第二章 药物的鉴别试验（不讲） [教学目的] 掌握一般鉴别试验的原理。 熟悉一般鉴别试验的基本方法。 了解一般鉴别试验的条件和灵敏度。 [本章分配学时数] 2学时 [教学环节与教学内容] [复习引入] 2分钟 在上节课里，我们重点介绍了中国药典的基本内容，有凡例、正文、附录、索引4个部分。其中正文部分是主要内容，收载了药品的质量标准。那么从本章开始，我们就将在药品质量标准的基础上主要介绍药物分析的一些基础知识，具体有药物的鉴别试验、药物的杂质检查、药物定量分析与分析方法验证三大部分。首先介绍的是药物的鉴别试验。大纲要求同学们经过本课程的学习后除了必须掌握一般鉴别试验的原理外，还要熟悉一般鉴别试验的基本方法，并了解一般鉴别试验的条件和灵敏度。 [教授新课] 概述 药物的鉴别试验（identification test）是根据药物的分子结构、理化性质，采用化学、物理化学或生物学方法来判断药物的真伪。 是药品质检工作中的首要任务，只有在药物鉴别无误的情况下，进行药物的杂质检查、含量测定等分析才有意义。 所有药典所收载的药品项下的鉴别试验方法，都是用来证实贮藏在有标签容器中的药物是否为其所标示的药物，而不是对未知物进行定性分析。 这些试验方法虽有一定的专属性，但不足以确证其结构，因此不能鉴别未知物。 鉴别试验的项目 鉴别项下规定的试验方法，仅适用于鉴别药物的真伪；对原料药而言，还应结合性状项下的外观和物理常数进行确认。 性状（description） 反映了药物特有的物理性质 外观 指药物的聚集状态、晶型、色泽以及臭、味等性质。 依托红霉素：本品为白色结晶性粉末；无臭，无味或几乎无味。 溶解度 溶解度是药物的一种物理性质，在一定程度上反映了药品的纯度。 药典采用“极易溶解、易溶、溶解、略溶、微溶、极微溶解、几乎不溶或不溶”来描述药品在不同溶剂中的溶解性能。 磺胺嘧啶在乙醇或丙酮中微溶，在水中几乎不溶。 物理常数 物理常数是鉴定药品质量的重要指标。其测定结果不仅对药品具有鉴别意义，也反映了该药品的纯杂程度。 相对密度、馏程、熔点、凝点、比旋度、折光率、黏度、酸值、皂化值、羟值、碘值、吸收系数。 熔点 熔点是指一种物质按规定方法测定，由固体熔化成液体的温度、熔融同时分解的温度或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。 是多数固体有机药物的重要物理常数。 比旋度 在一定波长与温度下，偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度称为比旋度。它是反映手性药物特性及其纯度的主要指标，可用以区别药品、检查纯度或测定制剂的含量。 吸收系数 在給定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度称为吸收系数。 有摩尔吸收系数和百分吸收系数两种 后者是中国药典收载的方法，它是指在一定波长下，溶液浓度为1％（W/V），厚度为1cm时的吸收度，用表示，它是吸光物质的重要物理常数，不仅用于考察原料药的质量，同时可作为该药物制剂应用紫外分光光度法测定含量时的依据。 一般鉴别试验的原理 一般鉴别试验（general identification test）是依据某一类药物的化学结构或理化性质的特征，通过化学反应来鉴别药物的真伪。 无机药物：根据其组成的阴离子和阳离子的特殊反应。 有机药物：大都采用典型的官能团反应。 一般鉴别试验只能证实是某一类药物，而不能证实是哪一种药物。 通常一般鉴别试验仅供确认药物质量标准中单一的化学药物，若为数种化学药物的混合物或有干扰物质存在时，除另有规定外，一般是不适用的。 有机氟化物的鉴别原理 有机氟化物经氧瓶燃烧法破坏，被碱性溶液吸收成为无机氟化物，与茜素氟蓝、硝酸亚铈在pH4.3溶液中形成蓝紫色络合物，反应式如下：  （茜素氟蓝） （蓝紫色） 有机盐的鉴别原理 水杨酸盐： 利用酚羟基在中性或弱酸性条件下，与三氯化铁试液生成配位化合物，在中性时呈红色，弱酸性时呈紫色。  