植物基因工程植物生物工程教研室第一章 抗植物病虫害基因及其应用第一节 抗植物虫害基因及其应用第二节 抗植物病毒基因及其应用第三节 抗植物真菌病害基因及其应用第四节 抗植物细菌病害基因及其应用第一节 概述一、作用及意义二、抗性基因的来源三、抗性基因分类一、作用及意义应用抗病虫害基因具有以下优势：
1,育种周期短,效率高,成本低 。
2,提高产量和品质 。
3,降低生产成本 。
4,防止化学农药污染,避免破坏生态平衡 。
5,克服亲本基因资源缺乏 。
6,抗性性状具有连续性和整体性。
二、抗性基因的来源根据基因来源分为三类：
1.植物组织 如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 。
2,动物 如杀菌肽 （ cecropins） 基因 。
3,微生物 如 Bt杀虫结晶蛋白基因 。
三、抗性基因分类据基因的作用功能和对象分为：
1,抗虫基因 。
2,抗病毒基因 。
3,抗真菌和细菌基因 。
第二节抗植物虫害基因及其应用一,Bt基因及其应用二、蛋白酶抑制剂基因及其应用三、植物凝集素基因及其应用四、淀粉酶抑制剂基因及其应用一,Bt基因及其应用
1,Bt基因的作用原理
2,ICP的分类、结构及抗虫谱
3,Bt基因的应用
4,存在的问题及对策
1,Bt基因的作用原理
Bt基因,是从微生物苏云金杆菌（ Bacillus thu-
ringicnsis）分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因,简称 Bt基因。
苏云金杆菌属于革兰氏阴性，形成孢子细菌。在芽胞形成过程中，可产生伴胞晶体，它由一种或多种蛋白组成，具有高度特异性杀虫活性，这种蛋白通常被称作 δ-内毒素（ δ-endotoxins）或杀虫结晶蛋白（ in-secticidal crysta1 protein,ICP）。
作用原理：
ICP通常以原毒素 （ protoxin） 形式存在,当昆虫取食 ICP后,原毒素在昆虫的消化道内被活化,转型为毒性多肽分子 。
活化的 ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异性结合蛋白结合,全部或部分嵌合于细胞膜中,使细胞膜产生一些孔道,细胞因渗透平衡糟破坏而破裂 。 导致昆虫幼虫停止进食,最终死亡 。
ICP的活化过程：
首先 ICP溶解在昆虫的肠道里 （ ICP在碱性条件可溶,而在中性条件下不溶 ）,然后,
在蛋白酶的作用下,通过专一性蛋白酶水解切割,ICP被活化 。
活化的 ICP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破坏 。
2,ICP的分类、结构及抗虫谱
据抗虫谱和序列同源性分为四种类型：
类型 I （ Cry I） 抗鳞翅目 （ Lepidoptera） 昆虫,
对其幼虫有特异的毒性作用 。
类型 II （ CryII） 抗鳞翅目和双翅目 （ Diptera） 。
类型 III（ CryIII） 抗鞘翅目 （ Coleoptera） 昆虫 。
类型 IVw（ CryIV） 抗双翅目 （ Diptera） 昆虫 。
类型 V（ CryV） 抗鳞翅目和鞘翅目 。
近年 Payne等人则发现了具有抗膜翅目 （ H ym en o - p t er a） 以及抗线虫
（ N e m a t o d e s ） 的 I C P 。
在每种主要类型中,据序列同源性,
ICP又划分为若干亚类例如,CryI 又分为 IA(a),IA(b)、
IA(c),I B,IC等 。
ICP的结构
CryＩ蛋白为长 1100～ 1200个氨基酸的多肽,大小为 130～ 140kD,其毒性多肽分子是约 60～ 70kD的核心片段 。 活性区在氨基端,而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列没有毒性功能 。
只保留编码毒性核心片段的核苷酸序列就能达到抗虫目的。
如,Bt2编码的最短毒性片段位于 29至
607氨基酸残基处，进一步从基因 3′端删除
4个密码子（ codon）或从 5′端删除 8个密码子，将完全丧失产物的毒性功能。
3,Bt基因的应用
1987年比利时的 Vacek等人利用农杆菌介导法首次获得了转基因烟草植株 。
他们使用全长的 CryIA（ b） 基因编码
1155个氨基酸和该基因保留了 5ˊ 端编码毒蛋白核心区域的缺失片段 （ 编码 610个氨基酸 ） 。 转基因植株对烟草天蛾 （ Manduca
Sexta） 幼虫的抗性为 75％ ～ 100％ 。
美国 Monsanto公司的 Fischhoff等人 （ 1987
年 ） 获得转 Bt基因的番茄植株 。
他们用带有 CaMV35S 启动子的
CryIA(b)基因转化番茄品系 VF36。 获得了对烟草天蛾显示出高抗虫活性的转基因植株 。 但因 ICP表达水平低,对番茄果螟
（ Heliothis virescens） 的抗性不强 。
目前全世界已有许多不同类型的
ICP基因转入多种作物，如烟草、
番茄、玉米、棉花、水稻、苹果、
核桃等。
研究结果表明：一般用全长 CryIA基因转化植物,ICP在转基因植物中表达量很低,甚至检测不到,其抗虫效果差或不具抗虫性 。 在高抗虫性的转基因植株中,
每毫克可溶性蛋白中约有 2.6～ 190ng的
ICP。
4,存在的问题及对策
（ 1） ICP在植物中表达水平低
（ 2）昆虫对 ICP产生抗性
（ 3）抗菌谱窄
（ 1） ICP在植物中表达水平低原因,
主要是 mRNA不稳定和翻译效率低 。
天然的 Bt基因富含 A,T碱基,而植物基因富含 G,C碱基,可能导致 Bt基因转录的末成熟终止 （ premature transcription
termination） 及不适当的切割 。
因密码子上的差异也可能使 Bt基因在植物细胞的转录过程中形成二级结构,
mRNA的特定序列被降解和翻译效率降低 。
为提高富含 A,T碱基的 Bt基因在富含 G、Ｃ碱基的植物细胞中表达水平。有人对 CryI基因进行了部分甚至完全的修饰。
修饰后的 CryI基因在转基因棉花、烟草、
番茄和玉米中的表达水平有了显著提高。
对策 1：修饰 Bt基因，改造密码子。
Monsanto公司的 Per1ak等人在不改变氨基酸序列的情况下，对 CryIA(b)和 CryIA(c)基因进行修饰（主要是去除富含 A,T 碱基序列），
使 CryIA(b)和 CryI(c)的表达水平提高了 100倍，
CryIA(b)和 CryI(c)蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的 0.05％～ 0.1％，获得良好的抗虫效果，
其中转基因棉花植株对棉铃虫（ Heliothis
armingera）的抗性达 80％。
对策 2：使用新启动子（包括组织特异性启动子）
Koziel等人合成了一个富含 G,C碱基的
CryIA(b)基因,该合成基因编码 CryIA(b)的部分氨基酸,与野生型 CryIA(b)基因只有 65％
的同源性 。 并用适合在玉米中表达的密码子替代原细菌密码子 。
利用基因枪把该基因导入玉米品种。使用
3种启动子：
1,CaMV35S启动子。
2,玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)
启动子。
3,玉米花粉特异性启动子调控。
后两种启动子调控下的 CryIA(b)基因在转基因玉米植株中显示出明显的组织特异性。
