第十一章 抗生素类药物的分析 [教学目的] 掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。 掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。 掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算。 熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。 五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。 [本章分配学时数] 2学时 [教学环节与教学内容] [复习引入] 2分钟 在上节课，我们进行了甾体激素类药物的分析，要求同学们掌握甾体激素类药物的结构特点与分析方法之间的关系、鉴别原理与方法、含量测定原理与方法以及杂质检查的方法。那么，这节课我们就要对抗生素类药物进行分析，经过本章的学习后，要求同学们不仅要掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系，掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法，掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算，还要熟悉抗生素类药物杂质检查的方法，了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。 [教授新课] 概述 抗生素药物的特点 抗生素（antibiotics）是指“在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称”。主要由微生物发酵、经化学纯化、精制和化学修饰等过程，最后制成适当试剂。与化学合成药物相比，其结构、组成更复杂，表现为： 化学纯度较低 三多： 同系物多：庆大霉素含有四个主要组分； 异构体多：半合成β-内酰胺抗生素均存在光学异构体； 降解物多：四环素类存在脱水、差向异构体。 活性组分易发生变异 微生物菌株的变化、发酵条件改变等均可导致产品质量发生变化，如组分的组成或比例的改变。 稳定性差 抗生素分子结构中通常含有活泼基团，而这些基团往往是抗生素的活性中心，如青霉素、头孢菌素类结构中的β-内酰胺环，链霉素结构中的醛基等均具有稳定性差的特点。 抗生素药物的质量分析 鉴别试验（理化方法） 官能团的显色反应 β-内酰胺环的羟肟酸铁反应、链霉素的麦呀酚反应、坂口反应。对于抗生素盐类，通常鉴别酸根或金属离子或有机碱。 光谱法（红外光谱或紫外吸收光谱） 抗生素的红外光谱分析时需注意，由于抗生素存在多晶现象，有时对照品与供试品图谱或对照图谱不一致，最好用相同溶剂同时重结晶供试品和对照品，使处于相同晶型情况下再进行测定，若多晶效应是由于研磨和压片过程中的晶相转变所致，则应采用溶液法试验。 色谱法 TLC和HPLC法，采用标准品对照法。 生物学法 检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与已知含量的对照品对照后进行鉴别。 检查 影响产品稳定性的指标 结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等。 控制有机和无机杂质的指标 溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等。 与临床安全性密切相关的指标 异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、无菌等。 其它指标 对于多组分抗生素还要进行组分分析等。此外，有些抗生素还规定“悬浮时间与抽针试验”、“吸碘物质”、“聚合物”、“杂质吸收度”等。 含量测定或效价测定 微生物检定法 微生物检定法是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生物效价的一种方法。该法的设计是根据量反应平行线原理，在实验所用的剂量范围内，对数剂量和反应呈直线关系，供试品和标准品的直线应平行。测定方法可分为稀释法、比浊法和管碟琼脂扩散法，后两种为抗生素微生物检定的国际通用方法。中国药典采用管碟琼脂扩散法，USP采用后两种方法。 抗生物管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑制圈。通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。 理化方法（主要是HPLC法） 是根据抗生素的分子结构特特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，并具有较高的专属性。 不足： 化学方法一定要运用其化学结构上官能团的特殊化学反应，对含有具同样官能团杂质的供试品就不适用，或需采取适当方法加以校正。 当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。 抗生素活性表示方法 抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用单位（u）或微克（ug）表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。