四, 基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用
主要应用,
1,提高次级代谢产物的产量
2,改进代谢产物的组分
3,改进菌种的生理性能
4,产生新的代谢产物
(一 ) 提高次级代谢产物的产量
基因工程技术提高抗生素产量的主要手段
1,增加限速酶的基因拷贝数
2,增加正调节基因,去除负调节基因
3,增加抗性基因的拷贝数
1,增加限速酶的基因拷贝数
原理,Ea Eb Ec Ed
A B C D E ( 代谢产物）
限速酶
Rate-limiting Bottleneck
Ea Eb Ec
例 1,起始原料 ACV三肽 异青霉素 N 青霉素
?-aminoadipic acid
L-cysteine Ea,ACV合成酶 Ec:异青霉素 N酰基水解酶
L-valine Eb:异青霉素 N合成酶 青霉素酰基转移酶
异青霉素 N合成酶对 P.chrysogenum青霉素产量的影响
菌株 原始菌株 低产菌株 高产菌株
Wis 54-1255 AS-P-78
IPNS 的基 1 ---- 9-14
因拷贝数
mRNA量 1 ---- 32-64
青霉素产量 100%
导入带 IPNS 140%
的基因片段
增加 IPNS基因提高青霉素产量
转化青霉素产生菌
Wis54-1255
转化菌株
青霉素 V产量提高 40%
例 2,头孢菌素 C生物合成的限速酶
在头孢菌素 C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到
的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素 C外，在发酵液中还积累另
一种产物 -青霉素 N。
问题：积累中间产物 -青霉素 N
原因：下一步反应为限速酶反应
解决：导入额外的扩环酶 /羟化酶基因
结果：使头孢菌素 C的产量提高 25-50%,积累的青霉素 N消失。
增加限速酶基因提高头孢菌素 C产量
转化 C.acremonium394-4
转化后菌株
头孢菌素 C产量提高 25-50%
增加限速酶的其它例子 -3:
例 3,
十一烷基灵菌红素 产生菌,天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2)
N
OH
H
N (C H 2 ) 10 CH 3
H
N
N
O CH 3
H
N (C H 2 ) 10 CH 3
H
N
acetyl CoA
polyketide pathway
氧甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸
构建重组质粒 (带 甲氧基转移酶 )
转化到 氧甲基转移酶缺陷变株
转化菌株
十一烷基灵菌红素 产量提高 5倍
增加限速酶的其它例子 -4:
例 4,泰洛星 (Tylosin) 产生菌,弗氏链霉菌 (S.fradiae)
acetyl CoA + malonyl CoA
polyketide pathway
大菌素（ macrocin)
甲氧基转移酶
Tylosin
构建重组质粒 (带 甲氧基转移酶 )
转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae)
转化菌株
泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高
2.增加正调节基因,去除负调节基因
调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正
调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因
的转录。
将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株
中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水
平的表达，提高了代谢产物的产量。
反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其
祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结
构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。
调节基因在次级代谢产物合成中的作用
次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因
基因 效应 菌株 次级代谢产物 功 能
brpA 正 吸水链霉菌 Bialaphos 激活 bar ( Bialaphos 抗性 )基因 和
6 个 bap (生物合成 )基因的转录
tylG 正 弗氏链霉菌 泰洛星 激活 tyl F(编码 MOMT)和其它 tyl
生物 合成基因的表达
actII 正 天蓝色链霉菌 放线紫红 素 能使 act 菌株放线紫红素的产
量增加 30 ～ 40 倍
mmy 负 天蓝色链霉菌 次 甲 霉素 该 基因 的 插入 失 活 导致 次甲 霉
素 过 量 生产
strR 正 灰色链霉菌 链霉素 调节 链霉素 的 生物合成
.