即在绿色组织中,CryIA(b)基因强烈表达，
占可溶性蛋白 0,1％～ 0.4％。
对策 3,寻找新一代启动子除组织特异性启动子外,研究人员也寻找第二代启动子来提高 ICP基因的表达水平 。
例如,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子和叶绿体转运肽,可以使转基因烟草中的 CryIA(ｃ ) 表达量提高 10-20倍 。
（ 2） 昆虫对 ICP产生抗性对策 1：使用组织专一性或化学诱导启动子 。
使用组织专一启动子，可使 Bt基因的表达局限在植物重要的组织。
例如，只在棉花的棉铃中表达，末经选择的害虫能在叶片上存活。
病原相关蛋白（ pathogen-sis-related
protein,即 PR蛋白）是植物受到病原物侵染或其它刺激时表达的一组蛋白。 PR-la是编码其中一种 PR蛋白的基因,可因侵染而被诱导,也可被一些化学刺激物 (包括水杨酸和聚丙酰酸 )诱导。
目前,CIBA的研究小组已经获得带
PR- la启动子调控 Bt基因的转基因烟草。
用化学药剂处理该基因烟草，它对烟草天蛾产生抗性。因此采用上述化学诱导启动子的方法可以调控 Bt基因在化学诱导剂存在下才能表达,从而降低抗性的选择压产生,以防止抗性扩散。
对策 2：修饰 Bt基因,使 ICP在植物中高剂量表达。
迄今，目前发现的高水平的 Bt抗性基因都是隐性基因,而且 ICP对害虫的幼虫特别有效,所以 Bt基因的连续、高剂量表达，可以消除突变杂合体。
对策 3：使用两种以上的 Bt基因或 Bt
与其它抗虫基因结合使用。
除非抗性位点出现的频率很高和毒蛋白剂量低到杂合体可以存活，
否则昆虫几乎不可能对两种独立杀虫蛋白同时产生耐受性。
对策 4：将转与非转基因的植株混种在繁育群体中保留一部分末经选择的害虫,防止害虫对 Bt基因的抗性扩散 。
（ 3） 抗菌谱窄对 策：
采用多基因导入策略，利用基因之间的协同拟菌作用，向植物体内同时导入多个基因。
二,蛋白酶抑制剂（ PI）基因及其应用
1,PI基因的抗虫原理
2,PI的分类及抗虫谱
3,PI基因的应用
是一类蛋白质,在植物防御昆虫和病原体侵染的天然防御系统中起着重要作用,具有明显的抗虫作用的蛋白质 。
PI基因的抗虫谱广泛，可抗几个目的昆虫。
蛋白酶抑制剂 （ proteinase in-
hibitor,PI）：
PI存在于自然界的所有生命体中，在大多数植物的种子和块茎中的含量可高达总蛋白的 1％ -10％。在有些果实中丝氨蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的 30％。
1,PI基因的抗虫原理
（ 1） PI与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合,形成酶抑制剂复合物 （ EＩ ）,从而阻断或减弱蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用,导致蛋白质不能被正常消化 。
（ 2） EI复合物能刺激昆虫过量分泌消化酶，
使昆虫产生厌食反应。停止进食而缺乏代谢所需的 一些氨基酸，导致昆虫发育不正常或死亡。
（ 3） 蛋白酶抑制剂分子可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统,从而严重干扰昆虫的蜕皮过程和兔疫功能,以致昆虫不能正常发育 。
PI的作用特点,
（ 1） PI作用于蛋白消化酶的活性中心 。 活性中心是酶最保守的部位,产生突变的可能性极小,故可以排除害虫通过突变产生抗性的可能性 。
（ 2） PI对于人,畜无害,因人,畜与昆虫的消化机理明显不同 。 人,畜的蛋白消化酶主要存在于肠道中,而 PI在胃中的酸性条件下,被胃蛋白酶分解 。
2,PI的分类及抗虫谱植物中存在三类：
（ 1） 丝氨酸蛋白酶抑制剂
（ 2） 巯基蛋白酶抑制剂
（ 3） 金属蛋白酶抑制剂
（ 1） 丝氨酸类蛋白酶抑制剂
大多数昆虫所利用的蛋白消化酶是丝氨酸类蛋白消化酶,特别是类胰蛋白酶,因此抗虫效果明显,
丝氨酸类蛋白酶抑制剂有 6种,最有效的有,
豇豆胰蛋白酶抑制剂 （ CpTI） 和 马铃薯蛋白酶抑制剂 （ patato inhibitor,PI）
豇豆胰蛋白酶抑制剂 （ CpTI）,
抗虫谱广泛,抗虫效果最理想 。 抗鳞翅目,鞘翅目,直翅目 。
CpTI 是由 80 个氨基酸组成的小分子多肽，分子中富含二硫键，它的一个分子具有两个抑制活性中心。 CpTI与胰蛋白酶紧密结合，使酶活性中心失活。
马铃薯蛋白酶抑制剂
（ patato inhibitor,PI）：
有 2类,PI-I家族和 PI-II家族
PI-I家族,
包括马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂 I，其成熟肽单体分子量为 8.1kD，
只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶
PI-II家族,
包括马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂 II，
其成熟肽单体分子量为 12.3kD,有两个活性中心,可分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋肉酶 。
PI-II比 PI-I抗虫效果好 。 对烟草天蛾等一龄幼虫抗性明显 。
（ 2） 巯基蛋白酶抑制剂
对利用巯基蛋白酶消化植物蛋白的昆虫具有特殊抗性 。
水稻巯基蛋白酶抑制剂 （ oryzacystatin） 是抗虫能力较强的一种 PI。 其基因序列内有两个内含子,cDNA编码 102个氨基酸的小肽,分子量约为１ 1,5kD,分子中部第 52位后的Ｇ ln-Val-
Val-Ala-Gly具有高度保守性,该保守区对于维持抑制剂活力是必要的 。
3,蛋白酶抑制剂基因的应用
1987年,英国 Durham大学的 Hilder
等把编码 CpTI的 cDNA转移到烟草品种 Sam-sun NN中,首先获得转 CpTI
基因的工程植株 。
该 cDNA长 550bP，由 CaMV35S启动子调控。获得的烟草转基因植株能够正确表达
CpTI基因，有的转基因植株中 CpTI的表达量高达 9.6μg／ mg可溶性蛋白。而 CpTI
的表达量达到 5μg／ mg可溶性蛋白时，转基因植株就表现出明显的抗虫性。
目前已把 CpTI 基因转移到许多有重要经济价值的植物中，如，水稻、油菜、白薯、苹果和杨树等。
目前已经有许多种蛋白酶抑制剂的基因或
cDNA被克隆,其中有些表现出明显的抗虫作用 。
CpTI基因,PI-II基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因是植物抗虫基因工程中应用最广,
研究较深入的蛋白酶抑制剂基因 。
提高 PI基因表达水平的对策：
深入研究基因表达的调控机理 。
使用特定启动子
修饰蛋白酶抑制剂基因 。
中科院遗传研究所利用不同的启动子和 Ω
因子对 CpIT基因进行修饰，得到不同的植物表达质粒。其中 Ω因子来自烟草花叶病毒（ TMV） 126kD蛋白基因转录序列
5ˊ 未端的非转译区，由 68bp组成，能够促进 mRNA翻译。利用 CaMV35S启动子串联 Ω因子调控的 CpTI基因转化烟草，转基因烟草中 CpTI的表达显著提高，但高效表达易引起转基因烟草的白化。
三,植物凝集素基因及其应用
1,基本特性
2,主要种类
3,抗虫原理
4,基因的应用
1,基本特性
