液的pH值常在4.5—5.5之间，市售的硫酸铵中还常含有少量的游离硫酸，致使其溶液的pH值常常降至4.5以下。当用其它pH值进行盐析时，要用氨水或硫酸来调整。 3．硫酸铵饱和度的计算方法和加入方式 在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度来表示，饱和溶液的饱和度定为100%。饱和硫酸铵溶液的配制方法是：在水中加入过量的硫酸铵，加热到50--60℃，保温数分钟，趁热过滤除去沉淀，在0℃或25℃下平衡1—2天，有固体析出时即达到100%饱和度。用硫酸铵盐析时，其溶液饱和度的调整方法有三种：①当蛋白质溶液体积不大，所需饱和度不高时，可加入饱和硫酸铵溶液。盐析所需饱和硫酸铵的数量可按下列公式计算： S2-S1 V = V0 1-S2 式中V代表所需饱和硫酸铵的体积，V0分别代表原溶液的体积，S2代表溶液所需达到的饱和度，S1代表原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但由于这种误差一般小于2%，可忽略不计。②所需达到的饱和度较高而溶液的体积又不能过分增大时，可直接加入固体硫酸铵。固体硫酸铵的加入量可按下列公式计算： G（S2-S1） X = 1-AS2 式中X代表将1升饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量（g），G和A为常数，与温度有关，在0℃时，G=707、A=0.27；在20℃时，G=756、A=0.29。③将盐析样品装入透析袋内对饱和硫酸铵进行透析，此法盐浓度变化比较连续，不会出现局部盐浓度过高的现象，但测定饱和度时比较麻烦，所以应用较少。 盐析时注意的几个问题 ①盐的饱和度 盐的饱和度是影响盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度要由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或分离后，再继续增加盐的饱和度，以便使第二种蛋白质沉淀。例如，用硫酸铵盐析分离血浆蛋白质，当饱和度达到20%时，纤维蛋白沉淀析出；饱和度增加到28%—33%时，γ—球蛋白沉淀析出；饱和度增加到33%--50%时，其它球蛋白析出；饱和度大于50%时，清蛋白沉淀析出。 ②pH值 在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出。因此，盐析时除个别特殊情况外，pH值常选择在被分离蛋白质的等电点附近。 ③蛋白质浓度 在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越容易沉淀，使用盐的饱和度就越低。例如，血清球蛋白浓度从0.5%增加到3.0%时，使用的中性盐饱和度从29%递减到24%。蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利，但浓度过高也容易引起杂蛋白的共沉现象。因此，必须选择适当的浓度，尽可能避免共沉现象的干扰。 ④温度 蛋白质盐析时对温度要求不太严格，由于盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，至于某些对热敏感的酶，则应维持低温条件。 ⑤脱盐 蛋白质（酶）应用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品或进行下一步操作。最常用的脱盐方法是透析法，即把蛋白质溶液装入透析袋内，透析袋的两端用线绳扎紧，然后对蒸馏水或缓冲液进行透析。这时，盐离子通过透析袋扩散进入水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能通过透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直到袋内盐分透析完为止。透析需要的时间较长，宜在低温下进行，为防止蛋白质变性或微生物污染，最好在水或缓冲液中加入适量防腐剂。透析脱盐也可在外加电场中进行，这种方法称为电透析。电透析装置也很简单，只要在透析缸内插入两根炭精电极，外加一整流器即可。电透析开始时，由于透析袋内盐分高，宜用低电压，随时着袋内盐分的降低，逐渐升高电压，以便缩短透析时间。电透析因电流通过袋内外溶液时产生一定的热，需要在透析缸外适当放置冷却剂或在冰箱内进行。 (二)、有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致蛋白质溶解度降低；另外，有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，所以使蛋白质分子在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。有机溶剂沉淀法就是利用蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异而达到分离目的方法。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮。但高浓度的有机溶剂易引起蛋白质变性失活，所以操作必须在低温下进行，并且在加入有机溶剂时不能太快，还要搅拌均匀，以避免局部浓度过大而引起部分蛋白质变性失活。用这种方法析出的沉淀，一般比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心。分离出的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH值在大多数情况下也应控制在被分离蛋白质的等电点附近。在有机溶剂沉淀时，若有少量中性盐存在，能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05M左右，过多不仅耗费有机溶剂，而且会影响沉淀效果。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制才能获得较好的重复性。有机溶剂沉淀蛋白质的分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。缺点是容易引起酶和具有活性的蛋白质变性。所以，在操作时要求的条件比盐析法严格。 (三)、等电点没淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质具有不同等电点的特点进行分离的方法称为等电点沉淀法。但在等电点时，各种蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，同时许多蛋白质的等电点十分接近，故单独使用此法效果不理想，分辨力也差。所以此法多用于提取后去除杂蛋白，即通过变动提取液的pH值，使某些与待提纯蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉淀析出。实际工作中常把等电点沉淀法和盐析法、有机溶剂沉淀法联合使用。 (四)、选择性变性法 选择一定的条件使其他蛋白质变性沉淀而又不影响待提纯蛋白质的分离方法，称为选择性变性法。 例如，将提取液加热到一定程度并维持一段时间（10--15′），可使某些杂蛋白变性沉淀；或加入惰性液体（如氯仿）振荡和利用泡沫的形成可使杂蛋白产生表面变必；另外，还有利用酸碱或加入重金属离子进行选择性变性的。应用选择性变性法时，必须事先对系统中需要除去的和待提纯的蛋白质的理化性质要有一个较全面的了解，否则，盲目的工作有可能事与愿违。 (五)、吸附法 在蛋白质的提纯方法中，选择性吸附也是应用较久迄今仍广泛采用的方法之一。早期工作常用高岭土（我国的一定土质，其分子式大致是：Al2O3·2SiO2·2HO2）、氧化铝（Al2O3）及活性炭等吸附剂，由于这些吸附剂吸附能力较弱，或者易引起蛋白质变性而应用不广，现已为凝胶性吸附剂所代替，如氢氧化铝凝胶、磷酸钙凝胶等，尤其后者使用最广。 吸附剂的应用有两种不同的方式，当蛋白质较易吸附时，可以选择适当条件主要吸附蛋白质而分离去杂质；当蛋白质较难吸附时，则可选择有利于吸附杂质的条件吸附杂质而将蛋白质留在溶液中。有时两种方法可先后使用，以达到较高的提纯目的。吸附通常在微酸性条件下（pH5—6）及稀盐溶液中进行，盐浓度过高会干拢对蛋白质或酶的吸附。洗脱一般在弱碱性条件或适当提高洗脱液离子强度的条件下进行。 吸附操作可以用静态吸附，也可以用柱层析吸附。柱层析吸附是将吸附剂装入层析柱中进行吸附操作。吸附剂装柱后，如果溶液的通过能力较差，可用助滤剂（如硅藻土）和吸附剂混合装柱，来提高溶液的通过能力。调节助滤剂和吸附剂的比例，可获得不同通过能力和不同吸附能力的层析柱。最近还使用羟基磷灰石[Ca10(PO4)6·(OH)2]分离蛋白质和酶，它可在高盐浓度下吸附中性或酸性杂蛋白而排出碱性蛋白质。吸附量可达50g/L，又可省去吸附前透析平衡的繁琐操作。 (六)、离子交换法 蛋白质和酶都具有电解质性质 ，所以可用离子交换法进行分离提纯，特别是经过了初步纯化后的蛋白质和酶采用此法效果尤为显著，有关离子交换剂及其使用方法在此不作过多的介绍，我们只着重介绍近年来以纤维素衍生物作为离子交换剂纯化蛋白质及酶的方法。在这类衍生物中以二乙氨基乙基纤维素和羧甲基纤维素应用最广。前者简称DEAE—纤维素，为阴离子交换剂；后者简称CM—纤维素，为阳离子交换剂。 DEAE—纤维素是纤维素结构中的氢原子被一定数量的二乙氨基乙基取代生成的弱碱性化合物。它作为阴离子交换剂的原理是： [纤维素—OCH2CH2N+(C2H5)2]B- + (蛋白质)- H [纤维素—OCH2CH2N+(C2H5)2](蛋白质)- + B- H 实际工作中常用磷酸盐缓冲液平衡DEAE纤维素后，才能对蛋白质进行交换吸附，所以B-可视为PO43-。DEAE—纤维素吸附蛋白质的常用pH范围为7—9，洗脱条件是提高盐浓度或降低pH值。洗脱下来的蛋白质溶液有时可进一步上CM—纤维素柱纯化。 CM—纤维素是纤维素结构中的氢原子被一定数量的羧甲基取代生成的弱酸性化合物。它作为阳离子交换剂的原理是： [纤维素—OCH2COO-]A+ + (蛋白质)+ [纤维素—OCH2COO-](蛋白质)+ + A+ 上式中A+可为H+或Na+，视平衡CM—纤维素时所用溶液剂而定。CM—纤维素吸附蛋白质的常用pH范围为4.5—6.0左右，洗脱条件是提高盐浓度或提高pH值。 离子交换纤维素对大分子物质有较大交换量，理论上离子交换纤维素的一个离子交换基团可和一个相对分子质量为10000或更大的蛋白质分子结合。例如，CM—纤维素对蛋白质的交换量为93—98mg/100mgCM—纤维素；DEAE—纤维素对蛋白质的交换量为75--122 mg/100mgDEAE—纤维素。此外纤维素离子交换剂还具有层析条件温和、物质易于洗脱、分辨力强、被分离物质不易变性等优点。 除了纤维素离子交换剂外，离子交换凝胶也是目前应用于蛋白质和酶的一种很好的离子交换剂。常用的有DEAE—葡聚糖凝胶和CM—葡聚糖凝胶。离子交换凝胶不仅具有交换量大、层析条件温和、操作简便等优点，而且兼备分子筛的性能，在梯度洗脱时，对不同分子量的蛋白质具有很高的分辨力。 (七)、结晶法 结晶是溶液中的溶质呈晶态析出的过程，它是生物大分子—蛋白质和酶分离纯化的方法之一。晶体的形状、大小可在显微镜下观察。 蛋白质和酶结晶的条件 ①纯度 蛋白质和酶在结晶时同样需要达到一定的纯度。若制品的纯度太低，就不能或者很难结晶。但究竟纯度达到什么程度才能结晶，依各种物质而异，没有一定的标准。蛋白质和酶结晶时，纯度应不低于50%。总的趋势是制品越纯越易结晶，但已结晶的制品并不代表已达到了绝对的统一纯度，只能说到了相当纯的程度了。大多数分子在第一次得到结晶后仍可进行多次结晶，每次重结晶都会使纯度有一定的提高，直至结晶的形态和大小衡定为止。 ②浓度 浓度越高，越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，所以结晶液的浓度一般要求较高，但不宜在过饱和状态下结晶，过饱和溶液中结晶时杂质较多，晶形也不好。 ③pH值 与沉淀蛋白质和酶的原理相同，结晶溶液的pH值选择在被结晶蛋白质和酶的等电点附近，有利于晶体的析出。 ④温度 除少数情况外，通常选择低温条件进行结晶。低温条件不仅使蛋白质和酶的溶解度降低，而且不易变性。在中性盐溶液中结晶时温度可在0℃至室温范围内选择，而在有机溶剂中结晶时要求的温度较低。 ⑤晶种 不易结晶的蛋白质和酶，常需要晶种接种。有时用玻璃棒轻轻刮擦容器壁也可达到此目的。 ⑥结晶时间 在结晶条件比较合适的条件下，几个小时甚至几分钟就可获得结晶，但有些情况下则需要几天甚至几个月才能结晶完全，视各种蛋白质和酶的具体情况不同而定。 蛋白质和酶的结晶大多数是针状、棒状、片状等，也有的呈八面体或立体菱形状结晶，结晶的大小和时间与条件有关。 结晶方法 结晶方法可分为：盐析法、有机溶剂法、等电点法、脱盐结晶法、利用金属离子结晶法等。不论哪一种方法，其原理都建立在降低蛋白质和酶溶解度的基础上。 在分离纯化蛋白质和酶时，若用上述单一的某一种方法一般达不到很好的分离效果，常需要将几种方法结合使用，才能达到预期的目的。例如，在提纯胰蛋白酶时，需要将等电点沉淀法、盐析法和结晶法结合使用，才有可能获得纯度较高的制品。 蛋白质含量测定与纯度鉴定 在蛋白质分离提纯过程中，经常需要测定蛋白质的含量和检查某一蛋白质的提纯程度。 测定蛋白质总量常用的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚试剂法（Lowry法）和紫外法等。 蛋白质制品纯度的鉴定通常采用电泳法和沉降分析法等。纯的蛋白质不论在任何pH条件下电泳，都只有一条区带或者说在电泳图谱中只有一个峰。同样在沉降分析中，纯的蛋白质在离心力的影响下，以单一的沉降速度运动，也只有一个区带。 有时还需要测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量，这种测定过程必须要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质，可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量。有些蛋白质虽然没有酶或激素那样特异的生物学活性，但大多数蛋白质被注射到适当的动物血液中时，会产生抗体，利用抗原—抗体反应也能测定某一特定蛋白质的含量。这些生物学方法和总蛋白质测定配合起来，可以用来衡量蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的提纯程度。提纯程度用这一特定蛋白质与总蛋白之比来表示，通常表示为每毫克蛋白质含多少活性单位（对于酶蛋白来说，这一比例称为比活力或比活性）。提纯工作一直要进行到这个比例不再增加为止。 第三章 核酸生物化学 核酸是重要的生物大分子。核酸的研究已有一百多年的历史。早在1868年，瑞士的一位青年科学家F.Miescher从外科绷带上的脓细胞核中分离出了一种有机化合物，它的含磷量之高超过任何当时已经发现的有机化合物，并且有很强的酸性。由于这种物质是从细胞核中分离出来的，当时就称为核素。F.Miescher所分离到的核素就是我们今天所指的脱氧核糖核蛋白。核素中脱氧核糖核酸含量为30%。以后陆续证明，任何有机体，包括病毒、细菌、动植物等都无一例外地含有核酸。核酸占细胞干重的5%—10%。 核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。所有生物细胞都含有两类核酸。DNA主要集中在细胞核内，线粒体、叶绿体中也含有DNA。RNA主要分布在细胞质中，细胞核中也有少量RNA。但对于病毒来讲，要么只含DNA，要么只含RNA。还没有发现既含有DNA，又含水量有RNA的病毒。所以可按照所含核酸的类型，将病毒分为DNA病毒和RNA病毒两大类。 核酸的生物学作用是sdg4/ 在发现核酸70多年以后才被证明的。这就是1944年由Avery等人通过著名的肺炎球菌转化实验证明了使肺炎球菌的遗传发生改变的转化因子是DNA，而不是蛋白质。这一发现极大地推动了对核酸结构和功能的研究。 1950年以前，四核苷酸结构学说流行。这种学说认为，任何核酸分子都是由等摩尔的四种核苷酸组成。因此，认为核酸不大可能具有重要的生理功能。这样一来，尽管Avery等人的实验有力地证明了DNA是重要的遗传物质，而反对者仍认为蛋白质才是转化因子。直到1950年前后，Avery等人的发现才得以公认。 1950年以后，查盖夫（Chargaff）和马卡姆（Markham）等人应用纸层析技术和分光光度计大量地测定了各种生物的DNA碱基组成后，才发现不同生物的DNA碱基组成不同，有严格的种的特异性，这就给了四核苷酸学说致命地打击。同时他们还发现，尽管不同生物的DNA碱基组成不同，但总是A=T、G=C，提示了A与T、G与C之间的互补概念。这一极重要的发现，为以后Watson和Crick建立DNA的双螺旋结构模型提供了重要的依据。 1953年DNA的双螺旋结构模型的提出，被认为是20世纪在自然科学中的重大突破之一。它揭开了分子生物学研究的序幕，为分子生物学的研究奠定了基础。此后，分子生物学所取得的突飞猛进地发展与DNA双螺旋模型的建立是分不开的。 70年代初建立起来的DNA重组技术是生命科学发展中的又一重大突破。一门崭新的科学----基因工程诞生了。人们终于可以按照拟定的蓝图来设计出新的生物体。在工业、农业、医学、药学等应用领域，基因工程技术得到了广泛地应用，并已创造了巨大的财富。同时，基因工程技术又是进一步揭示生命奥秘的有力武器。它大大推动了分子生物学和分子遗传学等学科的飞速发展。 DNA的空间结构 DNA的双螺旋结构 目前公认的DNA双螺旋结构模型的建立，主要有两方面的根据：一是DNA碱基组成的定量分析；二是对DNA纤维和DNA晶体的X—射线衍射分析。Watson和Crick二人在1953年提出的DNA双螺旋结构模型在分子生物学发展上具有划时代的贡献，为分子生物学和分子遗传学的发展奠定了基础。由于当时还不可能获得DNA分子结晶，Watson和Crick所用的资料来自在相对湿度为92%时所得到的DNA钠盐纤维。这种DNA称为B型DNA（B—DNA）。在相对湿度低于75%时获得的DNA钠盐纤维，其结构有所不同，称为A—DNA。另外还发现了一种左手双螺旋结构，称为Z—DNA。在生物体内天然状态的DNA几乎都以B—DNA的形式存在，所以我们重点讨论B—DNA的空间结构。 (一)、B—DNA的结构 Watson和Crick提出的B—DNA结构模型具有以下几点特征。 两条反方向平行的脱氧多苷酸链围绕同一中心轴缠绕成右手螺旋型。 嘌吟与嘧啶位于双螺旋的内侧，碱基的平面与中心轴垂直。磷酸与核糖在双螺旋的外侧，彼此通过3′，5′磷酸二酯键相连接，形成DNA分子的骨架，戊糖环的平面与中心轴平行。 双螺旋上有两条螺纹沟，一条较深，一条较浅。较深的称为大沟，宽为1.2nm，深度为0.85nm。较浅的沟称为小沟，宽度为0.6nm，深度为0.75nm。 双螺旋的直径为2.0nm，两个相邻的碱基之间堆积距离为0.34nm，两个核苷酸之间的夹角为36°。因此，沿中心轴每旋转一周需要10个核苷酸。螺距为3.4nm。 两条核苷酸链彼此依靠碱基之间的氢键相连系而结合在一起。根据分子模型计算，只有一条链上的嘌呤与另一条上的嘧啶相匹配，其距离才正好与双螺旋的直径相吻合。碱基构象的研究结果表明，A只能与T配对，可形成两个氢键，G只能与C配对，可形成三个氢键，所以G、C之间的连接较为稳定。上述碱基之间的配对规律称为碱基配对原则或碱基互补原则。根据碱基互补原则，当一条多核苷酸链的顺序被确定后，即可推知另一条互补链的序列。碱基互补原则具有极重要的生物学意义。它是DNA复制、RNA转录、反转录及其翻译等过程的分子基础。 (二)、A—DNA 在相对湿度低于75%时获得的DNA纤维的X—射线衍射分析资料表明，这种DNA纤维具有不同于B—DNA的结构特点，称为A—DNA。A—DNA亦是由两条反方向的多核苷酸链缠绕成的右手螺旋，但是螺旋体较宽，直径为2.55nm，碱基对与中心轴之间有20°的倾角。RNA分子的双螺旋区以及RNA—DNA杂交双链也都具有与A—DNA相似的结构，这是因为RNA分子中核糖环上有2′--OH存在，从空间结构上说不可能形成B—型结构。 (三)、Z—DNA的结构 除了A—DNA和B—DNA以外，自然界中还发现了一种Z—DNA。A.Rich在研究CGCGCG寡聚体的结构时发现了这种DNA。虽然CGCGCG的晶体也呈双螺旋结构，但它不是右手螺旋，而是左手螺旋。所以这种DNA称为左旋DNA。Z—DNA较B—DNA细一些，直径为1.84nm，其磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈“Z”字型，因此而得名。 天然B—DNA的局部区域可以出现Z—DNA结构，说明B—DNA与Z—DNA之间是可以相互转变的。 环形DNA 生物体内的有些DNA是以双链环形DNA的形式存在的，如病毒DNA、细菌质粒DNA、真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA等，许多细菌染色体DNA（如大肠杆菌染色体DNA）也是环形DNA。 有些环形DNA还可以进一步形成超螺旋，或称连锁状DNA。从力能学的观点来说，超螺旋DNA更容易形成。超螺旋DNA具有更致密的结构，可以将很大的DNA分子压缩在一个极小的体积内。在生物体内，绝大数DNA确是以超螺旋形式存在的。由于超螺旋DNA有较大的密度，在离心场中的运动较线形或开环形DNA要快，在凝胶电泳中泳动的速度也较快。所以应用离心和电泳可以很容易地将不同构象的DNA分离开来。 真核细胞染色体DNA，是以染色质的形式存在于细胞核中。染色质的结构极为复杂。染色质的基本构成单位是核小体，核小体的主要成分为DNA和组蛋白，组蛋白构成核心颗粒，双螺旋DNA则盘绕在此核心颗粒上形成核小体。核小体之间由高度折叠的DNA链相连接，构成念珠状结构。念珠状结构再进一步盘绕成更复杂更高层次的结构。 核酸的某些理化性质及常用研究方法 核酸的紫外光吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，所以碱基、核苷、核苷酸和核酸在240--290nm的紫外波段内有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同的核苷酸有不同的吸收特性。所以，可以用紫外分光光度计对核酸进行定量或定性测定。 实验室中最常用这一特性定量测定小量纯的DNA和RNA。也可用紫外法检测样品是纯品，检测时用紫外分光光度计读出260nm和280nm处的OD值，从OD260／OD280的比值即可判断样品的纯度。纯的DNA OD260／OD280应为1.8，纯的RNA应为2.0，样品中如果含有杂蛋白或苯酚，OD260／OD280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量分析。对纯的样品只要读出260nm处的OD值即可算出含量。通常1OD值相当于50μg/ml双螺旋DNA，相当于40μg/ml单链DNA或RNA，相当于20μg/ml寡聚核苷酸。这个方法快速，又相当准确，而且不会浪费样品。 核酸的沉降特性 溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。线形DNA、开环形DNA、超螺旋DNA、蛋白质及其它杂质，在超速离心机的强大力场中，沉降速率有很大差异。所以，可以用超速离心法纯化核酸，或对不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸沉降系数与分子量。 应用不同介质组成的密度梯度超速离心分离核酸时，效果较好。分离RNA常用蔗糖梯度，分离DNA最常用的是氯化铯梯度，氯化铯在水中有很大的溶解度，可以制成浓度很高（80mol/L）的溶液。如果分离不同构象的DNA、RNA及蛋白质，则可用啡啶溴红—氯化铯密度梯度。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可在紫外光照射下显得一清二楚。蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降较快，其次是线形DNA，再次是开环形DNA。用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。可用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除去氯化铯，再用苯酚抽提1—2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。这样得到的DNA有很高的纯度，可供DNA重组、序列测定及制作限制酶图谱之用。在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯梯度离心分离。 凝胶电泳 DNA分子的大小不同，在直流电场中的泳动速度不同；DNA的构象不同，泳动速度也不同。一般说来，分子量小，泳动快，分子量大，泳动慢。一般情况下超螺旋DNA的迁移率最快，其次是线形DNA，开环形DNA最慢。所以，既可以用凝胶电泳法分离纯化不同构象的DNA，也可以分离分子量大小不同的DNA，也可以测定DNA样品的分子量，还可以大体上判断出样品的浓度。 常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。既可以在水平槽中进行电泳，也可以在垂直槽中进行电泳。凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效应，所以分辨率很高。但用于小量DNA分子的定量分析则不够灵敏。 电泳完毕后，可将凝胶在荧光染料啡啶溴红水溶液中染色。DNA与啡啶溴红结合后，经紫外光照射可发射出红橙色可见荧光。在琼脂糖凝胶上，0.01μg的DNA即可用此法检出，所以十分灵敏。根据荧光的强弱程度可以大体上可判断出DNA样品的浓度，若在同一凝胶上加上已知浓度的DNA作参考，则所测得的样品浓度更为准确。 用凝胶电泳测定DNA分子量大小，则是在同一凝胶上加上一个或一组已知分子量的样品，电泳完毕后，用啡啶溴红染色，根据标准样品的分子量和迁移率及待测样品的迁移率即可推算出待测样品的分子量。 凝胶上的样品还可以设法回收，以供进一步研究之用。回收方法很多，最常用的方法是将胶上的某一区带在紫外光照射下切割下来，将切下的胶条放入透析袋中，装上电泳液，在水平槽中进行电泳，让胶条中的DNA释放出来，溶解在缓冲液中，收集缓冲液，用苯酚抽提1—2次，水相用乙醇沉淀，即得到纯的DNA样品。这样回收的DNA纯度很高，可供限制酶分析、序列分析或末端标记之用。 核酸的变性、复性与杂交 (一)、DNA的变性 变性是核酸的理化性质之一。核酸的变性是指核酸的双螺旋区的氢键断裂，两条链相互分开成为单链的现象，它不涉及共价键的断裂。多核苷酸链骨架上共价键（3′,5′磷酸二酯键）的断裂称为核酸的降解。 引起核酸变性的因素很多，由温度升高引起的变性称为热变性；由酸碱引起的变性称为酸碱变性。有些有机化合物（如尿素）也可引起核酸的变性。 当将核酸的稀盐溶液加热80--100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，并形成线团状结构，同时生物学活性也部分或全部丧失，理化性质也发生改变，如OD260值升高，粘度下降，浮力系数增加等。DNA的变性如同固体物质的熔解，是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。通常将50%的DNA变性时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm一般在70--80℃之间，主要与以下几个因素有关： 1．DNA的均一性 均一性越高的样品。熔解过程越是发生在一个很窄的温度范围内，即Tm的范围越小。 2．G-C的含量 G-C含量越高，Tm值越高，二者呈正比例关系。这是因为G-C对比A-T对更为稳定的缘故。所以测定Tm值可以推算出G-C对的含量，其经验公式为：G-C％ =（Tm-69.3）×2.44。 3．介质中的离子强度 一般说来，在离子强度低的介质中，DNA的熔解温度较低；而在离子强度高的介质中，Tm值则较高。所以，DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液或盐溶液中。如常保存在1mol/L NaCl溶液中。 RNA分子中有部分的双螺旋区，所以RNA也可发生变性，但Tm较低。 (二)、复性 在适当的条件下，娈性的DNA两条彼此分开的单链又可重新缔合为双螺旋结构，这个过程称为复性。DNA复性后，许多理化性质随之恢复，生物学活性也得到部分恢复。例如，将热变性的DNA骤然冷却时，DNA就不可能复性，但如果缓慢冷却，则可以复性。复性也与很多因素有关： DNA片段越大，复性越慢。 DNA浓度越大，复性越快。 均一的DNA易复性，非均一的DNA不易复性。 DNA的重复序列越多，复性越快。 (三)、核酸的杂交 将不同来源的DNA放在同一试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA在某些区域有相同序列，在复性时，则形成杂交DNA分子。DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和分子遗传的研究中应用极广，许多重大的分子遗传学问题都是用分子杂交技术来解决的。 核酸杂交可在液相或固相上进行。目前实验室中应用最广的是以硝酸纤维素膜作支持物进行的杂交。英国生物化学家E.M.Southern所发明的Southern印迹法就是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上之后，再进行杂交的。这里我们以DNA—DNA的杂交为例来介绍Southern印迹法的简要过程。 将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶进行电泳分离。将胶片浸泡在氢氧化钠溶液中进行变性，将变性的DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性的DNA），在80℃烘烤4—6小时，就可使DNA牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。然后与放射性同位素标记的变性后的DNA探针进行杂交，杂交需要在较高的盐浓度和适当的温度下（一般68℃）进行数小时或十余小时，通过洗涤除去未杂交的标记物，将硝酸纤维膜烘干后进行放射自显影，在乳胶片上就可清楚地显示出杂交DNA所在的位置。除DNA外，RNA也可作探针。 应用类似的方法也可以分析RNA，即将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交。这个方法称为Northern印迹法。用类似的方法，根据抗原与抗体特异性结合的原理，也可以分析蛋白质。这个方法称为Western印迹法。应用核酸杂交技术可以将含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来。 第三节 DNA的复制 原核生物每个细胞中含有一个染色体；而真核细胞则含有多个染色体。在细胞增殖周期的一定阶段整个染色体都将发生精确的复制，随后以染色体为单位将复制的基因组分配到两个子细胞中去。染色体DNA的复制与细胞分裂之间存在着密切的关系，一旦复制完成，即发生细胞分裂；细胞分裂之后，又开始新一轮的DNA复制。 染色体外的遗传因子，包括细菌的质粒、真核细胞的线粒体、叶绿体以及细胞内共有生物的DNA，它们的复制或是受染色体复制的控制，而与染色体复制同步，或是不受染色体复制的控制，在在细胞增殖中随时都可进行。 病毒是具有感染力的基因，它们在侵入细胞后即能进行复制。如果病毒的DNA整合进入宿主细胞的染色体中， 这部分DNA就作为宿主细胞染色体的一部分进行复制。 由于DNA是遗传信息的载体，在DNA合成时，决定其结构特殊性异性的遗传信息只能来自其本身，因此必须由原来存在的分子为模板指导合成新的分子，即进行自我复制。DNA的双螺旋结构对于维持这类遗传物质的稳定性及复制的准确性都是极为重要的。细胞内存在极为复杂的系统，以确保DNA复制的正确进行，并纠正可能出现的误差。 半保留复制 Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，在复制过程中首先碱基间的氢键要断裂并使双链解旋和分开，然后以每条链作为模板在其上合成新的互补链，结果由一条链形成互补的两条链。在此过程中，每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。 1958年Meslson和Stahl利用氮的同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长12代以后，使所有的DNA分子标记上15N。15N—DNA的密度比普通14N—DNA大1%，在氯化铯密度梯度离心时，这两种DNA形成位置不同的区带。接着将15N—DNA的大肠杆菌转移到普通培养基（以14N为氮源）上培养，经过一代之后，所有的DNA的密度都介于15N—DNA和14N—DNA之间，形成在DNA分子中的一半为15N—DNA，另一半为14N—DNA的杂合分子----14N15N—DNA。在进行氯化铯密度梯度离心量，其区带位于15N—DNA区带和14N—DNA区带之间。两代时，在氯化铯密度梯度离心时出现两条区带，一条位于14N—DNA的位置，另一条位于14N 15N—DNA的位置，且两条带的大小相等，说明14N—DNA和14N15N—DNA等量出现。若继续培养，可以看到14N—DNA的比例增大。当把14N15N—DNA杂合分子加热时，它们分开成为14N—DNA单链和15N—DNA单链。这就充分证明了在DNA复制时原来 的DNA分子可被分成两个亚单位，分别构成子代分子的一半，这些亚单位经过许多代复制之后仍然保持着完整性。 1.710g/ml 1.710g/ml 14N-DNA比例增大 1.717g/ml 1.717g/ml 1.724g/ml 14N-DNA 15N-DNA 14N-15N-DNA 14N-DNA、14N-15N-DNA 第一代 第二代 若干代以后 大肠杆菌DNA半保留复制示意图 在这以后，人们用许多原核和真核生物复制中的DNA作了类似的实验，都证明了DNA复制的半保留复制方式。然而，这类实验所研究的复制中的DNA在提取过程中已断裂成许多片段，得到的信息只涉及DNA复制前和复制后的状态。1963年Cairns用放射自显影的方法第一次观察到了完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA，他用3H脱氧胸苷标记大肠杆菌DNA，然后用溶菌酶将细胞壁消化掉，使完整的染色体DNA释放出来，铺在一张透析膜上，在暗处用感光胶片覆盖于干燥了的膜表面上，放置若干星期。