一种抗生素具有一个效价标准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算。 抗生素的分类 1．β-内酰胺类：青霉素：青霉素钾（钠）、阿莫西林、氨苄西林等 头孢菌素类：头孢他啶、头孢拉啶等 2．氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、萘替米星、卡那霉素等 3．四环素类：四环素、金霉素、土霉素等 4．大环内脂类：红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等 5．多烯大环类：制霉菌素、两性霉素B等 6．多肽类：多黏菌素、放线菌素等 7．苯烃胺类：氯霉素等。 8.蒽环类：阿霉素、紫红霉素等 9．其它抗生素（凡不属于上述类型的抗生素）均归于其它类。 上诉分类远远不能包括所有抗生素，且某些抗生素可同时划分为几个类型，因此此种分类仅仅是将常用的重要的抗生素列入几大类。 β-内酰胺类抗生素 本类抗生素包括青霉素霉和头孢菌素族，它们的分子结构中均含有β-内酰胺环，因此统称为β-内酰胺类抗生素。 化学结构与性质 青霉素和头孢菌素分子中都有一个游离羧基和酰胺侧链。氢化噻唑环或氢化噻唑环与β-内酰胺并合的杂环，分别构成二者的母核。青霉素族分子中的母核称为9-氨基青霉烷酸（6-APA）；头孢菌素族分子中的母核称为7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）。由此可以说，青霉素族的分子结构由侧链RCO-与母核6-APA两部分结合而成；头孢菌素族是由侧链RCO-与母核7-ACA组成。结构见教材P266。 青霉素分子中含有三个手性碳原子（C3、C5、C6），头孢菌素分子中含有两个手性碳原子（C6、C7）。由于酰氨基上R以及R1的不同，构成各种不同的青霉素和头孢菌素。 性质： 酸性与溶解度 分子中的游离羧基具有强酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。青霉素的碱金属盐水溶液遇酸则析出游离基的白色沉淀。 旋光性 青霉素族：三个手性碳原子 头孢菌素族：两个手性碳原子 紫外吸收特性 头孢菌素族母核部分具有O=C-N-C=C结构，R取代基具有苯环等共轭系统，有紫外吸收。 青霉素族分子中的母核部分无共轭系统，但其侧链酰胺基上R取代基若有苯环等共轭系统，则具有紫外吸收特征。 β-内酰胺环的不稳定性 β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。干燥条件下较稳定，室温条件下密封保存可贮存3年以上，但水溶液很不稳定，随pH和温度而有很大变化。 鉴别试验 呈色反应 羟肟酸铁反应 青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。反应式见教材P270。 类似肽键的反应 本类药物具有-CONH-结构，一些取代基有α-氨基酸结构，可显双缩脲和茚三酮反应。 其它呈色反应 侧链含有-C6H5-OH基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应而呈色，如头孢哌酮与重氮苯磺酸试液作用，呈橙黄色。此外，本类药物还可与变色酸－硫酸、硫酸、硝酸、铜盐等试剂反应而呈色。 各种盐的反应 钾、钠离子的火焰反应 青霉素族、头孢菌素族药品中，许多制成钾盐或钠盐供临床使用，因而可利用钾、钠离子的火焰反应进行鉴别。方法见第二章。 重氮化－偶合反应 普鲁卡因青霉素水溶液酸化后，显普鲁卡因芳伯氨基的重氮化－偶合反应，生成红色的偶氮染料沉淀。 青霉素盐的沉淀反应 青霉素钾和青霉素钠，加水溶解后，加稀盐酸2滴，即生成难溶于水的游离基白色沉淀。此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或过量的盐酸（与酰胺基成盐）中溶解。 光谱法 红外吸收光谱（IR） 红外吸收光谱反映了分子的结构特征，各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素的β-内酰胺环羰基的伸缩振动，仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动、羧酸离子的伸缩振动是该类抗生素共有的特征峰。 紫外吸收光谱（UV） 本类药物的紫外光谱鉴别法通常采用： 利用最大吸收波长鉴定法：将供试品配成适当浓度的溶液，直接测定紫外吸收光谱，根据其最大吸收波长或最大吸收波长处的吸收度进行鉴定； 利用水解产物的最大吸收波长鉴定法：将供试品在一定条件下水解，测定水解产物的最大吸收波长。 色谱法 HPLC和TLC被各国药典广泛用于本类药物的鉴别试验。利用比较供试品与对照品主峰的保留时间（tR）或斑点的比移值(Rf)是否一致进行鉴别。HPLC法一般都规定在含量测定项下的色谱图中，供试品和对照品主峰的保留时间应一致。中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物均采用HPLC法进行鉴别。 