植物凝集素 （ lectin） 是非兔疫来源的糖蛋 白 或 结 合 糖的 蛋 白质 (sugar-binding
protein),它们能聚集细胞和 （ 或 ） 沉淀糖蛋白 。
主要存在于细胞的蛋白粒中 。
最主要的特性是能和糖类结合 。
多数是一些寡聚蛋白,二聚体或四聚体,
少数含有两个糖结合部位的单体,如蓖麻毒蛋白 。
植物凝集素的蛋白质结构和基因结构有许多相似性 。
许多植物凝集素的一级结构,凝集素与配体结合物的三维立体结构或基因结构被测定 。
凝集素广泛存在于植物界,在各种组织器官中均有发现,尤以豆科植物的种子中含量最为丰富 。
2,主要种类
（ 1） 麦胚凝集素（ wheat germagg1utinin,Ｗ GA）
（ 2）雪花莲（ Galanthus nivalis,GNA ）凝集素
（ 3）豌豆外源凝集素（ pea-lectin,p-Lec）
麦胚凝集素：
是禾本科中典型的植物凝集素,有三种
WGAＩ,WGAII和 WGAIII,氨基酸组成相近 。 分子中甘氨酸和半胱氨酸含量很高,
极性氨基酸的含量很低,不含糖 。
雪花莲：
一级结构,生物合成以及基因结构已经清楚,由 105个氨基酸残基组成的成熟蛋白,
包括 3个重复性同源片段,每个约 25个氨基酸残基 。 对于蚜虫,叶蝉,稻褐飞虱等同翅目吸食性害虫具有极强的毒性,也能控制蚜虫一类的吸汁性害虫 。
豌豆外源凝集素：
由 275个氨基酸的组成的蛋白质 。 有活性的豌豆外源凝集素由以 α和 β两个亚基组成 。 能抑制豇豆象的生长 。
3,抗虫原理
当被昆虫取食后,外源凝集素在昆虫的消化道中与肠道围食膜上的糖蛋白专一性结合 （ 即不同的外源凝集素与相应的糖类结合 ）,从而影响营养的吸收 。
可能在昆虫的消化道内诱发病灶,促进消化道中细菌的繁殖 。
4,植物凝集素基因的应用
上述凝集素等的编码基因已经分离,并被成功地导入烟草和莴苣等植物中 。
用 CaMV35S启动子或水稻蔗糖合成酶基因启动子调控,转基因烟草对蚜虫表现出明显抗性 。
Bou1ter等 （ 1991） 豌豆凝集素基因的转基因烟草植株再与转 CpTI基因植株杂交,
获得了既能表达豌豆凝集素又能表达
CpTI的双价转基因烟草,其抗虫能力显著提高 。 这也表明了基因间的协同作用有可大大提高作物的抗性 。
Maddock等 （ 1990） 用基因枪转化玉米胚性悬浮系,获得的表达麦胚凝集素基因的转化植株对欧洲玉米螟具有良好的抗性 。
存在的问题：转基因植株是否对人,畜无害,还有待证实 。
四,淀粉酶抑制剂基因及其应用
1,基本特性
2,抗虫原理
3,应 用
1,基本特性
淀粉酶抑制剂 （ α-amylase inhibitor,α-AI）
是植物界普遍存在的一类蛋白质,它能抑制哺乳动物及昆虫体内的 α-淀粉酶的活性,
阻断对摄取食物中淀粉成分的消化 。
α-AI对植物本身和细菌的小 α-淀粉酶不起作用 。
α-AI作用的最适 pH值为 5.6,因此对鞘翅目昆虫 （ 消化道呈酸性的 ） 有良好抗性 。
α-AI的三种类型 （ 小麦和大麦 ）,
单体,12kD。 对黄粉虫,米象的抑制效果明显优于二聚体 。
二聚体,24kD。 对马铃薯甲虫,锯谷盗的抑制效果优于单体 。
四聚体,60kD。
2,抗虫原理
抑制昆虫消道内 α-淀粉酶的活性。
α-AI和淀粉酶结合成的 EI复合物刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈，产生厌食反应，最后导致非正常发育或死亡。
3,淀粉酶抑制剂基因的应用
Altabella等 （ 1990） 把菜豆 αAI基因导入烟草,并能准确,稳定地表达 。
分析表明：它对黄粉虫的肠道 α-淀粉酶具有显著的抑制效果,同时也抑制猪胰 α-淀粉酶的活性 。 对哺乳动物的淀粉酶抑制作用大大限制了其在生食作物基因工程中的应用 。
第三节抗植物病毒基因及其应用
病毒病引起的作物病害是十分严重的,仅以马铃薯为例,Χ病毒 (PVX)引起的产量损失可 10%,Y病毒 （ PVY） 引起的损失可达 80％,然而迄今杂交常规育种对病毒病的防治尚无良策 。 基因工程技术为培育抗病毒病的新品种开辟了途径 。 植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟 。
基因工程抗病毒的技术路线：
（ 1） 导入病毒外壳蛋白基因 。
（ 2） 利用病毒的卫星 RNA（ satellite RNA,Sat-RNA） 。
（ 3） 利用病毒非结构蛋白基因 （ 特别是复制酶 -
replicase基因 ） 。
（ 4） 缺损干扰颗粒 （ 人工构建 ）
（ defective interfering particle）
（ 5） 干扰素 （ interferon） 基因
（ 6） 利用反义 RNA技术
（ 7） 利用中和抗体法技术
（ 8） 设计核酶剪切病毒 RNA
第三节 抗植物病毒基因及其应用一,外源病毒外壳蛋白 （ coat protein,CＰ ） 基因二,病毒复制酶基因三,卫星 RNA
四,核糖体失活蛋白基因五,干扰素基因六,缺陷干扰颖粒一,外源病毒外壳蛋白 （ CＰ ） 基因
1,CP基因的抗病毒原理
2,转基因植株的特点
3,CP基因的应用
4,存在的问题
1,CP基因的抗病毒原理
当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后,立即被细胞中的自由 CP包裹,阻止了入侵病毒核酸的翻译和复制 。
在ＣＰ水平上抑制病毒脱壳。
导入的 CP基因都是缺失的不完整的,该类基因主要是缺少 AUG密码子,当这种不能被翻译的 CP基因或 CP基因的反义
RNA基因整合到植物染色体上后,能使转基因植株获得很好的抗性
说明这类转基因植株的抗性机理不是外壳蛋白在起作用，而可能是它们的 RNA转录体与入侵病毒 RNA之间相互作用。 。
许多种类病毒组及病毒的ＣＰ基因具有同源结构,在一定的条件下,一种ＣＰ基因将可能抗多种病毒 。
2,转基因植株的特点
抗性与ＣＰ表达量成正相关 。
在一定程度上延缓或减轻发病,不影响生长发育,孕性表现和生理表现 。
抗性可稳定地遗传给子代 。
抗性水平与整合到植物细胞中的 CP基因拷贝数有关,多拷贝的比单拷贝的抗性高 。
3,CP基因的应用
目前已被克隆的 CP基因：
TMV,马铃薯Ｘ病毒 （ potato virusX，
PVX）,黄瓜花叶病毒 (cucumber mosaic
virus,CMV),PVY,水稻条纹叶枯病毒
（ rice stripe virus virus,RSV）,TSWV、
PLRV,TRV,苜蓿花叶病毒 （ alfafa
mosaic virus,ALMV ）,洋李痘病毒
（ plum pox virus,PRV） 等 。
Monsanto公司在 1988年获得了表达 TMV
的 CP基因的番茄品种 VF36的转基因植株 。
在接种后表现出延迟发病,发病率小于
5%,产量几乎不受影响,而对照植株则
100%发病,果实减产 26-35%。
Monsanto公司 1990年把 PVX和 PVY的 CP
基因同时导入北美最重要的马铃薯品种Ｒ
usset Burbank,其中筛选出的一个转基因株系在接种条件下,完全抗 PVX和 PVY，
而田间试验表明,传毒蚜虫接种 16周后,转基因植株只有 8%的发病率,而对照植株的发病率却高达 79.3%。
荷兰 Wageningen农业大学把 TSWV的 CP
基因导入烟草 SR1,试验室接种实验表明,
转化植株获得了 90%的保护效果,而对照株在接种后 6天全部发病。