这期间3H由于放射性衰变放出β—粒子，使乳胶片曝光成银粒，显影后银粒黑点轨迹勾划出了DNA分子形状，黑点数目代表了3H在DNA分子中的密度，把显影后的片子放在光学显微镜下就可以观察到大肠杆菌染色体的全貌。用这种方法Cairns阐明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留复制的方式进行复制。 B C A 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图影 3H—胸苷掺入大肠杆菌DNA，经过近两代的时间。C为非复制部分，银粒子密度较低，由一条放射性链和一条非放射性链构成。B为一条复制的双链，但只有一条链的标记的。A为另一条复制的双链，银粒密度较高（为前者的2倍），两条链都是标记的。 DNA的半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代复制，DNA多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代的细胞中，而不是被分解掉。DNA与细胞的其它成分相比要稳定得多，这和它的遗传功能是相符合的。但是这种稳定性是相对的，DNA在代谢上并非是完全隋性的物质，在细胞内各种物理、化学及生物因素的作用下，DNA会发生损伤，需要修复；在复制和转录过程中也会损耗，而必须更新。在发育和分化过程中，DNA的特定序列还可能进行修饰、删除、扩增和重排。已有实验表明，老年动物DNA双链的不配对碱基远比幼年动物和胚胎期多。从进化角度来看，DNA更是处在不断变异和发展之中的。 复制的起点和单位 基因组能独立进行复制的单位称为复制子。每个复制子都有含有控制复制的起点。 原核生物染色体和质粒以及真核细胞的线粒体和叶绿体DNA都是环状分子，都只有一个复制子，都是从一个固定的复制起点开始复制。其复制方向大多数是双向的，即从复制起点开始解链，形成两个复制叉（或称生长点），分别向两侧推进；也有单向的，即从复制起点开始，复制叉只向一侧延伸。复制有对称的，也有不对称的。所谓对称是指两条链同时进行复制，或者指双向复制中两个复制叉等速延伸，不对称是指一条链复制后再进行另一条链的复制，或者指一个复制叉的移动速度快，而另一个复制叉的移动速度慢。环形DNA分子从复制起点开始解链，两条模板链同时指导合成各自的互补链，在电子显微镜下观察可看到形如“眼”状的结构，又有点象希腊字母“θ”，所以称为θ形结构。真核细胞染色体DNA多是线形双链分子，含有许多个复制子，是多起点的双向对称复制。病毒 DNA有多种多样，或是环形分子，或是线形分子，或是双链。或是单链。每一个病毒基因组DNA是一个复制子，它们的复制方式也是多种多样的，有双向的，也有单向的，有对称的，也有不对称的。 大多数生物染色体DNA的复制都是双向的，并且是对称的，但也有例外。例如：①枯草杆菌染色体DNA的复制虽然是双向的，但是两个复制叉移动的距离不同。一个仅在染色体上移动1/5的距离，然后停下来等待另一个复制叉移动完成4/5的距离。质粒R6K DNA两个复制叉的移动也是不对称的，第一个复制叉移动1/5的距离后即停下来，再从反方向开始形成第二个复制并完成其余部分的复制。质粒ColE1 DNA的复制完全是单向的，复制叉只向一个方向移动。②单向复制的一个特殊方式----滚动环式复制：噬菌体фX174 DNA是环状单链（正链）分子，它先以正链为模板合成负链，从而形成复制型的环状双链分子。然后正链在酶的作用下从特殊的位置切开，游离出3′--OH和5′--磷酸基末端。5′链被单链结合蛋白结合（细胞膜上），随后在DNA聚合酶的作用下，以负链为模板，从正链的3′--OH末端加入脱氧核苷酸，使链不断延长，从而合成正链。正链的合成和环的滚动是同步进行的。个别双链环状DNA分子也是以滚动环的方式复制的。③单向复制的另一个特殊方式----D—环式复制；D—环式复制又称取代环式复制。线粒体DNA的复制采用这种方式（纤毛虫的线粒体DNA是线形分子，其复制方式与此不同）。双链环在一固定的位点解开进行复制，但两条链的复制是高度不对称的，一条链先复制，另一条保持单链而被取代，在电镜下可以看到似“D”形环的形状。待一条链复制到一定程度，露出另一条链的复制起点时，另一条才开始复制。这表明两条链的复制起点并不在同一位置上，而是分开一定的距离。 用放射自显影的方法可以判断DNA的复制是双向的还是单向的。在复制开始时，先用低放射性的3H--脱氧胸苷标记大肠杆菌，数分钟后，再转移到含有高放射性的3H—脱氧胸苷培养基上继续培养，继续标记。然后，提取DNA进行放射自显影实验。这样在放射自显影图影上，复制起始区的放射性标记密度较低，感光还原出的银粒密度也就比较低；而继续合成区的标记密度较高，感光还原后的银粒密度也就比较高。若是单向复制，复制叉上的银粒密度应是一端低，一端高；若是双向复制，则应是中间低，两端高。由大肠杆菌获得的放射自显影图影都是两端密，中间稀，这就清楚地证明大肠杆菌染色体DNA的复制是双向复制。 复制叉 复制叉 复制叉 复制起点 复制起点 单向复制示意图 双向复制示意图 人们还用放射自显影的方法测定了不同生物复制叉的移动速度。大肠杆菌的染色体完成一次复制需要40分钟，但在营养丰富的培养基上每20分钟就可以繁殖一代，这是因为在营养丰富的培养基上，大肠杆菌在第一轮复制还未完成时，就开始了第二轮的复制，所以形成了单复制子的多复制叉结构。真核生物染色体DNA复制叉的移动速度比原核生物慢得多，这是由于真核生物染色体有复杂的高级结构，复制时需要解开核小体，复制后又要重新形成核小体。但真核生物染色体DNA是多起点的双向复制，可以得到一些弥补，通常完成染色体的一次复制需要6—8小时。 第一轮复制叉 第一轮复制叉 第二轮复制叉 第二轮复制叉 复制起始 大肠杆菌的单复制子多复制叉结构示意图 参与DNA复制的主要酶及蛋白质 DNA的复制是一个复杂的过程，需要多种酶及蛋白质协同作用才能完成。我们主要介绍几种与聚合、解链及引物合成有关的酶及蛋白质。 (一)、DNA聚合酶 1956年Kornberg等人首先从大肠杆菌的无细胞得取液中发现了DNA聚合酶，此后人们又从各种不同生物中找到了这种酶。经过许多实验证实，DNA聚合酶具有以下反应特点：①以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物；②反应需要接受模板的指导；③反应需要有引物3′--OH的存在；④反应需要Mg2+的激活；⑤聚合反应的方向（即DNA链的延长方向）为5′→3′；⑥产物DNA的性质与模板完全相同。这同时也表明DNA聚合酶合成的产物是模板的复制物。 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌的DNA聚合酶有三种，分别称为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 DNA聚合酶Ⅰ是一个多功能酶，它主要有以下三方面的功能：一是通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5′→3′方向延长，即具有5′→3′的聚合酶活力；二是由3′末端水解DNA链，即具有3′→5′核酸外切酶活力；三是从5′末端水解DNA链，即具有5′→3′核酸外切酶活力。在正常聚合条件下，3′→5′核酸外切酶活力受到抑制，但若出现错配碱基，聚合反应立即停止，此时3′→5′外切酶活力便显露出来，迅速切除错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以，3′→5′核酸外切酶活力被认为对DNA的合成起校对作用。这是对DNA复制忠实性的根本保证，如果没有这种活性，DNA复制的错误将会大大增加。DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活力可作用于双链DNA的5′末端,从5′切下核苷酸或寡聚核苷酸。因而被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要的作用，在DNA的半不连续性复制中，冈崎片段5′末端RNA引物的切除和切除引物后缺口的填补,也依赖于该酶的5′→3′外切酶活力和5′→3′聚合活力。所以，DNA聚合酶Ⅰ在复制的校正、DNA损伤的修复、RNA引物的切除和切除引物后缺口的填补等方面上具有重要的意义。 DNA聚合酶Ⅱ具有5′→3′的DNA聚合酶活力和3′→5′的核酸外切酶活力，但没有5′→3′的核酸外切酶活力。其5′→3′的聚合酶活力需要带有缺口的双链DNA作模板----引物，但缺口不能太大，否则聚合活力将会降低。所以DNA聚合酶Ⅱ可能在DNA损伤的修复中起一定的作用。 DNA聚合酶Ⅲ与DNA聚合酶Ⅰ一样兼有5′→3′聚合、3′→5′外切和5′→3′外切酶活力。实验证明，诱变消除DNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ的聚合反应活力后，大肠杆菌仍能进行DNA的复制和正常生长。所以，现在认为DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌细胞内正真负责从新合成DNA的复制酶。DNA聚合酶Ⅲ在组成上也与前两种酶不同，它是一个多亚基酶，由7种共9个亚基组成，并含有锌离子。 真核生物的DNA聚合酶 真核生物的DNA聚合酶有四种，分别称为DNA聚合酶α、β、γ、δ。总的说来，真核生物的DNA聚合酶 和大肠杆菌的DNA聚合酶的基本性质相同，都是以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物， 需要Mg2+的激活， 聚合时需要有模板链和3′--OH末端的引物存在，链的延长方向为5′→3′。但是真核生物DNA聚合酶本身往往不具有核酸外切酶活性，这就有可能由另外的酶或蛋白质在复制中起校对作用。 DNA聚合酶α相当于大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅲ，也是由多亚基组成的，它是真核生物DNA复制的主要酶。主要根据是DNA聚合酶α在细胞内活力水平的变化与DNA复制有明显的平行关系，在细胞分裂的S期达到高峰。另外有一种杀蚜虫毒素，可抑制真核生物体内的DNA复制。体外实验证明，它抑制的是DNA聚合酶α，而不抑制其它种类的DNA聚合酶。 DNA聚合酶β能以人工合成的多聚脱氧核苷酸为模板，以适当的寡聚脱氧核苷酸为引物合成DNA。这一种酶在细胞内的活力水平相当稳定，无论在分裂细胞还是停止分裂的细胞中，其含量变化均不大。所以，它可能主要在DNA损伤的修复中起作用。 DNA聚合酶γ能有效地以工人合成的多聚核糖核苷酸（RNA）为模板，以寡聚脱氧核糖核苷酸为引物合成DNA。但是该酶与RNA病毒中逆转录酶有许多不同之处。逆转录酶能以天然RNA为模板合成DNA。但γ酶在体外却不能成功地进行有关实验。γ酶在分裂细胞中的活力水平也有明显地变化，在S期一开始其活力水平可迅速增加2倍，然后再回到正常水平，这时α酶还未达到最高水平。人们推测它可能与DNA复制的调控有关。另外，从线粒体中可以分离到该酶，所以人们也推测它可能与线粒体DNA的复制有关。 DNA聚合酶δ与前几种酶不同，具有3′→5′核酸外切酶活力，需要Co2+和Mg2+的激活，天然DNA需经Dnase处理活化后才能作其模板和引物。它的生理功能还不清楚。 (二)、DNA连接酶 DNA聚合酶只能催化多核苷酸链的延长，但不能催化DNA链的连接反应。1967年，不同的实验室同时发现了DNA连接酶，这个酶能催化双链DNA切口处的5′--磷酸基和3′--OH生成磷酸二酯键。连接反应需要能量。细菌中的DNA连接酶以NAD作为量源，动物细胞和噬菌体中的连接酶则以ATP作为能量来源。DNA连接酶催化的反应如下： 3′ 5′ 3′ 5′ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ DNA连接酶 Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ 5′ P P OH P P 3′ATP AMP+PPi 5′ P P P P P 3′ P 或NAD NMN+AMP DNA连接酶催化的反应 DNA连接酶在DNA的复制、修复和重组等过程中均起着重要的作用。 (三)、与解链有关的酶及蛋白质 DNA复制时，首先需要将亲代DNA分子的两条链解开。在解链过程中会产生扭曲张力。早期认为，DNA分子可以通过旋转消除这种张力。然而一条很长的DNA双螺旋链进行高速旋转是不可思议的。现在认为，双螺旋链的解开依赖于DNA拓扑异构酶、DNA解螺旋酶及一些蛋白质因子。 DNA拓扑异构酶 DNA拓扑异构酶可分为两种类型，DNA拓扑异构酶Ⅰ（又称为转轴酶）能使一条链发生断裂和再连接；DNA拓扑异构酶Ⅱ（又称DNA旋转酶）能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接。当拓扑异构酶Ⅰ与DNA结合时，可使DNA分子的一条链断裂，形成一个切口，切口的5′--磷酸基与酶的亚基结合起来，在酶的牵引下，另一条链通过切口，然后切口再重新连接闭合，以达到改变螺旋数的目的。拓扑异构酶Ⅱ与DNA结合时，可同时使两条链断裂，两个5′--磷酸基分别与酶的两个亚基结合，酶通过改变构象牵引另一双链穿过切口，然后断裂的两条链再重新连接，达到消除复制叉前进时带来的扭曲张力目的，从而有利于双螺旋链的解开。 DNA解螺旋酶 DNA双链的解开，依赖于DNA解螺旋酶。这类酶通过水解ATP获得的能量来解开双链，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。当DNA分子中有单链末端或切口时，解螺旋酶即可结合在单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可沿模板链的5′→3′方向移动。与其配合发挥作用的还有rep蛋白，rep蛋白则在另一条模板链上沿3′→5′方向移动。这两类解螺旋酶相互配合，推动了DNA双链的解开。 单链结合蛋白（SSB蛋白） DNA模板解开的两条单股链即被单链结合蛋白覆盖，以稳定解开的单链，阻止复性和保护单链部分不被核酸酶降解。所以单链结合蛋白又被称为螺旋降稳蛋白。 原核生物的SSB蛋白与DNA的结合表现出明显的协同效应，当第一个蛋白与DNA结合后，其它蛋白质与DNA的结合能力可提高1000倍。所以，一旦结合反应开始即迅速扩展，直至全部单链被SSB蛋白覆盖。从真核生物体中分离出的SSB蛋白没有表现出这种协同效应，可能是它们的作用方式有所不同。 (四)、引发体 在合成DNA之前，首先要合成一段RNA引物，合成RNA引物的过程称为引发。这一过程是由引物酶来完成的，但该酶只有和另外6种蛋白质相互作用，组装成引发体之后才能起到引发作用。和引物酶一起构成引发体的6种蛋白质是：DnaB、DnaC、n、n′、n″和i。DnaB是一个六聚体蛋白，它具有ATP酶活力，在有ATP和Mg2+存在时可与6个DnaC蛋白结合为DnaB –DnaC复合物，此复合物在i蛋白（X因子）协助下与结合在单链DNA上的n、n′(Y因子)和n″（Z因子）蛋白组成前引发体（或引发前体），前引发体再与引物酶组成引发体。n′蛋白能够选择DNA的特定位置，在此位置进行前引发体和引发体的组装。 引发体沿模板链的5′→3′方向移动，它移动的方向与复制叉的方向相同，但与冈崎片段的合成方向相反。移动到一定位置（冈崎片段合成起始位点）即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP供给能量。n′蛋白具有ATP酶活力，并能从单链DNA上置换SSB蛋白，因此它对引发体移动可能是必须的成分。DnaB蛋白的功能在于识别冈崎片段合成的起始位点，促使RNA引物的合成，因此被称为可移动的启动子。 DNA复制体的结构 在DNA合成的生长点（即复制叉）上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质，它们在DNA链上形成离散的复合体，彼此配合，进行高度精确的复制，这一结构被称为复制体。已知的与大肠杆菌DNA复制过程有关的酶及蛋白质有30多种，我们主要介绍一些与聚合、解链、引发等过程有关的主要酶和蛋白质。与大肠杆菌复制体有关的主要酶及蛋白质如下表： 与大肠杆菌复制体有关的主要酶及蛋白质因子 酶或蛋白质 分子量 亚基数 每个细胞中的分子数 功 能 结构基因  拓扑异构酶Ⅱ 400000 4  引入负超螺旋   解螺旋酶Ⅰ 180000  600 解链   解螺旋酶Ⅱ 75000 1 6000 解链   解螺旋酶Ⅲ 20000  20 解链   rep蛋白 66000 1 50 解链 rep  单链结合蛋白 74000 4 300 稳定DNA解开的单链 ssb  i蛋白（X因子） 66000 3 50 预引发   n蛋白 25000 1 30 预引发   n′蛋白（Y因子） 55000 1 70 选择引发体组装点、ATP酶   n″蛋白（Z因子） 11000 1  预引发   DnaB蛋白 300000 6 20 可移动的启动子、ATP酶 DnaB  DnaC蛋白 25000 1 100 预引发 DnaC  引物酶（引发酶） 60000 1 75 合成RNA线物 DnaG  DNA聚合酶Ⅲ 400000 9 10--20 合成DNA   DNA聚合酶Ⅰ 109000 1 400 修复、切除引物、填补缺口 polA  DNA连接酶 74000 1 300 共价连接切口   尿嘧啶糖苷酶    切除DNA中的尿嘧啶 ung  AP核酸内切酶    水解无嘌呤和嘧啶的磷酸二酯键    大肠杆菌复制体的结构如下： 5′ 3′ DNA旋转酶 rep蛋白 解链酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ SSB蛋白 SSB蛋白 引发体 DNA聚合酶Ⅲ U DNA聚合酶Ⅰ RNA引物 DNA连接酶 尿嘧啶核苷酶 AP核酸内切酶 冈崎片段 3′ 5′ 3′ 5′ 前导链 后滞链 大肠杆菌复制体结构示意图 DNA复制体上的基本活动主要有：①模板DNA双链的解开；②RNA引物的合成；③DNA链的延长；④切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段；⑤切除和修复掺入DNA链的脱氧尿苷酸和错配的碱基。 DNA复制过程 大肠杆菌DNA的复制分为起始、延伸和终止三个阶段。 (一)、复制的起始 复制是从复制起点开始的。大肠杆菌的复制起点由245个碱基组成，含有多个顺向和反向重复序列，且富含脱氧腺苷酸。复制的起始涉及DNA双链的解开，引发体的组装和RNA引物的合成等过程。从噬菌体和大肠杆菌的研究结果来看，DNA双链的松开涉及到DNA旋转酶、DNA解螺旋酶、DnaA蛋白以及SSB蛋白等多种酶和蛋白质的作用。其具体过程还不十分清楚，但首先是在RNA聚合酶的催化下，以复制起点的核苷酸序列为模板转录出RNA短链，这些RNA短链的作用可能是经过RnaseH切除不必要的部分后作为前导链的引物。但其更重要的作用可能使原点处的双链分开，使DNA解螺旋酶得以与DNA单链结合，使引发体得以组装并合成RNA引物。所以，这一步称为转录活化。 (二)、DNA链的延伸----半不连续性复制 由于DNA双螺旋的两条链是反平行的，因此在复制叉附近解开的DNA链一条是5ˊ→３ˊ方向，另一条是3ˊ→5ˊ方向。新生链的方向必须与模式板链的方向呈反平行关系。但所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5ˊ→３ˊ，而没有3ˊ→5ˊ方向的的合成，这就无法解释DNA两条链如何能同时复制的问题。为了解释这一等速复制现象，日本学者冈崎（Okazaki）等提出了DNA的半不连续性复制模型。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超速离心法得到了许多3H标记的、被后人称为冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟的DNA链，因此这些片段必然是复制过程的中间产物。此外，用DNA连接酶温度敏感突变株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量的小DNA片段积累，说明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再用连接酶连接成大分子DNA。现在已知一般原核生物中的冈崎片段要长一些，其长度为1000—2000个核苷酸，相当于一个顺反子的长度；真核生物中的要短一些，其长度为100—200个核苷酸，相当于一个核小体的大小。进一步研究还证明，这种前导链的连续复制和后滞链的不连续复制在生物界中是有普遍性的，因此称之为双螺旋DNA的半不连续性复制。 以复制叉的方向为标准，一条模板链是3′→5′走向， 它指导的新链能以5′→3′的方向连续合成，称为前导链；另一条模板链是5′→3′走向，它指导合成新链的方向也应该是5′→3′，这就与复制的方向正好相反，无法随复制叉的移动进行连续性的复制，只能以倒退的方式合成不连续的DNA片段（冈崎片段），再由DNA聚合酶Ⅰ切除引物并填补切除引物之后留下的缺口，最后由连接酶连接成一条完整的DNA链。 DNA的合成需要引物，而RNA的合成不需要引物，这是因为DNA聚合酶有校对功能，它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，碱基配对准确无误后，才开始下一次聚合。它不能从无到有地合成新链，这是因为在未核实前一个核苷酸处于正确配对的情况下，是不会进行聚合反应的。RNA聚合酶没有校对功能，所以不需要引物。另一方面，聚合反应在刚开始时，错配碱基的概率比较大，先合成RNA作引物，最后再切除并代之以高保真的DNA链，这就大大提高了复制的正确性。 (三)、复制的终止 复制的终止既不需要特殊的核苷酸序列，也不需要特殊的酶或蛋白质。大肠杆菌DNA复制的终止点，在复制起点180°处。在复制的最后阶段，大肠杆菌的环形DNA会产生两个相互套接在一起的环，在拓扑异构酶的作用下去连环。然后再完成最后的复制。 真核生物DNA的复制 真核生物的DNA通常都与组蛋白构成核小体，以染色体的形式存在于细胞核中，其高层次的结构更为复杂，复制的机制也就更为复杂。目前对真核生物DNA复制的机制还不十分清楚，但与大肠杆菌DNA复制相比较有以下几个特点：①真核生物DNA的复制是多起点的双向对称复制，所以可同时形成许多个复制体，分段进行复制；②复制叉前进的速度比大肠杆菌复制叉前进的速度慢20—50倍；③真核生物染色体在全部完成复制之前，起点不再发动新一轮的复制；④DNA复制过程中的校对作用可能不是由DNA聚合酶来完成，而另有酶或蛋白质；⑤复制时要解开核小体，复制后要重新组装核小体。 七、DNA复制的忠实性 DNA复制是一个高度精确的过程。每一传代中，特定核苷酸错误复制的机率为10-9—10-10。复制的高度正确性可能与DNA聚合酶的3′--外切酶活力有关。现在已经确定大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段有两个结构域（将DNA聚合酶Ⅰ用枯草杆菌酶或胰蛋白酶水解，可裂解成两个片段，N端片段较小，C端片段较大，把较大的C端片段叫做Klenow片段）。大结构域含有一个荷正电的、直径为2.0nm的裂缝，DNA即结合于此。DNA一旦结合，裂缝即被关闭；这时DNA只能在裂缝隙中前后滑动。而小结构域含核苷酸结合位点，两个结构域在空间相距3.0nm。当新合成的DNA链中含有错误配对的核苷酸时，双螺旋发生变形，因而不能在裂缝中向前滑动，只能后移，这时3′--外切酶活力就切除错配的核苷酸。错配的核苷酸切除后，聚合反应继续进行。聚合酶Ⅲ是否有这方面的功能还有待查明。 提高复制准确性的另一个机制是误配修复。误配修复系统能检查新复制的DNA，切除误配的碱基，插入正确的核苷酸。 关于如何保持真核细胞复制正确性的机制也有了一些进展。过去在真核生物DNA聚合酶α中没有检测到3′--核酸外切酶活力，这就导致人们怀疑真核生物DNA的复制是否具有校对功能。最近从果蝇的复制酶中发现了隐藏的3′--核酸外切酶活力，即它的存在仅在某种条件下才显示。但对真核生物如何保证复制的忠实性还难以作出明确的的解答。 八、RNA指导的DNA合成 1970年，Temin、Mizufani以及Baltimore分别从致癌RNA病毒中发现了逆转录酶，这一发现具有重要的理论和实践意义。它不仅证实了Temin1964年得出的前病毒假说，而且表明再也不能把“中心法则”绝对化了，遗传信息也可以从RNA传递到DNA，而且有力的促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，也为肿瘤的防治得供了新的线索。逆转录酶现已成为研究这些学科的有力工具。逆转录酶是一种多功能酶，它兼有三种酶活力：①利用RNA作模板，合成出一条互补的DNA链，形成RNA-DNA杂种分子，即具有RNA指导的DNA聚合酶活力；②可沿5′→3′和3′→5′两个方向水解RNA-DNA杂种分子中的RNA链，即具有核酸外切酶的活力；③在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA链，形成双链DNA分子，即具有DNA指导的DNA聚合酶活力。致癌RNA病毒都含有逆转录酶，因此称为逆转录病毒。当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒粒子的RNA进入细胞，并由病毒自身带入的逆转录酶使病毒RNA转变成双链DNA。逆转录过程极为复杂，它包括病毒RNA作为模板合成互补的DNA链，切除RNA-DNA杂种分子中的RNA链，然后由DNA链作模板合成DNA链等过程。病毒双链DNA（前病毒DNA ）形成后即环化并进入细胞核，整合到宿主细胞DNA中，并随宿主细胞DNA的复制而传给子代细胞。在某种条件下，整合的前病毒DNA可转录RNA。RNA再转运到胞液中进行翻译，翻译出病毒蛋白质。最后病毒RNA和病毒蛋白质转移到质膜，通过出芽的方式形成新的病毒颗粒。在另一种情况下，则引起宿主细胞的癌变。 逆转录酶存在于所有的致癌RNA病毒中，它的存在与RNA病毒引起细胞的恶性转化有关。现已了解到，致癌病毒在浸染宿主细胞时，RNA基因组需要经过逆转录形成前病毒DNA，然后整到宿主细胞染色体中，再合成病毒RNA和蛋白质以及与细胞转化有关的蛋白质。逆转录酶发现后，许多研究者认为，如果能找到这类酶的抑制剂，就可以防止逆转录病毒的致癌作用。现在已找到了一些它的专一性抑制剂，可以有效的抑制致癌RNA病毒的逆转录过程，但在临床上治疗肿瘤并不理想，这是因为即使抑制了病毒RNA的逆转录过程，但对已经转化的细胞仍然无能为力。无论如何，逆转录酶的发现，有助于人们了解RNA病毒的致癌机制，并对防治肿瘤提供了重要的线索。 真核生物的染色体基因组中存在为数众多的逆假基因，它们无启动子和内含子，但有多聚（A）的残迹，推测是由mRNA经逆转录并整合到基因组中去的。说明真核细胞内也存在逆转录过程。目前已有报导，从正常的细胞和胚胎细胞中分离到了逆转酶。 DNA的损伤与修复 某些理化因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂，都有引起突变和致死的作用。因为这些理化因子都能作用于DNA，造成其结构和功能的破坏。然而在一定的条件下，生物体能使其DNA的损伤得到修复。这种修复作用是生物在长期进化过程中获得的一种保护功能。 化学因子是多种多样的，引起DNA损伤的机制也复杂多样。而物理因素中紫外线的作用机制研究得比较清楚。紫外线可以使DNA分子同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT）。这种二聚体是由两个胸腺嘧啶碱基以共价键连接成环丁烷的结构而形成的。 CH3 CH3 CH3 CH3 O= N 紫外线 O= N O= P O= N P N N （260nm） N N N O O O O 其它嘧啶碱基之间也能形成二聚体（CT、CC），但数量较少。形成的嘧啶二聚体不能再与互补链上的嘌呤之间以氢键配对，影响了DNA的双螺旋结构，使其复制和转录功能均受到阻碍。 细胞内有一系列起修复作用的酶系统，可以除去分子上的损伤，恢复DNA的正常双螺旋结构。目前已知的修复系统有四种，即光复活、切除修复、重组修复和诱导修复。后三种机制不需要光照，因此又称为暗修复。 光复活 光复活是由于可见光（最有效波长为400nm）激活了光复活酶，该酶能分解紫外线照射形成的嘧啶二聚体。 光复活作用是一种高度专一的修复方式。它只作用于紫外线引起的DNA嘧啶二聚体。光复活酶在生物界中分布很广，从低等单核生物直到鸟类都有，而高等哺乳动物却没有。这说明在生物进化过程中该作用逐渐被暗修复系统取代，并丢失了这种酶。 切除修复 所谓切除修复是指在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA分子恢复正常结构的过程。这是比较普遍的一种修复机制，它对多种损伤均能起修复作用。参与切除修复的酶主要有：特异的核酸内切酶、核酶外切酶、DNA聚合酶和连接酶。切除修复可分为四个步骤： ①细胞内有许多种特异的核酸内切酶，可识别由紫外线或其它因素引起的DNA损伤部位，并在其附近将核酸的损伤单链切开。 ②由5′→3′核酸外切酶将损伤链切除，形成一个缺口。 ③由DNA聚合酶催化，以另一条链为模板，沿5′→3′方向在缺口的3′端进行修复合成。 ④最后由连接酶将新合成的DNA链与原来的链连接起来。 在大肠杆菌体中DNA聚合酶Ⅰ兼有5′→3′聚合和5′→3′外切酶活力，所以上述步骤中②和③均由此酶完成。但在真核细胞中，DNA聚合酶没有外切活性，切除必须由另外的酶来完成。 我们在DNA复制忠实性的根本保证中曾提到的错配修复就是切除修复的一种方式。错配修复酶能够扫描新复制DNA中的错配碱基，并切除含有错误核苷酸的单链片段，再由DNA聚合酶进行修复合成。为了使切除不至于错误的发生在模板链上，可通过一种定时方法使错配切除局限于新合成的一股链上。校正酶只能切除附近有GATC序列的含错配碱基的DNA，并要求其中的A是未甲基化的。GATC中的A由一种dnm基因编码的甲基化酶作用可转变为N6—甲基腺嘌呤。对刚复制的DNA双链来说，模板链上GATC中的A是甲基化的，而新合成的一股条链中的GATC中的A还未来得及甲基化，所以校正酶只切除新合成的DNA链中的错配DNA部分。这是一种时间调控法。校正酶不但能检出错配碱基，而且也能检出小量的碱基插入和缺失。所以有了校正酶的作用，也减少了移码突变等事件的发生。 重组修复 切除修复发生在复制之前，因此称为复制前修复。然而，当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位也可以先复制再修复。复制时复制酶系统在损伤部位无法通过碱基配对合成子代DNA链，但它可以跳过损伤部位继续进行复制，结果就在子代链上留下缺口。这种遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从完整的母链上将相应核苷酸序列片段移至子代链缺口处，然后用再合成的序列补上母链的空缺。如图所示： × 模板DNA 复制 × 重组 × 再合成 × 子代DNA 重组修复示意图 在重组修复过程中，亲代链上的损伤并未消除掉，因此在进行第二次复制时子代链中仍会出现缺口，还需要通过重组修复来弥补。但随着复制的不断进行，代数增多后，损伤的这一条链所占的比例会越来越小，对正常的生理功能也就没有影响，损伤也就得到了“修复”。 诱导修复和SOS反应 前面我们介绍的DNA损伤的修复可以不经诱导而发生，但许多能造成DNA损伤和抑制复制的事件均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应，采用国际通用的紧急呼救信号“SOS”来表示。 SOS是一组基因，它是DNA修复最重要最广泛的基因集团，是DNA的紧急修复基因。SOS反应有以下几方面的作用。 ①诱导修复作用 SOS反应能诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的合成，使这些酶和蛋白质在细胞内的含量升高，从而加强切除修复和重组修复的能力。 ②诱变作用 SOS反应可导致变异。在一般情况下突变常常是不利的，但在DNA受到损伤或复制受到抑制的情况下，生物发生突变就有利于它的存活。所以，SOS反应在生物进化中也起着重要的作用。 ③抑制细胞的分裂 SOS反应可以使细菌的细胞分裂受到抑制，结果长成丝状体。其生理意义可能是在DNA复制受到阻碍时避免因细胞分裂产生不含DNA的细胞，或者使细胞内有更多重组修复的机会。 上述光复活、切除修复和重组修复机制在修复DNA的损伤时都不会导致突变，所以它们都是无差错的修复或叫做校正差错修复。SOS反应也有避免差错和校正差错的修复功能，但SOS反应更多的是导致基因突变，即进行倾向差错性修复。SOS反应可以允许DNA链在延伸时通过受损伤的片段进行复制，但复制是不忠实的，可能是在亲代链有损伤的部位，不依靠模板的指导而随意地掺入碱基，这样既是形成了完整的子代链，但也有缺陷，因此导致了突变。这种方式对细胞来说是失去了某些信息，但求得了存活，比根本不能存活要好一些。目前对于倾向差错性修复了解的还不十分清楚，但人们认为这是因为引起了复制校对系统松弛的缘故，使聚合作用即使在双螺旋变形的情况下也能通过受损伤的部位进行下去。但由于校对功能的丧失，在新合成的链上有比正常情况下多得多的不配对碱基，尽管这些错配碱基可以被错配修复系统和切除修复系统纠正，但因数量太大，没有被纠正的错误仍然很多。所以，SOS反应是导致突变的一个重要原因。 第五节 RNA的生物合成 在DNA指导下合成RNA的过程称为转录。RNA链的转录起始于DNA的一个特定位点（启动子），终止于另一个特定位点（终止子）。此转录区域称为转录单位。一个转录单位可以是一个基因，也可以是多个基因。基因的转录是一种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶段和细胞内外条件的改变转录不同的基因。转录是通过DNA指导的RNA聚合酶完成的，现在已从各种原核生物和真核生物中分离到了这种酶。通过提纯的酶在体外对某些DNA进行选择性的转录，基本上搞清楚了转录的机制。 DNA指导的RNA聚合酶 1960年至1961年,由微生物和动物细胞中分别得到了DNA指导的RNA聚合酶。这就为了解RNA的转录过程提供了基础。DNA指导的RNA聚合酶有如下几个作用特点。 1．以适当的DNA为模板，以四种核糖核苷三磷酸（NTP）为底物合成RNA。 2．Mg2+能促进聚合反应。 3．RNA链的合成方向也是5′→3′，反应是可逆的，但焦磷酸的分解可推动反应趋向聚合。 4．与DNA聚合酶不同，RNA聚合酶不需要引物，它能直接在模板上合成RNA链。 5．新合成的RNA链与模板DNA之间具有互补关系。分子杂交实验证明，将标记的新合成RNA链与模板DNA分子一起加热，再缓慢冷却，可形成完整的DNA—RNA杂交分子。此结果表明，RNA是在模板DNA分子上通过碱基配对原则合成的。 6．