微生物生理学
Microbial Physiology
教学安排
1,序言, 教学安排与要求
微生物细胞的结构与功能
2,微生物的营养
3,异养微生物的生物氧化
4,自养微生物的生物氧化
5,生物合成与能量代谢
6,微生物的固氮作用
7,微生物代谢调控的类型及机制
8,微生物代谢调控与现代工业生产
9,微生物代谢调控的发展及其次级代谢产物
教学安排
10,抗生素与质粒
11,次级代谢产物生物合成的调控
微生物的生理代谢与自由基
12,微生物的生长速率及其控制
13,细菌程序化死亡
14,微生物在各种环境中的生长繁殖, 微生物
芽孢与孢子的形成
15,链霉菌的分化
16,粘菌的分化调节机制
17,真菌分生孢子的分化过程与意义
绪 言
一, 微生物生理学研究对象与范围
1,对象, 各类微生物
微生物生理学是一门研究在实验室和自然条件下微生 物
生理活动特点与规律学科,
2,范围,
1)研究微生物细胞的重建方式与一般规律,即研究微生
物的蛋白质,核酸与多糖等生物大分子合成,这些
生物大分子如何组建成新细胞结构以及产生新的 生命
个体的方式、特点与规律
包含营养物质及其吸收、能量的产生与消耗,各个生理
活动的互相调节以及完成各种生理活动的细胞结构与
它的功能等。通过研究逐步 阐明生命起源 这个基本理论
问题;
2)研究微生物与周围环境之间的关系
环境, 适宜、不适宜和有害,
适宜环境, 微生物能以最大的比生长速率进行生长,可以
在较短的时间里获得更多的菌体物质与代谢产物;
不适宜环境, 微生物生长受到抑制或者通过生理代谢、
细胞结构发生相应的变化来对抗不良环境的作用,使
生命能维持与延续下去;
有害环境, 微生物通常是丧失生活能力,少数通过产生抗
性而生存下来。
因此,可以研究微生物生长、繁殖、形态发生与细胞分化的特点
与规律,微生物能在极端环境条件下生存下来的机理,从而可以
有效地对微生物进行控制,同时从另一个角度生命的本质;
3)研究微生物生理活动与人类的关系
微生物的生理活动与人类的关系极为密切,几乎涉及人们日
常生活的各个方面和国民经济的诸多部门。
表 0-1 微生物发酵生产的产品
发 酵 类 型 发 酵 产 品
食品饮料 各种酒类, 饮料, 酱制品, 醋, 面包等
有机酸 乳酸, 柠檬酸, 延胡索酸, 衣康酸, 葡萄糖酸等
有机溶剂 丙酮, 丁醇等
甘油 甘油
维生素 维生素 B2,维生素 C,维生素 B12等
抗生素 青霉素, 链霉素, 新霉素, 卡那霉素, 杆菌肽等
氨基酸 谷氨酸, 赖氨酸, 色氨酸, 苏氨酸等
核苷酸 肌苷酸, 鸟苷酸, 核苷酸等
多糖 右旋葡萄糖苷等
甾体氧化 可地松, 羟化可地松等
石油发酵 脱腊石油, 脱硫石油
甲烷发酵 甲烷等气体燃料
菌体 酵母菌, 各种杀虫菌, 单细胞蛋白等
菌肥 各种菌肥制剂
发酵饲料 营养丰富的饲料
细菌冶金 贫矿石变成富矿石, 提高矿石的品级等
抗癌药物 紫杉醇, 抗艾滋病 等
微生物生理学的发展
古代, 制造食品、改良土壤以及控制微生物的腐败与致病作用
1840年,库 津( Akutzing) 发现 酒变质 是由一种生物引起的
1857年,巴斯德( Louis Pasteur) 用加热方法杀死培养基中的生物
的方法,认为 发酵过程的本质 是由生物引起的化学过程。
酒变质,实验结果也证明酒变质也是由其他生物引起的;
还用实验证明在含糖培养基上一种生物可以引起 乳酸发酵,
另一种生物可引起 酒精发酵,从而认为“在化学上不同的发
酵是由生理上不同的生物所引起”,它使微生物学的研究进
入了一个新的时期 ——微生物生理学时期 。
1861年,巴斯德又发现 酪酸发酵 可以分为由糖变成乳酸和由乳酸变
成酪酸两个阶段,这两个阶段都由生物完成,并且还分离到了
