生 物 化 学
BIOCHEMISTRY
第一章 绪论
一、生物化学发展简历
二、生物化学的基本内涵
三、生物化学在专业学习中的地位与作用
四、如何学好生物化学
五、学习本课程的基本要求
二、生物化学的基本内涵
生物化学
是研究生命活动过程中 物质基础
及其 化学反应规律 的一门科学。
1、生命活动的物质基础
? 几乎所有生物体都使用 相同的生物分子,但生
物分子的形式是 多样性 的，这是生命现象多样
性的物质基础。
（ 1）功能基团（ Functional groups）
（ 2）构件分子（ Building molecules）
（ 3）生物大分子（ Biomacromolecules）
（ 4）化学键（ Chemical bonds）
? 细胞大约由 10,000种不同的分子构成，
其中水占到 5-95%,Na+,K+和
Ca2+占 1%，其它为有机化合物。构
成细胞的分子统称为生物分子。
? 生物分子主要由 C,H,O,N,P和
S等 6种元素构成。
常
见
的
功
能
基
团
1) Functional groups are clusters of atoms with
characteristic structure and functions,
2) Most biomolecules contain more than one
functional group,
3) Different families of organic compounds result
when hydrogen atoms on organic molecules are
replaced by different functional groups,
4) The distinct chemical properties of
each functional group contribute to the behavior of
any molecule that contains it,
Functional groups
构件分子
——构成生物大分子的基本单位
1) 单糖、双糖
2) 甘油、脂肪酸
3) 氨基酸
4) 核苷酸
葡 萄 糖
单 糖
双 糖
Fa
tty
ac
ids
Structure of an amino acid
生 物 大 分 子
1) 多 糖：淀粉、糖原、纤维素等
2) 蛋白质：结构蛋白、酶、转录因子等
3) 核 酸,DNA,RNA,dsRNA etc
Starch
Glycogen
Cellulose
Structure of cellulose as it occurs in a plant cell wall
Lipids are composed of three fatty acids (usually) covalently
bonded to a 3-carbon glycerol,
? Functions,Long-term energy storage; Structural components;
Hormones; insulators and cushions,
Structure of a phospholipid,
Phospholipids and
glycolipids are important
structural components of cell
membranes,Phospholipids
are modified so that a
phosphate group (PO4-) is
added to one of the fatty
acids,The addition of this
group makes a polar "head"
and two nonpolar "tails",
Proteins are very important in biological systems as control
and structural elements,The building block of any protein is
the amino acids,
HIV p17 protein and similarities of its structure
to gamma interferon,
化 学 键
? 共价键 ? 非共价键
氢键
离子键
静电作用力
范氏引力
疏水作用力
Formation of a
covalent bond between
two Hydrogen atoims,
Formation of
covalent bonds in
methane
Table Salt Crystal
Formation of a crystal of sodium
chloride,Each positively charged
sodium ion is surrounded by six
negatively charged chloride ions;
likewise each negatively charged
chloride ion is surrounded by six
positively charged sodium ions,
The overall effect is electrical
neutrality,
Ionic bond
Formation of a hydrogen bond between the hydrogen
side of one water molecule and the oxygen side of
another water molecule,
The presence of polar areas in the amino acids that
makeup a protein allows for hydrogen bonds to form,
giving the molecule a three-dimensional shape that is
often vital to that protein's proper functioning,
Electrostatic interactions
? Electrostatic interactions occur between oppositely
charged atoms or groups,
? An important aspect of all electrostatic interactions in
aqueous solution is the hydration of ions,Because
water molecules are polar,they are attracted to
charged ions,
? As ions become hydrated,the attractive force between
them is reduced,and the charged species dissolves in
the water,
Dissolution of an ionically bonded compound,
sodium chloride,by water molecules,
van der Waals forces
? van der Waals forces are relatively week,transient
electrostatic interactions,They occur between
permanent and / or induced dipoles,They may be
attractive or repulsive,depending on the the distance
between the atoms or groups involved,
? There are three types of van der Waals forces,
Dipole – dipole interactions
Dipole – induced dipole interactions
Induced dipoles – induced dipoles interactions,
The mean van der
Waals diameter of
water is identical
with that of
isoelectronic neon
(2.82 ?),
Hydrophobic interactions
As soon as nonpolar substances are mixed with water,
they coalesce into droplets because water-water
interactions are stronger than water-nonpolar
substance interactions,This process results from
hydrophobic interactions,
功 能 基 团
化 学 键
构 件 分 子
生 物 大 分 子
化 学 键
化 学 键
氢 键 （ h y d r o g e n b o n d ）
离 子 键 （ i o n i c ）
静 电 作 用 力 （ e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n ）
范 氏 作 用 力 （ v a n d e r W a a l s f o r c e s ）
疏 水 作 用 力 （ h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s ）
共 价 键 （ c o v a l e n t b o n d ）
非 共 价 键 （ n o n - c o v a l e n t b o n d ）
小 结
2、生物化学反应的基本规律
① 生命活动过程是由数千化学反应
组成的，相关联的化学反应形成
代谢途径，不同的代谢途径连接
形成代谢网络。
Chemical reactions
Metabolic pathways
Metabolic networks
A?B,B?C,C?D,
C?E,E?F
A?B?C?D
C?E?F
A?B?C?D
?