在体外RNA聚合酶能使DNA的两条链同时进行转录；但在体内DNA的两条链中仅有一条链可用于转录；或者在某些区域以这条链转录，另一些区域以另一条链转录；而对应的链无转录功能，说明在体内RNA聚合酶对DNA链具有选择作用。 7．DNA双链仅在RNA聚合酶结合的部位发生局部解链，其中的一条链指导合成RNA链，新合成的RNA链可与DNA模板链形成暂时的RNA—DNA双螺旋结构。当被解开的两条DNA链重新形成双螺旋结构时，已合成的RNA链即离开DNA链。 大肠杆菌的RNA聚合酶全酶的相对分子质量为46万，由五个亚基组成，可表示为“α2ββ′σ”，还含有两个Zn2+，与β′亚基相联。没有σ因子的酶叫做核心酶，可表示为“α2ββ′”。在不同的细菌中，α、β和β′亚基的大小比较恒定，σ亚基有较大的变动，其分子量从44000至92000不等。细菌的mRNA、rRNA和tRNA由同一种RNA聚合酶所转录。每一个大肠杆菌细胞中约有7000个酶分子。 σ因子（σ亚基）的功能在于使RNA聚合酶能稳定地结合到DNA的启动子上。单独的核心酶也能与DNA结合，这主要是由于碱性蛋白质与核酸之间的静电引力造成的，因此与其特殊序列无关，并且在结合后DNA仍保持双螺旋形式。σ因子能够改变RNA聚合酶与DNA之间的亲合力，它极大地减少了酶与一般序列的结合常数和停留时间，同时又极大地增加了酶与DNA启动子的结合常数和停留时间。这样就使得全酶能迅速地找到启动子并与之相结合。全酶与不同启动子序列间的结合能力不一样，这就说明了为什么不同的基因有不同的转录效率。不同的σ因子识别不同的启动子，从而转录不同的基因。 核心酶虽然不能启动RNA的合成，但可使已开始合成的RNA链不断地延长。从酶的活性中心来看，是位于β亚基上，β′亚基的功能是与DNA链结合，α亚基的功能还不完全清楚。 真核生物的RNA聚合酶有好多种，相对分子质量大致都在50万左右，通常由4—6种亚基组成，并含有Zn2+。目前将它们分为三类：RNA聚合酶A（或Ⅰ）存在于核仁中，主要催化rRNA前体的转录；RNA聚合酶B（或Ⅱ）存在于核质中，催化mRNA前体的转录；RNA聚合酶C（或Ⅲ）存在于核质中，催化小分子RNA（如4SRNA和5SRNA）的转录和tRNA的转录。 除了上述细胞核RNA聚合酶外，还分离到线粒体RNA聚合酶和叶绿体RNA聚合酶，它们分别转录线粒体和叶绿体的基因，它们的结构比较简单，能催化所有种类RNA的生物合成。 启动子和转录因子 启动子是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。RNA聚合酶在进行转录时常需要一些蛋白质辅助因子，称为转录因子。 利用足迹法和DNA测序法可以确定启动子序列的结构。通常将转录单位起点的核苷酸命名为+1，从近到远以正数计，称为下游；起点前一个核苷酸命名为-1，从近到远以负数计，称为上游。 大肠杆菌的-10处有一个6bp的保守序列TATAAT，称为pribnow框或-10序列，-35处又有一个6bp的保守序列TTGACA，称为识别区域或-35序列。如图所示。 起点 识别区 Pribno框 上游 下游 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔ xxxxＴＴＧＡＣＡxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxＴＡＴＡＡＴxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx -35 -10 　Ｃ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　+1 大肠杆菌启动子结构示意图 实验证明，-35序列的突变将降低RNA聚合酶与启动子结合的速度，但不影响转录起点附近DNA的解链速度；而-10序列的突变不影响RNA聚合酶与启动子结合的速度，可是会降低DNA的解链速度。由此可见，-35序列提供了RNA聚合酶的识别信号，-10序列则有助于双链局部的解开。-10序列含有较多的A-T碱基对，因而双链分开所需的能量也比较低。 真核生物的三类RNA（rRNA、mRNA和tRNA）分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所转录，它们的启动子各有其结构特点。例如，转录mRNA的聚合酶Ⅱ的启动子通常有三个保守区：-25-- -35左右有7bp的TAAA（T）AA（T）序列，称为TATA框或Hogness框，是DNA开始解链和决定转录起点位置的区域。如果失去TATA框，转录可在许多位点上开始。在-75位置左右有一个9bp的共有序列GGT（C）CAATCT，称为CAAT框，此区域可能与RNA聚合酶的结合有关。在更上游有时还具有另一个共有序列GGGCGG，称为GC框，某些转录因子（如spI因子）可结合在这一序列上。CAAT框和GC框均为上游因子，它们对转录的起始频率有较大的影响。 真核生物的启动子极为复杂，不同启动子之间的差异较大，有些无CAAT框和其它上游因子，也许是通过某些辅助因子帮助从而识别另外的序列，有些则无TATA框，这将是转录有不同的起点，但通常第一个进入合成部位的核苷酸总是A。RNA聚合酶Ⅲ的启动子则在转录区内部，如爪蟾5SRNA的启动子位于+55--+80的区域。 RNA聚合酶全酶可识别启动子的保守序列，但有时对某些RNA的启动子进行识别时还需要一些辅助因子。例如，5SRNA基因转录的辅助因子是一个分子量为37000的蛋白质。辅助因子通常结合在启动子的某一个区域上，以便于RNA聚合酶识别。 终止子和终止因子 提供转录终止信号的DNA序列称为终止子。协助RNA聚合酶识别终止信号的蛋白质辅助因子则称为终止因子。有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，这称为通读。这种引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止子。 DNA分子上的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子所识别。在转录过程中，RNA聚合酶沿着模板链向前滑动，它只能感受到正在转录的序列，而不能感受到尚未转录的序列。也就是说，终止子也应该被转录出来，这样RNA聚合酶才能感受到终止信号。分析RNA分子3′末端的结构发现，所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，其产生的RNA可形成发夹状结构，该结构可使RNA聚合酶减慢移动或暂停RNA的合成。 大肠杆菌存在两类终止子，一类称为不依赖ρ因子的终止子，或简单终止子；另一类称为依赖于ρ因子的终止子。简单终止子除能形成发夹结构外，在终止点前还有一系列U核苷酸（约6个）；回文对称区通常有一段富含G-C的序列。寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。这是因为由rU—dA组成的RNA—DNA杂交分子具有特别弱的碱基配对结构。当RNA聚合酶暂停时，RNA—DNA杂交分子即在rU—dA弱健结合的末端区解开。 依赖于ρ因子的终止子必需在ρ因子存在时才发生终止作用。依赖于ρ因子终止子的回文结构不富含G-C区，回文结构之后也无寡聚U。ρ因子是一种分子量为55000的蛋白质，在有RNA存在时它能水解三磷酸核苷，即具有依赖于RNA的NTP酶活力。由此推测，ρ因子结合在新产生的RNA链上，借助于水解NTP获得的能量沿着RNA链移动，RNA聚合酶遇到终止子是时移动速度减慢或暂停，使ρ因子得以追赶上RNA聚合酶。ρ因子与酶相互作用，造成RNA的释放，并使RNA聚合酶与该因子一起从DNA模板链上脱落下来。最近发现ρ因子具有RNA—DNA解螺旋酶活力，进一步说明了该因子的作用机制。 RNA聚合酶识别终止子时也需要一些辅助因子。如NusA蛋白等（另外还有NusB和NusE蛋白），NusA是一个分子量为69000的酸性多肽。NusA可以与RNA聚合酶的核心酶结合，形成α2ββ′NusA复合物。当σ因子存在时，它可取代NusA，形成α2ββ′σ，全酶可识别并结合到启动子上。σ因子在完成起始功能后即脱落下来，由核心酶合成RNA。然后NusA结合到核心酶上，由NusA识别终止子序列。转录结束后，NusA又被σ因子所取代，由此形成RNA起始复合物和终止复合物的循环。 有关真核生物转录的终止信号和终止过程了解甚少，但RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ转录产物的末端都有连续的U。仅仅连续的U本身并不足以成为终止信号，很可能U序列附近存在富含G-C对的区域在终止反应中起作用。 四、RNA的合成过程 RNA的合成分为起始、延伸和终止三个阶段。 (一)、RNA合成的起始 RNA聚合酶首先以全酶的形式结合在启动子上，在酶的结合位置上，自-10序列区至第12或第13个碱基处发生解链，按照起点（T或C）的碱基序列，选择pppA或pppG进入合成部位。通常酶只选择嘌呤核苷酸进入合成部位，作为RNA合成的起点，但偶而也选择嘧啶首先进入合成部位。从细胞中分离出来的RNA分子，其5′末端的核苷酸不是开始时的核苷酸，因为在RNA合成之后，要被核酸内切酶切去一小段，剩下来的链端很多是从嘧啶开始的，它们的5′也无三磷酸基团。所以，在体外分析RNA序列难以准确地判断出第一个进入起点的核苷酸。 在第一个核苷酸之间的磷酸二酯键形成之后，σ因子就从全酶上脱落下来。在核心酶的催化下RNA链开始延长。σ因子的释放可能是合成过程不再需要其功能的缘故，或者是σ因子的继续存在能使酶与启动子序列紧密结合而难以沿着模板链滑动的缘故。脱落下来的σ因子即可与另一核心酶结合，启动另一分子RNA的转录。 (二)、RNA链的延伸 当σ因子离开核心酶后，核心酶不断地沿模板链的3′→5′方向滑动，不断地使DNA分子解链，不断地使RNA链按5′→3′方向延伸，直至到达终止子序列。RNA链新合成的部分与模板链之间形成一个RNA—DNA杂交区，其长度约为12个碱基对。当解开的两条DNA链重新复性为双螺旋结构时，RNA链则被取代。DNA的解链区比RNA—DNA的杂交区稍长一些，约有17个碱基对。 RNA 5′ RNA-DNA杂交区 3′ 5′ 5′ 3′ RNA聚合酶 RNA延伸复合物模式图 (三)、RNA合成的终止 当核心酶滑动到终止子部位时，由于转录出了回文结构，RNA链即折叠成“发夹”，使得核心酶的移动速度大大降低或停止移动，在ρ因子参与或者无ρ因子的条件下（两类不同的终止子，作用的方式亦不同），释放出RNA链，核心酶也随之从模板链上脱落下来。脱落的核心酶又可以与σ因子结合，开始另一分子的转录。 五、RNA转录后的加工 在细胞内，由RNA聚合酶催化合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的断裂，5′末端和3′末端的切除和特殊结构的形成，碱基的修饰和糖苷键的改变，以及拼接等过程，才能成为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的加工或称为RNA的成熟。 原核生物的mRNA一经转录通常立即进行翻译，除少数情况外一般不进行转录后的加工。但稳定的RNA（tRNA和rRNA）都要经过一系列加工过程才能成为有活性的分子。真核生物由于存在细胞核结构，转录和翻译在时间上和空间上都被分隔开来，其mRNA前体的加工极为复杂，而且真核生物的大多数基因都被间居序列（即内含子）分隔而成为断裂基因，在转录后需要拼接使编码区成为连续序列。在真核生物中还能通过不同的加工方式，表达出不同的信息。因此，对于真核生物来讲，RNA的加工尤为重要。 (一)、原核生物中RNA的加工 在原核生物中，rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子。其余tRNA基因也成簇存在，或与编码蛋白质的基因组成操纵子。它们在形成转录物之后，经断裂成为rRNA 和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。 原核生物rRNA前体的加工 大肠杆菌共有7个rRNA的转录单位，它们分散在基因组的各处。每个转录单位由16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA以及一个或几个tRNA基因组成。16S rRNA与23S rRNA基因之间常插入1个或2个tRNA基因，有时在3′端5S rRNA基因之后还有1个或两个tRNA基因，每个基因之间还有一个间隔序列。最初合成的转录物称为30S rRNA前体（P30）。加工的步骤如下： ①首先由RNA内切酶Ⅲ和E将P30切开，成为16S、23S和5S rRNA的前体P16、P23和P5，但它们的两端都还带有附加序列。 ②分别由RNA酶M16、M23和M5切除P16、P23和P5两端的附加序列。 ③甲基化修饰，尤其是形成2—甲基核糖。16S rRNA约含有16个甲基，23S rRNA约含有20个甲基，其中N4,2′--O--二甲基胞苷（m4Cm）是16S rRNA的特有成分。一般5S rRNA中无修饰成分，不进行甲基化反应。 Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ E E P30 切开 M16 M16 M23 M23 M5 M5 P16 P23 P5 切除附加序列 M16 M23 M5 甲基化修饰 16S rRNA 23S rRNA 5S rRNA （tRNA前体，待加工） 原核生物rRNA前体加工过程示意图 原核生物tRNA前体的加工 大肠杆菌染色体基因组共有60个tRNA基因，大多成簇存在，或者与rRNA基因或者与mRNA基因组成混合转录单位。tRNA前体的加工包括以下几个步骤： ①由核酸内切酶在tRNA的两端切断， 大肠杆菌RNaseP从5′端切断， 使5′端成熟；RNaseF从3′端切断，但得到的仍然是不成熟的3′末端，仍有附加序列。RNaseP是一种特殊的酶，由RNA和蛋白质组成。 ②由核酸外切酶（RNaseD）从3′端逐个切去附加序列。所有成熟tRNA 3′末端都是CCA—OH结构。有些tRNA前体的3′端具有CCA三个核苷酸，位于成熟tRNA序列与3′附加序列之间，当附加序列被切除后即显露出CCA—OH结构。但有些tRNA前体没有CCA序列，必须在切除附加序列后，再添加CCA—OH结构。 ③在tRNA核苷酰转移酶催化下，以CTP和ATP为底物，在3′添加CCA—OH结构。 ④对tRNA中的核苷酸进行甲基化修饰和假尿嘧啶核苷酸的修饰。 RNaseP RNaseF RNaseP RNaseF 前体的切断 RNaseD RNaseD 3′端的修剪 CCA-OH 3′末端添加CCA结构 甲基化修饰 CCA-OH 甲基化修饰 CCA-OH CCA-OH 成熟tRNA 成熟tRNA tRNA前体的加工过程示意图 (二)、真核生物中RNA的加工 真核生物中rRNA和tRNA前体的加工过程与原核生物有相似之处，但其mRNA的加工较为复杂，这与原核生物大不相同。 真核生物mRNA转录后的加工 真核生物编码蛋白质的基因以单个基因作为转录单位，其转录产物为单顺反子mRNA，但大多数蛋白质基因存在着内含子，它们与外显子一起被转录出来，需要在转录后的加工过程中被切除掉。mRNA的原初转录物是分子量极大的前体，在核内加工过程中形成大小不等的中间物，它们被称为核不均一RNA（hnRNA）。其中至少有一部分可转变成细胞质的成熟mRNA。RNA的加工过程如下： 5′端形成特殊的帽子结构（m7G5′ppp5′NmNp—） 真核生物的mRNA都有5′端帽子结构，该特殊结构也存在于hnRNA中，它可能是在转录早期阶段或转录终止前就已形成，原初转录的巨大转录物的5′端为三磷酸嘌呤核苷（pppN1pN2p—），转录起始后不久，从5′端的三磷酸中脱去一个磷酸（ppN1pN2p—）；然后与GTP反应生成5′,5′三磷酸相连的酯键（G5′ppp5′N1pN2p—）；最后由S—腺苷甲硫氨酸提供甲基进行甲基化， 从而产生所谓的帽子结构（m7G5′ppp5′NmNp—）。 （去磷酸） （加鸟苷酸） pppN1pN2p—RNA ppN1pN2p—RNA G5′ppp5′N1pN2p—RNA pi GTP ppi （甲基化） （甲基化） m7G5′ppp5′N1pN2p—RNA m7G5′ppp5′NmpN2p—RNA S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷甲硫氨酸 5′端帽子结构的确切功能还不十分清楚，推测它能在翻译过程中起识别作用，以及对mRNA起稳定作用。有实验证明，5′端无完整的帽子结构时，mRNA不能有效的翻译。5′端的帽子结构还可以避免核酸外切酶的降解。 ②3′端的产生和多聚腺苷酸化 真核生物mRNA的3′端通常都有20—200个腺苷酸残基，构成多聚腺苷酸[简称poly（A）]的尾部结构。核内hnRNA的3′也有poly（A），表明加尾过程早在核内就已完成。hnRNA中的poly（A）比mRNA的略长一些，平均长度为150—200个核苷酸。 实验证明，RNA聚合酶Ⅱ的转录产物是在3′末端切断，然后再多聚腺苷酸化的。高等真核生物（酵母除外）的细胞和病毒mRNA在靠近3′端都有非常保守的序列AAUAA，这一序列离多聚腺苷酸加入位点不一，大致在11至30个核苷酸，一般认为，这一序列为链的切断和多聚腺苷酸化提供了信号。 首先，在RNaseⅢ的催化下，依据AAUAA序列提供的信号从3′末端将hnRNA切断；然后，在多聚腺苷酸聚合酶催化下，以ATP为供体，以hnRNA的3′--OH端为受体，完成多聚腺苷酸化的聚合反应。 实验证明，多聚腺苷酸化是mRNA的成熟过程，主要与mRNA的稳定性有关，而与mRNA的翻译功能无关。切去腺苷酸尾巴的mRNA稳定性较差，可被体内的有关酶降解。当mRNA由细胞核转移到细胞质中时，其多聚腺苷酸尾部常有不同程度的缩短。由此可见，多聚腺苷酸尾巴至少可以起到某种缓冲作用，防止核酸外切酶对mRNA的信息序列发生降解。 ③剪接 真核生物所有编码蛋白质的核结构基因都含有内含子，所有内含子的5′端和3′端均含有特殊的保存守序列，其5′端均为GT，3′端均为AG，称之为GT—AG规律（但此规律不适合线粒体和叶绿体的内含子）。如下图所示： 外显子 内 含 子 外显子 A64G73G100T100A62A68T63 6py74-78NC65A100G100N 内含子保存守序列和GT—AG规律示意图 此保守序列和GT—AG规律可能为核酸内切酶提供了切点信号。体外的剪接实验表明，首先从内含子的左端切开，所产生的5′端与3′端上游30个核苷酸附近的CTGAC中的A形成5′,2′磷酸二酯键，由此形成套索结构。接着内含子右端切开，两个外显子连在一起。套索状内含子去分支而成线形分子。剪接过程如图所示： 外显子 内 含 子 外显子 5′ 3′ 切开 内含子左端切开形成套索状结构 5′ 5′ 3′ 2′ 3′ 内含子右端切开 5′ 5′ 3′ 2′ 3′ 3 5′ 两外显子连接，套索状内含子去分支。 5′ 3′ 5′ 3′ 连接起来的外显子 内 含 子 真核生物mRNA加工过程中的“剪接”示意图 真核生物rRNA的加工 真核生物有四种rRNA，即5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA和5S rRNA。前三者的基因组成一个转录单位，彼此之间由间隔区分开，产生45S rRNA的前体（哺乳动物）。由于真核生物rRNA的加工过程比较缓慢，其中间产物可以分离出来，因此真核生物rRNA的加工过程研究的比较清楚。 真核生物细胞的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所。加工过程如下： 18S 5.8S 28S 45S 前体 41S 中间体 20S 中间体 32S 中间体 18S rRNA 32S 中间体 28S—5.8S rRNA 真核生物rRNA加工示意图 不同的生物rRNA前体的加工过程略有不同。RNaseⅢ和一些核酸内切酶在rRNA的加工过程中起了重要的作用。 rRNA在成熟过程中还要被甲基化，甲基化的位置主要在2′--OH上。真核生物rRNA的甲基化程度比原核生物rRNA的甲基化程度高。例如，哺乳动物的18S rRNA和28S rRNA中分别含有甲基43和74个，大约有2%的核苷酸被甲基化，相当于细菌rRNA甲基化程度的3倍。 真核生物中5S rRNA的基因也是成簇排列的，中间也有间隔序列，但间隔序列不转录。5S rRNA由RNA聚合酶Ⅲ转录后，经适当的加工即与28S rRNA和5.8S rRNA以及有关蛋白质一起组成核糖体的大亚基。18S rRNA则与有关蛋白质共同组成核糖体的小亚基。 3．真核生物tRNA的加工 真核生物tRNA基因也是成簇排列的，中间由居间序列将其隔开。tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录，转录产物是4.5S或稍大一点的tRNA前体，相当于100个核苷酸大小。而成熟的tRNA分子为4S，约70—80个核苷酸。tRNA前体5′端和3′端的切除与原核生物tRNA的加工过程相同，不同的是真核生物tRNA的3′都不带有CCA序列，所以必须由核苷酰转移酶催化，以CTP和ATP为供体进行添加。另外，真核生物tRNA除修饰碱基外，还有2′-O-甲基核糖，其含量约占核苷酸的1%左右，这是由特殊的修饰酶来完成的。 RNA的复制 在有些生物中，RNA就是遗传信息的携带者，并能通过复制合成出与其自身相同的分子。例如某些RNA病毒在侵入宿主细胞后即能借助于复制酶（RNA指导的RNA合成酶）进行病毒RNA的复制。 从感染RNA病毒的细胞中可以分离出RNA复制酶，这种酶能以病毒RNA为模板，在4种核糖核苷三磷酸和Mg2+存在时合成出与模板性质相同的RNA分子。用复制产物感染细胞，能产生正常的RNA病毒。可见病毒的全部遗传信息，包括合成病毒外壳蛋白的各种酶的信息均贮存在被复制的RNA分子中。 有些病毒RNA本身即为mRNA，可以直接指导与病毒有关的蛋白质的合成过程，通常将具有mRNA功能的链称为正链，它指导合成的互补链称为负链。有些病毒的RNA无mRNA的功能，不能指导蛋白质的合成，即为负链，它指导合成的互补链为正链。 RNA病毒的种类很多，其复制方式也是多种多样的，归纳起来可分为以下三类。 1．含正链的RNA病毒（如噬菌体Qβ和灰质炎病毒） 这类病毒进入宿主细胞后，首先在正链指导下合成复制酶和有关蛋白质，复制酶吸附在正链的3′末端，以正链为模板合成出负链RNA。然后复制酶再结合在负链的3′末端，以负链为模板合成出正链。可见RNA复制的方向也是5′→3′。 2．含负链和复制酶的RNA病毒（如狂犬病病毒和马水泡性口炎病毒） 这类病毒侵入细胞后，首先以负链为模板，借助于病毒带进去的复制酶合成出正链，再以正链为模板合成出病毒蛋白质和负链RNA。 3．含双链RNA和复制酶的病毒（呼肠孤病毒） 这类病毒以双链RNA为模板，在病毒复制酶的作用下，通过不对称复制方式复制出正链RNA，并以正链RNA为模板翻译出病毒蛋白质；然后再合成出病毒的负链RNA，从而形成双链RNA分子。 第六节 蛋白质的生物合成 遗传信息最终是通过蛋白质来表达的，即首先以DNA为模板指导合成mRNA，然后以mRNA为模板指导合成蛋白质，通过不同蛋白质的生物学功能来体现出生物的遗传性状。 在本世纪50年代初，学者们就发现蛋白质的生物合成与核酸有着密切的关系，经过40多年的努力，对这一问题的认识已比较清楚。以mRNA为模板指导合成蛋白质的过程称为翻译。翻译的问题要比复制和转录复杂得多，需要200多种生物大分子协同作用，如核糖体、mRNA、tRNA、氨酰—tRNA合成酶、起始因子、延伸因子、释放因子等等。蛋白质生物合成的早期研究工作都是用大肠杆菌的无细胞体系进行的，所以人们对大肠杆菌的蛋白质合成机理了解最多。真核生物蛋白质合成的机理与大肠杆菌有很多相似这处。 核糖体 1950年有人将放射性同位素标记的氨基酸注射到小鼠体内，经短时间后，取出肝脏，离心分离出细胞核、线粒体、微粒体以及上清液等组分，经检测发现微粒体中的放射性强度最高，再用去污剂—脱氧胆酸处理微粒体，将核糖体从微粒体上分离出来，发现核糖体上的放射性强度比微粒体要高7倍，这就是说核糖体是合成蛋白质的部位。 核糖体是一个巨大的核糖核蛋白体，在原核细胞中，它可以以游离形式存在，也可以与mRNA结合为串状的多核糖体。平均每个细胞中大约有2000个核糖体。在真核细胞中，核糖体可以游离存在，也可以与内质网结合，形成粗面内质网。每个真核细胞所含核糖体的数目大约为106—107个。此外，线粒体、叶绿体及细胞核也都有自己的核糖体。 核糖体由大小两个亚基组成，利用超速离心和其它分离分析手段已基本上搞清楚了大肠杆菌核糖体的全部组分及其化学结构。大肠杆菌的核糖体为70S，小亚基30S，大亚基50S。小亚基由一种1452个核苷酸组成的16S rRNA和21种蛋白质构成，大亚基由一种2904个核苷酸组成的23S rRNA、一种120个核苷酸组成的5S rRNA和34种蛋白质构成。真核细胞的核糖体为80S，小亚基40S，由一分子18S rRNA和30多种蛋白质组成，大亚基60S，由一分子5S rRNA、一分子5.8S rRNA、一分子28S rRNA和50多种蛋白质组成。 人们应用电镜和其他物理学方法已经提出了大肠杆菌30S、50S和70S核糖体的结构模型。70S核糖体为一个椭球体（13.5×20.0×40.0nm）。30S亚基的外形好象一个动物胚胎的样子，长轴上有一个凹陷下去的颈部，将30S亚基分成头和躯干两部分。50S亚基的外形很特别，好象一把特殊的椅子，三边带有突起，中间凹下去的部分有一个很大的空穴。当30S与50S亚基互相结合成70S核糖体时，两亚基的结合面上有一个相当大的空隙，蛋白质生物合成很可能就在这个空隙中进行。 核糖体的30S亚基能单独与mRNA结合形成30S核糖体—mRNA复合体，该复合体又可以与tRNA专一地结合。50S亚基不能单独与mRNA结合，但可以非专一性地与tRNA相结合，50S亚基上有两个tRNA结合位点，一个是供氨酰基—tRNA结合的氨酰基位点（A位点），一个是供肽酰基—tRNA结合的肽酰基位点（P位点）。此外，在核糖体还有许多与起始因子、延伸因子、释放因子以及各种酶相结合的位点，由此可以看出，核糖体是一个结构十分复杂的复合体。 核糖体结构示意图 大肠杆菌70S核糖体图解 当采用温和条件小心地从细胞中分离核糖体时，可以得到3—4个成串的甚至上百个成串的核糖体，称为多核糖体（或多核蛋白体）。多核蛋白体是由一个mRNA分子与一定数目的单个核糖体相结合而成的，呈念珠状，两个核糖体之间有一段裸露的mRNA，每个核糖体可以独立的完成一条多肽链的合成。所以，多核蛋白体可以同时进行好多条相同肽链的合成，这就大大提高了翻译的效率。 多核糖体结构示意图 遗传密码 任何一种多肽都有其特定的氨基酸排列顺序。自然界中大约有1010—1011种不同的蛋白质，构成数目如此庞大的不同蛋白质的单体却只有20种氨基酸。所以，氨基酸在多肽链中的不同排列顺序是蛋白质多样性的基础。目前已经清楚，多肽链上氨基酸的排列顺序最终是由DNA上核苷酸排列顺序决定的，但直接决定多肽链上氨基酸顺序的却是mRNA。不论是DNA还是RNA，基本上都是由4种核苷酸构成的，这4种核苷酸如何编制成遗传密码，遗传密码又如何被翻译成20种氨基酸组成的肽链，这就是蛋白质合成过程中遗传密码的翻译问题。 (一)、密码单位与密码子的破译 用数学方法推算，如果DNA分子中每两个相邻的碱基决定一个氨基酸在肽链中的位置，那么42=16，即4种碱基组成的核酸只能编制出16组密码子，不足以应付20种氨基酸的编码问题；如果采用每三个相邻的碱基编码一个氨基酸，则43=64，完全可以满足20种氨基酸编码的需要。所以，这种编码方式的可能性很大。在60年代先后用生物化学和遗传学的研究技术，已经证明是三个相邻的碱基编码一个氨基酸，所以称为三联密码或密码子。 在1961年Nirenberg（尼伦伯格）等人用大肠杆菌的无细胞体系，外加20种标记的氨基酸和poly U，经保温反应后，发现合成的多肽只有苯丙氨酸多聚体，显然poly U起了信使RNA的作用，所以UUU是编码苯丙氨酸的密码子，Nirenberg（尼伦伯格）等人进一步用poly UG、polyAC重复上述类似实验，发现标记氨基酸掺入新合成肽链的频率与统计学推算出的多核苷酸中三联密码出现的频率相符合。应用这种方法很快确定了为20种氨基酸编码的全部密码子。 在1964年Nirenberg（尼伦伯格）等人又通过实验证实，具有密码子功能的最短核苷酸链为三核苷酸，最有效的是3′--OH和5′--磷酸的三核苷酸；相反，以3′--磷酸为末端的三核苷酸没有模板功能。所以，密码子的阅读是有方向的，密码子的阅读方向是5′→3′。例如，pGpUpU是缬氨酸的密码子，pUpUpG是亮氨酸的密码子。与此同时，Khorana（科拉纳）应用人工合成的具有重复序列的的多核苷酸如：CUCUCUCU……进行体外蛋白质的合成实验，发现产物为亮氨酸和丝氨酸交替出现的多肽（CUC：亮氨酸，UCU：丝氨酸）。当应用人工合成的三核苷酸重复序列作模板进行实验时，得到了很有意思的结果，例如用UUCUUCUUCUUC……作模板时，得到的产物是三种不同的多肽：多聚苯丙氨酸、多聚丝氨酸和多聚亮氨酸，这是因为从不同的碱基开始阅读的结果。如： UUC-UUC-UUC-UUC-UUC…… 多聚苯丙氨酸 UCU-UCU-UCU-UCU-UCU…… 多聚丝氨酸 CUC-CUC-CUC-CUC-CUC…… 多聚亮氨酸 应用上述方法，仅用了四年的时间，于1965年就完全确定了编码20种氨基酸的60多组密码子，编制出了遗传密码子字典。 (二)、遗传密码的基本特性 遗传密码具有以下一些基本特性。 1．密码子是无标点符号的，即两个密码子之间没有任何起标点符号作用的碱基将它们隔开。因此，要正确阅读密码子就必须按一定的读码框架，从一个正确的起点开始，一个不漏的挨着读下去，直至碰到终止信号为止。若插入或删去一个碱基，就会使这一点以后的读码发生错误，这种情况叫做移码。由于移码引起的突变称为移码突变。 2．一般情况下密码子是不重叠的。目前已经证明，在大多数生物中的读码规则是不重叠的，但少数大肠杆菌噬菌体（如Qβ、R17）的RNA基因组中，部分基因的密码子是重叠的。 3．密码子的简并性。大多数氨基酸都可以有几组密码子，如UUA、UUG、CUU、CUA、CUG和CUC 6组密码子都编码亮氨酸，这种现象就称为密码子的简并。可以编码相同氨基酸的密码子称为同义密码子。密码子的简并性具有重要的生物学意义，它可以减少有害突变。可以设想，如果每个氨基酸只有一个密码子，20组密码子就足以应付20种氨基酸的编码了，那么剩下的44组密码子都将会导致肽链合成的终止。这样一来，由于突变而引起的肽链合成终止的频率也将会大大增加，合成现来的残缺不全的肽链往往不具有生物活性。另外，密码子的简并性也可使DNA的碱基组成有较大的变化余地，而仍保持多肽链的氨基酸顺序不变，所以在物种稳定上也起了重要的作用。 4．密码子的前两位碱基专一性大，第三位碱基专一性小，密码子的简并性往往只涉及第三位碱基。如丙氨酸有四组密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，头两个碱基相同，都是GC，第三全碱基就不同了。Crick对密码子的这一特性给予一个专门的术语，称为“摆动性”。当第三个碱基发生突变时，仍有可能翻译出正确的氨基酸来，从而使合成的多肽链仍具有生物学活性。在tRNA的反密码子中，除A、U、G、C四种碱基外，还经常出现次黄嘌呤（I），I的特点是它与U、A、C三者都能形成配对，这就使得带有I的反密码子都具有阅读mRNA上密码子的非凡能力，从而降低了由于遗传密码突变引起的误差，这一点已得到了证实。例如，酵母丙氨酸tRNA的反密子3′-CGI-5′能阅读GCU、GCC、GCA三组密码子。另外，tRNA反密码子第三位上的碱基G可以分别与U、C配对，U可分别与G、A配对。 5．64组密码子中，有三组不编码任何氨基酸，而是肽链合成的终止密码子，它们是UAG、UAA、UGA。这三组密码子不能被tRNA阅读，只能被肽链释放因子识别，另外有一组密码子（AUG）既是甲硫氨酸的密码子，又是肽链合成的起始密码子。 6．密码子是近乎完全通用的。所谓密码子的通用性是指各种高等和低等的生物在多大程度上可共用同一套密码子。较早时，曾认为密码子是完全通用的。但近年来的一些发现对密码子的通用性提出了挑战，因为线粒体中的密码子显然违背了遗传密码的通用性。例如，人的线粒体中，UGA不再是终止密码子，而编码色氨酸，AUA不再编码异亮氨酸，而编码甲硫氨酸，AGA和AGG不再编码精氨酸，而成为肽链合成的终止密码子。酵母线粒体和原生动物纤毛虫也有类似情形。所以，结论应该是遗传密码并非是绝对通用的，而是近于完全通用。 氨基酸的激活与氨酰—tRNA合成酶 氨基酸在被转运到模板上之前，首先要与tRNA相连接，这个过程称为氨基酸的激活。氨基酸激活的任务是由氨酰—tRNA合成酶来完成的，此酶必须能够同时专一地与氨基酸的侧链基团和tRNA相结合，所以它必须有两个结合部位，一个部位识别氨基酸的侧链基团，另一个部位识别特异的tRNA，最终使氨基酸的羧基与tRNA的3′--OH之间形成酯键，这个酯键是高能键，这个高能键的断裂与肽键的形成是以协同方式进行的，因此能量可用于肽键的形成。在形成氨酰—tRNA之前，氨基酸先被氨酰—tRNA合成酶活化，生成氨基酰腺苷酸，其中氨基酸的羧基以高能键的形式连接在腺苷酸上；随后氨酰—tRNA合成酶再将氨基酰转移到tRNA 3′末端的腺苷酸残基上。反应如下： AA1 + ATP + E1 （AA1～AMP）E1 + PPi （AA1～AMP）E1 + tRNA1 AA1～tRNA1 + E1 + AMP 每个细胞中至少需要20种不同的氨酰—tRNA合成酶和至少20种tRNA分子。实际上一种氨基酸常有多几种tRNA，这些tRNA通常称为“同工受体”。它们的存在是由于每种氨基酸常具有一个以上的密码子，每个密码子有一种独特的tRNA的缘故。但不同密码子的同工受体tRNA与氨基酸的连接通常是由同一氨基酰—tRNA合成酶催化的。 蛋白质生物合成过程中起始复合物的形成 (一)、N—甲酰甲硫氨酸 在核糖体上进行的蛋白质合成是从氨基末端开始，逐步加上一个个氨基酸，在羧基端终止的过程。所有细菌蛋白质合成的氨基端的第一个氨基酸都是N—甲酰甲硫氨酸（fmet）。这是一个修饰了的甲硫氨酸，没有游离的氨基，像这样一个封闭了的氨基酸只能用于蛋白质合成的起始阶段。由于不存在游离的氨基，这就防止了它在肽链延伸时插入肽链内部。这个甲酰基是在甲硫氨酸连接于tRNAfmet接合体上以后，由酶促反应加上去的。甲酰基的供体是N10—甲酰四氢叶酸，催化反应的酶叫做转甲酰酶。反应如下： 转甲酰酶 Met—tRNAfmet fmet--tRNAfmet N10—甲酰四氢叶酸 四氢叶酸 并非所有的甲硫氨酰—tRNA都可以甲酰化。大肠杆菌细胞中有两种类型的tRNAmet，一类是tRNAfmet，一类是tRNAmmet，只有tRNAfmet上的甲硫氨酸可以甲酰化。这两种类型的tRNA比较，反密码子是相同的，但核苷酸序列略有不同。实验证明，只有N—甲酰甲硫氨酰—tRNAfmet能够与蛋白质的起始因子及30S核糖体亚基结合，形成起始复合物，而甲硫氨酰—tRNAmmet只能与延伸因子结合，将甲硫氨酸掺入到肽链中间。 