去除负调节基因使结构基因超量表达
CH 2
H 3 C
H 3 C
O
C O O H
O
Methylenomycin（次甲霉素）
次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，
研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉
菌携带的质粒 SCP I 编码的。在其生物合
成结构基因的上游，存在一个负调节基因 -
mmy。
克隆到质粒上
转化变青链霉菌
转化子
（次甲霉素高产表达）
mmy
3.增加抗性基因的拷贝数
抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产
物所杀灭。其作用可通过三条途径实现,1.抗性基因产物 (酶 )将
抗生素作用的底物加以修饰 ; 2.将抗生素的分子结构加以修饰,使
其失活 ; 3.将抗生素分子排出细胞外。
提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提，
此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物
对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。
将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重
组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量
例 1,Davies J,利用链霉菌质粒 pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了 6’-N-氨基糖
苷乙酰转移酶 AAC6’的基因 (aacA),该基因产物在乙酰辅酶 A的存在下,可将
氨基糖苷类抗生素的氨基糖 6’乙酰化。, 将 aacA基因转入新霉素和卡那霉素
的产生菌中,结果显著提高了抗生素的产量,
转化
转化子 - 链霉菌细胞
氨基糖苷类抗生素产量提高
卡那霉素 6’-乙酰转移酶 [AAC（ 6’） ] 的作用
O
R
2
O
HO
HO
R
1
-H
2
C
NH
NH
2
O
CH
2
OH
OH
NH
2
HO
HO
R
3
A A C ( 6 ' )
A A C ( 3 )
A A C ( 4 ' )
A P H ( 3 ' )
A A C ( 2 ' )
A P H ( 2 " )
A N T ( 2 " )
R1 R2 R3
卡那霉素 A
N H 2
NH
2
NH
2
NH
2
NH
2
NH
2
OH
OH
H
H
H
H
卡那霉素 B
卡那霉素 C
妥布霉素
A A C A m i n o g l y c o s i d e ac e t y l t r a n s f e r a s e s
A P H A m i n o g l y c o s i d e p h o s p h o t r a s f e r a s e s
A N T
A m i n o g l y c o s i d e n e c l e o t i d e t r a n s f e r a s e s
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量 -2
例 2,螺旋霉素抗性基因 srmB
重组质粒
转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌）
转化子 使螺旋霉素产量提高。
(二 ) 改进代谢产物的组分
链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混
合物。每个化合物称为它的一个组分。多组分产生的分子基
础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合
成途径中分支途径的存在。
通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除
该分之支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用
组分，提高有用组分的含量。
例一, 阿维菌素产生菌的基因改造
O
Y CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
H
H
CH
3
OR
1
O
H
CH
3
O
X
A 1 a
CH
3
C
2
H
5CH
C H
A 1 b
CH
3
CH
3
R1
R2X - Y
A 2 a
CH
3
C
2
H
5
A 2 b
CH
3
CH
3
CH
2
C H
OH
H
CH C H
CH
2
C H
OH
C
2
H
5
CH
3
C
2
H
5
CH
3
B 1 a
B 1 b
B 2 a
B 2 b
H
H
H
阿维菌素,B”组分转化成,A”组分的分子基
础
O
Y CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
X
OH
O
Y CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
X
O C H 3
阿维菌素,B”组分