乳酸菌;巴斯德在研究醋酸发酵与丁酸发酵时,还发现在厌氧
时可生成丁酸,从而把发酵分成 有氧发酵 与 兼性发酵 两种类型,
1897年,巴克纳( Eduar Buchner) 用石英砂与硅藻土研磨酵母菌细
胞,再用这种新鲜的酵母滤液进行发酵,可以 完成糖发酵到乙
醇,这样将发酵过程的研究工作深入到非细胞水平,为酶学发
展打下了基础,
梅兹 ( Maze) 等人,证明污水中的 氨 可通过微生物作用 转变
成硝酸盐 ;
维诺格拉斯基 ( BИИorpaДckИЙ),建立微生物的 自养
概念;
1866年,沃罗宁 (Woronin) 发现 豆科植物 根瘤 中有 细菌 ;
1888年,贝哲林克 ( Beijerinck) 从根瘤中 分离出根瘤细菌 ;
1894年,维诺格拉斯基 分离出能固氮的巴氏梭菌 ;
1901年,贝哲林克又分离出 好氧固氮菌 ;
柯赫 ( Koch) 建立纯培养技术, 病原微生物生理 活动 ;
1931年,凡尼尔 ( Van Niel) 细菌光合作用 的机制;
1929年,弗莱明 ( Fleming) 发现 青霉素,
微生物生理活动的研究
1,生物化学方面
初级代谢的调节, 次级代谢产物合成 途径与
次级代谢的调节, 能量转换的基础;
集中研究一些特殊类型生物的生理活动
纤维素分解菌 产甲烷细菌 石油分解菌
有机农药分解菌 单细胞蛋白产生菌等
人工合成大分子物质的分解菌, 共生菌
寄生菌 单细胞蛋白产生菌等
2,生物大分子结构与功能的研究
微生物的核酸与蛋白质生物大分子的合成
1) 阐明微生物遗传信息传递与表达的方式和规
律;研究膜结构与功能 ;
2) 继续发现与研究新的细胞结构与功能;
3) 研究极端环境条件下微生物抗性与敏感性的
机理及其调节, 从分子水平上阐明生命的
本质 。
3,细胞的重建、形态发生、分化过程与趋向性
1) 重点是研究微生物组建成一个完整的有生物活
性细胞结构过程;
2) 研究微生物形态发生与分化的分子机理;
3) 研究微生物的趋向性(趋化性、趋光性、趋磁
性等)与运动的本质和生命与环境之间的本质
联系等
第一章
微生物细胞的结构与功能
第一节
真核微生物与原核微生物
第二节
细胞表面的附着物
一、丝状结构
? 鞭毛 Flagellum (Flagella)
? 菌毛 Pilus 革兰氏阴性菌
? 伞毛 Fimbria
1.鞭毛
长度一般为 15 ~ 20 μm,
直径 0.01~ 0.02μm
1) 组成
基 体 basal body
钩形鞘 hook
鞭毛丝 filament
a,基体,4个盘状物, 即 4环
L-环, 与 脂多糖层 相联系
P-环, 与 肽聚糖层 联系
S-环, 与 细胞膜表面 相联系,16个亚基,
不运动, 轴封作用
M-环, 与 细胞膜 相联系,16个亚基, 1个质子
进 入细胞转 1/16圈,256个质子 /圈
不同的微生物其鞭毛蛋白质氨基酸组成不同
细菌鞭毛与 真 核微生物鞭毛的比较
细 菌 鞭 毛 真核微生物鞭毛
1,由 3~ 8根平行的蛋白纤维左向 由 9对微管和两根中心微管纤维组成
螺旋排列成中空的丝状体, 无鞘 外有鞘
2,直径为 12 nm,长度为 4-5μm 直径为 200 nm,长度为 200μm
3,具抗原性 无抗原性
4,完全由蛋白质组成 70%蛋白质, 20%脂类, 10%糖
少量核酸
5,不存在半胱氨酸 由普通氨基酸组成
6,制备的鞭毛中不出现 ATP酶活性 制备的鞭毛中有 ATP酶活性
近年的研究表明
cAMP和 cGMP也参与纤毛和鞭毛运动的调控。
细胞外 K + 浓度下降 或 Ca 2+浓度升高 都可使细胞膜发
生 超极化,从而导致细胞内 cAMP浓度上升,鞭毛拍击频