E?F
2、生物化学反应的基本规律
② 生物化学反应是由酶催化的，反应的
基本原理是相同的。
氧化还原反应
亲核反应
异构化反应
水解反应
合成反应
etc
反应很多，但反
应的机制是相对
较少的
2、生物化学反应的基本规律
③ 生物化学反应实现了生命必须的物质转
换、能量传递和信息交流的统一。
物质转换 ?生化反应的表现形式 ?生命平台
能量传递 ?生化反应的催化动力 ?生命活力
信息交流 ?生化反应的目标实现 ?生命意义
2、生物化学反应的基本规律
④ 生物化学反应发生在细胞中，
体现出生命的系统性。
生物分子的相互作用
细胞器之间的相互作用
细胞内的信号
细胞生命活动的协调与统一
etc
2、生物化学反应的基本规律
⑤ 生物化学发应是动态的，具有方向性。
物质转换、能量传递、信息交流是无时不停的；
生化反应是可以调节的；
生化反应的平衡是动态的；
生化反应是有方向的。
三、生物化学在本专业学习中
地位与作用
? 基础理论作用 （学习后续课程的基础）
? 实践动手作用 （基本实验技能的培训）
? 生物思想作用 （生化的角度看生命现象）
四、如何学好生物化学
? 4R法（ Read,Remember,
Repeat,Review）
? 做好笔记
? 做好习题
? 教学互动
理 解
掌 握
了 解
认 识
概 括
重 复
记 忆
阅 读
方 法 过 程
学习生物化学的“分子哲学”法
五、学习本课程的基本要求
? 需要掌握的核心内容
氨基酸的基本结构、性质、分离鉴定方法
蛋白质的基本结构、性质、功能、研究方法
酶催化的基本理论和调节，特别是米氏方程
核酸的基本组成单位、结构、性质、功能、研究方法
DNA复制,RNA合成及蛋白质合成的基本过程
基本糖代谢途径及生物氧化
脂肪酸分解与合成的基本过程
蛋白质和氨基酸分解与合成的一般概念
代谢途径的相互关系及代谢调控的基本概念
五、学习本课程的基本要求
?上课保证、作业、习题练习
?教材阅读
?实验技能
教材与参考书
教 材,生物化学，王镜岩等编，高等教育出版社
生物化学实验指导书，生物化学课程组编
生物化学课堂同步训练，生物化学课程组编
参 考 书,生物化学，王希成编，清华大学出版社
生物化学与生物物理进展（杂志）
Instant Notes in Biochemistry,B.D.Hams
（影印版，科学出版社）
参考网站,剑桥大学出版社，生物化学电子版
台湾大学，生物化学教学课件
第二章 蛋白质化学
本章内容
? 第一节 氨基酸的结构与分类
? 第二节 氨基酸的性质
? 第三节 氨基酸混合物的分离
? 第四节 蛋白质概论
? 第五节 蛋白质的一级结构
? 第六节 蛋白质的三维结构
? 第七节 蛋白质的理化性质与分离纯化
第一节 氨基酸的结构与分类
氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组
成蛋白质的基本单位（构件分子）。从各
种生物体内发现的氨基酸已有 180多种，但
参与蛋白质组成的常见氨基酸只有 20种，
这 20种 氨基酸称为 常见氨基酸 或基本氨基
酸。
amino acid,aa 或 AA
一,氨基酸的结构
氨基酸的结构通式
H 3 N C H
C O O
R
-
+ α
H 2 N C H
C O O H
R
α或
氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的 R基不同，
（除脯氨酸外）都为 L-α -氨基酸。
H
甘氨酸
CH3
丙氨酸 L-氨基酸的通式
R
C
+
N H
3
C O O
-
H
据 R基团
化学结构
分类
脂肪族Ａ A（ 16种）
芳香族Ａ A (Phe,Tyr,Trp)
杂环ＡＡ (His,Pro)
据 R基团
极性 分类
极性 R基团 AA
非极性 R基团 AA
不带电荷
带电荷
带正电荷 （３ 种）
带负电荷 （２ 种）
据 酸碱性质
分类
中性ＡＡ （ 一氨基一羧基 ）
酸性ＡＡ (一氨基二羧基 ) Glu,Asp
碱性ＡＡ ()（二氨基一羧基） Lys,His,Arg
据 营养
学分类
必需 ＡＡ
非必需 ＡＡ
人的必需氨基酸
Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr
假 设 来 借 一 两 本 书
Arg,His Trp,Cys
二、基本氨基酸的分类
甘氨酸
（ Gly,G）
丙氨酸
（ Ala,A）
缬氨酸
（ Val,V）
亮氨酸
（ Lue,L）
异亮氨酸
（ Ile,I）
1,侧链只是烃链（ 5种）
脂肪族氨基酸
2,侧链含有羟基 （ 2种）
丝氨酸
（ Ser,S）
苏氨酸
（ Thr,T）
3,侧链含硫原子（ 2种）
半胱氨酸
（ Cys,C） 甲硫氨酸 （ Met,M）
4,侧链含有羧基或酰胺基（ 4种）
天冬氨酸
（ Asp,D）
谷氨酸
（ Glu,E）
天冬酰胺
（ Asn,N）
谷氨酰胺
（ Gln,Q）
5,侧链含有碱性基团（ 3种）
赖氨酸
（ Lys,K）
精氨酸
（ Arg,R）
组氨酸
（ His,H）
芳香族氨基酸
苯丙氨酸
（ Phe,F）
酪氨酸
（ Tyr,Y）
色氨酸
（ Trp,W）
杂环氨基酸
组氨酸
（ His,H）
脯氨酸
（ Pro,P）
非
极
性
氨
基
酸
极
性
中
性
氨
基
酸
带正电荷的氨基酸
带负电荷的氨基酸
三、不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸
在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为 不
常见蛋白质氨基酸 。这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的
基本氨基酸衍生而来的。
N
H
HO
C O O H
4- 羟基脯氨酸
H
2
N C H
2
C H C H
2
C H
2
C H C O O H
O H N H
2
5- 羟基赖氨酸
N H
2
C H
3
N H C H
2
C H C H
2
C H
2
C H C O O H
6- N - 甲基赖氨酸
HO
I
I
C H
2
C H C O O H
N H
2
3,5- 二碘酪氨酸
非蛋白质氨基酸, 存在于生物体内，但不组成蛋白质
的呈游离或结合态的氨基酸，约 150种，具有多种生理功能。
（ 1） L-α-氨基酸的衍生物
L-瓜氨酸和 L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。
（ 2） D-α-氨基酸
D-Ala存在于肽聚糖中,D-Phe是短杆菌肽 S的组分。
（ 3） β,γ,δ-氨基酸
β-Ala是泛酸的前体,γ-氨基丁酸是传递神经冲动的化
学介质。
第二节 氨基酸的性质
一, 氨基酸的构型、旋光性和光吸收
构型,组成蛋白质的氨基酸除 Gly以外都有手性碳原子，
在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，
这两种不同的构型分别称为 D-型和 L-型。
以丙氨酸为例,
如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称
为Ｄ -,Ｌ -，Ｄ别 -和Ｌ别 -氨基酸。
H 2 N C H
C O O H
C
C H 3
O HH
H C N H 2
C O O H
C
C H 3
O HH
H C N H 2
C O O H
C
C H 3
HH O
H 2 N C H
C O O H
C
C H 3
HH O
L-苏氨酸
(L-threonine)
D-苏氨酸
(D-threonine)
L-别 -苏氨酸
(L-allo-threonine)
D-别 -苏氨酸
(D-allo-threonine)
自然界中组成蛋白质的氨基酸都是 L-型。
(Gly除外 )
旋光性,
组成蛋白质的氨基酸除 Gly以外，都有手性碳原子,
所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋
转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的
称右旋，用“＋”号表示。是 AA的物理常数，与结构、
PH值有关。
消旋
外消旋
内消旋
光吸收,
组成蛋白质的氨基酸中，
Trp,Tyr和 Phe对 紫外光
有一定的吸收，这是因为
它们分子中含有苯环，是
苯环的共轭双键造成的，
这三个氨基酸的光吸收都
在 280nm附近。
pH=pI
+OH-
pH>pI
+H+
+OH-
+H+
pH<pI
带电荷为零 带电荷为正 带电荷为负
CH
NH 3 +
C OO -R CH
NH 2
COO -RCH CO O HR
NH 3 +
完全质子化 完全去质子化 兼性离子
二、氨基酸的 两性解离及等电点
(pK′1) (pK′2)
不同 pH时氨基酸以不同的离子化形式存在！
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。
? 等电点 (isoelectric point,pI)
– 在某一 pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及
程度相等，成为兼性离子，呈电中性,在电场中既不向阳极
也不向阴极移动。 此时溶液的 pH值 称为 该氨基酸的等电点 。
– 氨基酸等电点的特点,
1.净电荷数等于零，在电场中不移动；
2.此时氨基酸的溶解度最小。
氨基酸等电点的确定,
根据 pK值（该基团在此 pH一半解离）计算,
等电点等于两性离子两侧 pK值的算术平均数。
pI = ———— pK1+pK2 2 或（ pI = ————） pK2+pK3
2
氨
基
酸
的
酸
碱
滴
定
Henderson-Hasselbalch方程
pH=pKa + lg [质子受体 ] [质子供体 ]
酸性氨基酸，以 Asp为例,
碱性氨基酸，以 Lys为例,
（ 1）与 HNO2的反应
三、氨基酸的化学反应
（ 2）与茚三酮的反应,
脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色。在 570nm（蓝紫色）
或 440nm（黄色）定量测定（ 0.5-50μ g/ml）。
(3)与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法
OH 中和滴定
? 反应特点
A,为 α- NH2的反应
B,在常温，中性条件，甲醛与 α- NH2很快反应，生成羟甲
基衍生物，释放氢离子。
? 应用：氨基酸定量分析 —甲醛滴定法（间接滴定）
A.直接滴定，终点 pH过高（ 12），没有适当指示剂。
B.与甲醛反应，滴定终点在 9左右，可用酚酞作指示剂。