1991年日本国家农业环境所获得了水稻品种 Kinuhikari Nipponbai的转 RSV的 CP基因的抗纹叶枯病病毒的工程植株,接虫实验表明,转基因植株在 2-3周后,只有 3%-5%
的发病率,而对照植株的发病率为 95%-
100%。 这是禾本科作物中用基因工程获得抗病毒特性的第一例成功报道 。
奥地利的农林大学的科研人员把欧洲和整个地中海地区的核果实树的最重要的病毒
PVR 的ＣＰ基因导入杏 。
在国内,中科院微生物所等单位获得了烟草 NC89的双抗株系 （ 抗 MTV＋ CMV） 和单抗株系 （ 抗 TMV） 。 纯合系的大田试验表明,转基因植株的抗病毒效果达 70％ 。
已获得转 CP基因植株：烟草,马铃薯,
水稻,番茄,欧洲李和杏等 。
4,存在的问题
转基因植株对病毒的抗性水平不高,且仅限于特定的病毒或密切相关的病毒 。
转基因植株大多只是推迟发病,而不能彻底根治 。
二,病毒复制酶基因
1,抗病毒原理
2,应 用
3,特 点病毒复制酶基因：
是病毒非结构蛋白基因。复制酶一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成。
1,抗病毒机理
RNA转录体干扰病毒的复制 。
病毒非结构蛋白基因介导抗性 。
复制酶基因抑制病毒复制必须具备 2个条件,1.具有一定空间构象 。 2,不完整性 。
携有编码 54kD蛋白基因的转基因烟草中检测不到 54kD的蛋白产物,这说明很可能是其 RNA转录体干扰了病毒的复制
TMV的编码 126kD的完整基因导入植株后,
植株却未获得抗性；而若插入 1.4kD的核酸序列,使其基因失去功能,则能赋予植物抗性 。 。
把ＴＭＶ的ＲＮ A编码 126kD蛋白的通读部分 (readthrough)的 54kD（ 包含病毒复制酶核心功能团 ） 的基因导入烟草,转基因烟草对 TMV表现出很高的抗性 (接毒
500μg/ml,植株不发病 )。 很可能是不完整的复制酶亚基基因赋予了植物细胞这种抗性 。
2,病毒复制酶基因特点
病毒复制酶基因所介导的抗性强。远远强于ＣＰ基因介导的抗性。即使对转基因植株使用高浓度的病毒或其 RNA，仍具有明显抗性。
3,病毒复制酶基因的应用
用豌豆早褐病毒 （ PEBV） 221kD的复制酶中相当于 TMV的 54kD部分的核酸片段转化烟草,获得的转基因植株对高达
1000μg/ml的接种量仍具有高度抗性 。
将编码 CMV复制酶的二个亚基的缺失的
cDNA转入烟草,工程植株可抗 500μg/ml
的病毒或 100μg/ml RNA的接种量 。
三,卫星 RNA
1,抗病毒原理
2,应 用
3,存在问题卫星 RNA：
卫星 RNA是多核苷酸,它们有时在其相伴病毒中被发现 。 它们按照相伴病毒的复制和传播机制,从一个植株传到别一个植株 。 它们不与其相伴病毒的核苷酸序列同源,对病毒的复制也不起作用 。 但是卫星 RNA具有改变其相伴病毒的致病力的能力 。
1,抗病毒原理
相应病毒侵入植物细胞,其卫星 RNA被激活和放大,对病毒产生抗性 。
抗性水平不因病毒的接种量而降低 。
植物细胞中只要有低浓度的卫星 RNA的转录体即可产生抗性 。
2,病毒卫星 RNA的应用
目前获得一些带有病毒卫星 RNA的转基因植株。如，表达 CMV和烟草环斑病毒
（ TRV）的卫星序列的转基因烟草植株。
当被其相应的病毒侵染时，其发病症状减轻。
3,存在问题
只有少数植物病毒含有卫星 RNA,限制了应用范围 。
卫星 RNA有可能被其自然的病毒载体包装并释放到环境中 。
一个核甘酸的突变可能会造成严重病状,
或病毒卫星 RNA和植物卫星 RNA重组,从而产生一种难以预料的病症 。
有些卫星 RNA能够增强病毒的致病力 。
四,核糖体失活蛋白基因
1,RIP分类
2,RIP作用机理
3,RIP基因的应用是一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白,
广泛存在于高等植物中,含量丰富 。
核糖体失活蛋白：
（ ribosome-inactivating protein,RIP）
１,RIP分类据结构可为 2种类型：
I型 RIP：
是单链碱性蛋白质 。 分子量约为 30kD,带有或不带有糖基,但其生物活性都一样,都具有抑制无细胞蛋白质生物合成的作用,对完整细胞或动物呈无毒或低毒 。
II型 RIP：
是由 A,B两条肽链通过二硫键组成的二聚体 。
分子量约为 60kD。 其 A链与 I型 RIP同源呈酸性或碱性,是毒性分子,B链是凝集素,能结合到细胞膜表面并协助 A链进入细胞 。
２,RIP作用机理
RIP选择性作用于 60S核糖体大亚基,抑制肽链延伸 。
大多数植物和细菌中的 RIP是通过它的 N
一糖苷酶 （ N-g1ycosidase） 活性来抑制蛋白质合成的功能 。 它特异地作用于 28Ｓ
rRNA的第 4324位核苷酸的腺瞟呤与核糖之间的 N一糖苷键,进行水解,除掉腺瞟呤,使核糖体失活,不能合成蛋白质 。
真菌中的 RIP则通过其核酸酶 （ RNase）
活性起作用,RIP专一水解真核细胞核糖体 28Ｓ rRNA第 4325和 4326位核苷酸之间的磷酸二酯键 。
不同的 RIP分别对于病毒,真菌和昆虫具有不同的抗性 。
能使植物获得广谱抗性 。
商陆抗病毒蛋白
(pokeweed antiviral protein,PAP)
抗植物和动物的多种不同病毒 。 现已分别从商陆的春叶,夏叶和种子中分离出三种
PAP,分子量分别为 29kD,30Kd,31kD。
均不含糖的单链 RIP。
PAP抑制病毒,使病毒不能制造自身的蛋白,同时也不能利用寄主细胞的蛋白 。
３,RIP基因的应用
Monsanto公司克隆了编码 PAP的基因 。 通过农杆菌介导,把该基固导入烟草和马铃薯细胞,并获得了转基因植株 。
含高浓度的 PAP（ ＞１ 0ng／ mg蛋白 ） 的转基因烟草植株生长发育缓慢,患叶斑病,
而且败育 。 含较低浓度的 PAP（ 1～ 5ng／
mg蛋白 ） 的植株生长正常 。
五,干扰素基因
1,抗病毒原理
2,干扰素基因的应用
1,抗病毒原理
干扰素是一类分子量小的蛋白质,能结合在细胞质膜上,并导致抗病毒态的形成 。
干扰素促进寡核苷酸合成酶,核酸内切酶和激酶的产生,导致抗病毒态 。 三种酶平时处于静止状态,当细胞被病毒感染后才活化,活化后通过两种不同途径来阻断蛋白质的合成 。 一是活化后的激酶将蛋白质合成过程中所需的起始因子磷酸化,
使其丧失活性 。 二是由寡聚腺苷酸激活一种核酸内切酶,降解 mRNA。
干扰素作用特别强,且赋予细胞对病毒的广谱抗性 。
2.干扰素基因的应用
爱沙尼亚科学院,芬兰农业研究中心及赫尔辛基大学的研究人员共同合作,把大鼠中编码干扰素之一的 2ˊ,5ˊ －寡腺苷酸合成酶的基因导入马铃薯,获得转基因植株,用 PVX进行浸染,叶和块茎里的病毒浓度显著低于未转化的对照 。
效果好于ＣＰ基因的效果 。
六,缺陷于扰颖粒及其利用
缺陷干扰颗粒 （ defective interfering,DI）,
是指序列与亲本病毒相关,但必须依赖于病毒才能复制的 RNA分子 。
在自然界中,这种分子存在于多种动物病毒和植物病毒中 。
与卫星 RNA的区别,DI颗粒和病毒核酸同源,
DI颗粒直接来源于病毒的核酸序列 。
与反义 RNA的区别,DI颗粒是利用有义 RNA去竞争病毒复制酶的结合位点,从而干扰病毒复制 。
Marsh等发现用大麦花叶病毒 （ barely mosaic