特殊杂质的检查 聚合物 中国药典对头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟钠等规定了各自聚合物的检查。 有关物质和异构体 β-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体通常采用色谱法检查。 吸收度 药典也常采用测定杂质吸收度方法来控制本类抗生素的杂质含量。 药物 检查项目 检查方法  头孢他啶、头孢曲松钠、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠 聚合物 HPLC法  头孢呋辛酯 有关物质和异构体 HPLC法  头孢氨苄 有关物质 反相TLC法  青霉素钾（钠） 吸收度 紫外分光光度法  链霉素 链霉素B TLC法  硫酸萘替米星 有关物质 TLC法  庆大霉素 庆大霉素C组分 HPLC法  盐酸四环素 有关物质 HPLC法  含量测定 各国收载的青霉素族和头孢菌素族的含量测定除少数几个样品采用抗生素微生物检定法外，大多数采用理化方法，本章主要讨论中国药典收载的方法，如HPLC法、碘量法、电位配位滴定法、可见-紫外分光光度法。 碘量法 利用青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，而其降解产物消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。 反应步骤： 青霉素在碱性条件下水解，该步反应是按化学计量进行的； 水解生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定，同时做空白试验。 反应原理见教材P274。 碘量法是青霉素族的经典测定方法。头孢菌素族和青霉素族一样，也可经碱水解，β-内酰胺开环后与碘产生氧化还原反应，根据消耗的碘量计算含量。 电位配位滴定法 青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物如青霉噻唑酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如Cu2+、Hg2+形成稳定的配位化合物，其可能结构见教材P275。 电位配位滴定法利用这一性质，采用碱水解后用硝酸汞进行滴定，根据消耗的硝酸汞量可以计算青霉素的含量。由于样品中存在的降解杂质也会消耗硝酸汞，为消除干扰，药典采用两次滴定法，即水解后滴定（总量）与直接滴定（降解杂质量），然后分别计算含量，两次测定所得含量差即为样品的含量。 讨论： 水解必须完全。溶液的pH值和反应时间直接影响水解的完全程度，水解如不完全，将使测定结果偏低； 本法空白实验的作法与碘量法类似，即空白实验时也要称取供试品，但不经氢氧化钠水解。空白实验的目的也是为了消除供试品中可能存在的降解产物的干扰； 与碘量法比较，汞量法测定青霉素的主要优点是不需要青霉素标准品作对照，汞盐滴定液用EDTA标定即可。 可见－紫外分光光度法 青霉素类药物的降解产物青霉烯酸具有紫外吸收的性质，在320nm～360nm处有强烈吸收，但此水解产物不稳定，可加入Cu2+或Hg2+等与其生成稳定的配位化合物，再进行紫外分光光度法测定。 硫醇汞盐法 本法的原理为青霉素族抗生素在咪唑的催化下与二氧化汞定量地反应生成相应的青霉烯酸硫醇汞盐，在324nm～345nm波长范围内有最大吸收。需注意的是，如果青霉素侧链上有氨基，必须先将氨基乙酰化后，才能发生上述反应。 酸水解－铜盐法 青霉素族抗生素在弱酸性下水解，与Cu2+作用，形成较稳定的鳌合物，在320nm处有最大吸收。 羟肟酸比色法 青霉素族和头孢菌素族抗生素能与羟胺作用生成羟肟酸衍生物，在稀酸中与高铁离子生成红色配位化合物，可在一定波长下测定吸收度而进行定量。 高效液相色谱法 见教材P277～278。 生物样品中β-内酰胺类抗生素的分析 有色谱法、微生物法、放射免疫法，其中HPLC法因其专属、灵敏、检测手段多、应用广泛等优点是生物样品中抗生素分析的重要方法。 氨基糖苷类抗生素 这类抗生素的化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素（aminoglycosides antibiotics）。主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。 化学结构与性质 化学结构 以链霉素、巴龙霉素、庆大霉素、奈替米星为例，说明此类抗生素的结构特征与理化性质。 链霉素的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷。其中链霉双糖胺是由链霉糖与N-甲基L-葡萄糖胺所组成。链霉胍与链霉双糖胺间的苷键结合较弱，链霉糖与N-甲基L-葡萄糖胺间的苷键结合较牢。结构见教材P279。 巴龙霉素由巴龙胺和巴龙二糖胺结合而成的苷，结构见教材P279。 巴龙霉素有两个立体异构体： 巴龙霉素I：R1＝CH2NH2，R2=H 巴龙霉素II: R1＝H，R2=CH2NH2 庆大霉素是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷。结构见教材P280。 奈替米星的分子结构与庆大霉素C1a基本相同，主要差异在于绛红糖胺环的4,5位是双键。 性质 见教材P280～281。 