C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比 1,1）
D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。
? 反应特点
A.为 α- NH2的反应
B,在弱碱性条件下，与 DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸
? 应用：鉴定多肽或蛋白质的 N-末端氨基酸。
首先由 Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构。
(4) 与 2,4-二硝基氟苯（ DNFB）的颜色反应
（黄色）
N C S N H C H C
O
R 2
N C H C
O
R 1
H
H
N
H
S,C
C H C
O
R 1
H N N H C H C
O
R 2
SN
H
C
N H OC
R 1
C HN H 2 C H C
O
R 2
N
C
O C H
N H
SC
R 1
(5)与苯异硫氰酸酯（ PITC）的反应
? 由 Edman于 1950年首先提出
? 为 α- NH2的反应
? 用于 N末端分析，又称 Edman降解法
- OOC - CH - CH
2 - S
+ NH
3
S - CH 2 - CH - C OO -
+ NH
3
+
胱氨酸 二硫键
-HH
- OOC - CH - CH
2 - SH
+ NH
3
HS - CH 2 - CH - C OO -
+ NH
3
（ 6）半胱氨酸的氧化与还原反应
pI
PK2=4.25
PK3=9.67
PK1=2.19
PK2 PK3 PK1
pI
PK1=1.82
PK2=6.0
PK3=9.17
PK2 PK1 PK3
第三节 氨基酸混合物的分离
一、层析技术
纸层析、薄层层析、离子交换层析、高效液相层析
二、电泳技术
纸电泳
一、层析技术
层析技术又称色谱技术 （ Chromatography），是一
种根据被分离物质的物理、化学及生物学特性的差异，
使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的
方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体
化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力
的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动
相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达
到彼此分离的目的。
1,层析技术的分类
? 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸
层析、薄层层析和柱层析。
? 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层
析和气相层析。
? 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为
吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交
换层析、亲和层析等。
吸附层析 是以吸附剂为固定相，根据待分离物与
吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层
析技术。
分配层析 是根据在一个有两相同时存在的溶剂系
统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的
的一种层析技术。
凝胶过滤层析 是以具有网状结构的凝胶颗粒作为
固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层
析技术。
离子交换层析 是以离子交换剂为固定相，根据
物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技
术。
亲和层析 是根据生物大分子和配体之间的特异
性亲和力（如酶和底物、抗体和抗原、激素和
受体等），将某种配体连接在载体上作为固定
相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进
行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物
大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。
原理,组成层析系统的固定相和流动相具有相反
的极性。被分析的样品（如 aa混合物）中的各组
分依据其自身极性的强弱，与此两相的亲和力不
同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流
动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分
离的目的。
2,分配层析
（ 1）纸层析
单向纸层析 迁移率,Rf
双向纸层析图
（ 2）薄层层析
2．离子交换层析
原理,分离氨基酸时，用 离子交换树脂 作为支持物，利
用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换