酒石酸盐：  芳香第一胺类的鉴别原理 利用重氮化-偶合反应的原理。  托烷生物碱类的鉴别原理 托烷生物碱类均具有莨菪酸结构，有Vitali反应，显紫色。后马托品具莨菪醇结构而不具莨菪酸结构，无此反应，可进行区别。 无机金属盐的鉴别原理 钠盐、钾盐、钙盐的焰色反映 钠的火焰光谱线有589.0nm、589.6nm，故显黄色。钾的火焰光谱线有766.49nm、769.90nm，故显紫色。钙的火焰光谱线有622nm、554nm、442.67nm与602nm，其中622nm的谱线最强，故显砖红色。 铵盐   无机酸根的鉴别原理 氯化物 鉴别一： 取供试品溶液，加硝酸使成酸性后，加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀；分离，沉淀加氨试液即溶解，再加硝酸，沉淀复生成。如供试品为生物碱或其它有机碱的盐酸盐，须先加氨试液使成碱性，将析出的沉淀滤过除去，取滤液进行试验。 鉴别二： 取供试品少量，置试管中，加等量的二氧化锰，混匀，加硫酸湿润，缓缓加热，即发生氯气，能使湿润的碘化银淀粉试纸显蓝色。 硫酸盐 鉴别一： 取供试品溶液，加氯化钡试液，即生成白色沉淀；分离，沉淀在盐酸或硝酸中均不溶解。 鉴别二： 取供试品溶液，加醋酸铅试液，即生成白色沉淀；分离，沉淀在醋酸铵试液或氢氧化钠试液中溶解。 专属鉴别试验的原理 药物的专属鉴别试验（specific identification test）是证实某一种药物的依据，它是根据每一种药物化学结构的差异及其所引起的物理化学特性不同，选用某些特有的灵敏的定性反应，来鉴别药物的真伪。 例如苯巴比妥中苯环、司可巴比妥中双键、硫喷妥钠中的硫原子，可根据各自的特性采用专属反应进行鉴别。 与一般鉴别试验的区别 一般鉴别试验是以某些类别药物的共同化学结构为依据，根据其相同的物理化学性质进行药物真伪的鉴别，以区别不同类别的药物。 专属鉴别试验，则是在一般鉴别试验的基础上，利用各种药物的化学结构差异，来鉴别药物，以区别同类药物或具有相同化学结构部分的各个药物单体，达到最终确证药物真伪的目的。 鉴别方法 药物的鉴别方法要求专属性强、再现性好、灵敏度高，操作简便、快速等。常用的的鉴别方法有： 化学鉴别法 化学鉴别法必须具有反应迅速、现象明显的特点才有实用价值，至于反应是否完全则不是主要的。其包括测定生成物的熔点，在适当条件下产生颜色、荧光，发生沉淀反应或产生气体。 呈色反应鉴别法 指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下进行反应，生成易于观测的有色产物。常见的反应类型有： 三氯化铁呈色反应 具有此反应的药物，一般都含有酚羟基或水解后产生酚羟基。 异羟肟酸铁反应 具有此反应的药物，一般多为芳酸及其酯类、酰胺类。 茚三酮呈色反应 具有此反应的药物，一般在其化学结构中含有脂肪氨基。 重氮化－偶合显色反应 具有此反应的药物，一般都有芳伯氨基或能产生芳伯氨基。 氧化还原显色反应及其它颜色反应 沉淀生成反应鉴别法 指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下进行反应，生成不同颜色的沉淀，有的具有特殊的沉淀形状。常见的沉淀反应有： 与重金属离子的沉淀反应 在一定条件下，药物和重金属离子反应，生成不同形状的沉淀。 与硫氰化铬铵（雷氏盐）的沉淀反应 这类药物多为生物碱及其盐，具有芳香环的有机碱及其盐。 