从正在生长的细菌中分离出的蛋白质基本上不含甲酰--甲硫氨酸末端基团，表明有一种脱甲酰酶存在，它在肽链合成开始后不久即从正在延伸的肽链中除去甲酰基。更有一种氨肽酶，可将末端甲硫氨酸从蛋白质中切除，但它并不作用于全部蛋白质。实验证明，约有50%的蛋白质仍在其N—末端保留甲硫氨酸。现在认为，脱甲酰还是切除fmet，常常与相邻的氨基酸有关，如果第二个氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸等，以脱甲酰为主，如果相邻氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸及缬氨酸，则常常切除fmet。 (二)、起始密码子的正确选读 细菌体内蛋白质肽链的合成并不是从mRNA 5′端的第一个核苷酸开始的，被转译的头一个密码子往往位于5′--端的第25个核苷酸以后。许多研究证实，在mRNA 5′端距离起始密码子上游约10个核苷酸的地方有一段富含嘌呤的序列（称为Shine—Delgarno序列），而30S小亚基中16SrRNA的3′--端有一段富含嘧啶的序列，这两个序列在小亚基与mRNA结合时，可形成互补。现在认为，正是这样的配对将起始密码子带入核糖体的起始位置上，从而使起始密码得以被正确选读。如图所示： 5′ 3′ OH G A 16SrRNA A U U C UCCUCCA 5′GAUUCCUAGGAGGUUUGACCUAUGCGAGCUUUUAGU…………3′mRNA fmet Arg Ala Phe Ser mRNA起始区与16SrRNA3′末端的互补示意图 (三)、70S起始复合物的形成 在大肠杆菌中，mRNA首先与核糖体的30S小亚基相结合，此反应必须要有起始因子3（IF3，相对分子质量为21000的蛋白质）参加，先形成mRNA—30S—IF3复合物（比例为1:1:1），然后在IF1(相对分子质量为8000的蛋白质)参与下，mRNA—30S—IF3进一步与fmet--tRNAfmet、GTP相结合，并释放出IF3，这样就形成了“30S—mRNA—fmet--tRNAfmet”复合物，称为30S起始复合物。30S起始复合物再与50S亚基相结合，形成一个有生物学活性的70S起始复合物，同时GTP水解为GDP和Pi，IF因子也被释放出来。这时fmet--tRNAfmet占据了核糖体上的肽酰基位点（P位点），空着的氨酰基位点（A位点）准备接受另一个氨酰基—tRNA，为肽链的延伸作好了准备。在70S起始复合物中，tRNAfmet上的反密码子一定要与mRNA上的起始密码子AUG（GUG、UUG）配对，以保证读码准确无误。蛋白质生物合成的起始过程如图所示。 蛋白质生物合成过程中肽链的延长 大肠杆菌肽链的延长分为三个步骤。 1．氨酰—tRNA进入A位点 氨酰—tRNA通过反密码子与mRNA上密码子之间的配对，准确的进入A位点，这一步反应需要GTP和延伸因子参加。延伸因子有两种：EFTu，相对分子质量为19000，很不稳定；EFTs，相对分子质量为40000，比较稳定。EFTu先与GTP结合成EFTu--GTP，后者再与氨酰—tRNA结合成一个“三联”复合物。此复合物与70S复合物作用，借助于水解GTP释放出的能量使氨酰—tRNA进入A位点，同时释放出EFTu—GDP。EFTu—GDP再与EFTs及GTP反应，重新形成EFTu—GTP,参与下一轮的反应。除fmet--tRNAfmet外，所有的氨酰—tRNA都必须与EFTu—GTP结合后才能进入70S核糖体的结合位点。 2．肽键的形成 肽酰基（或fmet）从P位点转移到A位点上，同时形成一个新的肽键，即进入A位点的氨酰—tRNA上的氨基与P位点的肽酰—tRNA（或fmet--tRNAfmet）上的羧基之间形成一个新的肽键。这一步反应需要核糖体上的蛋白质因子----肽酰基转移酶和较高浓度的钾离子参加。与此同时，P位点上的tRNA卸下肽酰基或fmet成为无负载的tRNA，而A位点上的tRNA此时携带的不再是氨酰基，而是一个多肽酰基（或一个二肽酰基）。 蛋白质生物合成起始过程示意图 3．移位 移位是指核糖体沿mRNA的5′→3′方向作相对移动，每次移动一个密码子的距离。移位的结果使原来在A位点上的肽酰—tRNA进入P位点，原来在P位点上的无负载tRNA离开核糖体，移位反应也需要蛋白质因子----EFG（也称为移位酶）和GTP参加，但对GTP的具体作用还不清楚，过去认为GTP水解时释放出的能量直接用于肽键的形成，但目前认为这部分能量主要使IF2、EFTu及EFG等蛋白质因子从核糖体上释放出来，使它们投入到另一轮次的延伸反应中去。 上述三步反应每重复一次，肽链延长一个氨基酸，直至A位点上出现终止密码为止。肽链的延伸过程如图所示。 蛋白质生物合成中肽链延伸过程示意图 蛋白质合成的终止 当核糖体的A位点上出现肽链合成的终止密码子时，由蛋白质生物合成的释放因子（RF）识别并与之结合，从而促使新合成的肽链释放出来。mRNA上肽链合成的终止密码子为UAA、UAG、UGA。蛋白质生物合成的释放因子有三个，即RF-1、RF-2和RF-3，RF-1的相对分子质量为5000，可识别UAA和UAG，RF-2的相对分子质量为5000，可识别UAA和UGA，RF-3不识别任何终止密码，但能协助肽链的释放。RF-1和RF-2还可以使P位点上的肽酰转移酶活性转变成水解活性，从而水解P位点上tRNA与肽链之间的酯键，使肽链释放出来。肽链一旦释放出来，P位点上无负载的tRNA即离开70S核糖体，接着核糖体离开mRNA，并解离成50S亚基和30S亚基（IF3与30S亚基的结合，可防止50S亚基与30S亚基的聚合），再重新投入到新一轮的反应中去。 蛋白质生物合成终止过程示意图 真核细胞蛋白质的生物合成 真核细胞蛋白质生物合成的机理与原核细胞十分相似，但步骤更为复杂，涉及到的蛋白质因子也更多。总的说来，与原核细胞比较有以下几个特点： 1．真核细胞的核糖体更大。原核细胞核糖体的相对分子质量为2700000，而真核细胞核糖体的相对分子质量为4200000。 2．真核细胞蛋白质生物合成的起始氨基酸是甲硫氨酸，而不是N—甲酰甲硫氨酸。起始tRNA为Met—tRNAmet，此tRNA分子不含TψC序列，这在tRNA家族中是十分特殊的。 3．起始密码子AUG的上游不富含嘌呤序列。40S核糖体与mRNA 5′端的帽子结构相结合后，向3′端移动，以便寻找AUG密码子，并从此部位开始多肽链的合成。真核细胞的一个mRNA分子通常只有一个起始密码子，每种mRNA分子只能翻译出一种多肽链。 4．真核细胞蛋白质翻译过程中涉及到的蛋白质因子更多。在40S起始复合物的形成过程中，涉及到eIF-1、eIF-2、eIF-2A、eIF-3、eIF-4A、eIF-4B、eIF-4C、eIF-4D，在60S亚基与40S复合物结合为80S起始复合物的过程中主要是eIF-5起作用。真核细胞中肽链的延伸因子为EF1α和EF1βγ，相当于原核细胞中的EFTu和EFTs。真核细胞中多肽链合成的终止因子称为信号释放因子，缩写为eRF。 5．蛋白激酶参与真核细胞蛋白质合成的调节。在真核细胞中，蛋白激酶可以催化eIF-2磷酸化。eIF-2的作用是将Met—tRNAmet送至40S核糖体上，eIF-2被磷酸化后就难以投入到下一轮的起始过程中去，所以使蛋白质的生物合成受到抑制。 第四章 酶的作用原理 在生物体内几乎所有的生命活动都需要酶的参与。酶是一种生物催化剂。其化学本质是蛋白质，许多酶分子在发挥作用时，还需要辅酶或辅基参与，辅酶和辅基是小分子有机物，有些酶虽然不需要辅酶或辅基，但需要金属离子，有些酶既需要辅酶或辅基，又需要金属离子。酶作为催化剂具有底物专一性和催化反应的高效率两大特点，这些都与酶的结构有关。酶的催化活性与其一级结构密切相关，如果酶活性中心的氨基酸组成和结构发生改变，酶的活性也发生改变。酶的活性与其高级结构也有密切关系，如果酶的高级结构发生改变，则酶的活性亦发生改变。 在酶促反应中，酶首先与底物结合成不稳定的中间产物，此中间产物再生成产物并释放出酶。即： E + S ES P + E E表示酶，S表示底物，ES表示中间产物，P表示产物。 第一节 酶与底物相结合的两种假说 一、“钥匙”假说 “钥匙”假说认为：酶活性中心的必需基团与底物分子在化学结构上具有十分密切的互补关系，如同锁与钥匙的关系一样，因而能专一性的结合形成中间复合物。酶和底物分子都有三维空间结构，按照这一理论，酶的活性中心与底物分子的空间结构必须十分吻合，所以这一假说可以解释某些酶的立体异构专一性和酶的竞争性抑制作用，但却不能解释一个酶可以与几个底物结合的现象和酶催化的可逆反应等问题。 二、“诱导楔合”假说 “诱导楔合”假说认为：酶分子和酶分子活性中心的构象都是可变的，当底物与酶分子接近时，可诱导酶分子的构象发生改变，使之有利于与底物结合。此假说的要点是：在酶促反应中，酶分子活性中心的构象发生了变化。这一点已经通过旋光测定和X—射线衍射分析得到了证明。 第二节 酶促反应的本质和机制 酶促反应包括酶与底物的结合和催化基对反应的加速两个过程。酶活性中心与底物之间大多数是通过短程非共价力相结合的，因此反应产物易于与酶分开，但也发现在某些酶催化的反应中，存在着过渡性的共价复合物。酶的催化活力部分地受到活性中心内具有一定空间排列的带电荷基团的影响，这些基团是酶蛋白中某些氨基酸残基的电离侧链，它们通过酶蛋白分子的二级和三级折叠在空间相互靠近，从而组成了酶的活性中心。催化基团的精确位置对酶促反应甚为重要，当酶蛋白变性时，使这些基团在空间的排列状态受到破坏，酶因而失去活性。 酶催化反应的高效率是由几种不同的效应引起的，现已观察到在酶促反应中至少有五种不同的效应。 一、“张力”效应 酶可使底物分子中的敏感健产生“张力”，使底物激活。当底物与酶活性中心结合时，不仅使酶的构象发生变化，而且也常常使底物分子发生变化，在酶活性中心关键性电荷的影响下，使底物分子内敏感键的电子发生重排，其中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生了电子张力，使敏感键更为敏感，更易于发生反应，以致反应所需要的活化能降低，从而加快了反应速度。如图所示。 酶使底物敏感键产生“张力”示意图 酶与底物结合后产生的张力效应如何使底物激活的问题，可借助于非酶促反应的例子来理解。如二甲基磷酸和乙烯磷酸的水解反应： O O H3C—O—P—O—CH3 + —OH H3C—O—P—O- + CH3OH O- O- H2C CH2 … … O OCH2CH2OH O O + —OH P P -O O- -O O- 乙烯磷酸可以看作二甲基磷酸的环状类似物，由于二甲基之间形成了共价键，影响了C—O键的电子云密度，使其产生了张力，变得更为敏感，因而易于断裂。它的水解速度较二甲基磷酸的水解速度快108倍。 二、底物与酶的“靠近”及“定向”效应 由于化学反应速度与反应物浓度成正比，若在反应系统的某一局部区域，底物浓度升高，则反应速度也随之增加。提高酶促反应速度最主要的方法是：使底物分子进入酶的活性中心区域，也就是说大大提高酶活性中心底物的有效浓度。有人曾测过某底物在溶液中的浓度为0.001mol/L，而在其酶的活性中心的浓度竟达到了100mol/L，比溶液中的浓度高十万倍，这可能是酶活性中心与底物具有很高亲合力的原因。因此，可以想象，在酶活性中心区域反应速度必定是很高的。这就是酶和底物的“靠近”效应。 酶与底物的这种靠近“效应”对提高反应速度的作用可以用一个著名的有机化学实验来说明。如下表所示：双羧酸苯酯在分子内催化过程中，自由羧基作为催化剂起作用，而连有R基的酯键则作为底物，受—COO-的催化断裂成环而形成酸酐，催化基团—COO-越靠近酯键则反应速度越快，在最近的情况下，反应速度可增加53000倍。 分子内“靠近”效应的有机模式实验 酯 水解的相对速度   CH2—C—O—R CH2 O CH2 COO-  1   CH3 CH2—C—O—R C O CH3 COO-  20   CH2—C—O—R O CH2—COO-  230   C—O—R C O COO-  53000   但仅仅“靠近”还不够，还需要使反应基团和催化基团彼此严格地“定向”，只有既“靠近”又“定向”，反应物分子才被作用，迅速形成过渡态，从而加速了反应的进行。如图所示。 “靠近”与“定向”效应示意图 当底物未与酶结合时，活性中心的催化基团还未能与底物十分靠近，但由于酶活性中心有一定的适应性，即当专一性底物与活性中心结合时，酶蛋白会发生一定的构象变化，使活性中心的结合基团与催化基团正确地排列并定位，以便能与底物楔合，使底物分子得以靠近并定向于酶。这就是前面所提到的“诱导楔合”假说。只有这样才能使酶活性中心的底物浓度大大提高，酶促反应速度才能大大加快。所以，酶构象发生的这种变化是反应速度增大的一个重要原因。反应后释放出产物，酶的构象再逆转，回到它的初始状态。对溶菌酶及羧肽酶进行的X—射线衍射分析的实验结果已经证实了上述看法。Jenck等人指出：“靠近”及“定向”效应可能使反应速度增加108倍，这与很多酶的催化效率很相近。 三、共价催化 有些酶是以另一种方式来催化反应的，这种方式是酶与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，这个中间物很容易变成过渡态，因此能大大降低反应活化能，使底物越过较低的能阈而形成产物。这种催化方式称为共价催化。 共价催化可以提高反应速度的原因需要从有机模式的某些原理说起。共价催化最一般的形式是催化剂的亲核基团对底物中亲电子的碳原子进行攻击。亲核基团含有多电子原子，可以提供电子，所以是十分有效的催化剂。亲核基团作为强有力的催化剂提高反应速度的作用原理可以从亲核基团催化酰基转移的反应中看出。 ①亲核基团（Y）催化的反应 快 第一步 RX（酰基供体）+ Y X- + RY（酰化了的催化剂） 快 第二步 RY + H2O或醇（酰基受体） ROH + Y + H+ 快 二步合并 RX + H2O或醇 ROH + X + H+ Y ②非催化反应 慢 RX + H2O或醇 ROH + X + H+ 第一步反应中亲核基团（催化剂Y）攻击含有酰基的分子，形成了带有亲核基团的酰基衍生物，这种酰基衍生物作为一个中间物再起作用；第二步反应中将酰基从亲核催化剂上转移到最终的酰基受体上，这种受体分子可能是水或某些醇。由于反应中有催化剂参加，而且催化剂是易变的亲核基团，所以两步催化的总速度要比非催化反应大得多。因此，形成不稳定的共价中间物可以大大加速反应。酶分子上强有力的亲核基团很多，可以进行共价催化。酶蛋白分子上至少有三种亲核基团，即丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基。 —CH2—O: —CH2—S: —CH2—C＝CH H H HN N: C 丝氨酸羟基 半胱氨酸巯基 H 组氨酸咪唑基 此外,辅酶中还有另外一些亲核中心。共价结合也要以被亲电子基团所催化，最典型的亲电子基团是H+、Mg2+、Mn2+及Fe3+等。 酸碱催化 酸碱催化剂是催化有机反应最普遍最好的催化剂。酸碱催化剂有两类，一类是狭义的酸碱催化剂，即H+与OH-。由于酶促反应的最适pH一般近中性，因此H+与OH-的催化作用在酶促反应中的重要性是比较有限的。另一类是广义的酸碱催化剂，指的是质子供体（广义的酸基团）和质子受体（广义的碱基团），它们在酶促反应中的重要性大得多，发生在细胞内的许多类型的有机反应都是广义的酸碱催化的。例如，羰基上的加水反应、羧基酯及磷酸酯的水解反应、双键上的脱水反应、各种分子的重排反应以及许多取代反应都是广义的酸碱催化反应。 酶蛋白中含有好几种可以起广义酸碱催化作用的功能基，如氨基、羧基、硫氢基、酚羟基及咪唑基等。其中组氨酸上的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是有效的广义酸碱功能基。 蛋白质中可作为广义酸碱的功能基 广义的酸基团（质子供体） 广义的碱基团（质子受体）   —COOH  —COO-   —NH3+  —NH2   —SH  —S-   OH  O-   —C CH HN N+H C H  —C CH HN N： C H  影响酸碱催化反应速度的因素有两个：一是酸碱的强度。在这些功能基中，组氨酸咪唑基的解离常数约为6.0，这意味着从咪唑基上解离下来的质子浓度与水中的[H+]相近，因此它在接近生物体液pH的条件下（即中性），有一半以酸的形式存在，另一半以碱的形式存在。也就是说咪唑基既可作为质子供体，又可作为质子受体在酶促反应中发挥作用，因此咪唑基是最有效、最活泼的一个催化功能基。二是这样的功能基供出质子和接受质子的速度。在这方面，咪唑基又是特别突出的，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半寿期小于10-10秒，而且供出或接受质子的速度几乎相等。由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，但却很重要。推测在生物进化过程中，它很可能不是作为一般的结构成分，而是被选择作为酶分子的催化成分而存在下来的。 酶活性中心的疏水效应 有些酶的活性中心相对的说是非极性的，因此酶的催化基团被低介电环境所包围，在某些情况下，还可能排除高极性的水分子,能够与酶的疏水性活性中心结合的自然是底物分子上的非极性基团，从而使底物分子的敏感键准确的定向于酶活性中心的催化基团。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就有很大的反应力，有助于加速酶促反应。例如，胰凝乳蛋白酶的活性中心就有一个“疏水袋”，所以它能有选择的作用于芳香族氨基酸的羧基端肽键。 辅助因子在酶促反应中的作用 许多酶在催化反应时需要辅助因子存在。所以，辅助因子是影响酶活性的一个重因素。在些辅助因子仅仅与酶蛋白呈疏松的结合状态，又称为“激活剂”，可因透析而与酶蛋白分开，如Ca2+、Zn2+、Mn2+等金属离子。有些辅助因子是小分子有机物，有些小分子有机物与酶蛋白的结合也不紧密，可用透析等方法除去，称之为“辅酶”，另一些小分子有机物与酶蛋白结合紧密，不能用透析等简单的方法除去称之为“辅基”。 包含金属离子的酶促反应 金属离子的作用可能是将酶与底物通过配价键连接起来形成复合物，这种复合物的存在已得到了证实。例如，某些肽酶需要Co2+才能表现出最大活性，Co2+的作用是使酶与底物连接起来，通过肽键中的O和N（都是电子供体）形成五员环复合物，由于Co2+吸引了电子，使得肽键更容易被水解。 O R H H O R H C H C N C C + H2N—C…… N C C…… N COOH H Co2+ O 又如草酰乙酸的酶促脱羧反应也是通过类似机制完成的。 O O O C—C—CH2—C—O- C—C＝CH2 + CO2 O- O O O- M2+ M2+ O C—C—CH3 + M2+ O- O 2．包含辅酶的酶促反应 磷酸吡哆醛是一种重要的辅酶，包含在许多氨基酸代谢的酶促反应中。在含有磷酸吡哆醛的酶促反应中，其最初的变化是吡啶环上的醛基与底物氨基酸的氨基形成Schiff碱，其中含有共轭双键，因而含有流动的π电子，这种Schiff碱有几种可能的互变形式。根据底物氨基酸的性质，移动电子受到不同的影响，可产生几类不同的反应。而对于氨基酸来说，与磷酸吡哆醛的结合，使其变得更为活泼，更易发生反应。 H C＝O OH H X HO CH2—O—P—OH + O＝C—C—C—R H3C O OH NH2 N 脱羧 H X * O＝C C—C—R O N 转氨基 M2+ CH OH O CH2—O—P—OH O H3C N+ H *：若X是—OH（丝氨酸）为脱水反应；若是—SH则生成H2S。 上图中包含了磷酸吡哆醛参与催化的几种可能发生的反应。金属离子（M2+）的参与可能有助于保持平面结构，从而有利于共轭系统的电子移动。电子向-N+-移动的结果使Cα原子的化学键变弱，从而有利于反应的发生。磷酸吡哆醛与氨基酸结合后究竟引起哪一种反应，则取决于酶的性质。 第三节 酶促反应动力学 酶促反应动力学研究的是酶促反应的速度规律和各种因素对酶促反应速度的影响。 在酶的结构与功能的关系研究中，在酶的作用机制的研究中，需要动力学提供实验证据。为了寻找最有利的反应条件，最大限度的发挥酶促反应的高效率；为了了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等等，都需要掌握酶促反应速度的规律。因此，酶促反应动力学是酶学研究中的一个既具有重要理论意义，又具有实践意义的课题。 底物浓度对酶促反应速度的影响----米氏学说的提出 底物浓度对酶促反应速度的影响是比较复杂的。若以酶促反应速度v对底物浓度[S]作图，可得到如下关系图： v Vmax 零级反应 混合级反应 1/2Vmax 一级反应 Km [S] 酶促反应速度与底物浓度之间的关系 从图中可以看出，当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的增加，反应速度不再按正比例升高，表现为混合级反应。如果继续加大底物浓度，酶促反应速度不再加快，表现为零级反应，即反应速度趋向于一个极限值，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有此饱和现象，但各自达到饱和时所需要的底物浓度并不相同，甚至差异很极大。 曾有各种假说试图解释上述现象，其中比较合理的是1902—1903年Brown（布郎）和Henri（亨利）提出的“中间产物”学说。1913年前后Michaelis（米彻利斯）和Menten（门特）在此基础上作了大量的工作，积累了足够的实验证据，从而提出了酶促反应动力学的基本原理，并归纳为一个数学表达式。后来又经Briggs（布里格斯）和Haldane（霍尔丹）的补充和发展，将此数学表达式可写为： Vmax [S] V = Km + [S] 这个方程称为米氏方程（米、门、布、霍四氏方程），它的前提是酶与底物反应的“稳态平衡”假说（或叫做“快速平衡”假说）----开始，两者的反应速度较快，迅速地建立平衡。米氏方程表明了底物浓度与酶促反应之间的定量关系，这就是“中间产物”学说得到了人们的普遍承认。现在一般称之为“米氏学说”。 (一)、米氏公式的导出 从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想，推论酶促反应分两步走： k1 第一步：E + S ES ⑴ k2 k3 第二步： ES P + E ⑵ k4 这两步反应都是可逆的，它们的正反应与逆反应的速度常数分别为k1、k2、k3、k4。 由于酶促反应的速度与中间产物ES的形成及分解直接有关，所以必须先考虑ES的生成速度与分解速度。Briggs和Haldane的发展就在于指出了ES的量不仅与①式的平衡有关，有时还与②式的平衡有关，不能一概都把②式忽略不计。 ES的形成量与E + S及P + E有关，但P + E形成ES的速度极小（特别是在反应处于初速阶段时，P很小，所以P + E→ES的速度极小），故可以忽略不计。因此ES的形成速度可用下式表示： d[ES] = k1（[E]–[ES]）·[S] ⑶ dt 通常底物是过量的，即[S]＞＞[E]，因此被酶结合的底物量（即[ES]）与总底物量相比，可以忽略不计。所以[S]-[ES]≈[S]，而[ES]的分解速度则是： k2 k3 ES S + E 和 ES P + E 此两式的速度之和为ES分解的总速度： -d[ES] = k2[ES] + k3[ES] ⑷ dt 当整个反应体系处于动态平衡，即恒态时，ES的形成速度与分解速度相等，即[ES]保持动态恒定。所以③＝④，即： k1（[E]–[ES]）·[S]＝k2[ES] + k3[ES] （[E]-[ES]）·[S] k2 + k3 = ⑸ [ES] k1 k2 + k3 令： Km = 并代入⑤式 k1 （[E]-[ES]）·[S] 则： = Km ⑹ [ES] 由此式可以得出动态平衡时的[ES]： [E][S] [ES] = ⑺ Km + [S] 因为酶促反应速度v与[ES]成正比，所以 v = k1[ES] ⑻ 将⑦式中的[ES]值代入⑧式中得： [E][S] v = k3 ⑼ Km + [S] 当底物浓度很高时，所有的酶都被底物所饱和，而转变成ES复合物，即[E] = [ES]时，酶促反应速度达到了最大速度Vmax，所以： Vmax = k3[ES] = k3[E] ⑽ ⑨式除以⑩式得： k3[E][S] v Km + [S] = Vmax k3[E] Vmax[S] 因此：v = ⑾ Km + [S] 这就是米氏方程，Km称为米氏常数。这个方程表明，当已知Km及Vmax时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。 (二)、米氏常数的意义 1 当： v = Vmax 时 2 Vmax Vmax[S] = 2 Km + [S] 1 [S] = Km + [S] ∴ [S] = Km 由此可见，Km值的物理意义为：Km值是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是mol/L，与底物的浓度单位一样。 米氏常数是酶学研究中的一个极为重要的数据，有以下几个特点： ①Km值是酶的特征常数之一，一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。 ②如果一个酶有几种底物，则对每一种底物各有一个特定的Km值，即酶有几种底物就有几个Km值，其中Km最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。 ③Km值也受温度和pH值的影响。因此Km值作为酶的特征常数只是征对一定的底物、一定的pH值和一定的温度条件而言的。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段，但必须在指定的条件下进行。 ④Km值与酶和底物的亲合力有关。1/ Km可近似地表示酶对底物的亲合力大小，1/ Km越大，表明酶对底物的亲合力越大；反之，越小。 ⑤Km值与米氏方程的实际用途：可由所要求的反应速度（应到达Vmax的百分数），求出应当加入底物的合理浓度。反过来，也可根据已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度。 例如：当酶促反应速度为的Vmax 99%时，其底物浓度应为： 100% Vmax [S] 99% Vmax = Km + [S] 99Km + 99[S] = 100[S] ∴ [S] = 99 Km (三)、米氏常数的求法 Vmax[S] 根据v = 的数学式，以v对[S]作图，得到一双曲线，从此双曲 Km + [S] 线图中可找出Vmax，再从1/2 Vmax可求出相应的[S]，此[S]值即为Km值。但实际上即使用很大的底物浓度，也只能得到趋近于Vmax的反应速度，而达不到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。但我们可以把米氏方程加以改变，使它成为相当于Y = aX + b的直线方程，然后再用作图法求出Km值。米氏方程的变换方式有两种： 双倒数法 这是最常用的方法。将米氏方程两边颠倒，进行数学变换可写成： 1 Km 1 1 = · + v Vmax [S] Vmax 1 1 实验时选择不同的[S]测定相对应的v，求出两者的倒数，以—对 作图， v [S] 1 1 绘出直线，并延至与横轴相交，横轴上的截距（-X）即为 值，Km = - 。此 Km X 法因为方便而应用最广，但也有缺点：实验点过于集中在直线的左端，作图不易十分准确。 1 v Km 斜率 = Vmax 1 Vmax 1 1 -X= Km [S] v 2．v – 法 [S] 将米氏方程两边同乘以（Km + [S]），并整理成： v v = - Km· +Vmax [S] v Vmax 以v对 作图，得一直线，其纵轴截距为Vmax，横轴截距为 ，斜率为 [S] Km -Km。 v Vmax 斜率 = -Km v Vmax [S] Km 抑制剂对酶促反应的影响 凡使酶活性降低，但不引起酶蛋白变性的作用称为酶的抑制作用。所以抑制作用和变性作用是不同的，变性作用是指引起酶蛋白变性而丧失活力的现象。 某些物质并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子的某些必需基团（主要指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶促反应速度降低，将这类物质称为酶的抑制剂。 (一)、抑制作用的类型 根据抑制剂与酶的作用方式和抑制作用是否可逆，可将酶的抑制作用分为两大类。 不可逆性抑制作用 这类抑制剂通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的必需基团相结合，导致酶活性降低或丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶的活性。 按照不可逆性抑制作用的选择性不同，可分为专一性不可逆性抑制作用和非专一性不可逆性抑制作用两类。专一性不可逆性抑剂仅和酶活性中心的有关基团反应，非专一性不可逆性抑制作用可以和一类或几类基团反应。但这种区别不是绝对的，因作用条件和对象不同，某些非专一性抑制剂有时会转化，产生专一性抑制作用。 比较起来，非专一性抑制剂（如烷化疏基、碘代乙酸等）用途更广，它可用来了解酶有哪些必需基团。而专一性抑制剂（如TPCK、DFP、3,4-癸炔酰-N-乙酰半胱胺等）则往往要在前者提供线索的基础上才能设计出来。另外，非专一性抑制剂还可用来探索酶的构象。 可逆性抑制作用 这类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可用透析、超滤等方法除去抑制剂以恢复酶的活性。可逆性抑制剂与游离酶之间存在着一个平衡。即E + I（抑制剂）= EI。 根据抑制剂与底物的关系，可将可逆性抑制作用分为三类。 ①竞争性抑制作用 抑制剂与底物竞争酶的活性中心，从而阻止底物与酶的结合。因为酶的活性中心不能同时既与底物结合，又与抑制剂结合。这是最常见的一种抑制作用。竞争性抑制剂具有与底物相类似的结构，能与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解为产物P，酶促反应速度因此下降。可以通过增加底物浓度的方法减弱或解除这种抑制作用。抑制剂、酶、底物之间存在如下关系： E + S ES → P + E + I EI 竞争性抑制作用最典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用，因为丙二酸的结构与该酶的正常底物琥珀酸很相似。 ②非竞争性抑制作用 酶可以同时与底物及抑制剂相结合，两者没有竞争作用。酶与抑制剂结合后还可以和底物结合，EI + S→ESI；酶与底物结合后也可以与抑制剂再结合，ES + I→ESI。但是形成的三联复合物不能分解为产物，因此酶活性降低。这类抑制剂不是与酶的活性中心结合，而是与酶活性中心之外的必需基团相结合，其结构可能与底物毫无相关之处。如亮氨酸是精氨酸的一种非竞争性抑制剂。大部分非竞争性抑制作用都是由一些可以与酶活性中心之外的—SH可逆性结合的试剂引起的，这种—SH对酶活性来说也是很重要的，因为它们帮助维持酶分子的构象。例如，含某些金属离子（如Cu2+、Hg+、Ag+等）的化合物属于这类抑制剂，它们与酶反应时存在下列平衡： E—SH + Ag+ E—S—Ag + H+ 此外，EDTA可结合金属离子，对需要金属离子的酶起抑制作用，这也属于非竞争性抑制作用。 ③反竞争性抑制作用 酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合，即ES + I→ESI，形成的复合物也不发生反应。比较起来，这种抑制作用最不重要。 (二)、一些重要的抑制剂 不可逆性抑制剂 这类抑制剂被过量的加入到酶溶液中时，随着受抑制酶分子的逐渐增多，抑制作用不断增强，甚至使酶反应停止。某些不可逆性抑制剂通过对酶分子的化学修饰来起抑制作用，但有时修饰过的酶仍有一定活力，只是活力大大降低。 ①有机磷化合物 有机磷化合物能够与酶活性直接相关的丝氨酸羟基牢固地结合，从而抑制某些酶蛋白及酯酶。这类化合物强烈地抑制与中枢神经系统有关的胆碱酯酶，使乙酰胆碱不能分解为乙酸和胆碱。乙酰胆碱的堆积引起一系列的神经中毒症状，因此这类物质又被称为神经毒剂。第二次世界大战中曾用过的DFP（即DIPF：二异丙基磷酰氟）及一些有机磷杀虫剂（如1605、敌百虫、滴滴畏、乐果等）都属于这类化合物。 它们的一般结构如下： R O O P R、R′为烷基、X则为F、CN、 O NO2等。 R′ O X 如DFP的结构如下： CH3 CH CH3 O O P CH3 O F CH CH3 例如农药1605与胆碱酯酶的作用如下： OC2H5 C2H5 O S P + E—OH E OH…P OC2H5 C2H5 O O NO2 S 1605 胆碱酯酶 O NO2 OC2H5 HO NO2 + E O P OC2H5 S 对硝基酚 中毒的酶（磷酰化胆碱酯酶） 有机磷抑制剂与酶结合后虽不解离，但有时可用胯化物（含CH＝NOH基团）或羟肟酸把酶上的磷酸根除去，使酶复活。临床上应用的解毒剂PAM（解磷定）就是这类化合物，其解毒过程为： OC2H5 OC2H5 E—O—P—OC2H5 + CN＝NOH CH＝NO P—OC2H5+ E—OH S N+ N+ S CH3 CH3 中毒的酶 PAM 磷酰化PAM 游离酶 ②有机汞、有机砷化合物 这类化合物与酶的—SH作用，抑制酶的活性。如对氯汞苯甲酸的作用如下： E—SH + ClHg COO- E—S—Hg COO- + HCl 巯基酶 对氯汞苯甲酸 中毒的酶 氯化氢 这类抑制剂可因加入过量的巯基化合物如半胱氨酸或还原性谷胱甘肽而被解除。 这类抑制剂还可与巯基化合物作用生成环状硫醇化合物，如三价的有机砷化合物可与辅酶硫辛酸作用，破坏辅酶硫辛酸，从而抑制了丙酮酸氧化酶系统。 CH2—SH CH2—S CH2 CH2 As—R′+ H2O + O＝As—R′ CH —SH CH —S （CH2）4—COO- （CH2）4—COO- 还原型硫辛酸 有机砷化合物 环状硫醇化合物 路易斯毒气也是有机砷化合物，它的毒理作用也是这样的，能抑制几乎所有巯基酶。砷化物的毒性不能被单巯基化合物解除，但可被过量的双巯基化合物解除，如二巯基丙醇。 CH2—SH CH —SH 所以它是临床上砷化物和重金属中毒的重要解毒剂。 CH2—OH ③氰化物 氰化物与含铁卟啉的酶（如细胞色素氧化酶）中的Fe2+结合，使酶失去活性而阻抑细胞呼吸。 ④重金属 Ag、Pb、Hg等金属盐能使大多数酶失活，机理尚不清楚，但有一点，它可以与巯基酶的巯基结合是已知的。加入EDTA及巯基化合物可以解除此类中毒。 ⑤烷化剂 其中最重要的是含卤素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰胺及卤乙酰苯等。它们可使酶中的一些—SH烷化，从而使酶失活。常用它们作为鉴定酶中巯基的特殊试剂。