阿维菌素,A”组分
aveD
C5-氧甲基转移酶
阿维菌素 C5位的甲基化
C
C OO H
H 2 N H
CH 2
CH 2
S
CH 3
CH 2
H
O
H H
OH OH
H
N
N
NH
2
N
HC
N
S- 腺苷甲硫氨酸
+
C
C O O H
H 2 N H
CH 2
CH 2
S CH
2
H
O
H H
OH OH
H
N
N
NH
2
N
HC
N
S- 腺苷高半胱氨酸
ATP
转甲基酶
aveD
“B” 组分 H
CH 3
O
H
OH
5
3
H
CH 3
O
H
O C H 3
5
3“A” 组分
OCH3
0 10 20 30 40 50 60 70 80
k b
B a m H I m a p
A ve A 1 a ve A 2 a ve A 3 a ve A 4
a ve R a ve B Ⅰ a ve B Ⅲ a ve B Ⅴ a ve B Ⅶ
a v e F a v e D a v e C a v e E or f1 a ve B Ⅱ a ve B Ⅳ a ve B Ⅵ a ve B Ⅷ
图 3 阿弗菌素生物合成基因簇的物理基因图谱
阿维菌素生物合成基因簇
1.用基因工程手段灭活 C5-氧甲基转移酶基
因
主要过程：
1,克隆阿维菌素生物合成的 aveD基因
2,构建 gene disruption 质粒
3,转化阿维菌素产生菌 (S.avermitilis)
4,挑选双交换菌株
5,阳性菌株的发酵
6,发酵产物的组分分析 (HPLC,质谱 )
Disruption plasmid of aveD gene
双交换菌株（阻断变株）的挑选
2 双交换菌株（阻断变株）的挑选
转入 2 8 ℃
3 - 5 天
M S M Y M + A m 单孢子悬液
涂布 28 ℃ 转入
3 - 5 天
M Y M （ 1 - 3 代） M Y M + A m
M Y M + A m M Y M + A m +T sr
黑色为双交换菌落代表
图 2 - 2 双交换菌株的筛选
F i g,2 - 2 S e l e c t i on of do ub l e c r os s - ov e r St r e po m y c e s av e r m i t i l i s c ol on i e s
发酵产物的 HPLC分析
c o n t r o l A v e D 2 4
A 2 a
B 1 a
A 1 a
B 2 a
D 2 4 - 1
B 1 a
D 2 4 - 2
B 2 a
D24-1组分的质谱分析
c h e n g 0 2 4 _ 1 # 96 R T, 1, 7 0 AV,1 N L, 8, 7 0 E 7
T,+ c F u l l m s [ 1 5 0, 0 0 - 2 0 0 0, 0 0 ]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m / z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
R
e
l
a
t
i
v
e
A
b
u
n
d
a
n
c
e
8 1 3, 6
8 2 9, 6
4 3 2, 2
8 0 8, 3
5 2 9, 3
8 4 5, 8
4 1 5, 2
1 2 8 2, 8
4 3 7, 3
1 5 1 6, 6
8 4 7, 7
9 5 9, 3
1 3 7 7, 6
1 8 7 9, 01 5 7 2, 84 0 4, 2 4 6 5, 1
1 2 7 6, 5 1 7 8 1, 4
6 9 1, 0 1 1 5 9, 6
7 1 7, 6
1 0 2 5, 56 0 8, 8
1 3 9 0, 0
3 6 9, 3
1 2 6 5, 4 1 6 3 8, 4 1 7 2 3, 2
1 1 2 9, 8
1 9 9 0, 2
3 6 1, 3
3 0 3, 3
m/z813[M+Na] +,D24-1的分子质量为 790。与 107#菌
株发酵液主组分 oligmycinA的分子量一致。将两菌株
发酵液提取物混合后进样，根据在 HPLC分析中 D24-1
组分和菌株 Ave107#的主峰相重合，可以推测 D24-1组
分为 oligmycinA。
2,只产 Avermectin,2”组分基因工程菌的构建
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
23
22
25
1
2
3
4
5
12
7
6
10
8
9
11
13 15
19
2117
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
OR
1
O
CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
HO
OR
1
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3 23
22
25
1
2
3
4
5
12
7
6
10
8
9
11
13 15
19
2117
aveC
脱水酶
阿维菌素,2”组
分
阿维菌素,1”组分
aveC
基因
在染
色体
上的
位置
图 1 - 7 a v e C,a v e E 基因在阿维链霉菌生物合成基因簇中的位置
[3 2 ]