其它沉淀反应 荧光反应鉴别法 药物本身可在可见光下发射荧光 药物溶液加硫酸使呈酸性后，在可见光下发射荧光 药物和溴反应后，于可见光下发射出荧光 药物和间苯二酚反应后，发射出荧光及药物经其它反应后，发射荧光 气体生成反应鉴别法 大多数的胺（铵）类药物、酰脲类药物以及某些酰铵类药物：可经强碱处理后，加热，产生氨气 化学结构中含硫的药物：可经强酸处理后，加热，产生硫化氢气体 含碘有机药物：经直火加热，可生成紫色碘蒸气；含醋酸酯和乙酰铵类药物：经硫酸水解后，加乙醇可产生醋酸乙酯的香味。 测定生成物的熔点 该法操作繁琐、费时，应用较少。 光谱鉴别法 紫外光谱鉴别法 多数有机药物分子中含有能吸收紫外可见光的基团而显示特征吸收光谱，可作为鉴别的依据，但因吸收光谱较为简单，曲线形状变化不大，用作鉴别的专属性远不如红外光谱。 红外光谱鉴别法 红外光谱法是一种专属性很强、应用较广（固体、液体、气体样品）的鉴别方法。主要用于组分单一、结构明确的原料药，特别适合于用其它方法不易区分的同类药物，如磺胺类、甾体激素类和半合成抗生素类药品。 试样制备方法： 压片法 糊法 膜法 溶液法 色谱鉴别法 利用不同物质在不同色谱条件下，产生各自的特征色谱行为（Rf值或保留时间）进行鉴别试验。采用与对照品（或经确证的已知药品）在相同的条件下进行色谱分离，并进行比较，根据两者保留行为和检测结果是否一致来验证药品的真伪。此法操作较费时，一般在检查或含量测定项下已采用色谱法的情况下，采用此法鉴别。常用的方法有： 薄层色谱鉴别法 在实际工作中，一般采用对照品（或标准品）比较法，要求供试品斑点的Rf值应与对照品斑点一致。 高效液相色谱和气相色谱鉴别法 一般规定按供试品含量测定项下的高效液相色谱条件进行试验。要求供试品和对照品色谱峰的保留时间应一致。含量测定方法为内标法时，可要求供试品溶液和对照品溶液色谱图中药物峰的保留时间与内标物峰的保留时间比值应相同。 纸色谱鉴别法 纸色谱法存在分离效能低、分析时间长等缺点，在药物鉴别试验中逐渐被薄层色谱法或其它色谱法所取代。 生物学法 利用微生物或实验动物进行鉴别的方法。 药物鉴别方法新动向 仪器方法用于药物的鉴别数量大大增加，尤其是红外光谱法和高效液相色谱法。 有人对USP(24)和BP(2000)收载的原料药和制剂的鉴别方法进行了统计，从统计结果看，英美药典采用的仪器鉴别法与化学鉴别法的条目比约是2:1。IR,HPLC,TLC,UV几乎包揽了仪器鉴别方法的全部。在色谱鉴别中，BP应用TLC鉴别的比例较高，而USP则更青睐于HPLC法。 制剂广泛采用IR法鉴别。与原料药相比，制剂一般需采取提取分离后再压片绘制图谱。 鉴别条目简练，选择专属的方法进行鉴别，平均每个品种收载2条左右。 鉴别试验条件 溶液的浓度 在鉴别试验中加入的各种试剂一般是过量的，溶液的浓度主要是指被鉴别药物的浓度。鉴别试验多采用观察沉淀、颜色或测定各种光学参数的变化来判定结果，药物的浓度直接影响上述参数的变化，必须严格规定。 溶液的温度 温度对化学反应的影响很大，一般温度每升高10℃,可使反应速度增加2～4倍。但温度的升高也可使某些生成物分解，导致颜色变浅，甚至观察不到阳性结果。 溶液的酸碱度 许多鉴别反应都需要在一定酸碱度的条件下才能进行。溶液酸碱度的作用，在于能使各反应物有足够的浓度处于反应活化状态，使反应生成物处于稳定和易于观测的状态。 试验时间 有机化合物的化学反应和无机化合物不同，一般反应速度较慢，达到预期试验结果需要较长的时间。这是因为有机化合物是以共价键相结合，化学反应能否进行，依赖于共价键的断裂和新价键形成的难易，这些价键的更替需要一定的反应时间和条件。同时在化学反应过程中，有时存在着许多中间阶段，甚至需加入催化剂才能启动反应。因此，使鉴别反应完成，需要一定时间。 干扰成分的存在 在鉴别试验中，如药物结构中的其它部分或药物制剂中的其它组分也可参加鉴别反应，则会干扰鉴别试验结果的现象观察，使对结果难以作出正确的判断。这时必须选择专属性更高的鉴别方法或将其分离后再进行试验。 鉴别试验的灵敏度 鉴别试验是以灵敏的专属反应为依据，在合适的条件下进行试验判定工作的。如果鉴别反应的灵敏度越高，则所需要的药物量就越少。 