其作用如下： O O E—SH + I—CH2—C—OH E—S—CH2—C—OH + HI 巯基酶 碘乙酸 中毒的酶 碘化氢 ⑥有活化作用的不可逆性抑制剂 还有一类独特的化合物是以潜伏状态存在的，当它与某些酶的活性中心结合后，就被激活为有抑制活性的抑制剂。在与酶活性中心结合的过程中，酶激活了这类无活力的、潜伏状态的抑制剂，而酶自身的活力则完全丧失，所以这类抑制剂又被看作是酶的“自杀性底物”。 这类抑制剂只是在遇到对它们来说是专一性的靶子酶时，才从潜伏状态转变成活性状态。由于这种抑制作用具有高度的专一性，以及这种抑制作用是按化学计量进行的，因此，它们可成为对酶活性中心进行高度专一性研究的良好试剂。 可逆性抑制剂 可逆性抑制中最重要、最常见的是竞争性抑制剂，它们的结构与正常底物极为相似，但又有一些区别，它们能与底物争夺酶，但不能被酶作用。常见的可逆性抑制剂有以下几种。 ①磺胺类药物 以对氨基苯磺酰胺为例，它的结构与对氨基苯甲酸十分相似，是对氨基苯甲酸的竞争剂，对氨基苯甲酸是细菌合成二氢叶酸的原料。叶酸和二氢叶酸则是嘌呤核苷酸合成中的重要辅酶----四氢叶酸的前身，如果缺乏四氢叶酸，细菌的生长繁殖就会受到影响。 H2N COO- H2N SO2NH2 对氨基苯甲酸 对氨基苯磺酰胺 由于磺胺类药物与对氨基苯甲酸的结构类似，所以可竞争二氢叶酸合成酶，抑制二氢叶酸合成酶的活性，抑制细菌的生长繁殖，从而达到治病的效果。人体能直接利用食物中的叶酸，所以不受影响。也有一些细菌能直接利用环境中的叶酸，所以对磺胺灶药物不敏感。 ②抗菌增效剂TMP 抗菌增效剂TMP可增强磺胺类药物的药效，因为它的结构与二氢叶酸类似，是细菌二氢叶酸还原酶竞争性抑制剂，但它很少抑制人体的二氢叶酸还原酶。它与磺胺类药物配合使用，可使细菌的四氢叶酸合成受到双重阻碍，因而严重影响核酸及蛋白质合成。 OCH2 N CH2 OCH2 NH2 H2N N OCH2 TMP 2,4—二氨基—5—(3′,4′,5′--三甲氧苄基)嘧啶 ③氨基叶酸 氨基叶酸的结构与叶酸的结构类似，所以是叶酸还原酶的竞争性抑制剂。氨基叶酸中用氨基取代了正常叶酸中喋呤环上的羟基，所以可用作抗癌药物。 OH N N CH2 NH CO NH CH CH2 CH2 CPP- COO- H2N N N 叶酸 NH N N CH2 NH CO NH CH CH2 CH2 CPP- COO- H2N N N 氨基叶酸 竞争性抑制作用的原理是药物设计的根据之一，如抗癌药物阿拉伯糖胞苷、5—氟尿嘧啶等都是根据竞争性抑制作用设计出来的。 (三)、可逆性抑制作用的动力学 可逆性抑制剂与酶结合后产生的抑制作用，可以根据米氏学说的原理加以推导，找出其定量关系。 竞争性抑制作用 在竞争性抑制作用中，底物或抑制剂与酶的结合都是可逆的，存在着下列平衡： k1 k3 E + S ES E + P + K2 I ⑴ Ki1 Ki2 EI Ki2 [Ef]为游离酶浓度，[E]为酶的总浓度。Ki为EI的解离常数，Ki = 。Km Ki1 K2 + k3 为ES的解离常数，Km = 。 k1 酶不能同时与底物（S）和抑制剂（I）结合，即： ES + I × ESI EI + S × ESI 也就是说，反应系统中有ES、有EI、而没有ESI。 ∴ [E] =[Ef]+[ES]+[EI] ⑵ 根据米氏学说原理： Vmax = k3[E] v = k3[ES] Vmax [E] ∴ = v [ES] Vmax [Ef]+[ES]+[EI] = ⑶ v [ES] 为了消去[ES]项，必需先用米氏方程求出[Ef]项及[EI]项。 [Ef][S] ∵ Km = [见米氏方程推导过程中的⑹式] [ES] Km 1 ∴ [Ef] = [ES] = Km· ·[ES] ⑷ [S] [S] [Ef][I] ∵ Ki = [EI] [Ef][I] ∴ [EI] = Ki 将⑷代入[EI]式中得： 1 [I] [EI] = Km· ·[ES]· ⑸ [S] Ki 将⑷式、⑸式代入⑶式中得： 1 1 [I] Km· ·[ES] + [ES] + Km· ·[ES]· Vmax [S] [S] Ki = v [ES] 1 1 [I] = Km· + Km· · + 1 [S] [S] Ki [I] 1 = Km（1 + ） + 1 Ki [S] 1 Km [I] 1 1 ∴ = （1 + ） + ⑹ v Vmax Ki [S] Vmax 1 1 用 对 作图： v [S] 1 [I]加大 Km [I] v 加入I后的斜率： （1+ ） Vmax Ki Km 正常斜率： Vmax 1 Vmax 1 1 1 [S] - - Km [I] Km（1+ KI） 以v对[S]作图： v Vmax Vmax[S] 加入竞争性抑制：v = [I] 1/2Vmax Km（1+ ）+ [S] Ki Km K′m [I] K′m = Km（1+ ） Ki 由此可见，在加入竞争性抑制剂后，Vmax不变，Km变大。 非竞争性抑制作用 在非竞争性抑制作用中存在如下平衡： Km E + S ES P + E + + I I ⑴ Ki Ki Km E + EI ESI 在非竞争性抑制中，酶与底物结合后，可再与抑制剂结合，酶与抑制剂结合 后，也可再与底物结合。 [ES][I] ES + I ESI Ki = [ESI] [Ef][I] E + I EI Ki = [EI] 在此反应系统中，有Ef 、ES、EI及ESI。 ∴ [E]=[Ef]+[ES]+[EI]+[ESI] ⑵ Vmax [E] 代入 = 得 v [ES] Vmax [Ef]+[ES]+[EI]+[ESI] = ⑶ v [ES] [Ef][S] ∵ Km = [ES] Km 1 ∴ [Ef] = ·[ES] = Km· ·[ES] ⑷ [S] [S] [ES][I] ∵ Ki = [ESI] [ES][I] [I] ∴ [ESI] = = ·[ES] ⑸ Ki Ki [Ef][I] ∵ Ki = [EI] [Ef][I] 1 [I] ∴ [EI] = = Km· ·[ES]· ⑹ Ki [S] Ki 将⑷、⑸、⑹式代入⑶式中得： 1 1 [I] [I] Km· ·[ES]+[ES]+ Km· ·[ES]· + ·[ES] Vmax [S] [S] Ki Ki = v [ES] 1 [I] 1 [I] = Km· + Km· · + 1 + [S] Ki [S] Ki [I] 1 [I] = Km（1+ ）· +（1+ ） Ki [S] Ki 1 Km [I] 1 1 [I] ∴ = （1+ ）· + （1+ ） ⑺ v Vmax Ki [S] Vmax Ki 1 1 用 对 作图： v [S] [I]加大 1 Km [I] 加入I后的斜率： （1+ ） v Vmax Ki Km 正常斜率： Vmax 1 [I] （1+ ） Vmax Ki 1 1 [S] - Km 以v对[S]作图： v Vmax Vmax [S] v = Km + [S] （1/2 Vmax）V′max Vmax [S] 加入非竞争性抑制剂：v = 1/2 V′max [I] （1+ ）（Km+[S]） Ki Km（Km′） [S] 由此可见，加入非竞争性抑制剂后，Km不变，Vmax变小。 3．反竞争性抑制作用 这类抑制作用中存在着以下平衡： Km E + S ES P + E + I ⑴ KI ESI 酶蛋白必须先与底物结合，然后才与抑制剂结合。即： E + I × EI ES + I ESI 那么，这种抑制作用中就有Ef 、ES及ESI，但无EI。 ∴ [E]=[Ef]+[ES]+[ESI] ⑵ Vmax [E] 代入 = 得 v [ES] Vmax [Ef]+[ES]+[ESI] = ⑶ v [ES] [Ef][S] ∵ Km = [ES] Km 1 ∴ [Ef] = ·[ES] = Km· ·[ES] ⑷ [S] [S] [ES][I] ∵ Ki = [ESI] [ES][I] [I] ∴ [ESI] = = ·[ES] ⑸ Ki Ki 将⑷、⑸式代入⑶式中得： 1 [I] Km· ·[ES]+[ES]+ ·[ES] Vmax [S] Ki = v [ES] 1 [I] = Km· +（1+ ） [S] Ki 1 Km 1 1 [I] ∴ = · + （1+ ） ⑹ v Vmax [S] Vmax Ki 1 1 用 对 作图： v [S] 1 [I]加大 v 加入I后斜率不变 Km 正常斜率： Vmax 1 Vmax 1 1 [S] - Km 1 [I] - （1+ ） Km Ki 以v对[S]作图： v Vmax Vmax [S] v = Km + [S] V′max Vmax [S] 1/2 Vmax 加入反竞争性抑制剂：v = 1/2 V′max [I] Km + （1+ ）[S] Ki Km′ Km [S] 由此可见，加入反竞争性抑制剂后，Km和Vmax均变小。 第四节 变构酶与变构调节 变构酶的概念 生物体内的有些酶是由两个以上的亚基组成的寡聚酶，酶分子上有两个结合部位，一个可与调节物结合，调节酶的活性，称为调节部位；另一个可与底物结合，催化底物发生反应，称之为催化部位。当调节物（或称效应物）与调节部位结合时，引起酶分子构象的变化，从而改变了该酶的催化部位与底物结合的性能，使酶的活性也随之发生改变。我们将这种酶就称为变构酶（或称为别位酶）。 变构调节的概念 当调节酶与变构酶的调节部位结合后，引起变构酶构象的改变，使其催化活性增强或减弱，以便达到调节新陈代谢的目的。我们将这种调节机制叫做变构调节（或别位调节）。其调节物（效应物）称为变构剂。能够增加酶与底物的亲合力，增强酶活性的调节物称为正效应物（或变构激活剂）；能够降低酶与底物亲合力，减弱酶活性的调节物称为负效应物（或变构抑制剂）。正效应物增加酶活性的作用称为变构激活，负效应物减弱酶活性的作用则称为变构抑制。 变构酶的结构、性质及调节物 变构酶在结构上有以下特点：①由两个以上的亚基组成；②有四级结构，酶的变构效应就与四级结构有关；③除了可与底物结合的活性中心外，还有一个与调节物结合的变构中心（调节中心或称控制中心），而且这两个中心处在酶的不同亚基上或同一亚基的不同部位上。 变构酶还表现出与一般酶不同的一些化学性质，如：①某些变构酶在0℃不 稳定，在室温下反而稳定；②大多数变构酶不遵循米氏方程；③代谢调节物造成的抑制作用也不服从典型的竞争性、非竞争性或反竞争性抑制作用的数量关系。 不同变构酶的调节物分子是不同的，有的变构酶具有同促效应或称同种协同效应，它的调节物分子就是底物，也就是说，这些酶分子上有两个以上的底物结合中心，其调节作用取决于酶分子上有多少个底物结合中心被底物所占据。有的变构酶具有异促效应，这种变构酶除与底物结合之外，还能与其它的调节物结合，即它的调节物不是底物分子。例如苏氨酸脱水酶的底物是苏氨酸，但调节物是L—异亮氨酸。而更多的变构酶既有同促效应，又有异促效应，它既受底物分子的调节，又受底物以外的其它调节物分子的调节，也就是说它的调节物之一是底物，调节物之二是、之三等是底物以外的其它物质。 变构酶的动力学及变构酶对酶促反应速度的调节 变构酶的酶促反应速度（初速度）与底物浓度之间的关系不符合典型的米氏方程，即不呈一般的v—[S]的双曲线，而大多数是“S”形的v—[S]曲线。 这种“S”形曲线表明，酶结合底物（或效应物）之后，酶的构象发生了变化，这种新有构象大大有利于后续分子与底物的结合，大大地促进了酶对后续的底物分子（或效应物）的亲合力，这是“正协调性”，又称为“协同结合”。这种变构酶称为具有正协同效应的变构酶。 Vmax ++ + - -- 1/2Vmax [S] Km′小 Km 大 km″ 正协同效应变构酶动力学曲线 从正协同效应变构酶的动力学曲线图上可以看出，当增加正调节物浓度时，表观Km值减小，亲合力增大，协同性（对底物浓度变化的灵敏度）减小；增加负调节物浓度时，表观Km值增大，亲合力减小，协同性增大。此处的表观Km值也表示酶促反应最大速度一半时的底物浓度，但是不能用来计算变构酶的初速度，因为v—[S]关系不是米氏方程中的关系。 变构酶的“S”形动力学关系，十分有利于反应速度的调节。为了说明这个问题，我们可将变构酶的“S”形曲线与非调节酶的双曲线合并于一图，进行比较。 Vmax 90% A B 50% 10% [S] 0.11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 从图中可以看出，在非调节酶曲线（A）中，当[S]=0.11时，v达到Vmax的10%，当[S]=9时，v达到Vmax的90%，达到这两种速度的底物浓度比为81；而在变构酶的“S”形曲线（B）中，当[S]=3时，v达到Vmax的10%，而当[S]=9时v达到Vmax的90%，所以达到同样的速度，底物的浓度比仅为3。这表明，当底物浓度略有变化，如上升3倍，变构酶的酶促反应速度就可以从10% Vmax突然上升到90% Vmax。而在典型的米氏型酶中，酶促反应速度若发生这么大的变化，则需要底物浓度上升81倍才行。前者底物浓度3倍的变化对于动物体来说是可以忍受的，后者底物浓度81倍的变化对动物体来说则不可忍受，不可能存在。所以，变构酶的“S”形曲线优点体现为：当底物浓度发生较小变化时，变构酶活性可发生极大的变化，从而极大地控制着反应速度，这就是变构酶能灵敏地调节酶促反应速度的原因所在。由于上述正协同效应，底物浓度对酶促反应速度的影响极大。换句话说，正是由于正协同效应，使得酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感。 另一种变构酶具有负协同效应。这类酶的动力学在表观上与双曲线有些相似（如图中的3），但仔细分析起来就可以看出，在这种曲线中，在底物浓度较低的范围内（A），随底物浓度的增加，酶促反应速度上升很快，但继续下去（如A---B），底物浓度虽然有较大的提高，但酶促反应速度加快的幅度较小，也就是说，负协同效应可以使酶促反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。 v 1 2 3 [S] A B 虽然大多数变构酶都表现出以上两种曲线，特别是大部分变构酶都表现出“S”形的v—[S]曲线，但是有一些没有变构效应而具有其它复杂作用机制的酶也会产生以上图形。因此，作图法仅能提供一些线索，指出酶可能属于哪一种类型，但不能完全作用为判定变构酶的依据。 对于某些酶的均一制剂可以用加热、化学试剂或其它方法处理。经处理后，酶若仍保持其催化活力，但失去了调节性质（有人称这种现象为“脱敏作用”），则这种类型的酶很可能是变构酶。用这种方法判别变构酶是有一定价值的。 Koshland等人建议，用下列比例式定量地判断与区分三类酶： 酶与底物（或配基）结合达90%饱和度时的底物（或配基）浓度 Rs = 酶与底物（或配基）结合达10%饱和度时的底物（或配基）浓度 典型的米氏酶：Rs = 81 具有正协同效应的变构酶：Rs＜81 具有负协同效应的变构酶：Rs＞81 目前国际上更常用Hill系数来判断酶属于哪一种类型。Hill在研究血红蛋白与氧结合的关系时，用被氧饱和的百分比Ys对氧分压作图，发现也有“S”形的曲线，并得出下列经验公式： Ys = [S]n/K（Ks）+ [S]n 并经换算后改写成 Ys lg = nlg[S]-lgK（Ks） 1-Ys K为平衡常数，在酶中可用Ks代替K。 Ys 以lg 对lg[S]作图（hill作图法），可得一条直线，该直线的斜率n称 1-Ys 为Hill系数。将此作图法用于酶学研究中可以看到，在一般情况下米氏型酶的Hill系数等于1，具有正协同效应的变构酶的Hill系数总是大于1，而具有负协同效方应的变构酶的Hill系数小于1。因而Hill系数可以作为判断协同效应的一个指标。 变构酶调节酶活性的机理 变构酶活性的改变是通过酶分子四级结构的改变来完成的。目前有两种重要的酶分子模型用来解释变构酶的“S”形动力学曲线。这两种模型都是以变构酶是寡聚酶的事实为根据，并受到血红蛋白接受氧的机理的启发而提出的。 序变模型（KNF模型） 序变模型假说主张酶分子中亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，亚基逐个地依次变化，因此酶分子有各种可能的构象状态。如下图模式所示： S S S S 亚基全部处 全部亚基处 按次序变化 于“关”型 于“开”型 （T型） （R型） 在这个模型中表示了一个四个亚基的酶分子模型，其中“R型”为“开”型构象，它有利于结合底物或调节物，“T型”为“关”型构象，它不利于结合底物或调节物。当底物（或正调节物）浓度上升到可以与其中的一个亚基牢固结合时，这时剩下的亚基就会按次序迅速地改变构象，形成一个有活性的四聚体，给出“S”形曲线。 在序变模型中既可以有正调节物的作用，又可以有负调节物的作用。由于这个序变模型可以表示酶分子的许多中间构象状态，因此用来解释变构酶的酶活性调节作用比下面介绍的齐变模型更好一些，适用于大多数变构酶，特别是在描述异促效应时，一般认为用序变模型更好一些。 齐变模型或对称模型（MWC模型） 齐变模型假说主张变构酶的所有亚基，或者全部呈坚固紧密的、不利于结合底物的“T”状态，或者全部呈松散的、有利于结合底物的“R”状态，这两种状态间的转变对每个亚基都是同时的、齐步发生的。“T”状态中亚基的排列是对称的，变成“R”状态后亚基的排列仍然是对称的。如图所示： 齐步变化 S S S S “T”状态 “R”状态 （对称亚基） （对称亚基） 对称亚基 齐步变化 对称亚基 正调节物（如底物）与负调节物浓度的比例决定变构酶究竟处于哪一种状态。当无小分子调节物存在时，平衡趋向于“T”状态，当有少量底物时，平衡即向“R”状态移动，当构象已转变为“R”状态后，又进一步增强对底物的亲合力，给出“S”形动力学曲线。 这个模型可以解释正调节物的作用。可以假定“R”状态有利于正调节物结合，“T”状态有利于负调节物作用。在齐变模型中，同促效应必然有正的协同效果，而异促效应则可能有正的协同效果，也可能有负的协同效果。 目前认为齐京戏模型不适用于负协同反应。 第五节 酶工程简介 酶工程的定义 “酶工程”是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。目前世界上已发现和鉴定的酶有4000多种，但是由于分离和提纯酶的技术比较复杂繁琐，因而酶制剂的成本高、价格贵，不利于广泛应用。所以，到目前为止，投入规模生产和应用的商品酶只有十几种，小批量生产的商品酶也只有几百种。为了解决这个问题，人们把对自然酶的注意力转向了对自然酶进行适当的加工与改造。根据研究和解决问题的手段不同，将酶工程分为两大类：化学酶工程和生物酶工程。 化学酶工程 化学酶工程亦称初级酶工程，它主要由酶学与化学工程技术相结合而形成的，主要是通过化学修饰、固定化处理、甚至通过化学合成法等手段，改善酶的性质以提高催化效率及降低成本。它包括自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。 1．自然酶的应用 在食品工业、制药工业、制革工业、酿造工业及纺织工业上使用酶制剂可以大大地改造和革新工艺并降低成本。这方面多用粗酶制剂。 2．化学修饰酶 医学上进行治疗以及基础酶学研究时要求酶制剂纯度高、性能稳定，治疗上还要求低或无免疫原性，所以常常对纯酶进行化学修饰以改善酶的性能。例如抗白血病药物----天冬酰胺酶的游离氨基经过脱氨基作用、酰化反应等进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性得到了很大的提高。再如α—淀粉酶与葡萄糖结合后，热稳定性显著增加，使该酶的半寿期由2.5分钟提高到63分钟。 3．固定化酶 固定化酶是指被结合到特定的支持物上并能发挥作用的一类酶，是化学酶工程中具有强大生命力的主干。酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合及包埋等四种方法。固定化酶的优点是：①可以用离心法或过滤法很容易的将酶与反应液分开；在生产中十分方便有利；②可以反复使用，在某些情况下可以使用达千次数以上，可极大的节约成本；③稳定性能好。目前国内已用固定化酶技术半合成新青霉素，生产果糖糖浆等。还可以模拟生物体内的多酶体系，将完成某一组反应的多种酶和辅助因子固定化，以制成特定的、高效、专一、实用的生物反应器，并已获得了工业应用。 4．化学人工合成酶 近年来有许多科学家模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成了称之为人工酶的催化剂。但目前的人工合成酶由于催化效率不高，还没有多大实用价值。 生物酶工程 生物酶工程是在化学酶工程的基础上发展起来的，是以酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，因此又称为高级酶工程。 生物酶工程主要包括三个方面：①用DNA重组技术（即基因工程技术）大量地生产酶（克隆酶）；②对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）；③设计新的酶基因，合成自然界中不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。 第六节 核 酶 目前已提纯并证明自然界中有几千种蛋白质具有酶活性，所以50多年来人们一直认为所有的酶都是蛋白质。但是在80年代以后，许多实验证明，RNA分子也可以是高活性的酶。在1982年T.Cech发现四膜虫的26SrRNA的前体在没有蛋白质的情况下能进行内含子的自我剪接，当时由于只发现它有这种自我催化的活性，但并没有把它和酶等同起来。随后在1983年底S.Atman和Pace分别报导了在大肠杆菌RNA前体的加工过程中起作用的RNase是由20%的蛋白质和80%的RNA组成的，在除去蛋白质部分，并提高Mg2+浓度的情况下，余留下来的RNA部分仍具有与全酶相同的催化活性。这就说明RNA具有酶活性。后来在1986年T.Cech又发现L19RNA（它是原生动物四膜虫的26SrRNA的前体在自我拼接过程中释放出的内含子的缩短形式）在一定条件下能够以高度专一性的方式去催化寡聚核糖核苷酸底物的切割与连接。五聚胞苷酸（C5）可被L19RNA转化为或长或短的聚合物，特别是可将C5降解C4和C3；也可以将C5转变成C6或更长的甚至最多达到30个残基的多聚胞苷酸。因此L19RNA是既有核糖核酸酶活性，又有RNA聚合酶活性的生物分子，可以看做是酶，因此提出了核酶的概念。进一步研究发现L19RNA对寡聚胞苷酸的作用比在寡聚尿苷酸上的作用快得多，而对寡聚腺苷酸和寡聚鸟苷酸则不起作用，说明有作用的专一性。此RNA酶服从米氏动力学规律，对竞争性抑制剂也很敏感，说明L19RNA具有典型的酶特征。 L19RNA具有395个核苷酸，但其三维结构到目前为止还不清楚。因此对作用机理也不能作出确切的阐明。 目前，人们已经发现了几十种RNA催化剂（核酶），它们有些是单纯的RNA，有些是RNA与蛋白质的复合物。作为酶它们与本质是蛋白质的酶相比催化效率低。它们主要作用于核糖核酸，尤其是在RNA合成后的加工过程中起了重要的作用。有些核酶也具有α—1,4—葡聚糖分支酶的作用。 第五章 生物膜的结构与功能 近代生物学发展中具有重要意义的成就之一，就是认识到细胞主要是由膜系统组成的多分子动态体系。任何细胞都有一层薄膜（厚度约为4--7nm）将其内含物与环境分开，这层膜称为细胞膜或质膜或外膜。真核细胞还有许多内膜系统，它们组成具有各种特定生理功能的亚细胞结构，包括细胞核、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、过氧化物酶体等，在植物细胞中还有进行光合作用的叶绿体等。原核细胞（如细菌）的细胞壁内有细胞质膜，某些细菌的质膜还可向细胞内延伸成内陷结构，称为中体或者质膜体，它们可以完成真核细胞器的部分功能。比细胞更小的枝原体，直径仅为0.33--1.0μm，只有一层质膜包裹着细胞质。病毒颗粒的外周也有一层蛋白和类脂组成的外壳膜，有些病毒的外壳膜的类脂也是双分子层的典型生物膜结构。所有这些细胞中的膜系统虽然功能不同，但其基本的结构原则却是十分相似的。 细胞的外膜和内膜系统统称为“生物膜”。生物膜结构是细胞结构的基本形式，它对细胞内很多生物大分子的有序反应和整个细胞的“区域化”都提供了必需的结构基础，从而使各个细胞器和亚细胞结构既各自具有恒定、动态的内环境，又相互联系、相互制约，从而使整个细胞活动有条不紊、协调一致地进行。 生物膜具有多种功能。与生命科学中许多基本问题都有密切关系，如细胞起源、物质转运、能量转换、细胞识别、细胞免疫、激素作用、神经传导、药物作用、细胞分化、以及肿瘤的发生等。 生物膜的研究不仅具有十分重要的理论意义，而且在工农业及医学实践中也有广阔的应用前景。在工业上生物膜的基本原理为工程技术仿生学提供了原型，例如生物膜的选择透性功能一旦模拟成功，将大大提高污水处理、海水淡化以及回收有用工业副产品的效率。在农业方面，从生物膜结构与功能的角度来研究农作物的抗寒、抗旱、耐盐、抗病等机理，这方面的研究成果将为农业增产带来显著成效。 第一节 生物膜的化学组成 化学分析表明，所有生物膜几乎都是蛋白质（包括酶）和脂类（主要是磷脂）两大类物质组成，此外还有糖（糖蛋白和糖脂）、水和金属离子等。生物膜中的水分约占15--20%左右。生物膜的组分，尤其是蛋白质和脂类的比例随膜种类的不同而表现出很大的差异，蛋白质和脂类含量的变化和膜功能的多样性有密切的关系。一般说来，功能复杂和多样的膜，蛋白质所占的比例大，且种类多；相反，功能越简单特化的膜，蛋白质的含量和种类越少。例如，神经髓鞘膜主要起绝缘作用，只含有3种蛋白质，约占18%，而脂类则占79%，另外3%是糖，而线粒体内膜和细菌质膜功能复杂，含有电子传递系统和磷酸化酶系统，共有约60种蛋白质，占75%，脂类只占25%。 膜脂 1．膜脂的种类 生物膜中的脂质有磷脂、胆固醇和糖质等，但以磷脂为主要组分。 ①磷脂 磷脂是构成生物膜的主要脂质。磷脂主要是以甘油为骨架，在甘油分子的第1，2位碳原子的羟基上以酯键分别连接两个脂肪酸链，第3位碳原子与磷酸成酯，即形成磷脂酸，磷脂酸再与胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇等结合为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等。除甘油磷酸酯外，生物膜中还含有鞘磷脂组分。磷脂分子的结构如下。 O R1—C—O—CH2 R2—C—O—CH O O CH2—O—P—O—X O- R1、R2=脂肪酸碳链 X=—H 磷脂酸 =—CH2—CH2—N+(CH3)3 磷脂酰胆碱（卵磷脂） =—CH2—CH2—NH2 磷脂酰乙醇胺 =—CH2—CH—COOH 磷脂酰丝氨酸 NH2 =—CH2—CH—CH2OH 磷脂酰甘油 OH HO OH = OH 磷脂酰肌醇 HO OH O CH2—O—C—R3 O H O CH—O—C—R4 =—P—O—CH2—C—CH2—O—P—O—CH2 O 二磷脂酰甘油 O- OH O- （心磷脂） 甘油磷脂结构 磷脂分子是“两性”分子，磷脂分子的两性特征决定了它们在生物膜中呈双分子层排列的结构特征（称脂质双层）及其与各种蛋白质相结合的特性。磷脂分子中脂肪酸碳链的长短及其不饱和程度则与生物膜的流动性有着密切的关系。 ②胆固醇 动物细胞中的胆固醇含量比植物细胞高，质膜中的胆固醇含量比细胞内膜高。胆固醇也是“两性”分子，胆固醇的两性特点可能对生物膜中脂类的物理状态有一定的调节作用。在相变温度以上时，胆固醇阻扰磷脂分子脂酰链的旋转异构化运动，在相变温度以下时，胆固醇的存在又会阻止磷脂分子脂酰链的有序排列，从而防止向凝胶态的转化，保持了膜的流动性，降低了相变温度。 ③糖脂 糖脂在膜上的分布是不对称的，仅分布在细胞外侧的单分子层，暴露在膜的外表面，带糖基的极性端朝向膜外表的水相，而非极性的脂部分则分布在膜的疏水区。 细菌和植物细胞质膜的糖脂几乎都是甘油的衍生物，非极性部分以亚麻酸的含量较为丰富，极性部分则是糖残基（如半乳糖），可以是一个、两个或多个（一般为1--15个糖残基）。 动物细胞质膜上的糖脂几乎都是神经鞘氨醇的衍生物，如半乳糖脑苷脂、神经节苷脂等，统称神经糖脂。根据糖的性质不同，神经糖脂又分为中性糖脂和酸性糖脂，后者是在糖基的头部带有一个或多个唾液酸残基，它在中性条件下使细胞膜表面带负电荷。半乳糖苷脂的“极性”头部带有一个半乳糖残基。它是神经髓鞘膜的主要糖脂。神经节苷脂具有受体的功能，如霍乱毒素、干扰素、促甲状腺素、破伤风毒素等的受体都是神经节苷脂。糖脂末端的半乳糖残基在与毒素的结合中起主要作用。在细胞的癌变（如病毒转化细胞）中细胞膜上的神经节苷脂和脑苷脂常有很大的变化。 除磷脂、胆固醇和糖脂外，在叶绿体膜和嗜盐菌膜上还发现有含硫的脂质。 2．膜脂的不对称分布 一般说来，脂质分子在膜两侧的分布是不对称的，例如，人红细胞膜的外层含磷脂酰胆碱和鞘磷脂较多，内层则含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺较多。这种不对称分布会导致膜内外两层电荷数量、流动性等的差异。膜脂的不对称分布与膜蛋白的定向分布及其功能都有密切的关系。天然生物膜脂质在两层之间的翻转运动是非常缓慢的，因此，脂质在内质网合成时，这种不对称性分布看来就已经形成，而且通过不断地调节控制来维持其不对称性。 3．脂质的多形性 如前所述，脂质分子是两性分子，它们在水溶液中的溶解度是很有限的（包括磷脂分子）。以磷脂为例，当磷脂加入水中后，由于疏水部分表面积大，只有极少的分子以单体形式游离存在。绝大部分倾向于在水—空气界面上形成单分子层，其“极性头”与水接触，而“疏水尾”伸向空气一侧。如果加入较多量的磷脂分子，使水—空气界面达到饱和，磷脂分子就以“微团”或者“双层微囊”形式存在，这两种形式都使磷脂分子的“极性头”与水相接触，而“疏水尾”则通过疏水作用力和范德华力的作用，尽可能地靠近，将水从邻近部位排除。磷脂分子在水溶液中究竟以微团形式存在还是以双层微囊形式存在，则取决于磷脂的组成。大多数天然磷脂分子倾向于后一种形式，因为这样更有利于分子的堆积，而只含有一条脂酰链的溶血磷脂、游离脂肪酸和去污剂则更容易形成微团结构，因为从整个分子看，它们的疏水表面积仅占较小的比例。 磷脂分子在水溶液中存在的几种结构形式 在一定条件下，磷脂分子还可以形成六角形相Ⅱ（HⅡ）结构，微团和六角形相Ⅱ结构均称为非脂双层结构。磷脂酰胆碱、鞘磷脂等一般都形成稳定的脂质双层结构，而不饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺、单葡萄糖甘油二酯及单半乳糖甘油二酯则容易形成六角形相Ⅱ结构。心磷脂也容易形成六角形相Ⅱ，尤其是在Ca2+诱发的条件下。磷脂酰丝氨酸与磷脂酰甘油在中性与低温时，以脂质双层结构存在，在酸性与高温时则可转变为六角形相Ⅱ结构。 脂质双层结构和六角形相Ⅱ结构 生物膜在一般条件下都呈双层结构，在某些生理条件下（如细胞的内吞、外排，细胞融合，脂质分子的翻转运动，蛋白质跨膜运送等）均可能出现非脂双层结构，但迄今为止还不能十分肯定，还需要进一步的研究和证明。 膜蛋白 细胞中大约有20—25%左右的蛋白质是与膜结构相连系的。膜蛋白根据其与膜脂的相互作用方式及其在膜中排列部位的不同，粗略的可分为两在类：外周蛋白和内在蛋白。 1．外周蛋白 外周蛋白分布于膜的外表面，它们通过静电作用或范德华力与膜的外表结合。经过温和的处理，如改变介质的离子强度或pH值，或加入螯合剂等可把外周蛋白分离下来。从膜上分离下来和外周蛋白呈水溶性，不再聚合，与脂类不再形成膜结构，表现了一般水溶性蛋白质的特征。此类蛋白质约占膜蛋白的20--30%，在红细胞膜中约占50%左右。 2．内在蛋白 内在蛋白质有的全部埋于脂质双层的疏水区，有的部分嵌在脂质双层中，有的横跨全膜。它们主要以疏水效应（或称疏水作用力）与膜脂相结合，只有使用比较剧烈的条件，如加入表面活性剂、有机溶剂，或使用超声波才能将其从膜上溶解下来。它们的特征是水不溶性，分离下来之后，一旦去掉表面活性剂或有机溶剂，又能聚合成水不溶性，或与脂类形成膜结构。内在蛋白质约占膜蛋白的70--80%左右。内在蛋白质的氨基酸组分中，一般非极性氨基酸的比例高，其分子大都成为“双型”分子的特点，即极性氨基酸与非极性氨基酸在肽链中形成不对称分布。其非极性氨基酸部分与脂类的疏水区相互作用使蛋白质固着在膜中。内在蛋白质与脂质双层疏水区相接触的部分中，由于水分子的排除，多肽分子本身形成氢键的趋向大大增加，因此它们往往以α--螺旋或β折叠形式存在，尤其以前者更为普遍。 膜蛋白在生物膜中的分布和种类 a.外周蛋白;b.内在蛋白(不对称的分布于膜的一侧);c.内在蛋白(埋藏在脂质双分子层内);d.内在蛋白(穿过全膜);e.多酶复合体(由内在蛋白和外周蛋白组成,穿过全膜)。 糖类 生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。在细胞的质膜和内膜系统中都有分布，在细胞的质膜表面约占质膜总量的2--10%左右。糖类在膜上的分布也是不对称的，质膜和内膜系统的糖蛋白和糖脂中的寡糖都全部分布在非细胞质的一侧。分布于质膜表面的糖残基形成一层多糖--蛋白质复合物，可称为细胞外壳。分布于细胞内膜系统的糖类面向膜系的内腔。在生物膜中组成寡糖的单糖主要有：半乳糖、甘露糖、岩澡糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖和唾液酸。糖蛋白可能与大多数细胞的表面行为有关，细胞与周围环境的相互作用都涉及到糖蛋白，例如糖蛋白与细胞的抗原结构、受体、细胞免疫、细胞识别以及细胞癌变都有密切的关系。 细胞外壳（糖萼）示意图 在糖蛋白中，糖与肽链以三种不同的糖苷键相连接：①以N--β--糖苷键与天冬酰胺的酰胺基结合；②以O--β--糖苷键与丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸残基的羟基结合；③以S--糖苷键与半胱氨酸中的硫相结合。 除上述三类主要组分外，膜中尚含有少量水分和无机离子。膜的水分约为20%，呈结合状态。金属离子与膜蛋白和膜脂的结合有关。 生物膜的基本结构 生物膜的组分是蛋白质、脂类和糖类等，这些组分如何排列和组织起来形成特定的膜结构，膜的主要结构模型及主要理化性质是我们这一节讨论的主要问题。 生物膜中分子间的作用力 一般认为生物膜中分子间主要有三种类型的力起作用：静电力、疏水力和范德华力。 1．静电力 静电力是存在于一切极性和带电荷基团之间的吸引和排斥作用。膜两侧的脂质和蛋白质的亲水基团通过静电力的相互吸引可形成稳定的结构。静电力在膜蛋白之间的相互作用中也很重要，膜中疏水区的介电常数较低，它可使蛋白分子的极性部分之间形成强烈的静电力。 2．疏水力 疏水力对维持膜结构起着主要的作用。蛋白质分子具有非极性基团的氨基酸侧链和脂质双层的疏水脂肪酸链都有不与水接触或者说避开水的强烈倾向，因而使它们之间存在着一种相互趋近的力，称为疏水作用力。疏水力依赖于水的存在。在生物膜中，脂质的脂肪酸链和蛋白质分子的非极性面出于避开水的原因，排列在膜的内部；而脂质的极性端和蛋白质的极性部分或带电荷的基团则有与水接触的强烈倾向，定位于膜的两个表面，所以疏水力就成为决定膜总体结构的主要因素。 3．范德华力 范德华力倾向于使膜中的分子尽可能的彼此靠近。