F i g, 1 - 7 T h e l o c a t i o n o f a v e C,a v e E g e n e s i n AV M b i o s y n t h e s i s g e n e c l u s t e r
重
组
质
粒
的
构
建
p C 0 4
B g l II
p C 0 5
图 1 - 8 质粒 p C 0 5 的构建过程
F i g, 1 - 8 T h e p r o c e d u r e s i n t h e c o n s t r u c t i o n o f p l a s m i d p C 0 5
p C 0 3
L i g a s e
重组质粒的转化
转化阿维菌素产生菌
tsrR amRtsrR amR
Gene replacement (基因置换）
D B
B
C am C
aveC
aveC
am
tsrR amR aveC+ tsrS amR aveC–
遗传型的改变
Bam
aveC
am
aveC
tsrR amR aveC– tsrS amR aveC –
传几代后，丢掉质粒 基因工程菌 AveC9
基因工程菌 AveC-9发酵产物的 HPLC分析
c on t r ol 基因 工程 菌 A v e C 9
图 3 - 8 阿维链霉菌 a ve C 基因阻断变株产物 的 H P L C 分析
B 2a
A 2a
B 1a
A 1a
B 2a
A 2a
例二, 黑暗链霉菌的基因改造
黑暗链霉菌首先是从墨西哥土壤中分离得到的, 1967由美国礼
莱公司 （ Eli Lilly Co.） 最初报道了黑暗链霉菌产生的代谢产物 -尼拉
霉素复合物, 它包括 1,1’,2,3,4,5,5’,6,7等 15个组分 。 其
中组分 2,4,5’为尼拉霉素的主组分, 其他组分为小组分 。 组分 2为
安普霉素 （ Apramycin）, 组分 4为 6”-O-氨甲酰卡那霉素 B（ 6”-O-
Carbamoylkanamycin B,CKB）, 组分 5’为 6”-O-氨甲酰托普霉素
（ 6”-O-Carbamoyltobramycin,CTB） [3]
七八十年代, 我国中科院微生物所与四川抗生素工业研究所先后分
离到黑暗链霉菌的新菌株：黑暗链霉菌 410[7] 与黑暗链霉菌 83-
1050B[8],它们的组分中含有尼拉霉素组分 2,4,5’。 经过, 七五,
攻关中筛选到了只产组分 2 （ Apramycin ）, 5’ （ 6”-O-
Carbamoyltobramycin,CTB） 的菌株 U-135[9]。
黑暗链霉菌（ S.tenebrarius）菌株 U-135产生的两种主要抗生素
H C O H N
NH
2
O
HO
O
NH
2
HO
NH
2
O
O
HO
NH
2
OH
CH
2
OH
O
H 2 N
CH 2 OH
OH
O
HO
O
N H C H 3
OH
O
NH 2
O
HO
OH
NH 2
H
2
N
妥布霉素 (Tobramycin)
妥布霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌
（ S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份 5’。它对
革兰式阴性菌有很高的抗菌活性。特别是对绿脓杆菌有
独特的抗菌作用，因此常用来治疗烧伤后的绿脓杆菌感
染。
临床上使用的妥布霉素是由黑暗链霉菌经过发酵后，
经过树脂吸附，层析后得到中间产物 6”-O-氨甲酰托普霉
素，然后再将 6”-甲酰基水解掉，得到妥布霉素。
安普霉素 (Apramycin)
A brief introduction to apramycin
安普霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌
（ S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份 2 。它对
革兰式阴性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子
中具有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷类抗生素的
耐药菌仍有抑制和杀灭作用，与常用的氨基糖苷类抗生
素不易产生交叉耐药性。 80年代在美国和欧洲安普霉素
作为兽用抗生素和饲料添加剂投入市场。我们课题组经
过九五攻关，获得了产生安普霉素单一组分的菌株，并
把它开发成为二类兽用新药和饲料添加剂。
安普霉素 /妥布霉素生物合成基因簇的位置
安普霉素生物合成基因簇部分基因 妥布霉素生物合成基因簇？
？
aprA aprR
1.通过鸟枪克隆法从黑暗链霉菌 H-6中克隆到了安普霉素抗性基因 aprR
2.在抗基因上游找到一个完整的 ORF,定名为 aprA。
3.将抗性基因上游片段和报告基因 ermE,xylE插入到带有 aprA片段的质粒。
pHZ132中,得到重组质粒。
4,转化黑暗链霉菌得到双交换的菌株 42#菌株。
5.对 42#菌株发酵产物的分析表明,只产生单一的组分 6”-O-氨甲酰托普霉素。
(三 ) 改进菌种的生理性能
(四 ) 产生新的代谢产物
SS
S1 S2
C
G l u c o s e
B
P
G l u c o s e - 6 - P
C e l l m e m b r a n e