率增加,细胞向前运动。
当 cAMP浓度下降时,细胞膜去极化,细胞向后游动。
2) 鞭毛马达的结构与功能
鞭毛马达,Flagellar motor
大肠杆菌或伤寒沙门氏菌的鞭毛组装和运行需约
50余种 蛋白质中, 只有 5种 与鞭毛的 力矩 产生
密切相关
即 FliG,FliM和 FliN,MotA,MotB (鞭毛马达 )
FliG,FliM,FliN,切换复合体 C环
切换复合体的功能:
a,切换鞭毛运动方向;
CW/COW (clookwisc,CW; counterclock wise,CCW)
b,参与鞭毛组装,构成转子 (rotor)
c,与 (MotA/MotB)( 定子 ) 构成马达 (motor)
3) 引起马达切换的主要因素
a,化学因素, 趋化反应,
胞内代谢物水平胞内 pH等;
b,物理因素, 温度, 外力等;
c,随机或自发因素 。
Na+ 驱动的鞭毛马达 ( 有些细菌, 碱杆菌, 弧菌 )
H+ 驱动 ( 大多数细菌 )
K+ 驱动 (溶原弧菌 )
Li+
驱动速度 Na+>H+
300mM,50mM
Na+,300mM,1,700r/s
H+,50mM,600r/s
对细菌鞭毛驱动马达分子机器的了解
将有助于认识
生物的能量转化
细胞运动
这类生命基本问题
2.菌毛 ( pilus)
大肠杆菌的菌毛两种菌:
F-菌毛 (fertility pilus),I-菌毛 (infective pilus)
F-菌毛, φ8.5nm,长 2.0μm
中空, 易弯曲的丝状体, 是遗传物质的通道
I-菌毛,长 2μm以下, 中空的丝状体, 是噬菌体
感染宿主细胞的受体部位, 亦称感染菌毛,
噬菌体吸附到 I-菌毛后, 通过 I-菌毛的收缩,
使噬菌体与细胞表面接融后再感染宿主细胞 。
3,伞毛 ( fimbria)
是一类更短, 更直的, 类似毛发状的丝状体
结构;数量较菌毛多, 长度较菌毛短, 生理
作用也不同 。
大肠杆菌的伞毛的生理作用
引起细菌的聚集
静止培养:菌膜
氧气不足:伞毛菌生长迅速 ( 较非伞毛菌 )
稳定期:伞毛菌增加, 非伞毛菌下降, 附着到其他
固体表面上, 非伞毛菌则不 。
二、荚膜与粘液层
荚膜
微荚膜:厚 0.2μm以下, 与细菌表面牢固结合;
大荚膜:厚 0.2μm以上, 与细菌表面松驰结合,可制 备 ;
荚膜的作用:
1.抗干燥作用;
2.起贮存物质作用 。 C/N高时产荚膜,
C/N低时利用荚膜
3.保护作用, 不受原生动物或噬菌体的侵害;
4.避免或减少氧向细胞内扩散 ( 对好氧固氮菌 )
粘液层,
组成:多糖 ( 表面多糖, 胞外多糖 ), 多肽
蛋白质, 脂类 。
S-层蛋白的研究
S-层蛋白 (surface-layer protein)
位于细胞外壳最外层的一类表面结构,
生物圈中有 S-层的生物体普遍存在
尤其在古细菌和真细菌中,S-层是最常见的
表面结构之一,对细菌细胞的生存及完整性有
着很重要的作用。
S-层是由蛋白质或糖蛋白亚基组成的单分子晶体点
阵,它们形成有孔的网络结构覆盖在细胞表面。它
们具有独特的结构以及理化性质,还承担了很重要
的生物学功能。
S-层是由蛋白质亚单位组成的单分子晶状结构,其厚度
为 5-20nm
革兰氏阳性 (G+)菌 与 肽聚糖层 相连
革兰氏阴性 (G-)菌 与 外膜 相连
古生菌 直接与 细胞膜 相连
S-层蛋白的组成
一般具有高含量的酸性和疏水性氨基酸,其中疏水性
氨基酸可占 40-60%,S-层蛋白的糖基化现象普遍存在,
含 大量 谷氨酸 (Glu)和天冬氨酸 (Asp)
赖氨酸的含量 较 高,占 10%
极少 有含硫氨基酸
S-层蛋白多为 酸性,等电点在 4-6之间,少数呈 碱性 。