反应灵敏度和空白试验 在一定条件下，能在尽可能稀的溶液中观测出尽可能少量的供试品，反应对这一要求所能满足的程度，即称为反应的灵敏度（sensitivity）。常用最低检出量（minimum detectable quantity，又称检出限量）和最低检出浓度（minimum detectable concentration，又称界限浓度）表示。 最低检出量（以m表示），就是应用某一反应，在一定的条件下，能够观测出试验结果的供试品的最小量，其单位通常用微克（μg）表示。如钠离子的焰色反应，最低检出量为0.1ng，即表示少于这个量就不能被检测出。最低检出量越小，反应越灵敏。 但是，仅用最低检出量不能充分表示反应的灵敏度，因为它没有说明这些物质是在多大体积内，即没有说明溶液的浓度。将同样量药物溶解在不同量的溶剂中，试验的结果显然是不同的。故表示某一反应的灵敏度时还需考虑被测物的浓度。最低检出浓度就是应用某一反应，在一定条件下，能够观测出供试品的最低浓度，通常以1:V（或1:G）表示，其中V（或G）表示含有1g重某供试品的溶液的毫升（或克）数。 最低检出量和最低检出浓度之间的关系可以用下式表示： m=v/V×106 式中v为鉴别试验时，所需供试品溶液的最小体积（ml） 在选用灵敏度很高的反应时，必须采用高纯度的试剂和非常洁净的器皿，才能保证鉴别试验结果的可靠性。为了消除试剂和器皿可能带来的影响，应同时进行空白试验（blank test）以供对照。空白试验是指在与供试品鉴别试验完全相同的条件下，除不加供试品外，其它试剂均同样加入而进行的试验。 反应的灵敏度与分析方法、观察方式、反应条件、人的观察能力等因素有关。 提高反应灵敏度的方法 加入与水互不相溶的有机溶剂提取浓集 在鉴别试验中，如生成物具有颜色并颜色很浅时，可利用加入少量与水互不相溶的有机溶剂，浓集有色生成物，使其在有机溶剂中颜色变深，易于观测。 改变观测方法 如将目视观测溶液的颜色，改为可见分光光度法 将观测生成沉淀改为比浊度法 [新课小结] 一般鉴别试验的原理（难点） 有机氟化物的鉴别原理 有机盐的鉴别原理（水杨酸盐、酒石酸盐） 芳香第一胺类的鉴别原理 托烷生物碱类的鉴别原理 无机金属盐的鉴别原理 钠盐、钾盐、钙盐的焰色反映；铵盐 无机酸根的鉴别原理 氯化物、硫酸盐 一般鉴别试验的基本方法（重点） 化学鉴别法 呈色反应鉴别法、沉淀生成反应鉴别法、荧光反应鉴别法、气体生成反应鉴别法、测定生成物的熔点 光谱鉴别法 紫外光谱鉴别法、红外光谱鉴别法 色谱鉴别法 薄层色谱鉴别法、高效液相色谱和气相色谱鉴别法、纸色谱鉴别法（逐渐被取代） 生物学法 一般鉴别试验与专属鉴别试验的区别（重点） 概念（重点） 药物的鉴别试验 药物的外观、溶解度、物理常数 熔点、比旋度、吸收系数 一般鉴别试验、专属鉴别试验 反应灵敏度、空白试验、最低检出量、最低检出浓度 鉴别试验的条件（重点） 溶液的浓度、溶液的温度、溶液的酸碱度、试验时间、干扰成分的存在 [作业] 掌握一般鉴别试验的各鉴别原理 熟悉一般鉴别试验的基本方法 掌握本章中出现的概念、一般鉴别试验与专属鉴别试验的区别以及鉴别试验的条件 [练习题与答案] 药物的鉴别包括哪些项目？ 性状 外观、溶解度、物理常数（熔点、比旋度、吸收系数） 一般鉴别试验 专属鉴别试验 药物的鉴别可采用哪些方法？ 化学鉴别法 呈色反应鉴别法、沉淀生成反应鉴别法、荧光反应鉴别法、气体生成反应鉴别法、测定生成物的熔点 光谱鉴别法 紫外光谱鉴别法、红外光谱鉴别法 色谱鉴别法 薄层色谱鉴别法、高效液相色谱和气相色谱鉴别法、纸色谱鉴别法（逐渐被取代） 生物学法 为何要做灵敏度试验和空白试验？ 在选用灵敏度很高的反应时，必须采用高纯度的试剂和非常洁净的器皿，才能保证鉴别试验结果的可靠性。为了消除试剂和器皿可能带来的影响，应同时进行空白试验（blank test）以供对照。