A T P
c A M P
AC
I I A
G l c
I I A
G l c
P
H P r
P
H P r
E 1 E 1 P
E P E P y r u v a t e
主要应用,
1,提高次级代谢产物的产量
2,改进代谢产物的组分
3,改进菌种的生理性能
4,产生新的代谢产物
(一 ) 提高次级代谢产物的产量
基因工程技术提高抗生素产量的主要手段
1,增加限速酶的基因拷贝数
2,增加正调节基因,去除负调节基因
3,增加抗性基因的拷贝数
1,增加限速酶的基因拷贝数
原理,Ea Eb Ec Ed
A B C D E ( 代谢产物）
限速酶
Rate-limiting Bottleneck
Ea Eb Ec
例 1,起始原料 ACV三肽 异青霉素 N 青霉素
?-aminoadipic acid
L-cysteine Ea,ACV合成酶 Ec:异青霉素 N酰基水解酶
L-valine Eb:异青霉素 N合成酶 青霉素酰基转移酶
异青霉素 N合成酶对 P.chrysogenum青霉素产量的影响
菌株 原始菌株 低产菌株 高产菌株
Wis 54-1255 AS-P-78
IPNS 的基 1 ---- 9-14
因拷贝数
mRNA量 1 ---- 32-64
青霉素产量 100%
导入带 IPNS 140%
的基因片段
增加 IPNS基因提高青霉素产量
转化青霉素产生菌
Wis54-1255
转化菌株
青霉素 V产量提高 40%
例 2,头孢菌素 C生物合成的限速酶
在头孢菌素 C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到
的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素 C外，在发酵液中还积累另
一种产物 -青霉素 N。
问题：积累中间产物 -青霉素 N
原因：下一步反应为限速酶反应
解决：导入额外的扩环酶 /羟化酶基因
结果：使头孢菌素 C的产量提高 25-50%,积累的青霉素 N消失。
增加限速酶基因提高头孢菌素 C产量
转化 C.acremonium394-4
转化后菌株
头孢菌素 C产量提高 25-50%
增加限速酶的其它例子 -3:
例 3,
十一烷基灵菌红素 产生菌,天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2)
N
OH
H
N (C H 2 ) 10 CH 3
H
N
N
O CH 3
H
N (C H 2 ) 10 CH 3
H
N
acetyl CoA
polyketide pathway
氧甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸
构建重组质粒 (带 甲氧基转移酶 )
转化到 氧甲基转移酶缺陷变株
转化菌株
十一烷基灵菌红素 产量提高 5倍
增加限速酶的其它例子 -4:
例 4,泰洛星 (Tylosin) 产生菌,弗氏链霉菌 (S.fradiae)
acetyl CoA + malonyl CoA
polyketide pathway
大菌素（ macrocin)
甲氧基转移酶
Tylosin
构建重组质粒 (带 甲氧基转移酶 )
转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae)
转化菌株
泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高
2.增加正调节基因,去除负调节基因
调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正
调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因
的转录。
将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株
中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水
平的表达，提高了代谢产物的产量。
反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其
祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结
构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。
调节基因在次级代谢产物合成中的作用
次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因
基因 效应 菌株 次级代谢产物 功 能
brpA 正 吸水链霉菌 Bialaphos 激活 bar ( Bialaphos 抗性 )基因 和
6 个 bap (生物合成 )基因的转录
tylG 正 弗氏链霉菌 泰洛星 激活 tyl F(编码 MOMT)和其它 tyl
生物 合成基因的表达
actII 正 天蓝色链霉菌 放线紫红 素 能使 act 菌株放线紫红素的产
量增加 30 ～ 40 倍
mmy 负 天蓝色链霉菌 次 甲 霉素 该 基因 的 插入 失 活 导致 次甲 霉
素 过 量 生产
strR 正 灰色链霉菌 链霉素 调节 链霉素 的 生物合成
.