约 20%的氨基酸是以 α-螺旋 形式
约 40%的氨基酸采取 β折叠 形式
无规折叠和 β转角 含量在 5%到 45%之间变化
分子量
不同来源的 S-层蛋白,其分子量差异较大
40-20kDa 440-1645个氨基酸
乳杆菌 440-465个氨基酸残基
含有由 30个氨基酸组成的信号肽
克立次氏体 1612-1645个氨基酸残
含 32个氨基酸残基组成的信号肽
炭疽芽胞杆菌
苏云芽胞杆菌 非常相似
814-862个氨基酸组成
信号肽由 29个氨基酸组成
S-层蛋白的基因 ( 40多个)
近十年,许多不同来源的 S-层基因已被克隆和测序 发现
N末端有限区域内存在一段高度保守的序列
该区域对 S- 层亚单位与细胞壁的锚定致关重要
中部和 C 端部分 (包括自我组装加工必需的结构域和暴露于孔中和
S-层表面上的结构域 )只发现有极低的序列同一性 (约 20%)。
但是不同芽胞杆菌的 S- 层蛋白的整个中部和相应的 C 末端部分
观察到保守的 4- 6 氨基酸的序列以相对恒定的距离出现。
S- 层基因一般有很强的启动子
嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)
S- 层基因启动子的效率是编码乳酸脱氢酶基因启动子的 两 倍
(后者在细菌中被认为是最强的启动子之一 )
表面展示的研究
微生物细胞表面展示 (surface display)
指通过遗传操作的手段将外源大分子定位表达在微生物
细胞的表面,以达到一定的研究和应用目的。
多数情况下,表面展示是以构建融合蛋白的方式实现
的,即 以一定的方式将外源蛋白与菌体的某一表面蛋
白相融合,借助后者的表面识别和定位功能将前者
携带并定位在细胞的表面。
将外源蛋白固定在微生物细胞的表面可以直接用重
组微生物进行后续的操作,免去了产物的提取,纯化
和重新折叠等一系列的操作。
自 80年代兴起以来,表面展示工作取得了许多令人瞩目
的成绩。
表面展示的应用
Bingle等 (2001)
利用无致病性的 G-细菌 — 新月柄杆菌的 S-层蛋白 RsaA
作为载体,在细胞表面成功展示了铜绿假单胞菌的表面
抗原。
另外,还在新月柄杆菌的 S-层蛋白上尝试了多个 融合位
点,结果表明有 11个位点具有表面展示的能力。
六聚组氨酸
由六个组氨酸组成的单位。它最引人注意的功能是能够
有效的吸附一些重金属离子。
通过每个组氨酸残基提供一个电子,与一些二价金属离
子如镍、镉、铜、锌形成配位键,从而在这些金属离子
的周围形成稳定的配位环。
Qiagen公司
利用六聚组氨酸能吸附镍离子的特点,特别开发出了
一个蛋白质纯化系统 —— Ni-NTA。将六聚组氨酸的接
头融合在待纯化蛋白的 C-端,N-端,甚至是一些融合蛋
白的融合头上。
Sousa等利用大肠杆菌的外膜蛋白 LamB将多聚组氨酸肽展
示在了大肠杆菌的表面。
许朝晖利用大肠矸菌的外膜蛋 OmpC展示了多个六聚组氨酸
肽。
Samuelson等报道用葡萄球菌的表面结合蛋白表达多聚组
氨酸肽。
重组细胞吸附镍、镉离子的能力均大 大地提高
第三节 细胞壁
细胞壁的组成
1.由微纤维组成的网状结构物质,固定外形增加硬度
2.填充在网状结构表面的基质成分, 增加坚固性 。
原生质体与球质体的比较
特 点 兰氏阳性 革兰阴性
残存壁物质 不存在 存在
与胞壁有关的特性 完全丧失 不完全丧失
( 硬度, 渗透压, 抗原性, 鞭毛转动 )
间体 挤出原生质体 挤在壁膜之间
停止药物处理细胞壁 不能恢复 可以恢复
一, 藻类的细胞壁
二, 真菌细胞壁
三, 细胞壁的组成
1,肽聚糖 ( peptidoglycen,亦称胞壁质 murein)