virus,BMV） 的 RNA2构建的 DＩ颗粒在大麦原生质体内对病毒的复制有干扰 。 而 Stan1ey等人则从非洲木薯花叶病毒 （ ACMV） 中克隆了缺陷干扰颗粒 DNAB。 经串联重复后导入烟草,
获得的转基因植株抗 ACMV的感染 。
1,育种周期短,效率高,成本低 。
2,提高产量和品质 。
3,降低生产成本 。
4,防止化学农药污染,避免破坏生态平衡 。
5,克服亲本基因资源缺乏 。
6,抗性性状具有连续性和整体性。
二、抗性基因的来源根据基因来源分为三类：
1.植物组织 如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 。
2,动物 如杀菌肽 （ cecropins） 基因 。
3,微生物 如 Bt杀虫结晶蛋白基因 。
三、抗性基因分类据基因的作用功能和对象分为：
1,抗虫基因 。
2,抗病毒基因 。
3,抗真菌和细菌基因 。
第二节抗植物虫害基因及其应用一,Bt基因及其应用二、蛋白酶抑制剂基因及其应用三、植物凝集素基因及其应用四、淀粉酶抑制剂基因及其应用一,Bt基因及其应用
1,Bt基因的作用原理
2,ICP的分类、结构及抗虫谱
3,Bt基因的应用
4,存在的问题及对策
1,Bt基因的作用原理
Bt基因,是从微生物苏云金杆菌（ Bacillus thu-
ringicnsis）分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因,简称 Bt基因。
苏云金杆菌属于革兰氏阴性，形成孢子细菌。在芽胞形成过程中，可产生伴胞晶体，它由一种或多种蛋白组成，具有高度特异性杀虫活性，这种蛋白通常被称作 δ-内毒素（ δ-endotoxins）或杀虫结晶蛋白（ in-secticidal crysta1 protein,ICP）。
作用原理：
ICP通常以原毒素 （ protoxin） 形式存在,当昆虫取食 ICP后,原毒素在昆虫的消化道内被活化,转型为毒性多肽分子 。
活化的 ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异性结合蛋白结合,全部或部分嵌合于细胞膜中,使细胞膜产生一些孔道,细胞因渗透平衡糟破坏而破裂 。 导致昆虫幼虫停止进食,最终死亡 。
ICP的活化过程：
首先 ICP溶解在昆虫的肠道里 （ ICP在碱性条件可溶,而在中性条件下不溶 ）,然后,
在蛋白酶的作用下,通过专一性蛋白酶水解切割,ICP被活化 。
活化的 ICP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破坏 。
2,ICP的分类、结构及抗虫谱
据抗虫谱和序列同源性分为四种类型：
类型 I （ Cry I） 抗鳞翅目 （ Lepidoptera） 昆虫,
对其幼虫有特异的毒性作用 。
类型 II （ CryII） 抗鳞翅目和双翅目 （ Diptera） 。
类型 III（ CryIII） 抗鞘翅目 （ Coleoptera） 昆虫 。
类型 IVw（ CryIV） 抗双翅目 （ Diptera） 昆虫 。
类型 V（ CryV） 抗鳞翅目和鞘翅目 。
近年 Payne等人则发现了具有抗膜翅目 （ H ym en o - p t er a） 以及抗线虫
（ N e m a t o d e s ） 的 I C P 。
在每种主要类型中,据序列同源性,
ICP又划分为若干亚类例如,CryI 又分为 IA(a),IA(b)、
IA(c),I B,IC等 。
ICP的结构
CryＩ蛋白为长 1100～ 1200个氨基酸的多肽,大小为 130～ 140kD,其毒性多肽分子是约 60～ 70kD的核心片段 。 活性区在氨基端,而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列没有毒性功能 。
只保留编码毒性核心片段的核苷酸序列就能达到抗虫目的。
如,Bt2编码的最短毒性片段位于 29至
607氨基酸残基处，进一步从基因 3′端删除
4个密码子（ codon）或从 5′端删除 8个密码子，将完全丧失产物的毒性功能。
3,Bt基因的应用
1987年比利时的 Vacek等人利用农杆菌介导法首次获得了转基因烟草植株 。
他们使用全长的 CryIA（ b） 基因编码
1155个氨基酸和该基因保留了 5ˊ 端编码毒蛋白核心区域的缺失片段 （ 编码 610个氨基酸 ） 。 转基因植株对烟草天蛾 （ Manduca
Sexta） 幼虫的抗性为 75％ ～ 100％ 。
美国 Monsanto公司的 Fischhoff等人 （ 1987
年 ） 获得转 Bt基因的番茄植株 。
他们用带有 CaMV35S 启动子的
CryIA(b)基因转化番茄品系 VF36。 获得了对烟草天蛾显示出高抗虫活性的转基因植株 。 但因 ICP表达水平低,对番茄果螟
（ Heliothis virescens） 的抗性不强 。
目前全世界已有许多不同类型的
ICP基因转入多种作物，如烟草、
番茄、玉米、棉花、水稻、苹果、
核桃等。
研究结果表明：一般用全长 CryIA基因转化植物,ICP在转基因植物中表达量很低,甚至检测不到,其抗虫效果差或不具抗虫性 。 在高抗虫性的转基因植株中,
每毫克可溶性蛋白中约有 2.6～ 190ng的
ICP。
4,存在的问题及对策
（ 1） ICP在植物中表达水平低
（ 2）昆虫对 ICP产生抗性
（ 3）抗菌谱窄
（ 1） ICP在植物中表达水平低原因,
主要是 mRNA不稳定和翻译效率低 。
天然的 Bt基因富含 A,T碱基,而植物基因富含 G,C碱基,可能导致 Bt基因转录的末成熟终止 （ premature transcription
termination） 及不适当的切割 。
因密码子上的差异也可能使 Bt基因在植物细胞的转录过程中形成二级结构,
mRNA的特定序列被降解和翻译效率降低 。
为提高富含 A,T碱基的 Bt基因在富含 G、Ｃ碱基的植物细胞中表达水平。有人对 CryI基因进行了部分甚至完全的修饰。
修饰后的 CryI基因在转基因棉花、烟草、
番茄和玉米中的表达水平有了显著提高。
对策 1：修饰 Bt基因，改造密码子。
Monsanto公司的 Per1ak等人在不改变氨基酸序列的情况下，对 CryIA(b)和 CryIA(c)基因进行修饰（主要是去除富含 A,T 碱基序列），
使 CryIA(b)和 CryI(c)的表达水平提高了 100倍，
CryIA(b)和 CryI(c)蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的 0.05％～ 0.1％，获得良好的抗虫效果，
其中转基因棉花植株对棉铃虫（ Heliothis
armingera）的抗性达 80％。
对策 2：使用新启动子（包括组织特异性启动子）
Koziel等人合成了一个富含 G,C碱基的
CryIA(b)基因,该合成基因编码 CryIA(b)的部分氨基酸,与野生型 CryIA(b)基因只有 65％
的同源性 。 并用适合在玉米中表达的密码子替代原细菌密码子 。
利用基因枪把该基因导入玉米品种。使用
3种启动子：
1,CaMV35S启动子。
2,玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)
启动子。
3,玉米花粉特异性启动子调控。
后两种启动子调控下的 CryIA(b)基因在转基因玉米植株中显示出明显的组织特异性。
即在绿色组织中,CryIA(b)基因强烈表达，
占可溶性蛋白 0,1％～ 0.4％。
对策 3,寻找新一代启动子除组织特异性启动子外,研究人员也寻找第二代启动子来提高 ICP基因的表达水平 。