去除负调节基因使结构基因超量表达
CH 2
H 3 C
H 3 C
O
C O O H
O
Methylenomycin（次甲霉素）
次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，
研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉
菌携带的质粒 SCP I 编码的。在其生物合
成结构基因的上游，存在一个负调节基因 -
mmy。
克隆到质粒上
转化变青链霉菌
转化子
（次甲霉素高产表达）
mmy
3.增加抗性基因的拷贝数
抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产
物所杀灭。其作用可通过三条途径实现,1.抗性基因产物 (酶 )将
抗生素作用的底物加以修饰 ; 2.将抗生素的分子结构加以修饰,使
其失活 ; 3.将抗生素分子排出细胞外。
提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提，
此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物
对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。
将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重
组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量
例 1,Davies J,利用链霉菌质粒 pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了 6’-N-氨基糖
苷乙酰转移酶 AAC6’的基因 (aacA),该基因产物在乙酰辅酶 A的存在下,可将
氨基糖苷类抗生素的氨基糖 6’乙酰化。, 将 aacA基因转入新霉素和卡那霉素
的产生菌中,结果显著提高了抗生素的产量,
转化
转化子 - 链霉菌细胞
氨基糖苷类抗生素产量提高
卡那霉素 6’-乙酰转移酶 [AAC（ 6’） ] 的作用
O
R
2
O
HO
HO
R
1
-H
2
C
NH
NH
2
O
CH
2
OH
OH
NH
2
HO
HO
R
3
A A C ( 6 ' )
A A C ( 3 )
A A C ( 4 ' )
A P H ( 3 ' )
A A C ( 2 ' )
A P H ( 2 " )
A N T ( 2 " )
R1 R2 R3
卡那霉素 A
N H 2
NH
2
NH
2
NH
2
NH
2
NH
2
OH
OH
H
H
H
H
卡那霉素 B
卡那霉素 C
妥布霉素
A A C A m i n o g l y c o s i d e ac e t y l t r a n s f e r a s e s
A P H A m i n o g l y c o s i d e p h o s p h o t r a s f e r a s e s
A N T
A m i n o g l y c o s i d e n e c l e o t i d e t r a n s f e r a s e s
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量 -2
例 2,螺旋霉素抗性基因 srmB
重组质粒
转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌）
转化子 使螺旋霉素产量提高。
(二 ) 改进代谢产物的组分
链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混
合物。每个化合物称为它的一个组分。多组分产生的分子基
础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合
成途径中分支途径的存在。
通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除
该分之支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用
组分，提高有用组分的含量。
例一, 阿维菌素产生菌的基因改造
O
Y CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
H
H
CH
3
OR
1
O
H
CH
3
O
X
A 1 a
CH
3
C
2
H
5CH
C H
A 1 b
CH
3
CH
3
R1
R2X - Y
A 2 a
CH
3
C
2
H
5
A 2 b
CH
3
CH
3
CH
2
C H
OH
H
CH C H
CH
2
C H
OH
C
2
H
5
CH
3
C
2
H
5
CH
3
B 1 a
B 1 b
B 2 a
B 2 b
H
H
H
阿维菌素,B”组分转化成,A”组分的分子基
础
O
Y CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
X
OH
O
Y CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
X
O C H 3
阿维菌素,B”组分
阿维菌素,A”组分
aveD
C5-氧甲基转移酶
阿维菌素 C5位的甲基化
C