主要是阳性菌
2,磷壁质 (teichoic ouitl,磷壁酸 )
革兰氏阳性细胞壁和细胞膜中的含有磷酸基的线性
多聚体, 共价健与肽聚糖连接成一个整体 。
磷壁质分为 两类,甘油型磷壁质
核糖醇磷壁质
3,糖醛酸磷壁质 ( teichurose acid)
4,脂多糖,G-,外膜上, 多糖 -脂类复合物
5,蛋白质:结构蛋白, 载体蛋白, 酶蛋白
6,肽类与其他成分:
嗜高温产水细杆菌 Aquifex pyrophilius
(95℃ 自养生长 ) 具有复杂的被膜
质膜 (4nm),肽聚糖 (20nm)
外膜 (4nm)和表面蛋白 (4nm)
表面蛋白为六角形晶格
革兰氏阴性嗜高温菌
具有类似鞘的外层结构包围着;类似鞘的外层结构由 六角
形排列的外膜蛋白 组成, 其功能尚不清楚, 可能具有 孔蛋
白 (Porin)功能 。
极端嗜盐菌的细胞壁
不是由胞壁酸构成
而是由高度硫酸化的杂多糖形成;
特征
N-乙酰氨基古洛糖醛酸的存在和氨基葡萄糖残基被
N-氨基乙酰 (甘氨酰基 )取代 。 有的由糖蛋白 S层构成 。
产甲烷高温菌的细胞壁
拟 ( 伪 ) 肽聚糖 (pseudopeptidoglyean)
软骨素 (Methanochondroitin)
糖蛋白亚单位构成的表面 (S)层
S层糖蛋白 593个氨基酸
很高数量的异亮氨酸, 天门冬氨酸和半胱氨酸
在它的细胞两端的伪肽聚糖层内还发现数条
通向细胞外的通道,其功能尚不清楚 。
肽聚糖和伪肽聚糖的区别
真细菌 的 肽聚糖 聚糖链
N-乙酰葡萄糖胺 ---N-乙酰胞壁酸 ( β-1,4)
拟肽聚糖
N-乙酰葡萄糖胺 ---NacTalNA ( β-1,3)
( N-乙酰 -L-氨基塔罗糖胺醛酸 )
产甲烷菌
N-乙酰塔罗糖胺醛糖酸 (N-acetyltalosominuronic acid)
只有 L型氨基酸
3个 L-型氨基酸 (Glu-Ala-Lys)组成
没有 N-乙酰胞壁酸
热质体 (Thermoplasma)的细胞包被
腊酶糖 (Glycocalyx)构成的质膜
具有糖 (主要是甘露糖 )含量极为丰富的糖蛋白和糖脂
以增强细胞质膜的强度
泉古生物界 (Crenarchaeota)高温菌的细胞被膜
无胞壁酸, 也没有胞壁外膜
糖蛋白亚单位构成的 S-层,
细胞被膜与生长条件的关系
90℃ 生长的高温神袍菌 (Thermotoga)
肽聚糖
六角形 排列膜蛋白组成的 类似鞘的外层结构
110℃ 生长的 Methanothermus fervidus
在伪肽糖层外还有一层糖蛋白表面层
110℃ 以上温度下生长的高温菌
蛋白表面层 (PS)或糖蛋白表面层 (GPS)
典型的胞壁结构
-β-D-GlcA- (1→ 4)-β-D-NAcMA-(1→ 4)–β-D-GlcA- (1→ 4)-
甲烷菌软骨素
-β-D-GlcA- (1→ 3)-β-D-GalNAc -(1→ 4)–β-D-GalNAc- (1→ 4)-
硫酸软骨素
-β-D-GlcA- (1→ 3)-β-D-GalNAc -(1→ 4)–β-D-GlcA- (1→ 4)-
耐辐射奇球菌 (Deinococcus radiodurans)
1956年,美国科学家 Anderson及其同事从经 X-
射线辐射的罐装食品 中发现 (Anderson等,1956)一
种细菌,定 名为
耐辐射微球菌 (Micrococcus radiodurans)
后来,Brook等 (1981) 将其定名为
耐辐射奇球菌 (D.radiodurans)
相继的研究发现,这种细菌不仅抗 X射线辐射,而
且对紫外线 (UV),γ射线及其它辐射和不同的化学
诱变剂有极强的抗性。