例如,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子和叶绿体转运肽,可以使转基因烟草中的 CryIA(ｃ ) 表达量提高 10-20倍 。
（ 2） 昆虫对 ICP产生抗性对策 1：使用组织专一性或化学诱导启动子 。
使用组织专一启动子，可使 Bt基因的表达局限在植物重要的组织。
例如，只在棉花的棉铃中表达，末经选择的害虫能在叶片上存活。
病原相关蛋白（ pathogen-sis-related
protein,即 PR蛋白）是植物受到病原物侵染或其它刺激时表达的一组蛋白。 PR-la是编码其中一种 PR蛋白的基因,可因侵染而被诱导,也可被一些化学刺激物 (包括水杨酸和聚丙酰酸 )诱导。
目前,CIBA的研究小组已经获得带
PR- la启动子调控 Bt基因的转基因烟草。
用化学药剂处理该基因烟草，它对烟草天蛾产生抗性。因此采用上述化学诱导启动子的方法可以调控 Bt基因在化学诱导剂存在下才能表达,从而降低抗性的选择压产生,以防止抗性扩散。
对策 2：修饰 Bt基因,使 ICP在植物中高剂量表达。
迄今，目前发现的高水平的 Bt抗性基因都是隐性基因,而且 ICP对害虫的幼虫特别有效,所以 Bt基因的连续、高剂量表达，可以消除突变杂合体。
对策 3：使用两种以上的 Bt基因或 Bt
与其它抗虫基因结合使用。
除非抗性位点出现的频率很高和毒蛋白剂量低到杂合体可以存活，
否则昆虫几乎不可能对两种独立杀虫蛋白同时产生耐受性。
对策 4：将转与非转基因的植株混种在繁育群体中保留一部分末经选择的害虫,防止害虫对 Bt基因的抗性扩散 。
（ 3） 抗菌谱窄对 策：
采用多基因导入策略，利用基因之间的协同拟菌作用，向植物体内同时导入多个基因。
二,蛋白酶抑制剂（ PI）基因及其应用
1,PI基因的抗虫原理
2,PI的分类及抗虫谱
3,PI基因的应用
是一类蛋白质,在植物防御昆虫和病原体侵染的天然防御系统中起着重要作用,具有明显的抗虫作用的蛋白质 。
PI基因的抗虫谱广泛，可抗几个目的昆虫。
蛋白酶抑制剂 （ proteinase in-
hibitor,PI）：
PI存在于自然界的所有生命体中，在大多数植物的种子和块茎中的含量可高达总蛋白的 1％ -10％。在有些果实中丝氨蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的 30％。
1,PI基因的抗虫原理
（ 1） PI与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合,形成酶抑制剂复合物 （ EＩ ）,从而阻断或减弱蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用,导致蛋白质不能被正常消化 。
（ 2） EI复合物能刺激昆虫过量分泌消化酶，
使昆虫产生厌食反应。停止进食而缺乏代谢所需的 一些氨基酸，导致昆虫发育不正常或死亡。
（ 3） 蛋白酶抑制剂分子可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统,从而严重干扰昆虫的蜕皮过程和兔疫功能,以致昆虫不能正常发育 。
PI的作用特点,
（ 1） PI作用于蛋白消化酶的活性中心 。 活性中心是酶最保守的部位,产生突变的可能性极小,故可以排除害虫通过突变产生抗性的可能性 。
（ 2） PI对于人,畜无害,因人,畜与昆虫的消化机理明显不同 。 人,畜的蛋白消化酶主要存在于肠道中,而 PI在胃中的酸性条件下,被胃蛋白酶分解 。
2,PI的分类及抗虫谱植物中存在三类：
（ 1） 丝氨酸蛋白酶抑制剂
（ 2） 巯基蛋白酶抑制剂
（ 3） 金属蛋白酶抑制剂
（ 1） 丝氨酸类蛋白酶抑制剂
大多数昆虫所利用的蛋白消化酶是丝氨酸类蛋白消化酶,特别是类胰蛋白酶,因此抗虫效果明显,
丝氨酸类蛋白酶抑制剂有 6种,最有效的有,
豇豆胰蛋白酶抑制剂 （ CpTI） 和 马铃薯蛋白酶抑制剂 （ patato inhibitor,PI）
豇豆胰蛋白酶抑制剂 （ CpTI）,
抗虫谱广泛,抗虫效果最理想 。 抗鳞翅目,鞘翅目,直翅目 。
CpTI 是由 80 个氨基酸组成的小分子多肽，分子中富含二硫键，它的一个分子具有两个抑制活性中心。 CpTI与胰蛋白酶紧密结合，使酶活性中心失活。
马铃薯蛋白酶抑制剂
（ patato inhibitor,PI）：
有 2类,PI-I家族和 PI-II家族
PI-I家族,
包括马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂 I，其成熟肽单体分子量为 8.1kD，
只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶
PI-II家族,
包括马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂 II，
其成熟肽单体分子量为 12.3kD,有两个活性中心,可分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋肉酶 。
PI-II比 PI-I抗虫效果好 。 对烟草天蛾等一龄幼虫抗性明显 。
（ 2） 巯基蛋白酶抑制剂
对利用巯基蛋白酶消化植物蛋白的昆虫具有特殊抗性 。
水稻巯基蛋白酶抑制剂 （ oryzacystatin） 是抗虫能力较强的一种 PI。 其基因序列内有两个内含子,cDNA编码 102个氨基酸的小肽,分子量约为１ 1,5kD,分子中部第 52位后的Ｇ ln-Val-
Val-Ala-Gly具有高度保守性,该保守区对于维持抑制剂活力是必要的 。
3,蛋白酶抑制剂基因的应用
1987年,英国 Durham大学的 Hilder
等把编码 CpTI的 cDNA转移到烟草品种 Sam-sun NN中,首先获得转 CpTI
基因的工程植株 。
该 cDNA长 550bP，由 CaMV35S启动子调控。获得的烟草转基因植株能够正确表达
CpTI基因，有的转基因植株中 CpTI的表达量高达 9.6μg／ mg可溶性蛋白。而 CpTI
的表达量达到 5μg／ mg可溶性蛋白时，转基因植株就表现出明显的抗虫性。
目前已把 CpTI 基因转移到许多有重要经济价值的植物中，如，水稻、油菜、白薯、苹果和杨树等。
目前已经有许多种蛋白酶抑制剂的基因或
cDNA被克隆,其中有些表现出明显的抗虫作用 。
CpTI基因,PI-II基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因是植物抗虫基因工程中应用最广,
研究较深入的蛋白酶抑制剂基因 。
提高 PI基因表达水平的对策：
深入研究基因表达的调控机理 。
使用特定启动子
修饰蛋白酶抑制剂基因 。
中科院遗传研究所利用不同的启动子和 Ω
因子对 CpIT基因进行修饰，得到不同的植物表达质粒。其中 Ω因子来自烟草花叶病毒（ TMV） 126kD蛋白基因转录序列
5ˊ 未端的非转译区，由 68bp组成，能够促进 mRNA翻译。利用 CaMV35S启动子串联 Ω因子调控的 CpTI基因转化烟草，转基因烟草中 CpTI的表达显著提高，但高效表达易引起转基因烟草的白化。
三,植物凝集素基因及其应用
1,基本特性
2,主要种类
3,抗虫原理
4,基因的应用
1,基本特性
植物凝集素 （ lectin） 是非兔疫来源的糖蛋 白 或 结 合 糖的 蛋 白质 (sugar-binding
protein),它们能聚集细胞和 （ 或 ） 沉淀糖蛋白 。