C OO H
H 2 N H
CH 2
CH 2
S
CH 3
CH 2
H
O
H H
OH OH
H
N
N
NH
2
N
HC
N
S- 腺苷甲硫氨酸
+
C
C O O H
H 2 N H
CH 2
CH 2
S CH
2
H
O
H H
OH OH
H
N
N
NH
2
N
HC
N
S- 腺苷高半胱氨酸
ATP
转甲基酶
aveD
“B” 组分 H
CH 3
O
H
OH
5
3
H
CH 3
O
H
O C H 3
5
3“A” 组分
OCH3
0 10 20 30 40 50 60 70 80
k b
B a m H I m a p
A ve A 1 a ve A 2 a ve A 3 a ve A 4
a ve R a ve B Ⅰ a ve B Ⅲ a ve B Ⅴ a ve B Ⅶ
a v e F a v e D a v e C a v e E or f1 a ve B Ⅱ a ve B Ⅳ a ve B Ⅵ a ve B Ⅷ
图 3 阿弗菌素生物合成基因簇的物理基因图谱
阿维菌素生物合成基因簇
1.用基因工程手段灭活 C5-氧甲基转移酶基
因
主要过程：
1,克隆阿维菌素生物合成的 aveD基因
2,构建 gene disruption 质粒
3,转化阿维菌素产生菌 (S.avermitilis)
4,挑选双交换菌株
5,阳性菌株的发酵
6,发酵产物的组分分析 (HPLC,质谱 )
Disruption plasmid of aveD gene
双交换菌株（阻断变株）的挑选
2 双交换菌株（阻断变株）的挑选
转入 2 8 ℃
3 - 5 天
M S M Y M + A m 单孢子悬液
涂布 28 ℃ 转入
3 - 5 天
M Y M （ 1 - 3 代） M Y M + A m
M Y M + A m M Y M + A m +T sr
黑色为双交换菌落代表
图 2 - 2 双交换菌株的筛选
F i g,2 - 2 S e l e c t i on of do ub l e c r os s - ov e r St r e po m y c e s av e r m i t i l i s c ol on i e s
发酵产物的 HPLC分析
c o n t r o l A v e D 2 4
A 2 a
B 1 a
A 1 a
B 2 a
D 2 4 - 1
B 1 a
D 2 4 - 2
B 2 a
D24-1组分的质谱分析
c h e n g 0 2 4 _ 1 # 96 R T, 1, 7 0 AV,1 N L, 8, 7 0 E 7
T,+ c F u l l m s [ 1 5 0, 0 0 - 2 0 0 0, 0 0 ]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m / z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
R
e
l
a
t
i
v
e
A
b
u
n
d
a
n
c
e
8 1 3, 6
8 2 9, 6
4 3 2, 2
8 0 8, 3
5 2 9, 3
8 4 5, 8
4 1 5, 2
1 2 8 2, 8
4 3 7, 3
1 5 1 6, 6
8 4 7, 7
9 5 9, 3
1 3 7 7, 6
1 8 7 9, 01 5 7 2, 84 0 4, 2 4 6 5, 1
1 2 7 6, 5 1 7 8 1, 4
6 9 1, 0 1 1 5 9, 6
7 1 7, 6
1 0 2 5, 56 0 8, 8
1 3 9 0, 0
3 6 9, 3
1 2 6 5, 4 1 6 3 8, 4 1 7 2 3, 2
1 1 2 9, 8
1 9 9 0, 2
3 6 1, 3
3 0 3, 3
m/z813[M+Na] +,D24-1的分子质量为 790。与 107#菌
株发酵液主组分 oligmycinA的分子量一致。将两菌株
发酵液提取物混合后进样，根据在 HPLC分析中 D24-1
组分和菌株 Ave107#的主峰相重合，可以推测 D24-1组
分为 oligmycinA。
2,只产 Avermectin,2”组分基因工程菌的构建
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3
23
22
25
1
2
3
4
5
12
7
6
10
8
9
11
13 15
19
2117
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
OR
1
O
CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
H
CH
3
R
2
H
CH
3
H
O
O
O
H
H
CH
3
O
H
CH
3
O
HO
OR
1
O
H
O C H
3
CH
3
O
O
H
CH
3
OH
CH
3
CH
3 23
22
25
1
2
3
4
5
12
7
6
10
8
9
11
13 15
19
2117
aveC
脱水酶
阿维菌素,2”组
分
阿维菌素,1”组分
aveC
基因
在染
色体
上的
位置
图 1 - 7 a v e C,a v e E 基因在阿维链霉菌生物合成基因簇中的位置
[3 2 ]
F i g, 1 - 7 T h e l o c a t i o n o f a v e C,a v e E g e n e s i n AV M b i o s y n t h e s i s g e n e c l u s t e r