由于这种细菌极抗辐射和化学诱变剂,加之又有 独
特的细胞壁结构
Deinococcus radiodurans R1
全基因序列已经测出,并已绘制出物理图谱
(lieyi等,1999; Owen等,1999)
有 4个环状 DNA
两个为染色体 DNA
DNA1,2,648,638 bp
DNA2,412,348 bp)
两个为质粒 DNA
大质粒,177,466 bp
小质粒, 45,704 bp
耐辐射奇球菌的细胞壁
Baumeister 等 (1987)
用三维电子显微技术对这种细菌细胞壁的特异性观察发
现,它具有规则对称的表面层 HPI(hexagonally packed
intermediate) 层,紧密地与细胞壁结合在一起。
在其外还有相当 厚而致密的糖衣 透过 HPI层间隙锚于外
层细胞壁上,并覆盖着 HPI层。
HPI层易用除污剂分离,且具有异乎寻常的抗化学干扰物
的性能。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,它是由 多种多肽 所构
成。
此外,还发现在耐辐射奇球菌的细胞壁内外膜之间也有 肽
聚糖以及一些组分尚不清楚的嵌入物,
三, 细胞壁的其它用途
1,抗肿瘤,双歧杆菌细胞壁酸成分, 在体外与肿瘤组织
共同培养, 组分对 K562细胞无杀伤作用,
但对肿瘤组织有低杀伤作用, 食道癌组织;
2.最近, 美国大学的研究人员报道, 杀死炭疽杆菌 的
药物, 专 一性地破坏炭疽杆菌的细胞壁 。
四、细菌的 L型
第四节 细胞膜
一, 膜的组成
1,脂类
2,蛋白质
二, 膜的结构
三、嗜盐细菌的紫膜
嗜盐细菌
在高浓度 NaCl,氧分压低的光照条件下生长时, 可
在细胞膜上形成一种特殊的呈六面格子形状的 紫色斑,
这种紫色斑的膜又称为紫膜 ( purple membrance) 。
质 膜 上 的 颜 色 由 膜 上 的 细 菌 视 紫 红 质
(bacteriorhodopsin,bR )决定 。
细菌视紫红质
蛋白质, 75 % 脂, 25 %
分子量 26,000 Da 248氨基酸
7个 α螺旋
bR 三个重要功能
质子泵
电荷分离
光致变色
bR特性
良好的热稳定性 (140℃ )
高的空间分辨色 (>5000线 /mm)
高的光灵敏度 (10-3J/cm2)
高的循环次数 (>106次 )
良好的非线性光学特性
获得性能更为优良的 bR变体
被公认为最有前途的生物光学材料
用 途
分子电子学
生物计算机等领域具有诱人的前景,
实时光学信息处理
光开关
光电转换
光学图像识别
空间光调制器
投影显示
全息记录
模式识别
光信息存储等方面
视黄醛的异构化在光循环中起着关键作用
状态, 光适应
暗适应
光适应的 bR中视黄醛为全 --反式构型
一个光循环
吸收光能 ---从全 —反到 13—顺式的光致异构过程
--K中间态 --通过热弛豫 --13—顺式的 L,M,N态
和全 —反式的 O态的转变 --返回 B态
O态 由 13—顺式转变为 9—顺式, P态
热衰减到具有 9—顺式构型的 Q态
Q态再经蓝光照射可返回初始的 B态
P态在衰减为 Q态前的寿命为几分钟或更长
Q态的寿命为 5-20年
需要在强的蓝光照射下才能返回 B态
P态和 Q态的这种特性为蛋白质用于
长期信息存储提供了可能
光致异构化量子效率
[用量子效率 (φ)来衡量光的利用效率 ]
光致变色
B态呈 紫色, 吸收峰位于 570nm
M态呈 黄色, 吸收峰位于 410nm
先用绿光照射 bR,就可以出现 M态, B→M
再用蓝光照射 bR,可使 M返回 B态
实现 M→ B的转变
M态是长寿命中间态
信息存储
谢 谢 !