溶解度与碱性 旋光性 苷的水解与稳定性 紫外吸收光谱 鉴别试验 茚三酮反应 本类抗生素为氨基糖苷结构，具有羟基胺类和α-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合而成蓝紫色化合物。中国药典采用本法鉴别硫酸核糖霉素、硫酸庆大霉素。其反应原理见教材P281。 Molisch试验 具有五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸（或硫酸）作用下脱水生成糠醛（五碳糖）或羟甲基糠醛（六碳糖）。这些产物遇α-萘酚或蒽酮呈色。呈色原理见教材P281～282。 N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应） 本类药物经水解，产生葡萄糖胺衍生物，如链霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素中的D-葡萄糖胺，在碱性溶液中乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物（I），与对二甲基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物（II）。 麦芽酚（Maltol）反应 这是链霉素的特征反应。链霉素在碱性溶液中，链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍生成麦芽酚，麦芽酚与高铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。反应原理见教材P282～283。 坂口（Sakaguchi）反应 这是链霉素水解产物链霉胍的特有反应。本品水溶液加氢氧化钠试液，水解生成链霉胍。链霉胍和8-羟基喹啉（或α-萘酚）分别同次溴酸钠反应，其各自产物再相互作用生成橙红色化合物。反应原理见教材P283。 硫酸盐反应 本类药物多为硫酸盐，因此，各国药典都将硫酸根的鉴定作为鉴别这类抗生素的一个方法。操作方法见第二章。 色谱法 薄层色谱法 中国药典和USP（25）、BP（2000）采用该法对硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龙霉素、链霉素等进行鉴别。多以硅胶为薄层板，氯仿、甲醇、浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸气为显色剂。 高效液相色谱法 BP（2000）采用高效液相色谱法鉴别庆大霉素，根据组分检查项下色谱图，比较供试液和标准品溶液的色谱图，庆大霉素C1、C2、C1a及C2a四组分的保留时间应一致。 光谱法 红外吸收光谱 本类药物还可采用红外光谱法进行鉴别，如硫酸阿米卡星、妥布霉素（中国药典2000），硫酸庆大霉素（USP25）。 紫外吸收光谱 庆大霉素分子中无共轭双键系统，故在紫外区无吸收。BP（2000）利用这一性质对其进行鉴别。 特殊杂质检查及组分分析 链霉素中链霉素B的检查 　链霉素B是指甘露糖链霉素，它是由链霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4〝〞位上的羟基连接一个D-甘露糖组成的。链霉素B本身是发酵中由菌种（球形孢子放线菌）产生的，其生物活性仅为链霉素的20％～25％，能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。因此，如果提取、精制不彻底，链霉素中很可能残存活性较低的链霉素B。仅BP（2000）规定了该项检查，采用的检查方法为薄层色谱法。方法见教材P284～285。 硫酸奈替米星中有关物质检查 现版各国药典已对该类部分抗生素采用色谱法（HPLC或TLC法）进行有关物质的检查。如硫酸奈替米星中有关物质的检查见教材P285。 讨论： 奈替米星是由西梭米星经化学衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能残留西梭米星，需进行控制。 庆大霉素C组分测定 庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效，因此需控制各组分的相对摆分含量。因为庆大霉素无紫外吸收，故需进行衍生化处理后再进行高效液相色谱法测定。 硫酸盐测定 本类抗生素临床应用的主要为硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法测定硫酸盐含量，作为组分分析。 含量测定 本类抗生素的效价测定目前各国药典采用微生物检定法。但其理化分析方法近年来国内外发表的论文很多，有人综述了氨基糖苷类抗生素的分析方法，微生物法、各种免疫法、色谱法是本类抗生素的定量分析的主要方法。其中自动免疫分析法在治疗药物监测中是最适合的方法，而高效液相色谱法的高选择性和灵敏度使其在药动学、代谢物、稳定性等研究中独占鳌头。 四环素类抗生素 这类抗生素分子有四个环构成，故统称为四环素类（tetracyclines）抗生素。 化学结构与性质 鉴别试验 特殊杂质检查 含量测定 抗生素类药物中高分子杂质的检查 抗生物药物中高分子聚合物的定义、来源与分类 高分子杂质的基本结构与特点 高分子杂质的控制方法 [新课小结] [作业] [练习题与答案]