由于这种作用力存在于所有原子对之间，所以它们在膜结构中也是十分重要的，它和疏水力有相互补充的作用。 在水相中，影响膜结构稳定的力可能来自两个方面：与膜平面平行作用的力和垂直作用的力。这两方面的力都是由疏水力和亲水力这两种相反作用力的总和形成的。垂直于膜平面的亲水力主要倾向于把磷脂的极性基团拉向于水相；相反疏水力则倾向于把磷脂分子的碳氢链拉向脂质的中心部分以避开水相。这两种相反的作用力呈动态平衡，因而磷脂分子经常处于不断轻微伸出和缩入膜双分子层的状态中，表现为膜平面的波形振荡运动。另一方面，与脂质双层平行方向也有两种相反作用力，一是疏水力和范德华力都使磷脂的脂肪酸链互相靠近并排斥水分子，二是极性端之间的排斥或吸引使磷脂分子彼此分开或靠近。这两种相反作用的结果，使每个组分经常可以彼此互相侧向置换。同样，膜中的兼性蛋白质也是这样，以疏水力和亲水力与脂质分子相互作用。由于脂质双分子层经常处于轻微的收缩--扩张的周期运动，因而蛋白质也不断表现出伸出和缩入脂质双分子层的轻微波动。 热能倾向于抵消或减弱上述各种吸引力。当非键合原子之间的范德华力使脂类的末端碳氢链尽可能靠近时，热能会使其末端运动。由于热能随温度上升而增大，因此在一定温度下，脂类末端就由静止的晶态转变为无秩序的流动液体态。 电介质在水相中有加强疏水力的倾向，但同时又有减弱静电力的倾向。但另一方面，非极性物质则有减弱疏水力的倾向，但同时又有加强静电力的倾向。 二、生物膜的流动性 膜的流动性也可称之为运动性，包括膜脂和膜蛋白的运动状态。 流动性是生物膜结构的主要特征。大量研究结果表明，合适的流动性对生物膜表现其正常功能具有十分重要的作用。例如，能量转换、物质转运、信息传递、细胞分裂、细胞融合、内吞、外排以及激素的作用等都与膜的流动性有密切的关系。 (一)、膜脂的流动性 相变与分相 相变与分相是生物膜结构的一个基本特征。在生理温度下，膜脂双分子层中有相当一部分表现为流体态（液晶态），但另一部分由于各种因素而表现为固体态（结晶态）。因此，从膜平面看，显示出分相现象。当温度降至相变温度时，流动的液晶态可转变为不流动的结晶态，在一定条件下，结晶态也可以转变为液晶态，将液晶态和结晶态的相互转变称之为相变。磷脂的相变与其成分和环境条件密切相关。脂肪酰链的不饱和度、链长及极性端的结构都影响相变温度。例如，含不饱和双键的磷脂的相变温度大大低于相应的饱和键磷脂的相变温度；在碳氢链相同的情况下，磷脂酰胆碱相变温度比磷脂酰乙醇胺低；在极性头相同的情况下，随时脂肪酰碳链加长相变温度升高。所以，各种脂质由于组分的不同而具有各自的相变温度。生物膜脂质组成很复杂，其相变温度的范围就很宽，有时可宽达几十度。 脂质的分相与相变 2．膜脂运动的几种方式 在相变温度以上时，磷脂的运动可归纳为下列几种方式。 ①磷脂烃链围绕C—C旋转而导致异构化运动。磷脂分子脂肪酸的C—C键具有全反式和偏转两种构型，在低温条件下磷脂主要以全反式构型存在，随着温度升高，偏转构型增多，流动性增大。 ②磷脂分子围绕与膜平面相垂直的轴左右摆动，而且从整个分子来看，这种运动还表现出梯度现象。极性部分的运动较快，甘轴骨架的运动较慢，脂肪酸烃链部分运动又较快，尤其以“尾部”的运动最快。 ③磷脂分子围绕与膜平面相垂直的轴作旋转运动。 ④磷脂分子在膜内作侧向扩散或侧向移动。 ⑤磷脂分子在脂质双层中作翻转运动。由于磷脂分子是一种两性分子，作翻转运动时必须通过脂质双层的疏水区，因此与其它运动方式相比，这种运动速度要慢得多。 磷脂分子运动的几种方式 在相变温度以下，有些运动方式仍可进行，但是速度变慢。 影响磷脂流动性的因素很多，诸如：磷脂脂肪酰链的不饱和程度和链长，胆固醇、鞘磷脂的含量，膜蛋白以及温度、pH、离子强度、金属离子等等。 3．胆固醇与膜的流动性 胆固醇在膜结构的调节机理中，具有重要的作用。在质膜中胆固醇含量较高，与磷脂的比例约为1:1；但在细胞内膜系统中，胆固醇含量很低。胆固醇由于本身的聚合能量较大，常不与蛋白质结合，而主要与磷脂结合。胆固醇为兼性分子，在膜中其极性端分布于亲水界面，非极性端约深入脂质双分子层的10个碳原子的深度。它在膜中的运动主要有两种方式，沿其分子长轴作摆动或旋转。实验证明，在相变温度以上时，胆固醇由于能抑制磷脂分子的脂肪酰链的旋转异构化运动，减少歪扭构象的数量，因而降低膜的流动性；另一方面，在相变温度以下，膜脂处于晶态排列时，胆固醇又可诱发脂肪酰链歪扭构象的产生，从而阻止结晶态的出现；使膜处于“中间流动”的结构状态。此外，胆固醇可以取消膜脂的相变。 (二)、膜蛋白的运动性 1．膜蛋白的侧向扩散 膜蛋白在膜中的平面扩散，主要是由于脂质分子快速运动引起的，但其运动速度较脂质分子低10--100倍。但并不是所有的膜蛋白都能在膜平面中进行扩散运动，目前也发现有些膜蛋白和受体等并不随意扩散，而是相对固定在细胞膜表面的一定区域。细胞的骨架系统对膜蛋白的运动有一定的作用，例如，微丝对膜中蛋白组分有移运作用，这是通过微丝的收缩引起的；而微管则有固定膜蛋白组分的作用，二者正好相反，构成一套控制系统。膜蛋白的侧向扩散对研究膜的装配，对免疫反应、膜融合、感觉传导、细胞分裂和发育以及代谢等都有重要意义。 2．膜蛋白旋转扩散 膜蛋白可以围绕与膜平面垂直的轴进行旋转运动。这种运动方式比侧向扩散的速度要慢，但与侧向扩散相似，不同的内在膜蛋白由于本身和微环境的差别，它们的旋转扩散也有很大的差异。膜蛋白在膜中旋转运动的生理意义，可能在酶蛋白和其底物的相互联系，以及蛋白质之间相互作用时调整正确的构象等。 (三)、膜流动性的生理意义 生物膜流动性的生理意义在于：膜脂合适的流动性是膜蛋白表现正常功能的必要条件。这是因为膜脂流动性对生物膜的内在蛋白部分嵌入脂质双层的深度有一定影响。当膜脂流动性降低时，嵌入膜蛋白暴露于水相的部分就会增加；相反，如果膜脂流动性增加，嵌入的膜蛋白则更多地深入脂质双层。因此，膜脂流动性的变化会影响膜蛋白的构象与功能。在生物体内，可以通过细胞代谢、pH、金属离子（Mg2+、Ca2+等）等因素对生物膜进行调控，使其具有合适的流动性从而表现正常功能。如果超出调节范围，生物膜就会发生病变。已经发现很多疾病患者的病变细胞膜或红细胞膜的流动性有异常变化，例如，急性淋巴细胞白血病患者的淋巴细胞膜流动性明显高于正常人。也有报道，杜兴氏（Duchenne）型进行性肌肉营养不良症患者的红细胞、骨骼肌、肝细胞膜的流动性都比正常要低。β--脂蛋白缺乏症和遗传性球形红细胞症患者的红细胞膜流动性也明显低于正常，我国学者也报道，大骨节病患者的红细胞膜和克山病患者心肌线粒体膜的流动性都低于正常。 另外，植物的抗冷性也与生物膜的流动性存在着一定的相关性，我国科学工作者报道，玉米或水稻等农作物的抗冷性与其线粒体膜的流动性具有一定的内在联系。 三、生物膜的分子结构模型 科学家对生物膜的结构进行了几十年的研究，先后提出过50多种说明膜结构的理论模型。在这里我们对有代表性和影响比较大的几种模型作以简要的介绍。 1．脂质双层模型 1899年Overton在研究细胞膜的透性时已经提出脂质和胆固醇类物质可能是构成细胞膜的主要组分。1925年荷兰科学家Gorter与Grendel用丙酮抽提了红细胞膜的脂质并铺成单分子层，用Langmuir槽测定了其表面积。同时他们估算了红细胞膜的表面面积。结果发现，前者是后者的两倍，因而提出了膜中脂质分子以双分子排列的模型。后来经多人研究证明，脂质双分子层的概念是正确的，所以迄今为止，双脂层是生物膜结构主体的论点仍然被广泛接受。 2．三夹板模型 1935年Danielli和Davson在Gorter与Grendel提出的连续的磷脂双分子层构成生物膜主体的基础上，企图解释蛋白质定位的问题时，提出了这种模型。其要点是：连续的脂质双分子层组成生物膜的主体，两层磷脂分子脂肪酸烃链伸向膜的中心，极性端朝向膜外两侧的水相，蛋白质则以单层形式覆盖于膜的两侧，从而开成“蛋白质--脂质--蛋白质”的三夹板（或“三明治”）式结构。这个模型曾得到电镜观察和X--射线衍射分析等方面实验结果的支持。 脂质双层模型 三夹板模型 3．单位膜模型 这是一种类似于三夹板膜的模型，是1964年由Robertson提出的，与三夹板模型相同之处是膜也有三层结构，是“蛋白质—磷脂—蛋白质”的结构方式。不同之处是蛋白质以单层肽链的厚度，以β--折叠形式通过静电作用与磷脂极性端相结合，而且蛋白质在两侧呈不对称性分布。 但是，人们逐渐发现大多数生物膜所含的脂质并不全是连续的，而且大多数蛋白质都需要用比较剧烈的方法（如去污剂、有机溶剂、超声波等）才能从膜上分离下来，这些都是Robertson的单位膜模型难以解释的。 单位膜模型 4．流体镶嵌模型（液态镶嵌模型） 在生物膜的流动性和膜蛋白分布的不对称性等研究获得一系列重要成果的基础上，1972年美国的Singer与Nicolson提出了“流体镶嵌”模型。它与以前提出的各种模型的差别在于：一是突出了膜的流动性，二是显示了蛋白质分布的不对称性。它主要把生物膜看成是球型蛋白质和脂质按三维排列的流体。从膜的横切面观看，膜中的内在蛋白与磷脂的双分子层交替排列，且与磷脂一样，其极性端突出膜表面伸向水相，而非极性端埋藏在膜脂的疏水部分。有些内在蛋白或其聚合体可横穿膜层，两端的极性部分伸向水相，中间的疏水部分与脂质双分子层的脂肪酸链部分呈疏水结合。外周蛋白与膜两侧的极性部分呈离子键结合。流体镶嵌模型主要强调流动的脂质双分子层构成膜的连续主体；蛋白质则无规则地任意流动在脂质的“海洋”中。 液态镶嵌模型 5．板块模型 迄今为止，液态镶嵌模型虽然得到了比较广泛的支持，但仍然存在着很多局限性。例如，有很多实验结果表明，膜的流动性是不均匀的。由于脂质组成的不同，膜蛋白--脂质、膜蛋白--膜蛋白的相互作用以及环境因素（如温度、pH、金属离子等）的影响，在一定温度下，有的膜脂处于结晶态，有的膜脂则呈流动的液晶态。即使都处于液晶态，膜中各部分的流动性也不相同。这样，整个膜可视为具有不同流动性的“微区”相间隔的动态结构。因此，1977年Jain和White提出了“板块模型”。该模型认为，在流动的脂质双层中存在着许多大小不同刚度较大的独立移动的脂质“板块”（有序结构“板块”），板块之间由无序的流动的脂区（无序结构“板块”）所分割。这种无序结构“板块”和有序结构“板块”之间，可能处在一种连续的动态平衡之中。分布于膜内两半层的“板块”彼此独立，呈不对称性，但也可能有某些“板块”延伸到全部双分子层。板块内的各种组分之间以疏水力相互作用。蛋白质和脂质两者也可能形成另一种不同性质的长距离的有序组织（一般超过几百个分子大小）。因此，膜平面实际上同时存在不同组织结构和性质的许多“板块”，它们的变化主要由“板块”内组分的构象和相互作用的特异性所决定。而膜功能的多样性也可能与“板块”的性质和变化有关。 从上述几种不同的生物膜结构模型可以看出，生物膜结构的问题还远没有解决。一种模型也难以概括不同来源不同功能的生物膜。但下述几条基本原则对所有已知的生物膜结构来说可能都是共同的：①磷脂的双分子层；②脂质分子的各种运动形式；③磷脂双分子层两半层的不对称性；④膜蛋白结构、功能、分布及运动的不均一性；⑤外周蛋白主要以离子键与膜脂极性端结合，内在蛋白由于其一级结构和三维结构的不同，以各种方式和不同深度插入或穿过膜脂双分子层；⑥膜蛋白、脂质等不同组分经常处于动态（相变和分相）和代谢周转过程中。 板块模型 物质的跨膜运输 生物膜的通透性具有高度的选择性，细胞能主动地从环境中摄取所需的营养物质，同时排出代谢废物和产物，使细胞保持动态的恒定，这对维持细胞的生命活动是极为重要的。大量证剧表明，生物界中的许多生命过程都直接或间接与物质的跨膜运输密切相关。诸如神经冲动传导，细胞行为和细胞分化，以及感觉的接受和传导等重要生命过程。因此，了解物质跨膜运输的规律和机理具有重要的意义。 物质的单向、同向和反向过膜运输 物质的跨膜转运有多种方式（如图所示）。如果只是把一种物质由膜的一侧转运到另一侧，称为单向转运；如果一种物质的转运与另一种物质相伴随，称为协同转运，其中，方向相同，称为同向协同转运，方向相反，称为反向协同转运。根据被转运的对象及转运过程是否需要载体和消耗能量，还可再进一步细分出各种跨膜运输方式。 下面我们主要介绍一些小分子物质及大分子物质（包括蛋白质）跨膜运输及其相关分子机理的主要观点。 一、小分子物质的跨膜转运 (一)、被动运输 被动运输是物质从高浓度的一侧跨膜转运到低浓度的一侧，即顺浓度梯度的转运过程。这是一个不需要能量的自发性过程。物质的转运速率既依赖于膜两侧的浓度差，又与被转运物质的分子大小、电荷和在脂质双层中的溶解度有关。 1．简单扩散 简单扩散是物质依赖于在膜两侧的浓度差，从高浓度的一侧向低浓度的一侧扩散的过程，不需能量，也不需载体。但不同的分子与离子并非以相同的速率进行过膜扩散。由于膜的基本结构是脂质双层，因此一般说来，疏水性小分子的透过性好，如O2、N2和苯等能较容易地穿越脂质双层。而离子和多数的极性分子透过性较差。下图所示是一些物质在脂质双层上的透过率比较。 K+ 色氨酸 吲哚 水 尿素 Na+ Cl- 葡萄糖 甘油 10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 （通透率cm2/s） 脂质双层对一些物质的通透率 促进扩散 促进扩散又称易化扩散，与简单扩散有相似之处，它也是物质从高浓度的一侧向低浓度的一侧转运的过程，也不需要提供能量。但不同的是这种转运方式需要特异的转运载体参与。转运载体有移动性载体和通道载体两种类型，它们有的是肽类抗菌素，有的是蛋白质。下面我们介绍几种移动性载体和通道载体。 移动性离子载体 移动性离子载体是一类可溶于脂质双层的疏水性小分子物质，如缬氨霉素、A23187、尼日利亚菌素等。 ①缬氨霉素 它是由链霉菌产生的一种抗生素，它对结合K+具有高度的选择性。它与K+形成缬氨霉素-- K+复合物，有效的屏蔽了分子内部的亲水基团，而使分子的四周呈疏水性，因此复合体能从膜的一侧运送K+到膜的另一侧。用已知磷脂组分的人工膜做实验发现，缬氨霉素运送K+的能力与温度有关，如果在磷脂的相变温度以上时，K+的运送速度明显增加，反之，很小。这就说明缬氨霉素是一个移动性离子载体。如果把缬氨霉素加入到含有K+的线粒体制剂中，发现保温介质中的K+进入线粒体，而且同时发现了H+的反向运动，这说明它进行的是反向协同转运。因此，被广泛用于人工膜或生物膜的许多重要功能（如H+转位）的研究中。 ②“A23187”载体 这是另一种移动性离子载体，它的功能是运送Ca2+、Mg2+等二价阳离子，在运送阳离子进入细胞的同时，将2个H+带至细胞外，所以进行的也是反向协同转运。如果把A23187加入到含Ca2+的活细胞培养液中，Ca2+可很快进入细胞质中。因此，在细胞生物学的研究中，被广泛用于增加细胞质的游离Ca2+浓度。 ③尼日利亚菌素 它是一个多环醚羧酸化合物，其主要作用是进行H+与K+的交换。其作用机制类似于缬氨霉素，它通过分子上带负电荷的羧化物与K+相互作用形成尼日利亚菌素--K+复合体，进行H+-- K+交换。 移动性载体运送物质的分子机理可用移动性载体模型来说明。该模型假说认为：运送体或运送体结合被运送物质的部位在运送过程中，由于通过膜的来回穿梭运动或由于通过膜平面的旋转运动改变它在膜内的定向，使物质从膜的一侧运至另一侧。如图所示。 移动性载体模型示意图 ⑵．通道载体 通道载体是横跨于膜上的多肽或者蛋白质，如短杆菌肽A、ATP/ADP交换体等。 ①短杆菌肽A 它属于形成通道的离子载体，可从短芽孢杆菌中分离出来，是由15个氨基酸组成的线形多肽，具有疏水性侧链，由两个单体分子头--头相对的二聚体形成一个穿过膜的通道。能选择性地让一价阳离子顺电化学梯度通过。据测定，在较大的电化学梯度下，短杆菌肽在一秒钟内每打开一次通道，大约能运送2×107个阳离子，这比单纯的移动性载体在相同时间运送的离子要快上千倍。 通道载体运送物质的分子机理可用孔道或通道模型来加以说明。该模型认为：载体在膜内有较确定的方向，并且形成一个对被运送物质具有立体构型的亲水性孔道。孔道在识别被运送物质并作出反应时才瞬时打开，让被运送物质通过膜。从孔道的开关来说，又具有闸门作用。如果当配基结合到一个专一性的细胞表面受体时，引起通道打开，称为“配体--闸门通道”（如图所示）。如果通因膜电位变化而打开，称为；“电压--闸门通道”（如图所示）。 配体--闸门通道示意图 电压--闸门通道示意图 ②ATP/ADP交换体 真核细胞线粒体是合成ATP的主要场所，而细胞中很多利用ATP的代谢过程主要是在细胞质中。这就需要将线粒体内的ATP跨线粒体内膜转运到细胞质中，这种转运功能是通过分布在线粒体膜上的ATP/ADP交换体进行的。通过呼吸作用形成的跨线粒体膜的膜电位（内负、外正），使ATP/ADP交换体易于向外运送ATP，向内运送ADP。 线粒体内膜ATP/ADP交换体及其作用的分子机理模型 分离提纯的ATP/ADP交换体是一个分子量为30000的蛋白质，在膜上是以二聚体的形式存在的。生物化学与动力学研究，都支持ATP/ADP交换体作用机理的两态闸门--孔道机制假说。认为每一个二聚体只含有一个核苷酸结合位点，当它面向膜外面时，对ADP的亲合力高，而面向膜内侧时，对ATP的亲合力高。核苷酸的结合位点的这两种状态可以通过膜蛋白的构象变化而相互转变，而实现核苷酸的交换。（如图所示） (二)、主动运输 主动运输是物质从低浓度的一侧跨膜转运到高浓度的一侧，即逆浓度梯度的转运过程。如果被转运物质带有电荷，则物质在跨膜运输时，需要逆两个梯度，一个是浓度梯度，一个是电荷梯度。这二者的总和又称为电化学梯度。所以全面的讲，主动运输是物质逆浓度梯度或电化学梯度的转运过程。这是一个需要能量和依赖于转运载体的过程，能量由ATP提供，转运载体则是膜蛋白。主动运输的主要特点是：①有专一性。例如，有的细胞膜能主动运输某些氨基酸，但不能运送葡萄糖，有的则相反。②有饱和动力学特征。例如，葡萄糖进入细胞的速度可随外界浓度的增加而加快，但这种增加有一定的限度，增加到一定浓度时运送体即处于“饱和”状态，即使再增加葡萄糖浓度，其速度不再增加，犹如酶分子被底物饱和一样。③有方向性。例如，细胞为了保持其内、外K+、Na+离子的浓度梯度差以维持其正常的生理活动，主动地向外运送Na+，而向内运送K+。④选择性抑制。各种物质的运送有其专一的抑制剂阻遏这种运送。例如，乌本苷专一地抑制K+向外运送，而根皮苷则抑制肾细胞的葡萄糖运送。⑤需要提供能量。例如，红细胞的K+、Na+主动运输的能源主要来自糖酵解产生的ATP，如果加入糖酵解过程的抑制剂（如氟化物），则运送不能进行。肝或肾细胞中的K+、Na+主动运输的能源来自线粒体的氧化磷酸化，如果加入电子传递体的抑制剂氰化物或解偶联剂2,4--二硝基酚，则主动运输过程也被抑制。因此，主动运输过程的进行，需要有两个体系存在。一是参与运输的载体，二是酶或酶系组成的能量传递系统。这二者的偶联才能推动主动运输。 1．Na+和K+的转运（Na+-- K+泵） 无论动物、植物细胞或细菌，细胞内外都存在着离子浓度差。细胞内的K+浓度高而Na+浓度低，细胞外的Na+浓度高而K+浓度低。例如，红细胞内的K+含量比Na+含量高20倍左右，这种明显的离子梯度显然是逆浓度梯度主动运输的结果。执行这一运送功能的体系称为Na+-- K+泵，Na+-- K+泵就是分布于细胞膜上的 Na+,K+--ATP酶。 Na+,K+--ATP酶是由一个跨膜的催化亚单位(相对分子质量大约为100000)和与其相结合的一个糖蛋白(相对分子质量约为45000)组成。催化亚单位在位于膜内侧表面有Na+和ATP的结合位点，而在膜外侧表面有K+和乌本苷（抑制剂）的结合位点。糖蛋白的功能还不清楚。Na+,K+--ATP酶在膜上可能以四聚体（两个大亚基和两个小亚基）的形式存在。Na+,K+--ATP酶具有依赖于Na+、K+的ATP酶活性，其主动运送Na+,K+的作用正是由水解ATP提供的能量来驱动的。 Na+,K+--ATP酶的作用机理是：在Na+存在下，将ATP末端的磷酸基转移到ATP酶的天冬酰胺残基上，这种与Na+有关的蛋白质磷酸化作用导致酶的构象发生变化，形成一个“开口”向外且对Na+亲合力小而对K+亲合力大的构象，将Na+从细胞内转运到细胞外。然后在K+存在下，ATP酶去磷酸化导致构象变化，再回到原来的“开口”向内的状态，这种构象对K+亲合力小而对Na+亲合力大，从而将K+从细胞外转运到细胞内。这一步反应可被乌本苷抑制。所以在Na+和K+的主动运输过程中，Na+,K+--ATP酶经历了磷酸化和去磷酸化的变化过程，每经过一次变化过程，可以向膜外泵出3 个Na+，向膜内泵入2个K+。作用模型如图所示。 由Na+,K+--ATP酶维持的离子梯度差具有重要的意义。它不仅维持了细胞的膜电位，而且成为可兴奋细胞（如神经、肌细胞等）的活动基础，也调节细胞的体积和驱动某些细胞中的糖和氨基酸的转运。 Na+,K+--ATP酶的作用模型 1．Na+的结合；2．Na+的结合引起细胞质侧ATP酶的磷酸化；3．磷酸化作用使其构象发生变化，运送Na+通过膜并释放Na+到细胞外侧；4．K+的结合；5．K+的结合引起ATP酶去磷酸化；6．去磷酸化的结果使其回到原来的构象，运送K+通过膜并释放K+到细胞质侧。 2．Ca2+的运送（Ca2+--泵） 细胞内外以及肌质网、线粒体内与细胞质之间都存在着明显的Ca2+离子浓度差。例如，细胞质中的Ca2+浓度很低，约在10-6--10-7mol/L，而细胞外的Ca2+浓度却高达10-3mol/L。肌质网和线粒体内的Ca2+浓度也极明显的高于细胞质。这种差异主要是通过存在于细胞膜和细胞内膜系统中的Ca2+运送体系的作用实现的。我们主要介绍肌肉细胞中肌质网膜上的Ca2+泵（Ca2+--ATP酶）。 肌质网是肌细胞含有的一种特化的内质网膜系统，是一种由许多精细的通道构成的网状结构，是细胞内重要的Ca2+库之一。当肌细胞受到外界剌激（如电剌激产生神经冲动使膜去极化）时，Ca2+由肌质网释放进入细胞质中，引起肌肉收缩。当肌肉松弛时，Ca2+重新被摄入肌质网。可见肌肉的收缩和松弛过程，是Ca2+从肌质网释放和再摄入的主动运送过程。这一过程与Ca2+泵即Ca2+--ATP酶的作用有关。Ca2+--ATP酶是一个跨膜蛋白，在膜上可能以四聚体的形式存在。肌质网膜上的Ca2+--ATP酶的相对分子质量约为110000，由1015个氨基酸残基组成。Ca2+--ATP酶具有Ca2+激活的ATP酶活性，其主动运送Ca2+的作用正是由水解ATP提供的能量来驱动的。 Ca2+--ATP酶的活性受钙调蛋白（CAM或CaM）的调节。钙调蛋白可结合4个Ca2+，它对Ca2+--ATP酶活性的调节作用与细胞质中的Ca2+浓度有关。当细胞质中的Ca2+浓度极低时,钙调蛋白主要以不与Ca2+结合的非活性状态存在，也不能激活Ca2+--ATP酶,酶对Ca2+的亲合力也很低。如果细胞质中的Ca2+ 达到10-6--10-5mol/L时，钙调蛋白与Ca2+形成复合物，该复合物与Ca2+--ATP酶结合，并提高酶与Ca2+的亲合力，酶活性增加6--7倍，使Ca2+的主动运输大大增强，从而使细胞质中的Ca2+浓度又达到原有的稳态水平。 Ca2+--ATP酶的作用机理与Na+,K+--ATP酶类似。Ca2+--ATP酶有E1和E2两种构象，E1构象对Ca2+有很高的亲合力，可与2个Ca2+结合，与Ca2+结合的结果使酶磷酸化（即将ATP分子上的磷酸基转移到酶分子上）成为E2构象，该构象对Ca2+的亲合力降低而释放Ca2+，从而将Ca2+由膜的一侧运送到另一侧。E2构象对K+的亲合力增大，可与K+结合，结果使酶去磷酸化成为E1构象，该构象对K+的亲合力降低而释放出K+。所以，Ca2+--ATP酶在运送Ca2+的同时，也转运了K+。如图所示。 肌质网Ca2+--ATP酶作用机理假设 3．糖和氨基酸的运送 ⑴．协同运送 一些糖或氨基酸的主动运送并不是靠直接水解ATP提供能量，而是依赖于离子梯度形式储存的能量。在动物细胞中形成这种离子梯度的通常是Na+。在小肠和肾细胞中，葡萄糖的运送是伴随Na+一起被送入细胞的，所以这种运送称为协同运送（或协同转运）。协同转运假说认为，由于膜外Na+浓度高，Na+顺电化学梯度流向膜内，葡萄糖利用Na+梯度提供的能量，通过专一的运送载体，伴随Na+一起进入细胞。Na+梯度越大，葡萄糖进入的速度越快。如果细胞外的Na+浓度明显降低，葡萄糖的运送也就减慢或停止。但是，进入膜内的Na+通过膜上的Na+--K+泵又被运送到膜外，以维持Na+浓度梯度，从而使葡萄糖不断利用离子梯度形式的能量进入细胞（如图所示）。动物细胞质膜中氨基酸的运送，也是通过运送蛋白伴随Na+进行协同运送的。但在细菌中，很多糖与氨基酸的运送是由质子梯度推动的。换言之，在协同运送中，伴随的不是Na+，而是H+。在大肠杆菌中，每运送一个乳糖分子进入细胞，伴随着一个H+的协同运送。在线粒体和较低等的真核细胞膜中也存在着这种协同运送。如果运送一种分子由膜的一侧到另一侧，称为单向运送；如果物质（糖和氨基酸）与另一种物质（例如有关Na+ 、H+）而且运送方向相同，称为同向协同运送，反之为反向协同运输。 葡萄糖的同向协同运送示意图 细菌中糖的基团运送示意图 ⑵．基团运送 一般来说，物质通过膜运送时不需要经过化学修饰，但有些糖在通过细胞膜时需要进行磷酸化反应加入一个磷酸基团，以糖--磷酸的形式才能通过膜，称为基团运送。例如，1964年S.Rosman等人在大肠杆菌中发现的磷酸烯醇式丙酮酸转磷酸酶系统（PTS），能利用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作为磷酸基团的供体，使糖磷酸化并运送通过细胞膜（如图所示）。可见这种主动运输形式中的能量来自于PEP，而不是ATP。细菌中的脂肪酸、嘌呤和嘧啶等物质的运送也可能是通过基团运送机理进行的。 大分子物质的跨膜转运 大分子物质的跨膜转运与小分子物质的跨膜转运有很大不同。例如，多核苷酸、多糖等大分子物质甚至颗粒物质主要是通过外排作用、内吞作用及包括受体介导的内吞作用等形式运送的。蛋白质的跨膜运送除内吞、外排作用之外，还有跨内质网膜和线粒体膜、叶绿体膜等运送类型。 (一)、外排作用 细胞内物质先被囊泡裹入形成分泌泡，然后与细胞质膜接触、融合并向外释放被裹入的物质，这个过程称为外排作用（如图所示）。真核细胞对合成物质的分泌通常是通过外排作用完成的。例如胰岛素的分泌，产生胰岛素的细胞将胰岛素分子堆积在细胞内的囊泡中，然后这种分泌囊泡与质膜融合并打开，从而向细胞外释放胰岛素。细胞质中的Ca2+有促进分泌泡与质膜融合而启动外排的作用。神经等因素引起的细胞分泌，以及血浆中的葡萄糖促进胰岛素的分泌都是通过细胞膜的去极化，使Ca2+进入细胞而引起的。除依赖于胞浆中的Ca2+之外，外排作用也需要ATP供能。 内吞与外排作用示意图 (二)、内吞作用 细胞从外界摄入的大分子物质或者颗粒，逐渐被质膜的一小部分包围，内陷，其后从质膜上脱落下来而形成含有摄入物质的细胞内囊泡的过程，称为内吞作用（如图所示）。内吞作用又可分为吞噬作用、胞饮作用以及受体介导的内吞作用。 1．吞噬作用 凡以在的囊泡形式（常称为液泡）内吞较大的固体颗粒、直径达几微米的复合物、微生物以及细胞碎片等的过程，称为吞噬作用。例如，原生动物摄取细菌和食物颗粒；高等动物免疫系统的巨噬细胞内吞侵入的微生物等。吞噬作用是一个需要能量的主动运输过程，但不具有明显的专一性。 2．胞饮作用 是指以小的囊泡形式将细胞周围的微滴状液体（微滴直径一般小于1微米）吞入细胞的过程。被吞入的微滴常含有离子或小分子，胞饮作用也不具有明显的专一性。 3．受体介导的内吞作用 是指被吞物（称为配体，它们或者是蛋白质或者是小分子物质）与细胞表面的专一性受体结合，并随即引发细胞膜的内陷，形成囊泡将配体裹入并输入到细胞内的过程。因此，这是一种专一性很强的内吞作用，能使细胞选择性的摄入大量专一性配体，无需像胞饮作用那样摄入体积相当大的细胞外液。例如，动物细胞摄取胆固醇的过程就是通过受体介导的内吞作用实现的。胆固醇及其酯是以低密度脂蛋白（LDL）的形式运输的，是一种比较大的球形颗粒，直径约为22nm，胆固醇及其酯位于其颗粒的内部，载脂蛋白覆盖于表面。在细胞表面具有特异的LDL受体，它是一种糖蛋白，能特异的识别和结合LDL上的载脂蛋白。当血浆中的LDL与细胞表面的LDL受体结合后，形成LDL--受体复合物，然后通过胞吞作用将此复合物摄入胞内。此时复合物被质膜包围起来形成内吞泡，内吞泡再与胞内溶酶体融合，由溶酶体中的水解酶将LDL降解，其中的蛋白质被水解为氨基酸，胆固醇酯则被水解为胆固醇及脂肪酸。游离的胆固醇可以掺入到质膜中去，或者转变为生物活性物质，或者再酯化为胆固醇酯储存于细胞中，还可以参与细胞内胆固醇生物合成的调节。LDL受体蛋白则可以再“回流”到质膜上。 (三)、蛋白质分子的跨膜转运 蛋白质在细胞质的核糖体中合成之后，要分送到细胞各部分（如细胞质、细胞核、线粒体、内质网、溶酶体等等）进行补充和更新，有的还要通过细胞的质膜分泌到细胞外去。由于细胞各部分都有特定的蛋白质组分，因此，合成的蛋白质必须定向地、准确无误地运送到特定部位发挥作用，才能保证细胞活动的正常进行。对于亚细胞和细胞器来说，合成的蛋白质运送到有关部位后，还要跨膜运送（有的通过的还不至一层膜），才能“各就各位”，发挥其正常功能。蛋白质从合成部位是怎样定向地运送到一定部位的？就定位于亚细胞结构和细胞器内的蛋白质而言，它们又是如何跨膜运送的？跨膜之后又是依靠什么信息来进行识别，从而选择分配到各自的“岗位”的？对于膜蛋白来说，还有一个在膜上定向分布的问题（外周蛋白，还是内在蛋白，部分镶嵌还是跨膜分布，在膜的外侧还是在膜的内侧等等）这又是怎样决定的？这些都是十分有趣的问题，也是生物膜研究中十分活跃的领域。 真核细胞中，合成的蛋白质跨膜运送主要有三种类型：①以内吞（包括受体介导的内吞）或外排形式通过质膜；②通过内质网膜，一般认为在此过程中，信号肽、信号识别蛋白（SRP）、停泊蛋白（DP）等起了重要的作用。③通过线粒体膜、叶绿体膜、过氧化物酶体膜以及乙醛酸循环体膜等，在这些过程中前导肽起着重要的作用。对于内吞和外排作用，我们在前面已经作了简要介绍，下面就②、③两种类型作以简要介绍。 1．分泌蛋白通过内质网膜的运送 1975年Blobel和Dobberstein提出了“信号肽”假说。这一假说认为，分泌蛋白质的生物合成像细胞质中一般蛋白质一样，系在自由核糖体上开始的，但在肽链的N--端首先合成的是由20个左右的氨基酸组成的、决定着肽链去向的“信号肽”。当N--端的信号肽延伸出核糖体后，即由信号肽识别蛋白体（SRP，一种核糖核酸蛋白复合体）识别，并与合成该蛋白质的自由核糖体结合为SRP--信号肽--多核糖体复合物，此时肽链的合成暂时停止。SRP--信号肽--多核糖体复合物随后再与内质网膜上的SRP的受体蛋白--停泊蛋白（DP）相结合并在膜上形成蛋白孔道，结合后暂时中止的多肽合成又恢复进行，而信号肽则通过蛋白质孔道穿越内质网膜。信号肽在穿越内质网膜之后，即被内质网膜内腔中信号肽酶水解，而正在合成的新生肽链则继续通过蛋白质孔道穿越脂质双层。一旦核糖体移动到mRNA分子上的终止密码位置时，蛋白质合成即告完成，“翻译”体系解散，内质网膜上的蛋白质孔道消失。信号肽假说原来是针对分泌蛋白如何跨越内质网膜进行运送提出的，后来已扩展到一些其它蛋白质的跨膜运送。信号肽假说主要的特点在于蛋白质合成与跨膜运送是同步进行的，称为“伴随翻译的运送。 2．线粒体蛋白的跨膜运送 线粒体是细胞的“动力站”，它虽然含有遗传物质（DNA、RNA）以及核糖体等等，拥有遗传复制所需的全部“装置”，但是它的DNA信息含量极为有限。在线粒体所拥有的上百种蛋白质中，绝大部分都是由核DNA编码，并在细胞质自由核糖上合成的。这些蛋白质首先被释放到细胞质中，再跨膜运送到线粒体的各部分。与分泌蛋白质通过内质网膜进行运送不同，通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后才转运的，所以称为“翻译后运送”。 这类运送过程有如下特征：①通过线粒体膜的蛋白质在运送之前大多数是以前体形式存在的，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽或称为引肽共同组成。迄今为止，已有40多种线粒体蛋白质的前导肽一级结构被阐明，它们约含有20—80个氨基酸残基，当前体蛋白过膜时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解转变为成熟蛋白质；②蛋白质通过线粒体内膜的运送是一种需要能量的过程；③蛋白质通过线粒体膜运送时，外膜上很可能有专一性不很强的受体参与作用。 蛋白质能定位于线粒体的不同部位（基质、内外膜之间或外膜）可能是由前导肽的组成及结构性质所决定的。①定位于线粒体基质的蛋白质的前导肽，一般由导向基质肽段和水解部位两部分组成。在进入线粒体基质后由水解酶从水解部位水解切去前导肽而成为成熟蛋白质。②定位于线粒体内外膜之间的蛋白质的前导肽，一般由导向基质肽段、止运入（内膜）肽段以及水解部位3个部分组成。在运送过程中，它的前导肽经历两次水解，首先“导向基质肽段”被基质中的水解酶水解，接着在内、外膜之间又被另一水解酶水解，从而成为成熟形式。由于它的前导肽中含有止运入（内膜）肽段，从而保证了被牵引蛋白质定位于内、外膜之间。③定位于线粒体外膜的蛋白质并不是以前体形式运送的，因为它没有前导肽，但这类蛋白质的N端氨基酸往往行使了前导肽的功能，其N端肽段可分为两部分，即导向基质肽段和停止运入（外膜）肽段。这类蛋白质之所以不能进入线粒体基质而滞留于外膜，主要是由停止运入（外膜）肽段的定位作用实现的。 信号的过膜转导 动物体是一个统一的整体，体内的每个细胞之间以及细胞内部的各个部分之间的生理活动都是密切配合、互相协调的。这种协调一致是通过神经与体液传送的化学信号的调节来实现的。体液的化学信号主要是激素，神经的化学信号主要是神经递质。这些化学信号物质的大部分不进入细胞内，而是与细胞质膜上的专一性受体结合，引起受体及有关蛋白分子构象的改变，从而改变膜离子通道的开关状态或在细胞内产生“第二信使”物质，再通过第二信使物质引起一系列细胞内的生物化学变化，从而发挥生理效应的。只有少部分较为疏水的信号分子可以直接穿越质膜进入细胞内，与胞浆内或核内的受体结合，然后起作用。这一节简要介绍信号过膜传导的主要系统。 受体 (一)、受体的特点 受体是指生物膜上或膜内能识别生物活性物质（激素、神经递质、毒素、药物、抗原和其他细胞粘附分子）并与之结合的生物大分子。绝大多数受体是蛋白质，少数是糖脂。能与受体结合的活性分子常被称为配体。配体是信息的载体，是信号分子，也称第一信使。受体通常有以下几个特点。 1．受体与配体的结合具有专一性。一种受体只能与一种配体结合，但也存在有些相同生物活性的配体可共享一种受体的现象。 2．受体与配体的结合是快速和可逆的。受体与配体之间是以非共价键结合的，结合的时程主要受温度和受体浓度的影响，在37℃时几分钟内它们的结合就可以达到平衡状态，而在低温时则在几小时内也未必能达到饱和状态。 3．受体的数目相对恒定。配体与受体的结合表现为两种情况，一种是很快达到饱和的特异性结合，另一种是在配体浓度很高的情况下也不能达到饱和的非特异性结合，它的亲合力极低，这种低亲合力的非特异性结合可能是一种吸附现象。特异性结合很容易达到饱和，反映出受体在靶细胞上的数目是一定的。 受体与配体的亲合力高，其解常数通常达到10-11--10-9mol/L。 5．受体与配体结合后可通过第二信使（如cAMP、Ca2+等）引发细胞内的生理效应。 (二)、受体的类型 根据受体在细胞信号转导中所起的作用，可将受体分为四种类型。 