反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固
程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移
动，从而达到分离的目的。
离
子
交
换
原
理
及
流
程
示
意
图
+
树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯
组成的具有网状结构的高分子聚合物。
洗脱顺序主要与各种离子所带电荷有关，在电
荷相同时，与极性、非极性有关。
阳离子交换树脂：活性基团是酸性的,如磺酸基 -SO3H
（强酸型），羧基 -COOH（弱酸型）
阴离子交换树脂：活性基团是碱性的,如季胺基 -N+(CH3)3OH-
基本步骤,
装柱 上样 分步洗脱 分步收集
强酸型阳
离子交换
树脂
pH2~3，使所有
氨基酸带正电荷，
正电荷大小顺序：
碱性 AA>中性
AA>酸性 AA
逐步提高洗
脱液 pH和离
子强度
习题举例,
有一种蛋白质水解物,在 pH6时,用阳离子交换柱层
析分离,第一个被洗脱的氨基酸是 ( )
A,Val (pI5.96) B,Lys (pI9.74) C,Asp(pI2.77)
D,Arg(pI10.76) E,Tyr (pI5.66)
二、电泳
氨基酸在 pH高于或低于其 pI的溶液中为带电的颗粒，
在电场中能向正极或负极移动。这种通过氨基酸在电场中
泳动而达到分离各种氨基酸的技术,称为 电泳
(elctrophoresis) 。
分离氨基酸混合物常用 纸电泳 。
第四节 蛋白质概论
一、蛋白质的定义
蛋白质 (Protein,pr),是一切生物
体中普遍存在的，由天然氨基酸按
照一定的顺序，通过肽键连接而成
的一条或多条肽链构成的生物大分
子；其种类繁多，各具有一定的相
对分子质量，复杂的分子结构和特
定的生物功能；是表达生物遗传性
状的一类主要物质。
二、蛋白质的生物学重要性
1,蛋白质是生物体重要组成成分
分布广 含量高
2,蛋白质具有重要的生物学功能
1）催化生物化学反应（酶）
2）结构成分 (结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白 )
3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）
5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6）激素功能（胰岛素）
7）防御功能（抗体、血凝蛋白）
8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）
9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
3,氧化供能
三、蛋白质的元素组成
主要有 C,H,O,N 和 S。
有些蛋白质含有少量 磷 或金属元素 铁、铜、锌、锰、
钴、钼,个别蛋白质还含有 碘 。
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为 16％,这是凯氏定氮法
测蛋白质含量的理论依据,
蛋白质含量＝蛋白质含 N量 × 6.25
1,按组成分类
﹡ 单纯蛋白质
这类蛋白质 只含有 ?-氨基酸组成,不含其它成分。
例如,RNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋
白等。
﹡ 结合蛋白
由 简单蛋白与其它非蛋白 成分结合而成，这些非蛋
白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。
糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。
脂蛋白：如血清 ?-,?-脂蛋白等。
核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。
色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。
四,蛋白质的 分类
2.按 蛋白质的外形分类
﹡ 球状蛋白质
外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数
蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。
﹡ 纤维状蛋白质
分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和
不溶性纤维状蛋白质。
不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如
胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。
可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。
3.按 多肽链条数分类
﹡ 单体蛋白质
仅含一条多肽链。
﹡ 多聚蛋白质
含两条或多条多肽链。
例如,
牛核糖核酸酶,一条多肽链
胰岛素,两条（两种）多肽链
血红蛋白：四条（两种）多肽链
胰岛素
牛核糖核酸酶 血红蛋白
五、蛋白质的分子结构层次
一级结构 (primary structure)