主要存在于细胞的蛋白粒中 。
最主要的特性是能和糖类结合 。
多数是一些寡聚蛋白,二聚体或四聚体,
少数含有两个糖结合部位的单体,如蓖麻毒蛋白 。
植物凝集素的蛋白质结构和基因结构有许多相似性 。
许多植物凝集素的一级结构,凝集素与配体结合物的三维立体结构或基因结构被测定 。
凝集素广泛存在于植物界,在各种组织器官中均有发现,尤以豆科植物的种子中含量最为丰富 。
2,主要种类
（ 1） 麦胚凝集素（ wheat germagg1utinin,Ｗ GA）
（ 2）雪花莲（ Galanthus nivalis,GNA ）凝集素
（ 3）豌豆外源凝集素（ pea-lectin,p-Lec）
麦胚凝集素：
是禾本科中典型的植物凝集素,有三种
WGAＩ,WGAII和 WGAIII,氨基酸组成相近 。 分子中甘氨酸和半胱氨酸含量很高,
极性氨基酸的含量很低,不含糖 。
雪花莲：
一级结构,生物合成以及基因结构已经清楚,由 105个氨基酸残基组成的成熟蛋白,
包括 3个重复性同源片段,每个约 25个氨基酸残基 。 对于蚜虫,叶蝉,稻褐飞虱等同翅目吸食性害虫具有极强的毒性,也能控制蚜虫一类的吸汁性害虫 。
豌豆外源凝集素：
由 275个氨基酸的组成的蛋白质 。 有活性的豌豆外源凝集素由以 α和 β两个亚基组成 。 能抑制豇豆象的生长 。
3,抗虫原理
当被昆虫取食后,外源凝集素在昆虫的消化道中与肠道围食膜上的糖蛋白专一性结合 （ 即不同的外源凝集素与相应的糖类结合 ）,从而影响营养的吸收 。
可能在昆虫的消化道内诱发病灶,促进消化道中细菌的繁殖 。
4,植物凝集素基因的应用
上述凝集素等的编码基因已经分离,并被成功地导入烟草和莴苣等植物中 。
用 CaMV35S启动子或水稻蔗糖合成酶基因启动子调控,转基因烟草对蚜虫表现出明显抗性 。
Bou1ter等 （ 1991） 豌豆凝集素基因的转基因烟草植株再与转 CpTI基因植株杂交,
获得了既能表达豌豆凝集素又能表达
CpTI的双价转基因烟草,其抗虫能力显著提高 。 这也表明了基因间的协同作用有可大大提高作物的抗性 。
Maddock等 （ 1990） 用基因枪转化玉米胚性悬浮系,获得的表达麦胚凝集素基因的转化植株对欧洲玉米螟具有良好的抗性 。
存在的问题：转基因植株是否对人,畜无害,还有待证实 。
四,淀粉酶抑制剂基因及其应用
1,基本特性
2,抗虫原理
3,应 用
1,基本特性
淀粉酶抑制剂 （ α-amylase inhibitor,α-AI）
是植物界普遍存在的一类蛋白质,它能抑制哺乳动物及昆虫体内的 α-淀粉酶的活性,
阻断对摄取食物中淀粉成分的消化 。
α-AI对植物本身和细菌的小 α-淀粉酶不起作用 。
α-AI作用的最适 pH值为 5.6,因此对鞘翅目昆虫 （ 消化道呈酸性的 ） 有良好抗性 。
α-AI的三种类型 （ 小麦和大麦 ）,
单体,12kD。 对黄粉虫,米象的抑制效果明显优于二聚体 。
二聚体,24kD。 对马铃薯甲虫,锯谷盗的抑制效果优于单体 。
四聚体,60kD。
2,抗虫原理
抑制昆虫消道内 α-淀粉酶的活性。
α-AI和淀粉酶结合成的 EI复合物刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈，产生厌食反应，最后导致非正常发育或死亡。
3,淀粉酶抑制剂基因的应用
Altabella等 （ 1990） 把菜豆 αAI基因导入烟草,并能准确,稳定地表达 。
分析表明：它对黄粉虫的肠道 α-淀粉酶具有显著的抑制效果,同时也抑制猪胰 α-淀粉酶的活性 。 对哺乳动物的淀粉酶抑制作用大大限制了其在生食作物基因工程中的应用 。
第三节抗植物病毒基因及其应用
病毒病引起的作物病害是十分严重的,仅以马铃薯为例,Χ病毒 (PVX)引起的产量损失可 10%,Y病毒 （ PVY） 引起的损失可达 80％,然而迄今杂交常规育种对病毒病的防治尚无良策 。 基因工程技术为培育抗病毒病的新品种开辟了途径 。 植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟 。
基因工程抗病毒的技术路线：
（ 1） 导入病毒外壳蛋白基因 。
（ 2） 利用病毒的卫星 RNA（ satellite RNA,Sat-RNA） 。
（ 3） 利用病毒非结构蛋白基因 （ 特别是复制酶 -
replicase基因 ） 。
（ 4） 缺损干扰颗粒 （ 人工构建 ）
（ defective interfering particle）
（ 5） 干扰素 （ interferon） 基因
（ 6） 利用反义 RNA技术
（ 7） 利用中和抗体法技术
（ 8） 设计核酶剪切病毒 RNA
第三节 抗植物病毒基因及其应用一,外源病毒外壳蛋白 （ coat protein,CＰ ） 基因二,病毒复制酶基因三,卫星 RNA
四,核糖体失活蛋白基因五,干扰素基因六,缺陷干扰颖粒一,外源病毒外壳蛋白 （ CＰ ） 基因
1,CP基因的抗病毒原理
2,转基因植株的特点
3,CP基因的应用
4,存在的问题
1,CP基因的抗病毒原理
当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后,立即被细胞中的自由 CP包裹,阻止了入侵病毒核酸的翻译和复制 。
在ＣＰ水平上抑制病毒脱壳。
导入的 CP基因都是缺失的不完整的,该类基因主要是缺少 AUG密码子,当这种不能被翻译的 CP基因或 CP基因的反义
RNA基因整合到植物染色体上后,能使转基因植株获得很好的抗性
说明这类转基因植株的抗性机理不是外壳蛋白在起作用，而可能是它们的 RNA转录体与入侵病毒 RNA之间相互作用。 。
许多种类病毒组及病毒的ＣＰ基因具有同源结构,在一定的条件下,一种ＣＰ基因将可能抗多种病毒 。
2,转基因植株的特点
抗性与ＣＰ表达量成正相关 。
在一定程度上延缓或减轻发病,不影响生长发育,孕性表现和生理表现 。
抗性可稳定地遗传给子代 。
抗性水平与整合到植物细胞中的 CP基因拷贝数有关,多拷贝的比单拷贝的抗性高 。
3,CP基因的应用
目前已被克隆的 CP基因：
TMV,马铃薯Ｘ病毒 （ potato virusX，
PVX）,黄瓜花叶病毒 (cucumber mosaic
virus,CMV),PVY,水稻条纹叶枯病毒
（ rice stripe virus virus,RSV）,TSWV、
PLRV,TRV,苜蓿花叶病毒 （ alfafa
mosaic virus,ALMV ）,洋李痘病毒
（ plum pox virus,PRV） 等 。
Monsanto公司在 1988年获得了表达 TMV
的 CP基因的番茄品种 VF36的转基因植株 。
在接种后表现出延迟发病,发病率小于
5%,产量几乎不受影响,而对照植株则
100%发病,果实减产 26-35%。
Monsanto公司 1990年把 PVX和 PVY的 CP
基因同时导入北美最重要的马铃薯品种Ｒ
usset Burbank,其中筛选出的一个转基因株系在接种条件下,完全抗 PVX和 PVY，
而田间试验表明,传毒蚜虫接种 16周后,转基因植株只有 8%的发病率,而对照植株的发病率却高达 79.3%。
荷兰 Wageningen农业大学把 TSWV的 CP
基因导入烟草 SR1,试验室接种实验表明,
转化植株获得了 90%的保护效果,而对照株在接种后 6天全部发病。
1991年日本国家农业环境所获得了水稻品种 Kinuhikari Nipponbai的转 RSV的 CP基因的抗纹叶枯病病毒的工程植株,接虫实验表明,转基因植株在 2-3周后,只有 3%-5%