1．配体门控通道型 这类受体一般是快速反应的神经递质受体，如乙酰胆碱受体和γ--氨基丁酸受体。它们位于膜上，直接与离子通道相连，控制着离子进出的大门。在配体与受体结合后的数毫秒内就能引起生物膜对离子通透性的改变，继而引起膜电位的改变。 2．G蛋白偶联型 很多激素的膜受体属于这种类型，如肾上腺素受体等。它们通过G蛋白的参与控制着第二信使的产生或离子通道。 3．酪氨酸激酶型 这类受体本身具有酪氨酸激酶的活性，因此受体可以直接调节细胞内效应蛋白的磷酸化过程，进而引起生理效应。生长因子受体就属于这一类。 4．DNA转录调节型 此类受体存在于胞浆或核内。这类受体的激活直接影响DNA的转录和特定基因的表达。其效应过程比较长，甚至要数天。固醇类激素的受体属于这一类。 G蛋白 G蛋白（鸟苷酸结合蛋白）位于细胞膜的内侧，与激素的受体相偶联，可参与许多种信号的转导过程。例如，与肾上腺素β--受体相偶联的蛋白Gs，当肾上腺素专一地与β--受体结合后，首先活化与受体相偶联的G蛋白，G蛋白再携带激动信号到腺苷酸环化酶上，活化腺苷酸环化酶，从而触发一系列由cAMP引起的级联反应。 现在已分离出十多种G蛋白，它们分别介导不同的信号转导系统（见下表）,但它们无论在结构还是在功能上都有许多共性。 几种G蛋白的基本特征 G蛋白 相对分子质 量（kD） 细菌毒素的作用 主要功能  GS GS1 GS2 46 44.5 霍乱毒素(激活GS) 霍乱毒素(激活GS) 激活腺苷酸环化酶  Gi Gi′ Gi″(GP′) 40.5 / 百日咳毒素(抑制Gi′) 抑制腺苷酸环化酶  GP GP GP′(Gi″) / / 对毒素不敏感 百日咳毒素(抑制GP′) 介导肌醇磷酸的代谢 同上  Gt Gt1 Gt2 40 40.5 百日咳毒素和霍乱毒素 同上 视杆细胞内激活GTP磷酸二酯酶 视椎细胞内激活GTP磷酸二酯酶  GO  39 百日咳毒素(抑制GO) 抑制Ca2+流  GK  40 / 刺激K+通道的开放  GCa  / / 介导内质网的Ca2+释放   所有的G蛋白都是膜蛋白，都是由α、β、γ三个亚基组成，其中β和γ通常紧密结合为βγ二聚体，对所有G蛋白都是相同的，差别仅存在于α亚基上，不同的G蛋白α亚基不同。α亚基上有鸟苷酸结合位点和GTP酶活性，可与GDP或GTP结合，所以G蛋白有两种形式，GDP形式为无活性状态，GTP形式为有活性状态，两种形式之间可以互变。 Gα—GDP与βγ二聚体有很高的亲合力， 可结合为无活性（Gβγα—GDP）形式。无激素时，几乎所有的G蛋白都处于无活性的GDP形式；当激素结合到受体上时，GTP取代GDP，使G蛋白转变成有活性形式（Gα—GTP），即激素—受体复合物使得结合状态的GDP从G蛋白上释放出来，而使GTP进入Gα亚基的结合位点，Gα—GTP与βγ二聚体的亲合力低，从βγ亚基上解离出来成为活性形式，然后Gα—GTP作用于细胞内的效应蛋白（酶）。所以，信息的流向是：激素—受体复合物→G蛋白→胞内效应蛋白（酶）。 在Gα—GTP完成传达信息的任务之后，由于它本身具有GTP酶活性，可使GTP水解成GDP和Pi，Gα—GDP又与βγ二聚体结合，恢复G蛋白的无活性状态（如图所示）。 G蛋白对于效应酶（如腺苷酸环化酶）的作用可以有激活和抑制两种情形，激活腺苷酸环化酶的G蛋白为Gs蛋白，抑制腺苷酸环化酶的G蛋白是Gi蛋白。 与G蛋白相偶联的受体通常是一条肽链形成的过膜蛋白，有七段α--螺旋往返于质膜的脂质双层，如β--肾上腺素的受体（如图所示）。 G蛋白的活性形式与无活性形式之间的转变 β--肾上腺素的受体的结构图象---七螺旋区 几种重要的信号转导系统 (一)、cAMP信号转导系统 在激素--受体复合物的作用下，G蛋白转变为活性形式Gα—GTP，Gα—GTP作用于腺苷酸环化酶，通过对该酶的激活或抑制作用来改变细胞内第二信息物质cAMP的浓度，再通过cAMP将激素的调节信息传递到胞内的关蛋白质或酶分子上，从而起到调节代谢的作用。例如，β--肾上腺素与受体结合后，Gs蛋白转变为有活性形式，Gα—GTP与Gβγ二聚体分离而与腺苷酸环化酶结合，激活了腺苷酸环化酶，使cAMP的生成增加。从激素到cAMP的信息流如图所示。 cAMP可在磷酸二酯酶催化下，水解开环成为5′--AMP而灭活的。 凡有cAMP的细胞，都有一类催化蛋白质磷酸化反应的酶，称为蛋白激酶A（PKA），cAMP通过蛋白激酶A发挥它的作用。 蛋白激酶A的无活性形式含有两种亚基，一种是催化亚基（C），另一种是调节亚基（R），调节亚基抑制催化亚基。蛋白激酶的变构调节物就是cAMP。当cAMP结合到调节亚基上时，就使无活性的催化亚基—调节亚基复合物解离，产生有活性的自由的催化亚基和cAMP—调节亚基复合物。也就是说cAMP消除了酶活性的抑制物（调节亚基）。有活性的催化亚基一方面使磷酸化酶激酶磷酸化而具有活性，后者再激活磷酸化酶使糖原分解；另一方面使糖原合成酶磷酸化而失去活性，使糖原合成停止，最终导致血糖浓度升高。 从激素到cAMP的信息流 cAMP C R 结合cAMP C R + C R C R 无活性的催化亚基 调节亚基 有活性的催化亚基 cAMP-调节亚基 复合物 cAMP激活蛋白激酶 有活性的蛋白激酶A不仅能使磷酸化酶激酶磷酸化，还可以使许多蛋白质如组蛋白、核糖体蛋白、脂肪细胞的膜蛋白、线粒体的膜蛋白、微粒体蛋白及溶菌酶等产生磷酸化作用。 动物体在遇到意外情况时，随着肾上腺素的分泌，cAMP的浓度极其迅速地增加，于是动物体表现出上述一系列的应激反应，其中对糖原分解作用的调节过程如图所示（级联放大作用）。一旦意外消除，肾上腺素分泌随之停止，结合在细胞膜上的肾上腺素就解离下来，随之发生一系列的变化：cAMP不再形成，遗留下来的cAMP被磷酸二酯酶分解；蛋白激酶的两个亚基又联结成无活性的催化亚基和调节亚基复合物；有活性的磷酸化酶激酶脱磷酸变成无活性形式；磷酸化酶a在磷酸酶的作用下脱磷酸成为无活性的磷酸化酶b；于是上述糖原分解体系恢复到正常的休止状态。同时无活性的磷酸化形式的糖原合成酶经过脱磷酸作用又变得活跃起来，继续合成糖原。 肾上腺素除能促使肝细胞中的糖原分解成葡萄糖外，还能促进骨骼肌及心肌细胞中的糖原分解为乳酸。因为肌肉组织中没有葡萄糖-6-磷酸酶，所以肌糖原分解后不能转变成葡萄糖，只能通过酵解途经氧化分解。除肾上腺素之外，还有很多激素也是通过cAMP起作用的，但是每一种激素只能与其专一的靶细胞膜上的专一性受体结合，而且所形成的cAMP只存留在这种细胞中，并不能随血液循环而影响其它细胞，因此，不同的激素引起不同的生理效应。 剌激→肾上腺髓质 产生释放 肾上腺素 血流 β-受体 G蛋白 环化酶 ATP cAMP+PPi cAMP 蛋白激酶（C、R） 蛋白激酶（C）+ R cAMP （无活性形式） （活性形式） ATP+脱磷酸的磷酸化酶激酶 磷酸化的磷酸化酶激酶+ADP （无活性形式） （活性形式） ATP+磷酸化酶b 磷酸化酶a+ADP （无活性形式） （活性形式） 糖原+Pi G—1—P G—6—P 葡萄糖+Pi 血糖 肾上腺素在促进糖原分解中的级联放大作用 (二)、磷酸肌醇信号转导系统 当激素与细胞膜受体结合时，活化细胞膜上的受体，活化的受体激活G蛋白，通过G蛋白将信息传递到结合在细胞膜上的磷酸肌醇酶使其活化。磷酸肌醇酶又称为磷脂酶C或磷酸肌醇磷酸二酯酶。它能催化磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成两个细胞内信号物质（第二信使）：肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG或DG）。 受激素触发的受体 Pi 活化 Pi G蛋白 打开Ca2+通道 Pi OH HO 6 5 活化 Pi Pi 磷酸肌醇酶 肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3） 1 4 + H2O OH HO Pi 2 3 R R′ 磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2） O C C O 激活蛋白激酶C O O H2C CH CH2OH 二酰基甘油（DAP） IP3是一个短寿命的信使，只能维持几秒钟。它可以在三个磷酸酶的作用下，以5、1、4的顺序脱去三个磷酸基形成肌醇。 DAG一方面可以被磷酸化形成磷脂酸，此磷脂酸再与CTP反应生成CDP—二酰甘油磷酸，CDP—二酰甘油磷酸进一步与肌醇反应生成磷酸肌醇（PI），后者与ATP反应生成磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。另一方面DAG可以被水解生成甘油和两个组成DAG的脂肪酸。此脂肪酸是二十碳的不饱和脂肪酸----花生四烯酸，它是一系列前列腺激素的前体。还可以在脂酰CoA转移酶的作用下，与其它脂肪酸合成三酰甘油。 IP3的作用是打开细胞内膜结构上的Ca2+通道，使Ca2+释放到细胞质中。在对IP3的研究中，将IP3用微注谢法加到细胞内或将IP3加到细胞膜受过处理可以通透的细胞的外面之后，发现Ca2+从细胞内的贮藏所----内质网以及肌肉中的肌浆网中迅速地释放出来，致使细胞质中的Ca2+水平升高，由此触发许多过程，如：平滑肌收缩、糖原分解、胞吐现象等。 DAG激活蛋白激酶C（PKC）。蛋白激酶C是一个相对分子质量为77000的酶，由一条肽链组成。具有一个催化结构域和及一个调节结构域。DAG结合到蛋白激酶C上，逆转了酶分子调节区造成的抑制作用，使酶能发挥其催化活性。活性蛋白激酶C可使许多种靶蛋白中丝氨酸残基和苏氨酸残基上的羟基磷酸化，从而改变这些靶蛋白的生物活性，使其活化或者失活。例如，糖原合成酶被蛋白激酶C磷酸化后，失活而停止糖原的合成；胰岛素、β--肾上腺素等激素的膜受体磷酸化后，阻塞了信息的转导途径。还可以使DNA甲基转移酶，Na+--K+ATP酶和转铁蛋白等磷酸化。 由磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸水解产生的DAG只引起短暂的PKC活化。近年来还以现了DAG的另一个来源：在微量Ca2+存在下，膜上的磷脂酶D可使磷脂酰胆碱水解产生磷脂酸，后者再由磷脂酸磷酸酶水解生成DAG。这种DAG也同样激活PKC，但可引起PKC持久的活化，与出现较慢的细胞增殖、分化等生物学效应有关。 (三)、Ca2+信号转导系统 Ca2+是一种广泛存在的胞内信使，对细胞反应起着重要的调节作用。通常动物细胞质中游离的Ca2+浓度很低（≤10-7mol/L），与细胞外的浓度（≥10-3mol/L）比较相差一千倍以上。这是由于质膜上的Ca2+泵能主动地将Ca2+排出细胞外；内质网膜和线粒体膜上的Ca2+泵能主动摄取大量的Ca2+的原故。激素与受体作用后产生第二信使物质IP3，IP3与内质网膜的的Ca2+门控通道结合，促使内质网中的Ca2+释放到细胞质中，使细胞质中的Ca2+浓度瞬间升高，从而诱发一系列的生理效应。因此，Ca2+可以看作是第三信使。 信使Ca2+在胞内的调节机制与一系列钙结合蛋白有关。Ca2+与钙调蛋白（CaM）结合，使CaM转变成活性构象，大大提高了对靶酶的亲合力。已知依赖Ca2+/CaM的酶有十几种，其中包括几种蛋白激酶、磷酸酯酶、核苷酸环化酶、离子通道蛋白和肌肉收缩蛋白等。通过影响这些酶的活性来控制细胞反应。 钙调蛋白（CaM）是钙传感器家族的成员之一，其相对分子质量为17000，它存在于所有真核细胞中，对于任何微量的钙都能敏感地捕获。在二级结构中Ca2+的结合位点由这个蛋白质的E（α螺旋）区和F（α螺旋）区以及结合Ca2+的泡区构成，它们的相对位置就好像右手的大拇指和食指夹着一个吸Ca2+区那样。Robert 和Krettwo称这种螺旋区—泡区—螺旋区结构为EF手图象。 EF手图象（由“螺旋区—泡区—螺旋区”的结构单位组成） 牛脑的CaM是一条由148个氨基酸残基组成的肽链，等电点为4.0，相对分子质量为16700，对热稳定，不易氧化，是一个相当稳定的分子，这可能为CaM的多功能提供了结构基础。它的氨基酸排列顺序已经阐明，有近1/3的氨基酸是谷氨酸和天冬氨酸。CaM分子内有4个可以与Ca2+结合的结构域，这些结构域的结构相似，并与前后的α螺旋形成EF手图象，可以说它是4个相连的EF手图象。在进化上CaM是一个非常保守的蛋白质。 牛脑CaM的一级结构（氨基酸用单字母表示） 当Ca2+与其结合位点结合时，激活CaM，CaM再去剌激其它的酶。分光光度研究和模型构建研究的结果表明，当Ca2+结合到E螺旋和F螺旋之间的泡区时，引起每个螺旋在其轴线附近的旋转并改变其所在的位置，这种改变可能使得钙调蛋白转变成一种对于靶蛋白具有很高亲合性的构象。 综上所述，CaM 只有与 假设的Ca2+的结合引起的EF手图象的构象变化 Ca2+ 结合成Ca2+·CaM复合 物后，才有生物活性。Ca2+·CaM复合物可以两种方式调节代谢，一是直接与靶酶起作用；二是通过活化依赖于Ca2+·CaM复合物的蛋白激酶(如蛋白激酶C)起作用。 受钙调蛋白调控的酶至少有15种，另外还有许多生理活动受它的协调，现分别介绍如下： 调节环式腺苷酸代谢 细胞内有多种类型的水解cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，其中有些磷酸二酯酶可被CaM活化。同时人们也发现了依赖于CaM的腺苷酸环化酶。CaM对磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶的影响主要是增大酶促反应的最大速度（Vmax），而对于Km值则影响不大。 调节钙的代谢 钙调蛋白不仅能将Ca2+的信息传递给不同的酶，而且可以激活Ca2+--ATPase（钙泵），促进Ca2+的吸收及转运。当细胞受激素和神经脉冲剌激后，质膜上的Ca2+通道被打开，同时也将Ca2+从胞内Ca2+库中释放出来，致使胞内Ca2+浓度瞬间内极大地的提高，形成Ca2+·CaM复合物，此复合物与膜上的Ca2+--ATPase结合，酶活性因而提高6—7倍，运转Ca2+的能力大大增强，这样又降低细胞质中的Ca2+浓度，使其迅速地恢复到兴奋前的稳态水平。 促进肌肉收缩及细胞运动 CaM作为Ca2+受体蛋白，具有激活MLCK（肌球蛋白轻链激酶）的作用。MLCK促使肌球蛋白轻链磷酸化后，发生了构象变化，从而可以与肌动蛋白作用，触发产生ATPase活性，使ATP水解，为肌肉的收缩提供必需的能量。CaM对非肌细胞如血小板、巨噬细胞的运动也有影响。 促进糖原代谢 Ca2+·CaM在触发肌肉收缩的同时，也活化磷酸化酶激酶，从而促进糖原分解，为肌肉收缩提供能量。Ca2+·CaM也能激活糖原合成酶，所以对糖原的代谢具有双重调节作用。 5．促进细胞分裂 Ca2+·CaM促进细胞分裂的前期（G1期）向DNA合成期（S期）转变。所以具有促进细胞分裂的作用。 6．促进神经递素的合成及神经弟素和激素的释放 依赖于Ca2+·CaM的蛋白激酶可使与神经递素合成有关的酶磷酸化而被激活，如酪氨酸-3-加单氧酶、色氨酸-5-加单氧酶等，从而促进儿茶酚胺类物质和5—羟色胺的合成。Ca2+·CaM还能促进神经递素和激素（如胰岛素等）的释放和分泌。 7．调节磷脂和前列腺素代谢 在血小板中，CaM剌激磷脂酶A2的活性，也调节血栓素A2的代谢，导致血小板聚集，血管收缩。CaM还可抑制催化前列腺素降解反应的酶15—羟基前列腺素脱氢酶，从而抑制前列腺素的分解。 综上所述，目前已知至少有15种酶受Ca2+·CaM的调节，其中特别重要的是它对各种代谢调节剂如激素、神经递素、细胞内第二信使（cAMP、Ca2+）等有直接或间接的调控作用。 以上几种代谢调节剂在空间和时间上是有互补作用的，如激素负责细胞间的通讯，Ca2+、cAMP则为细胞内信使；从时间上看，激素的作用时间以分、小时乃至用天计算，而cAMP则在秒、分的范围之内；Ca2+因无需再合成，适合于快速反应，反应时间是毫秒级的。 鉴于CaM对这些代谢调节剂的调控作用，有人称它为细胞代谢调控的综合剂。特别是它作为细胞内Ca2+的受体，既调节细胞内Ca2+的功能，同时还调节第二信使cAMP的合成与分解。因此，在调节体系中，CaM处于中心地位。正是因为它在代谢调控中有如此重要的地位，才被人们誉为70年代发现和发展DNA重组技术后，分子生物学中最重要的发现。 (四)、酪氨酸蛋白激酶信号转导系统 跨膜受体本身是一种酪氨酸蛋白激酶，其胞外部分是受体识别和结合配体的区域，跨膜部分是一个疏水的α--螺旋，质膜内侧部分是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，具有使自身的酪氨酸残基磷酸化并催化其它效应蛋白（或酶）的酪氨酸残基磷酸化的作用。配体一旦与受体的结合位点结合，就激活了酪氨酸蛋白激酶催化部位，它一方面自动地对催化部位的酪氨酸残基进行磷酸化，这种自动地自身磷酸化作用增大了该激酶对效应蛋白的酪氨酸残基进行磷酸化的容量；另一方面，催化效应蛋白的酪氨酸残基磷酸化，从而表现出生理效应。 例如，表皮生长因子（EGF）受体为单条肽链，可分成三个结构域：质膜外侧N--端肽段包含糖基化部位，富含半胱氨酸，是与EGF的结合区；中间为疏水性的跨膜螺旋区；质膜内侧C--端肽段具有酪氨酸蛋白激酶活性（如图所示）。EGF与受体结合后，激活酪氨酸蛋白激酶活性，使受体自身及其他效应蛋白的酪氨酸残基磷酸化，从而发挥促进细胞生长和分化的效应。同时EGF--受体复合物还通过与G蛋白的作用，激活蛋白激酶C系统，而对细胞的代谢施加影响。 再如，胰岛素受体是一种跨膜糖 蛋白，由4条肽链组成， 即α2β2， α亚基位于质膜外侧，含有胰岛素结 合部位；β亚基的N端在质膜的外侧， 表皮生长因子的受体 与α亚基结合，经一跨膜区段使其含 酪氨酸蛋白激酶的C端肽段位于质膜内侧（如图所示）。受体与胰岛素结合后，立即激活酪氨酸蛋白激酶，导致β亚基自身以及效应蛋白酪氨酸残基的磷酸化。胰岛素与受体复合物除促进细胞生长的长期效应外， 还能作用于G蛋白， 导致Giα的释放并激活磷脂酶C，通过磷酸肌醇系统发挥作用。此外，它还具有蛋白水解酶活性，通过水解膜蛋白释放化学介质，直接调节细胞内控制糖代谢和脂肪代谢的主要酶类的生物活性。胰岛素的调节机制十分复杂，它可促进葡萄糖、其他糖类和氨基酸进入肌肉和脂肪细胞；促进肌肉、肝脏和脂肪组织的合成代谢，抑制分解代谢，特别是增加糖原、脂肪酸和蛋白质的合成速度，增强糖酵解作用，引起多种效应。 胰岛素受体 (五)、cGMP信号转导系统 甘油二酯（DAG）在α--脂肪酸水解酶或磷脂酰肌醇二磷酸在磷脂酶A2作用下产生花生四烯酸，后者经脂加氧酶形成两个重要的前列腺素过氧化物PGG2、PGH2。它们均能激活岛苷酸环化酶（GC），使cGMP浓度升高。cGMP通过激活多种酶及依赖于cGMP的蛋白激酶而发挥生理效应。依赖于cGMP的蛋白激酶是蛋白激酶G（PKG），它由两条肽链组成，与cGMP结合后被活化，但二聚体并不解离。蛋白激酶G对底物蛋白质的磷酸化方式与蛋白激酶A类似，但它们的天然底物不同，产生的生理效应也往往是相互制约的。例如，蛋白激酶A可使糖原分解加快，而蛋白激酶G则使糖原合成加快。 第六章 代谢调节 代谢是一切生命活动的基础。代谢包括物质代谢、能量变代谢和信息代谢三个方面。任何物质变化总伴有能量变化，而能量变化又总伴随着它们组成成分相对无序和有序结构的变更。组织结构的这种变化可以通过称为“熵”的热力学函数进行测量。熵越大，系统越混乱；反之熵越小，系统的有组织程度就越高。信息也可以作为系统组织程度的量度，获得信息便意味着混乱程度或者不确定程度减少，也就是说它的组织程度越高。因而可以说信息就是负熵。活细胞不断与环境交换物质，摄取能量，输入负熵，从而得以构建和维持其复杂的组织结构；这种关系一旦破坏，便意味着死亡。 在本科的学习阶段我们已经讲述了糖、脂肪、蛋白质和核酸等物质的代谢过程，以及这些物质代谢过程中能量和信息的变化。实际上，生物机体的新陈代谢是一个完整统一的过程，并且存在复杂的调节机制。生物体的代谢在三种不同的水平上进行，即①分子水平调节；②细胞水平调节；③多细胞整体水平调节。所有这些调节机制都是在基因产物蛋白质（可能还有RNA）的作用下进行的，也就是说与基因表达调控的关。 这一章里，我们将着重介绍代谢调节的基本概念，酶在代谢调节中的作用原理以及整体调节的状况。 糖、脂肪和蛋白质代谢的相互关系 代谢途径的相互关系 生物界，包括人类、动物、植物和微生物，其结构特征和生活方式多种多样，千变万化。然而，它们的新陈代谢有着共同的规律。细胞内有数百种小分子物质在代谢中起着关键的作用，由它们构成了成千上万种生物大分子。如果这些分子各自单独进行代谢而互不相关，那么代谢反应将变得无比庞杂，以至细胞无法容纳。细胞代谢的原则和方略是，将各类物质分别纳入各自的共同代谢途径，以少数种类的反应，例如氧化还原、基团转移、水解合成、基团脱加、异构反应等，转化种类繁多的分子。不同的代谢途径可以通过交叉点上关键的中间物而相互作用和相互转化。这些共同的中间代谢物使各代谢途径得以沟通，形成经济有效、运转良好的代谢网络。其中三个最关键的中间代谢物是：6--磷酸葡萄糖、丙酮酸和乙酰辅酶A。 下面我们简要介绍糖、脂类和蛋白质代谢的相互关系。 糖代谢与蛋白质代谢的相互关系 糖与蛋白质之间可以相互转变。 糖是生物机体的重要碳源和能源，可用于合成各种氨基酸的碳链结构，再以氨基化或转氨作用生成相应的氨基酸。例如葡萄糖在代谢过程中可产生丙酮酸、α--酮戊二酸、草酰乙酸以及羟丙酮酸，这四种酮酸经氨基化或转氨基反应分别生成丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸。此外糖在代谢过程中产生的能量，尚可供氨基酸和蛋白质合成之用。 蛋白质可分解为氨基酸，除亮氨酸之外，其它氨基酸的碳骨架均可转变为糖。 2．脂类代谢与蛋白质代谢的相互关系 脂类与蛋白质之间可以相互转变。 脂类分子中的甘油可先转变为糖代谢的中间产物，再转变为丙酮酸、α--酮戊二酸、草酰乙酸以及羟丙酮酸，然后接受氨基生成丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸。脂肪酸虽然说经β--氧化生成乙酰辅酶A后，再与草酰乙酸缩合为柠檬酸进入三羧酸循环，从而与天冬氨酸和谷氨酸相联系，但这种由脂肪酸合成氨基酸碳链结构的可能性是受限制的。实际上，当乙酰辅酶A进入三羧酸循环而形成氨基酸时，需要消耗三羧酸循环中的有机酸，如无其它来源补充，反应将不能进行。在植物和微生物体内，存在乙醛酸循环，可以由两分子乙酰辅酶A合成一分子琥珀酸，用以增加三羧酸循环中的有机酸，从而促进脂肪酸合成氨基酸。但在动物体内不存在乙醛酸循环，所以一般来说，动物组织不易利用脂肪酸合成氨基酸。 蛋白质可以转变为脂肪。可以转变为糖的氨基酸通过丙酮酸既可转变为甘油，也可脱羧转变为乙酸辅酶A而合成脂肪酸。 此外磷脂分子中的胆胺或胆碱，主要是由丝氨酸转变生成。丝氨酸在脱去羧基后形成胆胺。胆胺是脑磷脂的组成成分。胆胺经接受甲硫氨酸提供的甲基后，即形成胆碱，胆碱是卵磷脂的组成成分。 3．糖与脂类的相互联系 糖与脂类也可以相互转变。 糖酵解的中间产物磷酸二羟丙酮可被还原为甘油；丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A，然后再缩合成脂肪酸。 脂类分解产生的甘油可以经过磷酸化转变为磷酸甘油，再转变为磷酸二羟丙酮，后者异生为糖。至于脂肪酸转变为糖的过程，则有一定的限度。脂肪酸通过β--氧化生成乙酰辅酶A。在植物和微生物体内，乙酰辅酶A可缩合为三羧酸循环中的有机酸，如经乙醛酸循环生成琥珀酸，琥珀酸再参加三羧酸循环，转变为草酰乙酸，由草酰乙酸脱羧生成丙酮酸，丙酮酸即可异生为糖。但在动物体内，不存在乙醛酸循环，通常情况下，乙酰辅酶A都是经三羧酸循环氧化为二氧化碳和水的，生成糖的机会很少。虽然同位素实验表明，脂肪酸在动物体内也可以转变为糖，但在这种情况下，需要有其他来源补充三羧循环中的有机酸。 在某些病理状态下，可以观察到糖代谢与脂类代谢的密切关系。例如，糖尿病患者的糖代谢发生了障碍，同时也常伴有不同程度的脂类代谢紊乱。由于糖的利用受阻，体内必须依靠脂类物质的氧化来供给能量。因此，大量动用体内贮存的脂肪，运到肝脏组织进行氧化，结果产生大量酮体，再由血液运送到其它组织（如肌肉组织）氧化利用。酮体本身主要为酸性物质，血液中酮体增高时，常有发生酸中毒的危险。当饥饿时，体内无糖可供利用，也会产生与糖尿病相类似的情况，大量动用脂肪，并造成酮体过多。 综上所述，可以看出，糖、脂类和蛋白质等物质在代谢过程中都是彼此影响，相互转化和密切相关的。三羧酸循环不仅是各类物质共同的代谢途径，而且是它们之间相互联系的渠道。 降解代谢与合成代谢的单向性 生物体内的代谢反应都是由酶催化的。任何催化剂，包括酶在内，仅能改变化学反应的速度，并不能改变化学反应的平衡点。因此，对于正反应和逆反应起着同样的促进作用。代谢途径中大量生化反应都能可逆进行。然而，实际上整个代谢过程是单向的，降解代谢和合成代谢各有其自身的途径。在一条代谢途径中，某些关键部位的正反应和逆反应往往是由两种不同的酶催化，一种酶催化正向反应，另一种酶催化逆向反应。因此，这些反应被称为相对立的单向反应。这种分开机制可使生物合成与降解途径或者正向反应和逆向反应分别处于热力学的有利状态。生物合成是一个吸能反应，它通过与一定数目ATP的水解相偶联而得以进行。降解则是放能反应。这些吸能反应和放能反应均远离平衡点，从而保证了反应的单向性。 例如，在糖代谢中，有几个部位的正向反应和逆向反应是分开进行的： 己糖激酶 a．葡萄糖+ATP 6--磷酸葡萄糖+ADP ⑴ 6--磷酸葡萄糖酶 b．6--磷酸葡萄糖+H2O 葡萄糖+Pi 磷酸果糖激酶 a．6--磷酸果糖+ATP 1,6--二磷酸果糖+ADP ⑵ 1,6--二磷酸果糖酶 b．1,6--二磷酸果糖+H2O 6--磷酸果糖+ Pi UDPG焦磷酸化酶 糖原合成酶 a．1--磷酸葡萄糖+UTP UDPG 糖原（n+1） PPi 糖原（n） ⑶ 磷酸化酶 b．糖原（n）+ Pi 1--磷酸葡萄糖+糖原（n-1） 脂肪酸代谢中也有类似情况： 硫激酶 a．脂肪酸+ATP+CoA 脂酰～CoA+AMP+PPi ⑴ 硫酯酶 b．脂酰～CoA+H2O 脂肪酸+ CoA 乙酰～CoA羧化酶 a．乙酰～CoA+CO2+ATP 丙二酸单酰～CoA+ADP+Pi ⑵ 丙二酸单酰～CoA脱羧酶 b．丙二酸单酰～CoA 乙酰～CoA+CO2 在上述诸反应中，正向反应（a）与三磷酸核苷的水解反应相偶联；逆向反应（b）往往是水解反应或其它分解反应，a、b都是不可逆的。如果a反应与b反应处于非控制状态，那么，将导致水解高能磷酸键的空转。实际上由于a反应和b反应同时受到细胞的控制，因而这一部位便成为代谢调节的关键反应或者限速反应。新陈代谢的调节实质上就是对单向反应或者非平衡反应的酶活性或含量的调节，这些酶通常称之为关键酶或者限速酶。 三、新陈代谢的调节 生物体内的各种代谢变化是由酶驱动的，酶有两种功能：其一，催化生化反应，是生物催化剂；其二，控制代谢的速度、方向，是新陈代谢的调控元件。酶对代谢的调节主要有两种方式：一种是通过激活和抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性；另一种是通过影响酶分子的合成与降解以改变酶分子的含量。这种“酶水平”的调节机制是代谢的最本质的调节。 高等动物新陈代谢调节的基本方式有三种：细胞水平的调节、激素的调节的神经的调节。 细胞水平的调节是从单细胞生物到高等动物都具有的一种最原始的调节方式，也是其他调节方式的基础。它主要是通过细胞内某些调节物浓度的改变，来改变关键酶的活性。细胞内的调节物主要是：细胞能量体系，即ATP/ADP（AMP）；细胞还原力体系，即NADPH/NADP+；其他重要代谢中间物，如6--磷酸葡萄糖、柠檬酸及长链脂酰CoA等等。动物的膜结构把整个细胞分成许多小区，并把不同代谢途径的酶系固定的分布在不同的分区中，为代谢调节提供了方便。这种分隔一方面可使某些调节物只对某一分区中的代谢途径发生影响；另一方面还可通过膜的转运功能，根据条件变化的需要把调节物从一个分区转到另一个分区，以发挥调节作用。 高等动物是多细胞生物，因而除了每个细胞都能自己调控其自身的代谢途径以适应其自身的生命活动外，还需要有协调全身各个组织、各个细胞之间代谢的机制。并且整个动物作为一个整体，还需要对内外环境的变化做出准确的反应。这些任务主要由神经和激素来完成的。高等动物具有多种内分泌腺，它们分泌多种不同的激素，每种激素都对代谢有特异的调节作用。激素的分泌也是受到调控的。当机体需要时，就促使某些内分泌腺分泌激素，这些激素通过血液到达靶细胞，对靶细胞的代谢发挥其调节作用。神经对代谢的调节途径有两条：其一是通过神经递素对效应器直接发挥作用；其二是改变某些激素的分泌，通过这些激素间接发挥其调节作用。神经和激素敏感地探测着内外环境的变化，并根据内外环境的变化情况来调控新陈代谢以进行适应。所以神经和激素的调控是全身性调控。 酶活性调节 酶活性调节是一种快速调节机制。关键酶的活性对调节浓度的改变能做出迅速、灵敏地反应，以适应内外环境变化的要求。 酶促反应的前馈与反馈 前馈是指代谢底物对代谢过程的作用；反馈则是指代谢产物对代谢过程的作用。前馈和反馈都分为正作用和负作用两种。代谢底物对途径关键酶的激活作用称为正前馈；代谢底物对途径关键酶的抑制作用称为负前馈。代谢产物对途径关键酶的激活作用称为正反馈；代谢产物对途径关键酶的抑制作用称为负反馈。如下图所示，S代表反应物，其中S0为底物，P为产物；E代表酶，其中E0为途径关键酶。 正前馈 正反馈 + + E0 E1 E2 S0 S1 S2 P - - 负前馈 负反馈 1．前馈作用 通常，代谢物对代谢反应有促进作用。在代谢途径中前面的底物对其后某一关键酶起激活作用，就称为正前馈作用。正前馈作用的例子很多。例如，糖原合成中，6--磷酸葡萄糖是糖原合成酶的变构激活剂，可促进糖原的合成。 ATP ADP UTP PPi 糖原合成酶 葡萄糖 G--6--P G--1--P UDPG 糖原 + 在某些特殊情况下，为了避免代谢途径的过分拥挤，当代谢底物过量存在时，对代谢途径亦可呈负前馈作用。此时过量的代谢底物还可以转向另一个途径。例如，高浓度的乙酰CoA是乙酰CoA羧化酶的变构抑制剂，因而可避免丙二酸单酰CoA合成过多。 乙酰～CoA羧化酶 乙酰～CoA+CO2+ATP 丙二酸单酰～CoA+ADP+Pi - 2.反馈作用 ①一价反馈抑制 一价反馈抑制(或称单价反馈抑制)是指一个单一代谢途径的末端产物对催化反应的关键酶活性（通常是第一个酶活性）的抑制作用。例如，催化嘧啶核苷酸生物合成的第一个酶天冬氨酸转氨甲酰酶，是该途径的关键酶，它受到途径的终产物胞苷三磷酸的反馈抑制。 天冬氨酸转氨甲酰酶 氨甲酰磷酸+天冬氨酸 氨甲酰天冬氨酸 乳清酸 Pi - CMP CTP CDP ②二价或多价反馈抑制与同工酶调节 在分支生物合成途径中，有时催化共同途径第一步反应的酶活性可被两个或两个以上末端产物所抑制，称为二价或多价反馈抑制。另一种情况是，关键步骤的反应由两个或两个以上的酶所催化，这些酶是同工酶它们可被各自分支途径的产物所抑制。例如赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸同工激酶的抑制，如图所示。 a - A.B.C 天冬氨酸 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸-β-半醛 高丝氨酸 苏氨酸 c d e - - - b - 赖氨酸 甲硫氨酸 异亮氨酸 A.B.C为天冬氨酸同工激酶；a苏氨酸单价的反馈抑制；b赖氨酸单价的反馈抑制；c、d、e赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸对相应酶的反馈抑制。 ③累加反馈抑制 多条分支途径的末端产物对其共同途径第一步反应的酶活性具有抑制作用，对该酶活性抑制的强弱程度是多种末端产物的累加效应，这种抑制作用称为累加反馈抑制。例如，谷氨酰胺合成酶接受多条代谢途径末端产物的反馈抑制，这些代谢途径的末端产物有甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、组氨酸、CTP、AMP等。如图所示。 甘氨酸 丙氨酸 色氨酸 组氨酸 CTP 谷氨酰胺合成酶 谷氨酸+NH3 谷氨酰胺 AMP ATP ADP+Pi 氨甲酰磷酸 - 葡糖胺-6-磷酸 各种末产物累加的反馈抑制 ④连续负反馈作用（顺序反馈抑制） 代谢途径的终产物或靠后的代谢物反馈抑制途径的关键酶之一，使该酶前方的代谢物积累，后者再反馈抑制其前方的另一关键酶的方式称为连续负反馈作用或顺序反馈抑制。例如，在糖代谢途径中，当ATP（或柠檬酸）的浓度升高时，首先抑制酵解途径的一个关键酶--磷酸果糖激酶的活性，使6--磷酸葡萄糖的浓度升高，后者再反馈抑制己糖激酶，从而使糖分解代谢途径的速度降低。如图所示。 己糖激酶 磷酸果糖激酶 葡萄糖 G-6-P F-6-P F-1,6-2P 乙酰--CoA - - ATP+CO2+H2O ⑤反馈激活 代谢物对酶活性的调节，不仅表现为反馈抑制，也可以表现为反馈激活。代谢物增强关键酶活性的作用称为反馈激活。例如，在鼠伤寒沙门氏菌体内，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的调节中就存在着代谢物的激活作用。磷酸烯醇式丙酮酸通过羧化反应，形成草酰乙酸，这是复杂分支代谢途径中共同的第一步反应。由草酰乙酸可以转变成各种氨基酸和核苷酸。另一方面，草酰乙酸还可以促使乙酰CoA，通过三羧酸循环而被氧化。 草酰乙酸作为氨基酸和核苷酸的前体物质，能被产物连续地进行反馈抑制。即当嘧啶核苷酸积累时，催化其分支途径第一步反应的酶--天冬氨酸转氨甲酰酶受到抑制，这就导致天冬氨酸的积累，进而对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性产生抑制作用。然而，三羧酸循环中柠檬酸的合成又必须要有草酰乙酸参加，从而产生了三种正调节，对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶进行激活。这三种正调节是：嘧啶核苷酸的反馈激活；乙酰CoA的反馈激活；二磷酸果糖的前馈激活。如图所示。 核酸 葡萄糖 二磷酸果糖 嘧啶核苷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 氨甲酰天冬氨酸 + + + 乙酰--CoA - - 天冬氨酸 草酰乙酸 柠檬酸 氨基酸 α--酮戊二酸 蛋白质 此外，乙酰CoA还能增加磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对嘧啶核苷酸的亲合力，从而促进了嘧啶核苷酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用效应。这样，通过错综复杂的调节系统，就能使磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应处于最适当的水平。 动物体内也存在着反馈激活作用。例如，当酵解作用增强（或其它原因）而使柠檬酸的合成加快，但细胞内的能量水平已够高，三羧酸循环的运转并不增强时，可使柠檬酸的浓度升高。