重
组
质
粒
的
构
建
p C 0 4
B g l II
p C 0 5
图 1 - 8 质粒 p C 0 5 的构建过程
F i g, 1 - 8 T h e p r o c e d u r e s i n t h e c o n s t r u c t i o n o f p l a s m i d p C 0 5
p C 0 3
L i g a s e
重组质粒的转化
转化阿维菌素产生菌
tsrR amRtsrR amR
Gene replacement (基因置换）
D B
B
C am C
aveC
aveC
am
tsrR amR aveC+ tsrS amR aveC–
遗传型的改变
Bam
aveC
am
aveC
tsrR amR aveC– tsrS amR aveC –
传几代后，丢掉质粒 基因工程菌 AveC9
基因工程菌 AveC-9发酵产物的 HPLC分析
c on t r ol 基因 工程 菌 A v e C 9
图 3 - 8 阿维链霉菌 a ve C 基因阻断变株产物 的 H P L C 分析
B 2a
A 2a
B 1a
A 1a
B 2a
A 2a
例二, 黑暗链霉菌的基因改造
黑暗链霉菌首先是从墨西哥土壤中分离得到的, 1967由美国礼
莱公司 （ Eli Lilly Co.） 最初报道了黑暗链霉菌产生的代谢产物 -尼拉
霉素复合物, 它包括 1,1’,2,3,4,5,5’,6,7等 15个组分 。 其
中组分 2,4,5’为尼拉霉素的主组分, 其他组分为小组分 。 组分 2为
安普霉素 （ Apramycin）, 组分 4为 6”-O-氨甲酰卡那霉素 B（ 6”-O-
Carbamoylkanamycin B,CKB）, 组分 5’为 6”-O-氨甲酰托普霉素
（ 6”-O-Carbamoyltobramycin,CTB） [3]
七八十年代, 我国中科院微生物所与四川抗生素工业研究所先后分
离到黑暗链霉菌的新菌株：黑暗链霉菌 410[7] 与黑暗链霉菌 83-
1050B[8],它们的组分中含有尼拉霉素组分 2,4,5’。 经过, 七五,
攻关中筛选到了只产组分 2 （ Apramycin ）, 5’ （ 6”-O-
Carbamoyltobramycin,CTB） 的菌株 U-135[9]。
黑暗链霉菌（ S.tenebrarius）菌株 U-135产生的两种主要抗生素
H C O H N
NH
2
O
HO
O
NH
2
HO
NH
2
O
O
HO
NH
2
OH
CH
2
OH
O
H 2 N
CH 2 OH
OH
O
HO
O
N H C H 3
OH
O
NH 2
O
HO
OH
NH 2
H
2
N
妥布霉素 (Tobramycin)
妥布霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌
（ S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份 5’。它对
革兰式阴性菌有很高的抗菌活性。特别是对绿脓杆菌有
独特的抗菌作用，因此常用来治疗烧伤后的绿脓杆菌感
染。
临床上使用的妥布霉素是由黑暗链霉菌经过发酵后，
经过树脂吸附，层析后得到中间产物 6”-O-氨甲酰托普霉
素，然后再将 6”-甲酰基水解掉，得到妥布霉素。
安普霉素 (Apramycin)
A brief introduction to apramycin
安普霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌
（ S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份 2 。它对
革兰式阴性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子
中具有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷类抗生素的
耐药菌仍有抑制和杀灭作用，与常用的氨基糖苷类抗生
素不易产生交叉耐药性。 80年代在美国和欧洲安普霉素
作为兽用抗生素和饲料添加剂投入市场。我们课题组经
过九五攻关，获得了产生安普霉素单一组分的菌株，并
把它开发成为二类兽用新药和饲料添加剂。
安普霉素 /妥布霉素生物合成基因簇的位置
安普霉素生物合成基因簇部分基因 妥布霉素生物合成基因簇？
？
aprA aprR
1.通过鸟枪克隆法从黑暗链霉菌 H-6中克隆到了安普霉素抗性基因 aprR
2.在抗基因上游找到一个完整的 ORF,定名为 aprA。
3.将抗性基因上游片段和报告基因 ermE,xylE插入到带有 aprA片段的质粒。
pHZ132中,得到重组质粒。
4,转化黑暗链霉菌得到双交换的菌株 42#菌株。
5.对 42#菌株发酵产物的分析表明,只产生单一的组分 6”-O-氨甲酰托普霉素。
(三 ) 改进菌种的生理性能
(四 ) 产生新的代谢产物
SS
S1 S2
C
G l u c o s e
B
P
G l u c o s e - 6 - P
C e l l m e m b r a n e
A T P
c A M P
AC
I I A
G l c
I I A
G l c
P
H P r
P
H P r
E 1 E 1 P
E P E P y r u v a t e