的发病率,而对照植株的发病率为 95%-
100%。 这是禾本科作物中用基因工程获得抗病毒特性的第一例成功报道 。
奥地利的农林大学的科研人员把欧洲和整个地中海地区的核果实树的最重要的病毒
PVR 的ＣＰ基因导入杏 。
在国内,中科院微生物所等单位获得了烟草 NC89的双抗株系 （ 抗 MTV＋ CMV） 和单抗株系 （ 抗 TMV） 。 纯合系的大田试验表明,转基因植株的抗病毒效果达 70％ 。
已获得转 CP基因植株：烟草,马铃薯,
水稻,番茄,欧洲李和杏等 。
4,存在的问题
转基因植株对病毒的抗性水平不高,且仅限于特定的病毒或密切相关的病毒 。
转基因植株大多只是推迟发病,而不能彻底根治 。
二,病毒复制酶基因
1,抗病毒原理
2,应 用
3,特 点病毒复制酶基因：
是病毒非结构蛋白基因。复制酶一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成。
1,抗病毒机理
RNA转录体干扰病毒的复制 。
病毒非结构蛋白基因介导抗性 。
复制酶基因抑制病毒复制必须具备 2个条件,1.具有一定空间构象 。 2,不完整性 。
携有编码 54kD蛋白基因的转基因烟草中检测不到 54kD的蛋白产物,这说明很可能是其 RNA转录体干扰了病毒的复制
TMV的编码 126kD的完整基因导入植株后,
植株却未获得抗性；而若插入 1.4kD的核酸序列,使其基因失去功能,则能赋予植物抗性 。 。
把ＴＭＶ的ＲＮ A编码 126kD蛋白的通读部分 (readthrough)的 54kD（ 包含病毒复制酶核心功能团 ） 的基因导入烟草,转基因烟草对 TMV表现出很高的抗性 (接毒
500μg/ml,植株不发病 )。 很可能是不完整的复制酶亚基基因赋予了植物细胞这种抗性 。
2,病毒复制酶基因特点
病毒复制酶基因所介导的抗性强。远远强于ＣＰ基因介导的抗性。即使对转基因植株使用高浓度的病毒或其 RNA，仍具有明显抗性。
3,病毒复制酶基因的应用
用豌豆早褐病毒 （ PEBV） 221kD的复制酶中相当于 TMV的 54kD部分的核酸片段转化烟草,获得的转基因植株对高达
1000μg/ml的接种量仍具有高度抗性 。
将编码 CMV复制酶的二个亚基的缺失的
cDNA转入烟草,工程植株可抗 500μg/ml
的病毒或 100μg/ml RNA的接种量 。
三,卫星 RNA
1,抗病毒原理
2,应 用
3,存在问题卫星 RNA：
卫星 RNA是多核苷酸,它们有时在其相伴病毒中被发现 。 它们按照相伴病毒的复制和传播机制,从一个植株传到别一个植株 。 它们不与其相伴病毒的核苷酸序列同源,对病毒的复制也不起作用 。 但是卫星 RNA具有改变其相伴病毒的致病力的能力 。
1,抗病毒原理
相应病毒侵入植物细胞,其卫星 RNA被激活和放大,对病毒产生抗性 。
抗性水平不因病毒的接种量而降低 。
植物细胞中只要有低浓度的卫星 RNA的转录体即可产生抗性 。
2,病毒卫星 RNA的应用
目前获得一些带有病毒卫星 RNA的转基因植株。如，表达 CMV和烟草环斑病毒
（ TRV）的卫星序列的转基因烟草植株。
当被其相应的病毒侵染时，其发病症状减轻。
3,存在问题
只有少数植物病毒含有卫星 RNA,限制了应用范围 。
卫星 RNA有可能被其自然的病毒载体包装并释放到环境中 。
一个核甘酸的突变可能会造成严重病状,
或病毒卫星 RNA和植物卫星 RNA重组,从而产生一种难以预料的病症 。
有些卫星 RNA能够增强病毒的致病力 。
四,核糖体失活蛋白基因
1,RIP分类
2,RIP作用机理
3,RIP基因的应用是一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白,
广泛存在于高等植物中,含量丰富 。
核糖体失活蛋白：
（ ribosome-inactivating protein,RIP）
１,RIP分类据结构可为 2种类型：
I型 RIP：
是单链碱性蛋白质 。 分子量约为 30kD,带有或不带有糖基,但其生物活性都一样,都具有抑制无细胞蛋白质生物合成的作用,对完整细胞或动物呈无毒或低毒 。
II型 RIP：
是由 A,B两条肽链通过二硫键组成的二聚体 。
分子量约为 60kD。 其 A链与 I型 RIP同源呈酸性或碱性,是毒性分子,B链是凝集素,能结合到细胞膜表面并协助 A链进入细胞 。
２,RIP作用机理
RIP选择性作用于 60S核糖体大亚基,抑制肽链延伸 。
大多数植物和细菌中的 RIP是通过它的 N
一糖苷酶 （ N-g1ycosidase） 活性来抑制蛋白质合成的功能 。 它特异地作用于 28Ｓ
rRNA的第 4324位核苷酸的腺瞟呤与核糖之间的 N一糖苷键,进行水解,除掉腺瞟呤,使核糖体失活,不能合成蛋白质 。
真菌中的 RIP则通过其核酸酶 （ RNase）
活性起作用,RIP专一水解真核细胞核糖体 28Ｓ rRNA第 4325和 4326位核苷酸之间的磷酸二酯键 。
不同的 RIP分别对于病毒,真菌和昆虫具有不同的抗性 。
能使植物获得广谱抗性 。
商陆抗病毒蛋白
(pokeweed antiviral protein,PAP)
抗植物和动物的多种不同病毒 。 现已分别从商陆的春叶,夏叶和种子中分离出三种
PAP,分子量分别为 29kD,30Kd,31kD。
均不含糖的单链 RIP。
PAP抑制病毒,使病毒不能制造自身的蛋白,同时也不能利用寄主细胞的蛋白 。
３,RIP基因的应用
Monsanto公司克隆了编码 PAP的基因 。 通过农杆菌介导,把该基固导入烟草和马铃薯细胞,并获得了转基因植株 。
含高浓度的 PAP（ ＞１ 0ng／ mg蛋白 ） 的转基因烟草植株生长发育缓慢,患叶斑病,
而且败育 。 含较低浓度的 PAP（ 1～ 5ng／
mg蛋白 ） 的植株生长正常 。
五,干扰素基因
1,抗病毒原理
2,干扰素基因的应用
1,抗病毒原理
干扰素是一类分子量小的蛋白质,能结合在细胞质膜上,并导致抗病毒态的形成 。
干扰素促进寡核苷酸合成酶,核酸内切酶和激酶的产生,导致抗病毒态 。 三种酶平时处于静止状态,当细胞被病毒感染后才活化,活化后通过两种不同途径来阻断蛋白质的合成 。 一是活化后的激酶将蛋白质合成过程中所需的起始因子磷酸化,
使其丧失活性 。 二是由寡聚腺苷酸激活一种核酸内切酶,降解 mRNA。
干扰素作用特别强,且赋予细胞对病毒的广谱抗性 。
2.干扰素基因的应用
爱沙尼亚科学院,芬兰农业研究中心及赫尔辛基大学的研究人员共同合作,把大鼠中编码干扰素之一的 2ˊ,5ˊ －寡腺苷酸合成酶的基因导入马铃薯,获得转基因植株,用 PVX进行浸染,叶和块茎里的病毒浓度显著低于未转化的对照 。
效果好于ＣＰ基因的效果 。
六,缺陷于扰颖粒及其利用
缺陷干扰颗粒 （ defective interfering,DI）,
是指序列与亲本病毒相关,但必须依赖于病毒才能复制的 RNA分子 。
在自然界中,这种分子存在于多种动物病毒和植物病毒中 。
与卫星 RNA的区别,DI颗粒和病毒核酸同源,
DI颗粒直接来源于病毒的核酸序列 。
与反义 RNA的区别,DI颗粒是利用有义 RNA去竞争病毒复制酶的结合位点,从而干扰病毒复制 。
Marsh等发现用大麦花叶病毒 （ barely mosaic
virus,BMV） 的 RNA2构建的 DＩ颗粒在大麦原生质体内对病毒的复制有干扰 。 而 Stan1ey等人则从非洲木薯花叶病毒 （ ACMV） 中克隆了缺陷干扰颗粒 DNAB。 经串联重复后导入烟草,
获得的转基因植株抗 ACMV的感染 。