柠檬酸浓度升高后，一方面反馈抑制了磷酸果糖激酸，使酵解途径的速度减慢，以减少乙酰CoA的来源；另一方面反馈激活乙酰CoA羧化酶，使乙酰CoA转向脂肪酸的合成。二者都使乙酰CoA的含量减少，也就减少了柠檬酸自己的合成，使柠檬酸的浓度保持恒定。 丙二酸单酰CoA 脂肪酸 乙酰CoA羧化酶 + 葡萄糖 G-6-P F-6-P F-1,6-2P 乙酰CoA 柠檬酸 - - 这个机制说明，当一个代谢途径的代谢物过剩时，可使之转向另一个途径。 从上述酶活性调节的实例中可能看出，反馈抑制在酶活性调节中占有很重要的地位。反馈抑制有很大的优点。第一，这种机制的实质是由产物本身来控制产生自己的生成速度，因而是控制产物数量最准确的方式。当产物的浓度高时，抑制途径的关键酶活性，使途径的速度降低，以减少产物的生成，使产物浓度得以降低。相反，当产物的浓度低时，对途径关键酶活性的抑制作用减弱，使途径的速度加快，以增加产物的生成量，从而使产物的浓度得以升高。第二，产物控制的大多数是途径（或分支途径）的第一个酶，所以是最经济的方式。可以设想，如果控制的是其它的酶，当产物的浓度升高时，固然也能通过抑制该酶而降低产物生成的速度，但该酶以前的反应仍将以高速度进行，这将会使某些代谢物在体内堆积，产生不利作用，而且也浪费了原料和能量。所以，反馈抑制是最经济有效的调控方式，是酶活性调节最基本的方式。 变构调节 1.变构酶的概念 生物体内的有些酶是由两个以上的亚基组成的寡聚酶，酶分子上有两个结合部位，一个可与调节物结合，调节酶的活性，称为调节部位；另一个可与底物结合，催化底物发生反应，称之为催化部位。当调节物（或称效应物）与调节部位结合时，引起酶分子构象的变化，从而改变了该酶的催化部位与底物结合的性能，使酶的活性也随之发生改变。我们将这种酶就称为变构酶（或称为别位酶）。 变构调节的概念 当调节物与变构酶的调节部位结合后，引起变构酶构象的改变，使其催化活性增强或减弱，以便达到调节新陈代谢的目的。我们将这种调节机制叫做变构调节（或别位调节）。其调节物（效应物）称为变构剂。能够增加酶与底物的亲合力，增强酶活性的调节物称为正效应物（或变构激活剂）；能够降低酶与底物亲合力，减弱酶活性的调节物称为负效应物（或变构抑制剂）。正效应物增加酶活性的作用称为变构激活，负效应物减弱酶活性的作用则称为变构抑制。 3．调节物 不同变构酶的调节物分子是不同的，有的变构酶具有同促效应或称同种协同效应，它的调节物分子就是底物，也就是说，这些酶分子上有两个以上的底物结合中心，其调节作用取决于酶分子上有多少个底物结合中心被底物所占据。有的变构酶具有异促效应，这种变构酶除与底物结合之外，还能与其它的调节物结合，即它的调节物不是底物分子。例如苏氨酸脱水酶的底物是苏氨酸，但调节物是L—异亮氨酸。而更多的变构酶既有同促效应，又有异促效应，它既受底物分子的调节，又受底物以外的其它调节物分子的调节，也就是说它的调节物之一是底物，调节物之二、之三等是底物以外的其它物质。例如，大肠杆菌的天冬氨酸转氨甲酰酶既具有同促效应，又具有异促效应。天冬氨酸对其具有底物协同效应；CTP则是其变构抑制剂，而ATP是其变构激活剂，这二者又对其具有异促效应。 变构酶的动力学及变构酶对酶促反应速度的调节 变构酶的酶促反应速度（初速度）与底物浓度之间的关系不符合典型的米氏方程，即不呈一般的v—[S]双曲线，而大多数是“S”形的v—[S]曲线。 这种“S”形曲线表明，酶结合底物（或效应物）之后，酶的构象发生了变化，这种新的构象大大有利于后续分子与底物的结合，大大地促进了酶对后续的底物分子（或效应物）的亲合力，这是“正协调性”，又称为“协同结合”。这种变构酶称为具有正协同效应的变构酶。 Vmax ++ + - -- 1/2Vmax [S] Km′小 Km 大 km″ 正协同效应变构酶动力学曲线 从正协同效应变构酶的动力学曲线图上可以看出，当增加正调节（变构激活剂）物浓度时，表观Km值减小，酶对底物的亲合力增大，但协同性（对底物浓度变化的灵敏度）减小；增加负调节物（变构抑制）浓度时，表观Km值增大，酶对底物的亲合力减小，但协同性增大。此处的表观Km值也表示酶促反应最大速度一半时的底物浓度，但是不能用来计算变构酶的初速度，因为v—[S]关系不是米氏方程中的关系。 变构酶的“S”形动力学关系，十分有利于反应速度的调节。为了说明这个问题，我们可将变构酶的“S”形曲线与非调节酶的双曲线合并于一图，进行比较。 Vmax 90% A B 50% 10% [S] 0.11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 从图中可以看出，在非调节酶曲线（A）中，当[S]=0.11时，v达到Vmax的10%，当[S]=9时，v达到Vmax的90%，达到这两种速度的底物浓度比为81；而在变构酶的“S”形曲线（B）中，当[S]=3时，v达到Vmax的10%，而当[S]=9时，v达到Vmax的90%，所以达到同样的速度，底物的浓度比仅为3。这表明，当底物浓度略有变化，如上升3倍，变构酶的酶促反应速度就可以从10% Vmax突然上升到90% Vmax。而在典型的米氏型酶中，酶促反应速度若发生这么大的变化，则需要底物浓度上升81倍才行。前者底物浓度3倍的变化对于动物体来说是可以忍受的，后者底物浓度81倍的变化对动物体来说则不可忍受，不可能存在。所以，变构酶的“S”形曲线优点体现为：当底物浓度发生较小变化时，变构酶活性可发生极大的变化，从而极大地控制着反应速度，这就是变构酶能灵敏地调节酶促反应速度的原因所在。由于上述正协同效应，底物浓度对酶促反应速度的影响极大。换句话说，正是由于正协同效应，使得酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感。 例如，大肠杆菌的天冬氨酸转氨甲酰酶（简称ATCase）是具有正协同效应的变构酶。ATCase由12条肽链组成，6条为形成催化亚基的C链，6条为形成调节亚基的R链。ATCase的三维结构是很独特的，一个催化三聚体亚基（C3）在上，另一个催化三聚体亚基（C3）在下，中间为三个调节二聚体亚基（R2），它们以一上一下的排列像腰带般地夹绕在两个C3中间。如图所示。 E．Coli的ATCase中亚基的排列 A．ATCase 的顶面观；B．ATCase 的前面观。C代表催化亚基；R代表调节亚基。 C C C ATP 汞化物 R R R R R R + CTP 巯基化合物 R2 C C C C3 无催化活性构象 有催化活性构象 催化亚基 调节亚基 T型 R型 （三聚体） （二聚体） ATCase的构象变化及其亚基的关系。 图中的C代表催化亚基；R代表调节亚基。 ATCase是既有同促效应又有异促效应的变构酶。当CTP沿未产生，只有天冬氨酸结合到催化亚基的活性中心时，即反应刚开始时，就有同促效应。此时一个分子的天冬氨酸结合到活性中心，就增加了其它亚基对底物的亲合力，因此大大地增大了反应速度，表现出S形特征。这种同促过渡作用属于齐变类型。但是，一旦反应生成CTP，就有了天冬氨酸和CTP两种分子，这时就产生异促效应。CTP在不影响酶的Vmax的情况下通过降低酶与底物的亲合力来抑制ATCase，抑制程度可能达到90%，具体情况视底物的浓度而定。ATP则是ATCase的另一个异促效应调节物，它可以增强酶与底物的亲合力，同样也不影响酶的Vmax。同促效应的意义在于，当底物天冬氨酸浓度升高时，与酶的底物结合部位之一结合，引起酶分子构象的改变，增加了酶对后续底物分子的亲合力，提高了酶的催化活性，从而避免底物天冬氨酸的积累。CTP作为异促效应变构抑制剂的意义在于，当底物天冬氨酸过多，而又要保持反应速度不变，以避免CTP积累过多时，便发生CTP的反馈抑制作用。CTP通过与调节亚基的结合，引起酶分子构象的改变，降低酶的催化活性，减少终产物CTP的生成，以保持其浓度的恒定。ATP作为异促效应变构激活剂的意义在于，ATP作为信号表明有能量供给核酸合成，而需要加强嘧啶核苷酸的合成，以保证原料供给。此时，ATP与酶的调节亚基结合，引起酶分子构象的改变，增加酶与底物天冬氨酸的亲合力，提高酶的催化活性，加快CTP的合成速度。ATCase的动力学曲线及负调节物CTP和正调节物ATP作用的动力学过程如图所示。 Vmax + +ATP 无 +CTP 同促效应动力学曲线 - 1/2Vmax 表观Km（即Km′） [S] ATCase动力学曲线 另一种变构酶负协同效应变构酶。这类酶的动力学在表观上与双曲线有些相似（如图中的3），但仔细分析起来就可以看出，在这种曲线中，在底物浓度较低的范围内（A），随底物浓度的增加，酶促反应速度上升很快，但继续下去（如A---B），底物浓度虽然有较大的提高，但酶促反应速度加快的幅度较小，也就是说，负协同效应弯构酶可以使酶促反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。 v 1 2 3 [S] A B 负协同效应变构酶动力学曲线 3--磷酸甘油醛脱氢酶是具有负协同效应的变构酶的典型代表，它催化的反应如下。 3--磷酸甘油醛 + NAD+ + HPO42- 1,3--二磷酸甘油酸 + NADH + H+ 此酶有四个亚基，可以和四个NAD+结合，但从结合常数来分析，前两个亚基与NAD+的亲合力大，后两个亚基与NAD+的亲合力小。因此，在开始时，虽然底物NAD+的浓度很低，也能顺利地和酶结合。酶与NAD+结合后，分子构象发生变化，使酶与NAD+的亲合力降低，所以，在NAD+浓度升高时，酶再要结合第三和第四个NAD+就不那么容易，除非NAD+的浓度高出两个数量级，才会进一步地结合。也就是说，这时候再要提高酶反应速度是较难的，需要浓度大大提高才行。在一定的底物浓度范围中，底物浓度的变化不足以影响酶反应速度。这就是负协同效应变构酶对底物浓度变化的不敏感性。 变构酶调节酶活性的机理 变构酶活性的改变是通过酶分子四级结构的改变来完成的。目前有两种重要的酶分子模型用来解释变构酶的“S”形动力学曲线。这两种模型都是以变构酶是寡聚酶的事实为根据，并受到血红蛋白接受氧的机理的启发而提出的。 ①序变模型（KNF模型） 序变模型假说主张酶分子中亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，亚基逐个地依次变化，因此酶分子有各种可能的构象状态。如下图模式所示： S S S S 亚基全部处 全部亚基处 按次序变化 于“关”型 于“开”型 （T型） （R型） 在这个模型中表示了一个四亚基的酶分子模型，其中“R型”为“开”型构象，它有利于结合底物或调节物，“T型”为“关”型构象，它不利于结合底物或调节物。当底物（或正调节物）浓度上升到可以与其中的一个亚基牢固结合时，这时剩下的亚基就会按次序迅速地改变构象，形成一个有活性的四聚体，给出“S”形曲线。 在序变模型中既可以有正调节物的作用，又可以有负调节物的作用。由于这个序变模型可以表示酶分子的许多中间构象状态，因此用来解释变构酶的酶活性调节作用比下面介绍的齐变模型更好一些，适用于大多数变构酶，特别是在描述异促效应时，一般认为用序变模型更好一些。 ②齐变模型或对称模型（MWC模型） 齐变模型假说主张变构酶的所有亚基，或者全部呈坚固紧密的、不利于结合底物的“T”状态，或者全部呈松散的、有利于结合底物的“R”状态，这两种状态间的转变对每个亚基都是同时的、齐步发生的。“T”状态中亚基的排列是对称的，变成“R”状态后亚基的排列仍然是对称的。如图所示： 齐步变化 S S S S “T”状态 “R”状态 （对称亚基） （对称亚基） 对称亚基 齐步变化 对称亚基 正调节物（如底物）与负调节物浓度的比例决定变构酶究竟处于哪一种状态。当无小分子调节物存在时，平衡趋向于“T”状态，当有少量底物时，平衡即向“R”状态移动，当构象已转变为“R”状态后，又进一步增强对底物的亲合力，给出“S”形动力学曲线。 这个模型可以解释正调节物的作用。可以假定“R”状态有利于正调节物结合，“T”状态有利于负调节物作用。在齐变模型中，同促效应必然有正的协同效果，而异促效应则可能有正的协同效果，也可能有负的协同效果。例如，天冬氨酸对ATCase是同促效应；CTP对ATCase的反馈抑制是异负促效应，ATP对ATCase的激活作用是正异促效应。血红蛋白的情况则为：协同结合氧是同促效应；H+、CO2、DPG降低对氧的亲合力是负异促效应。 目前认为齐变模型不适用于负协同反应。 还有许多变构酶有更复杂的调节过程，为了说明各种变构酶的特殊调节作用及动力学，还提出了其他一些模型。 有人认为不能用一种模型去解释所有变构酶的行为，从现有的实验数据来看，很可能某些变构酶的行为符合序变模型，而另一些变构酶的行为符合齐变模型，有的变构酶则在这种条件下其行为符合齐变模型，而在另一种条件下又符合序变模型，它们有着不同的调节机理。也有人认为可以期望将来有可能只用一种模型来解释变构酶的作用机理。 共价调节 1．共价调节酶的两个特点 有些酶，在其它酶的催化下，其分子结构中的某些特殊基团，如：Ser、Thr或Tyr的OH基，能与特殊的化学基团，如ATP分子上脱下的磷酸基或腺苷酸基（AMP）共价结合或解离，从而使酶分子在有活性形式与无活性形式之间相互转变，这种修饰作用称为共价调节。这种被修饰的酶称为共价调节酶。生物体内共价调节酶比较多，下表是一些例子。 共价调节酶及酶活性调节 酶 修饰机理 活性变化  糖原磷酸化酶 磷酸化酶b激酶 糖原合成酶 丙酮酸脱氢酶 谷胺酰氨合成酶 磷酸化/脱磷酸 磷酸化/脱磷酸 磷酸化/脱磷酸 磷酸化/脱磷酸 腺苷酰化/脱腺苷 增大/减小 增大/减小 减小/增大 减小/增大 减小/增大   这类酶最显著的特点之一是，它有无活性型（或低活性型）和有活性型（或高活性型）两种形式。最典型的例子是动物组织中的糖原磷酸化酶，它催化糖原转变为1--磷酸葡萄糖，是糖原分解代谢的关键酶。 磷酸化酶 糖原（n）+H3PO4 糖原（n-1）+ 1--磷酸葡萄糖 这个酶有两种形式：活性较高的形式是磷酸化酶a，活性较低的形式是磷酸化酶b。磷酸化酶a是一个由四个亚基组成的寡聚酶，其中每一个亚基含有一个其羟基被磷酸化了的丝氨酸残基。亚基上的这些磷酸基是酶表现催化活性所必需的，它们可以被相关的磷酸酶水解而除去。反应如下： 磷酸化酶磷酸酶 磷酸化酶a + 4H2O 2磷酸化酶b + 4H3PO4 磷酸化酶a上的磷酸基被酶水解除去后， 磷酸化酶a解离成两个低活性的半分子---磷酸化酶b。而这种低活性的磷酸化酶b又可以在磷酸化酶激酶的作用下，接受ATP提供的磷酸基重新磷酸化，“复活”为高活性的磷酸化酶a。反应如下： 磷酸化酶激酶 2磷酸化酶b + 4ATP 磷酸化酶a + 4ADP 由此可见，磷酸化酶的活性调节，是通过磷酸基与酶分子的共价结合（磷酸化）和从酶分子上水解除去磷酸基（脱磷酸）来实现的。 P P 磷酸化酶a （高活性） P P 4H2O 4ADP 磷酸化酶 磷酸化酶 磷酸酶 4Pi 4ATP 激酶 + 磷酸化酶b （低活性） 磷酸化酶两种形式的转变过程 共价调节酶的另一个显著特点是，它们可以将化学信号极大地放大，可实现使酶促反应速度在Vmax的1%--99%范围内变化的调节，这是变构酶无法实现的。例如，一个磷酸化酶激酶分子可以催化几千个低活性的磷酸化酶b转变为高活性的磷酸化酶a，能极大地加快糖原的分解速度。实际上，从肾上腺素（化学信号）到糖原分解是一连串的放大作用，称为酶的级联放大作用。 2．共价调节酶的两种类型 共价调节酶有两种不同的类型。 第一种类型的共价调节酶，通过接受ATP提供的磷酸基磷酸化或脱下磷酸基而进行共价修饰，如磷酸化酶。 第二种类型的共价调节酶，通过接受ATP提供的腺苷酰基或脱下腺苷酰基而进行共价修饰，如大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶： +腺苷酰基 高活性的谷氨酰胺合成酶酶 低活性的谷氨酰胺合成酶酶 -腺苷酰基 谷氨酰胺合成酶有12个亚基，腺苷酰基从ATP转移到每一个亚基的专一性酪氨酸残基上，产生低活性的谷氨酰胺合成酶。相反，当低活性的谷氨酰胺合成酶水解除去腺苷酰基后，又转变为高活性的谷氨酰胺合成酶。 共价修饰调节的意义 前面我们讲过，调节酶是变构酶，只需要调节物浓度发生3倍量的变化，就可以实现酶促反应速度在Vmax的10%--90%范围内的变化，所以可以灵敏的调节新陈代谢。但在有些情况下，动物体需要更迅速、更灵敏地调节代谢途径的速度，例如动物体需要酶促反应速度在Vmax的1%--99%范围内发生变化，此时，调节酶即使是变构酶，也不能满足需要，因而需要有灵敏的放大调节机制。 共价修饰调节的意义就在于，对调节物的调节效应具有放大作用。只要催化酶型互变的两个酶（如糖原磷酸化酶（即调节酶）系统中的磷酸化酶激酶和磷酸化酶磷酸酶-即其它影响调节酶的酶）中的任何一个占据优势，当其催化的反应达到平衡时，则可以使99%的途径酶关键（如糖原磷酸化酶）转变为高活性型（如磷酸化酶a）或低活性型（如磷酸化酶b），从而实现酶促反应速度在Vmax的1%--99%范围内的变化。据计算，只要调节物的浓度增高或降低20%左右时，即可实现催化酶型互变酶的优势转换，不过此时优势酶的优势并不是很大的，因而优势酶催化的反应达到平衡时所需要的时间也可能较长，这就是共价修饰调节的的放大机制受到一定限制。但假如说，象变构调节一样，使调节物的浓度发生3倍量的变化，则优势酶的优势就十分明显，催化反应达到平衡所需要的时间很短，就可以是途径中的关键酶在Vmax的1%--99%范围内迅速地发生变化。 第三节 酶含量的调节 生物体内除了通过改变已有酶的活性来调节代谢速度的机制之外，还存在着通过改变细胞内酶的含量来调节代谢速度的机制，这类调节机制称为酶含量调节。人们早就发现，随着生理条件的改变，动物可改变其某些酶的含量以进行适应。例如，人们早就知道，消化酶的含量随着食物营养成分的改变而改变，但这种改变比较缓慢。人类较长时间不吃脂肪，消化道中脂肪酶的含量就会减少，此时，若吃入大量的脂肪，就会因为脂肪酶的含量不会立即增多而发生消化不良。然而对于动物体内酶含量调控的机制，只是在近年来才开始有所了解。原则上说，酶含量的调节包括酶合成速度的调控和酶降解速度的调控两个方面，因为合成和/或降解速度的改变都可改变酶的含量。酶合成速度的调节实质上是蛋白质合成速度的调控，其调控机制也就是基因表达的调控机制。 从蛋白质的合成过程可以推知，酶合成速度的调控可在其合成过程中的每一个环节上进行，目前一般将其分为转录水平的调控和翻译水平的调控。所谓转录水平的调控是指为某一酶编码的结构基因是转录还是不转录，如果转录，则转录的速度是快还是慢的问题。许多事实证明，动物的基因有的转录，有的就不转录；有的转录的快，有的转录的慢，这是控制动物种的特点、生长发育以及适应环境的很重要的方式。动物体DNA中所含基因的数目是十分庞大的，但只有一小部分被表达，其余绝大部分则在动物的一生中根本就不转录。在被转录的基因中，有的无论什么时候在任何细胞中都转录，有的则依时间、地点、条件为转移。早在三十年代人们即知道，细胞中有些酶，例如糖酵解和三羧酸循环酶类，是无论在什么条件下都以一定速度合成的，这些酶称为固有酶或者组成酶，而另一些酶则不同，它们平时产量极微，但当细胞在具有该酶底物存在的环境中生存时，该酶的合成量才显著增加，这些酶称为适应酶或可透导酶。这些酶合成多少的主要原因之一，就是取决于其基因转录的快慢。这是营养条件不同影响基因转录的例子，后来逐步发现，除了营养条件外，还有许多其他影响基因转录的客观因素。所谓翻译水平的调控是指已有mRNA是否翻译，以及对翻译速度的调控。目前对翻译水平的调控了解的还太少，仅发现了一些事实，还不能对其调控机制作出详细地解释。 一、酶蛋白合成的诱导作用与阻遏作用 酶的底物或产物以及激素或药物都可影响酶的合成。一般将增加酶合成量的化合物称为诱导剂；将减少酶合成量的化合物称为阻遏剂。诱导剂增加酶合成量的作用称为诱导作用；阻遏剂减少酶合成量的作用称为阻遏作用。诱导剂和阻遏剂可在酶蛋白生物合成的转录和翻译过程中起作用，而以影响转录较为常见。目前认为，细胞中存在着两类与酶合成调节有关的调节蛋白：阻遏蛋白和激活蛋白。阻遏蛋白与DNA结合后，使转录处在关闭状态。阻遏蛋白分有活性型和无活性型两种形式，前者可与DNA分子结合，后者则不能与DNA分子结合。诱导剂（如底物等）与有活性的阻遏蛋白结合后，可使其转变为无活性形式，从而开启基因的转录；阻遏剂（如产物）与无活性的阻遏蛋白结合后，可使其转变为有活性形式，从而关闭基因的转录。激活蛋白与DNA结合后，使转录处在开启状态。激活蛋白也分为有活性型和无活性型两种形式。前者可与DNA分子结合，后者则不能与DNA分子结合。诱导剂与无活性的激活蛋白结合后，可使其转变为有活性形式，从而开启基因的转录；阻遏剂与有活性的激活蛋白结合后，可使其转变为无活性形式，从而关闭基因的转录。 由于这种调节作用要通过一系列蛋白质生物合成的环节，故调节效应出现较慢，但酶一旦被诱导合成，即使去除诱导剂，酶仍能保持活性，直至酶蛋白被降解，因此调节效应持续的时间较长。 1．底物对酶合成的诱导作用 受酶催化的底物可以诱导酶的合成，这种现象在生物界中普遍存在。高等动物由于有激素的调节，这种底物诱导作用不如微生物那么重要，但某些代谢途径中的关键酶也受到底物的诱导调节。例如，当饲料中的酪蛋白从8%增加到70%时，可使鼠肝精氨酸酶量增加2--3倍。将精氨酸加入到Hela细胞的培养基中，可使精氨酸酶的合成增快3--5倍。又如，在食物吸收后，血中很多氨基酸的浓度增加，氨基酸的增加又可能诱导氨基酸分解酶系中催化起始反应的酶，如色氨酸吡咯酶、苏氨酸脱水酶、酪氨酸转氨酶和鸟氨酸转氨酶等。这对维持体内游离氨基酸浓度的相对恒定和促进氨基酸成糖均有一定的生理意义。 2．产物对酶合成的阻遏作用 代谢途径的终产物不但能抑制途径关键酶的活性，而且还可以阻遏这些酶的合成。例如，β-羟-β-甲基戊二酸单酰CoA还原酶（HMG--CoA还原酶）是胆固醇生物合成途径中的关键酶，它的生物合成受到胆固醇的反馈阻遏，所以当细胞内胆固醇的含量升高时，就会通过抑制HMG--CoA还原酶的生物合成来降低细胞内胆固醇的合成速度，以维持胆固醇含量的相对稳定。又如，δ-氨基-γ-酮戊二酸合成酶（ALA合成酶）是血红素合成途径的关键酶，它的生物合成受途径终产物血红素的反馈阻遏。有人认为，这是由于血红素可以和细胞内的某些蛋白质结合为血红素蛋白质，该复合物对ALA合成酶的模板mRNA有阻遏作用，使其在核糖体上不能翻译出ALA合成酶，从而减少了血红素的合成。 3．药物对酶合成的诱导作用 很多药物和毒物可促进肝细胞微粒体上混合功能氧化酶或其他一些药物代谢酶的合成，从而促进药物和毒物的氧化失活。这实际上也属于底物对酶合成的诱导作用，这对防止药物和毒物的积聚中毒具有重要意义，但也因之而导致耐药现象。例如，长期服用苯巴比妥催眠的人，会因诱导生成混合功能氧化酶而使苯巴比妥逐渐失效。氨甲酰喋呤治疗癌症时也可因诱导叶酸还原酶的合成而使原来剂量的氨甲酰喋呤不足以抑制此酶而失效。 二、激素对酶含量的调节作用 激素是高等动物体内影响酶合成最重要的调节因素。甾醇类激是普遍通过影响蛋白质的生物合成来发挥生理效应的。例如，糖皮质素能诱导一些氨基酸分解代谢起始反应的酶和糖异生作用的关键酶。有些含氮类激素也能通过影响蛋白质的生物合成来发挥生理作用，如胰岛素则能诱导糖酵解和脂肪酸合成途径中关键酶的合成。 影响酶或其它蛋白质生物合成的激素进入细胞内，与胞内的特异性受体结合成激素--受体复合物，该复合物再转移到细胞核中，在转移过程中发生变构作用，转变为有活性的激素--受体复合物，该活性复合物作用于染色质，诱导酶或其它蛋白质的生物合成。核内的活性复合物发挥生理效应的第一步是与染色体上的接受位点（非组蛋白）发生特异性结合。非组蛋白是特异性很高的酸性蛋白质，种类很多，在每一种细胞核内可多到500种以上。它们在不同组织和不同动物体内有很大的特异性。现在已有很多实验提示：它们与基因活动的调控有密切的关系。有人认为，活性复合物与染色体上的非组蛋白结合后，能使该部位消除阻抑状态，促进该部位的DNA片段（基因）进行转录，合成一些关键性mRNA，同时进行rRNA和tRNA的合成，再通过翻译过程合成一些特殊的蛋白质，这些蛋白质被称为诱导蛋白。最后由诱导蛋白发挥调节作用。不同激素产生的诱导蛋白的种类和功能都不相同。例如，雌二醇--受体复合物产生的诱导蛋白能活化RNA聚合酶，促使细胞核中各种RNA（mRNA、rRNA、tRNA）的合成，进而加速多种蛋白质的合成，导致子宫肥大，代谢增强。雌二醇—受体复合物对染色体的作用过程可概括为： 染色体去阻抑→合成特殊的mRNA→合成诱导蛋白→RNA聚合酶活性增强→各种RNA合成加速→多种蛋白质合成加速→产生各种生理效应。 由此可见，雌二醇是以多阶段方式逐步促进RNA和蛋白质合成来扩大它的生理效应的。目前，对其它甾醇类激素和甲状腺素等激素诱导蛋白质（酶）生物合成的机制还了解得较少，但它们都有增强细胞内RNA聚合酶活性和促进RNA合成的作用。所以，通过mRNA合成诱导蛋白质，再扩大生理效应，这可能是这类激素发挥作用的普遍规律。 酶降解速度的调节 改变酶分子的降解速度，也是调节细胞内酶含量的途径之一。例如，饥饿时精氨酸酶的含量增加，这主要是因为酶蛋白的降解速度减慢所致。而饥饿使乙酰CoA羧化酶含量降低，这除了酶蛋白的生物合成减少之外，还与酶蛋白的降解速度加快的关。但目前人们对酶降解速度调节的机制还知道得很少，这是因为对细胞内蛋白质降解机制本身就了解的很少。不过人们已经提出了两种可能的调控机制。第一种机制认为，酶分子本身可能具有多种构型，其中有些比较稳定，有些则不稳定。调节物通过与酶作用而改变其构型，从而改变酶的稳定性，使酶的降解速度发生改变。第二种机制认为，调节物可改变酶降解体系的活性，即通过对酶降解体系中酶类（如胞内的蛋白水解酶等）的活化或抑制，在细胞内位置的转移等作用，以改变酶降解体系的活性，从而调控酶的降解速度。不过这些都是设想，还没有找到真正的例证。 第四节 整体调节 高等动物是一个复杂的多细胞体系，每个细胞都被组织在高度分化了的组织和器官之中，各自执行着不同的生理功能，共同表现出动物的整个生命活动。这些不同组织的细胞既有分工，更需协调，才能使整个动物体的生命活动正常进行。事实上，动物体内的所有细胞都是互相依存和互相制约的。一种组织细胞的代谢发生了变化，必然影响另外一些组织细胞的代谢发生相应的变化。而且当内外环境发生变化时，常常是许多组织细胞的代谢发生改变以进行适应。机体的生理活动和内外环境的变化是多种多样的，要想使机体所有组织的细胞代谢随着这些变化做出准确而灵敏的反应，就必须把所有的细胞都高度组织起来，这种组织方式就是机体的整体调节。 那么动物体是怎样进行整体调节的呢？其中最简单也是最基本的方式就是通过某些代谢中间物浓度的改变在细胞间传递信息而实现的。例如，当肌肉活动增强消耗大量葡萄糖而使血糖浓度降低时，低血糖可使脂肪组织中的脂肪动员加强，于是血浆中游离脂肪酸的浓度升高。血浆中游离脂肪酸浓度升高后，一方面进入肌肉组织的量增加，促进了肌肉组织中脂肪酸的氧化分解；另一方面进入肝脏的脂肪酸量也增多，于是产生的酮体量增多，血浆中酮体浓度升高。血中酮体的浓度升高后，既可为肌肉组织所利用，也可为大脑组织所利用。由于此时肌肉和大脑等组织可利用脂肪酸和酮体氧化供能，从而节约了糖，同时酮体和脂肪酸的氧化产物又有抑制糖酵解的作用，因而使糖的消耗量降低，保证了在持久的肌肉活动中不致缺乏糖。从这个例子可以看出，葡萄糖、脂肪酸和酮体就是在细胞间传递信息的代谢中间产物，由它们把肌肉、脂肪组织和肝脏等组织的代谢活动联系起来，以保证肌肉持久活动的进行。 通过中间产物传递信息的机制虽然是整体调节的基础，并且简单可靠，然而单靠这种机制是远远不够的。因为：①仍以上述例子而言，单靠低血糖来动员脂肪酸常常是不能满足要求的。首先，在需要大量动员脂肪酸时，血糖浓度要降得很低才行，但血糖浓度是不能大幅度降低的，因为大脑等组织在任何条件下都要消耗糖，因而血糖浓度的降低一般不能超过其正常值的30%。其次，在许多情况下（如应激时），要求在血糖浓度并不降低（甚至升高）的同时动员脂肪酸，这是单靠中间产物作为信号物质所不能实现的。②许多内外环境的变化不能以代谢中间产物作为信号。例如，惊恐、寒冷等刺激是不能改变某些中间产物浓度的，因而也就不能靠它们来传递信息以进行代谢调节了。因而为了适应内外环境的变化，在高等动物体内出现了神经和激素的整体调节代谢的体系。激素的种类很多，它们是由特异分化的细胞产生并分泌的调控代谢的化学信号。激素有强大的、多种多样的调控代谢的作用，它们的分泌则受到神经以及其它因素的调控。现在认为，许多外环境以及内环境的变化，首先作用于中枢神经系统，中枢神经细胞受到刺激后，它们通过电的传导和神经递素，或者直接调控代谢，或者促进和/或抑制某些激素的释放而间接调控代谢。另外，有些内环境的变化也直接促进或抑制某种激素的分泌以调控代谢。这样，在神经、激素的调控下，使机体成为一个整体，随着内外环境的变化，随时调控各个组织器官的代谢，使之协调，以适应环境的变化。下面我们以饥饿和应激为例来说明这两种实际情况下的整体调节。 饥饿时的整体调节 由于各种原因，使动物体不能进食，体内的糖得不到补充时，可使动物体内的代谢发生一系列的改变，这些改变都是在激素的影响下产生的。 短期饥饿，如不能进食1--3天后，体内可利用的肝糖原显著减少，血糖降低，引起胰岛素分泌减少和胰高血糖素分泌增加，这两种激素的增减可引起体内一系列的代谢变化。饥饿对血浆中某些激素和燃料浓度的影响见下表。 饥饿对血浆中某些激素和燃料浓度的影响 动物所处状态 胰岛素(微单位/毫升) 胰高血糖素(微微克/毫升) 血糖(mg%) 脂肪酸 乙酰乙酸 β-羟丁酸 甘油 总氨基酸 丙氨酸 丙酮酸      微摩尔/升  吸收后状态 饥饿初期 饥饿后期 15 8 6 100 150 120 80 70 60 600 1000 1200 10 1000 1500 10 4000 6000 60 100 100 4500 4500 3500 300 250 125 60 45 35  1．肌肉组织释放氨基酸的速度加快 激素平衡的改变使骨骼肌的蛋白质分解加快，释放出氨基酸。释放出的氨基酸大部分转变为丙氨酸和谷氨酰胺，然后进入血液循环，成为糖异生作用的原料或者成为燃料。 2．糖异生作用增强 胰岛素对糖异生作用具有抑制作用，饥饿时胰岛素分泌减少，大大减弱了这一作用。同时胰高血糖素可以促进以氨基酸为原料的糖异生作用，胰高血糖素分泌量的增加，大大加快了肝脏摄取丙氨酸，并以丙酮酸异生为糖的速度。所以在饥饿时，氨基酸（特别是丙氨酸）的糖异生作用明显增强，虽然肌肉组织释放出的丙氨酸增多，但血液中的丙氨酸浓度反而降低（见上表）。同时，肌肉组织释放出的谷氨酰胺在无酸中毒的情况下，主要被肠粘膜细胞摄取，并且也转变为丙氨酸，由门静脉进入肝脏，成为葡萄糖的另一重要来源。肝脏是饥饿初期糖异生作用的主要场所，约占体内糖异生总量的80%，小部分（约20%）则在肾皮质中进行。 3．脂肪动员加强和酮体生成增多 胰岛素促进脂肪组织的“酯化作用”，而抑制“酯解作用”。胰高血糖素则促进酯解作用。在饥饿时，二者分泌量的变化，大大促进了脂肪组织中脂肪的动员，使血浆中甘油和脂肪酸浓度升高（见上表）。甘油是糖异生的原料，可异生为糖。脂肪酸不但成为动物体的能量来源（包括为糖异生作用提供能量），而且能促进氨基酸、丙酮酸和乳酸的糖异生作用。例如，脂肪酸的代谢中间物----乙酰CoA可激活与糖异生有关的丙酮酸羧化酶。 从脂肪组织中分解释放出的大量脂肪酸当中，约有1/4可在肝脏中转变为酮体。所以饥饿时血浆中的酮体浓度可高达吸收后状态的数百倍（见上表）。此时，脂肪酸和酮体成为心肌、肾皮质和骨骼肌的重要燃料。一部分酮体也可被大脑利用。 4．组织对葡萄糖的利用降低 心肌、骨骼肌、肾皮质等组织摄取和利用脂肪酸和酮体的量增加，可减少这些组织对葡萄糖的摄取和利用，这主要是由于：①长链脂肪酸抑制这些组织中葡萄糖的载体转运；②脂肪酸β--氧化和酮体氧化时生成的乙酰CoA可和草酰乙酸缩合为柠檬酸，后者是糖酵解途径的关键酶----磷酸果糖激酶的强烈抑制剂；③乙酰CoA可抑制丙酮酸脱氢酶，阻碍丙酮酸的氧化。这些机理不但使组织中葡萄糖的利用降低，其中②③还和促进糖异生作用有关。 同样，饥饿时大脑氧化酮体生成的乙酰CoA，也可使大脑对葡萄糖利用比平时有所减少，但在饥饿初期，大脑仍以葡萄糖为主要能源。 因糖异生作用增强，加上一些重要组织对糖的利用减少，故在饥饿初期血糖浓度改变较小。血糖浓度的恒定不但能保证中枢神经系统，特别是大脑的能量供应，而且对一些主要利用糖酵解供能的组织也有重要的意义，这些组织产生的乳酸又可回到肝脏和肾皮质中重新异生为葡萄糖。 总之，饥饿时的能量来源是储存的脂肪和蛋白质，其中脂肪约占能量来源的85%以上。此时若给动物体输入葡萄糖，不但可减少酮体的生成，降低酸中毒的发生率，而且可防止蛋白质的消耗。每输入100克葡萄糖大约可节约50克蛋白质，这对不能进食的动物体尤为重要。 长期饥饿，体内的代谢将发生进一步的变化，此时下列几方面与短期饥饿不同：①脂肪的动员进一步加速，在肝脏中大量生成酮体，脑组织利用酮体的比例增加，甚至超过葡萄糖，可占总氧耗氧的60%，这对减少糖的利用、维持血糖、以及减少氨基酸的糖异生作用从而减少体蛋白的分解都具有一定的意义。②肌肉中以脂肪酸代替酮体为燃料，以保证酮体尤先供应脑组织。③血中酮体增多还可直接作用于肌肉，减少肌肉蛋白的分解，此时肌肉释放的氨基酸减少，而甘油和乳酸则成为肝脏中糖异生作用的主要原料。④肾脏的糖异生作用明显增强，几乎和肝脏相等。⑤肌肉释放出的谷氨酰胺进入肠粘膜细胞的量减少，而被肾脏的摄取增多，在肾脏中通过糖异生作用异生为葡萄糖。同时，谷氨酰胺脱下的酰胺氮和氨基氮，可以以氨的形式排入肾小管管腔，从而有利于促进体内H+排出，改善酮体症引起的酸中毒。⑥因为肌肉蛋白分解减少，氮的负平衡状况有所改善，此时尿中的尿素含量减少，而尿氨含量增加。 应激 应激是指作用于机体的一些异常刺激，诸如创伤、剧痛、冷冻、缺氧、中毒、感染以及强烈的情绪激动等引起机体的“紧张状态”。应激伴有一系列神经和体液的变化，包括交感神经兴奋、肾上腺髓质和皮质激素分泌增加，胰高血糖素和生长素水平升高，同时还常有胰岛素分泌减少。虽然不同原因引起的应激状态在代谢的改变上不尽相同，但一般都具有下列特点。 1．血糖升高 交感神经兴奋引起的去甲肾上腺素、肾上腺素和胰高血糖素的增加都可通过激素的作用原理作用于肝脏的糖原磷酸化酶，促进肝糖原分解；同时肾上腺皮质激素和胰高血糖素等又可使体内的糖异生作用加速；加上糖皮质激素和生长素使周围组织对糖的利用降低。这些因素都可引起血糖浓度升高，而与上述激素相拮抗的胰岛素分泌减少，又使血糖水平进一步升高。高血糖在休克时特别明显，并与休克的严重程度有一定的一致性。但在严重感染或中毒时，由于影响了肝功能，可因肝脏的糖异生能力降低，反而出现低血糖。 2．脂肪动员加快 胰岛素的分泌减少和生长素、糖皮质激素分泌增加，可促进脂肪动员，血浆中的游离脂肪酸浓度升高，成为必肌、骨骼肌等组织主要的能量来源，并且因组织对脂肪酸的利用增强，使糖的氧化利用进一步降低。部分脂肪酸可在肝脏中生成酮体，所以血浆中酮体浓度也有不同程度的升高。 3．蛋白质分解加强 肌肉组织中蛋白质的分解加强，释放出的丙氨酸等氨基酸的量增加，为肝脏中糖异生作用提供原料；同时尿素的生成增加，使机体出现氮的负平衡状态，这和饥饿时极为相似。 因为体内的脂肪和蛋白质分解加快，引起消瘦、无力等现象。例如，在人体大手术后1--2天，体内脂肪的消耗量可达每天200克以上，比饥饿时更多。肌肉蛋白质和血浆清蛋白的分解也增加，特别是组织损伤后的修复期更为明显，这是因为创口修复所需要的氨基酸也是来自这些蛋白质的分解。