二级结构 (secondary structure)
三级结构 (tertiary structure)
四级结构 (quaternary structure)
高级
结构
蛋白质的一级结构决定高级结构！
第五节 蛋白质的一级结构
一、肽（ peptide）
1.肽的结构和命名
肽是由 一个氨基酸的 ?-羧基 与 另一个氨基酸的 ?-
氨基 脱水缩合而形成的无分支线形聚合物 。 其中的氨
基酸单位称 氨基酸残基 。
氨基酸间缩水形成的共价键称 肽键 (peptide bond)。
NH
2
- CH - C
H
O
OH
甘 氨 酸甘 氨 酸
+
-HOH
甘氨酰甘氨酸 肽键
NH 2 - CH - C - N - CH - C
O
OHHHH
O
NH - CH - C
H OH
O
H
甘 氨 酸
甘氨酰甘氨酸
*两分子氨基酸缩合形成 二肽,三分子氨基酸缩合则形成 三肽 ……
*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为 寡肽 (oligopeptide),由更多
的氨基酸相连形成的肽称 多肽 (polypeptide)。
* 多肽链 (polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而
成的一种结构 。
N 末端：多肽链中有自由氨基的一端
C 末端：多肽链中有自由羧基的一端
多肽链有两端
氨基酸的顺序是 N 端 → C 端的排列顺序。如上述五肽可表示为,
Ser-Val-Tyr-Asp-Gly
丝氨 酰 缬氨 酰 酪氨 酰 天冬氨 酰 谷氨 酸
C C N C C N C C N C C N C
C H
2
C H C H
2
C H
2
C H
2
C O O
-
O H C O
2
H C H
2
C O N H
2
O H
C H
3
H
3
N
+
O O O O
H H H H H
H H H H
S e r V a l T y r A s p G l n
C H
3
N- 端 C- 端
肽键
COOH
２,肽键的结构特点,
氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽
键中的 C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。所
以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面
称为 肽平面 。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结
构存在。
Ｎ Ｃ
Ｏ
酰胺平面 —— 由肽键周围的 6个原子组成的刚性平面
— C — NH —
O
O
C? — C N — C?
H
键长介于单
双键之间
O –
— C NH — +
? 虽是单键却有 双键 性质
? 周边六个原子在 同一平面 上
? 前后两个 ?-carbon在对角 (trans)
C
N C H ?
N C
O C ?
0.123nm
0.132nm 0.153nm
0.147nm
C-N 0.149 nm
C=N 0.127 nm
相关名词,
? 肽单元：参与肽键的 6个原子被约束于一个平面上，与此相应
的 -Cα-CO-NH-Cα-则称为肽单元 。
? 多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长
链骨架 (…Cα -CO-NH-Cα….) 为多肽链的主链。
或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链,
称为主链。
? 多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团
为多肽侧链。或：氨基酸残基的 R-基连在主链上
成为侧链。
说明,各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（ R-基）
的顺序即氨基酸的顺序各不相同 。
３,肽的理化性质 —— 类似于氨基酸性质
１）旋光性
２）两性解离及等电点
３）化学反应
双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物 与碱
性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色
越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定
量测定及测定蛋白质水解程度。
４,天然存在的活性肽
在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白
质的亚单位。
有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这
类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为 活性肽 。
如,脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘
肽；蛇毒多肽 等。
① 谷胱甘肽 (glutathione,GSH)
γ-
GSH过氧
化物酶
H2O2 2GSH
2H2O GSSG
GSH还原酶
NADPH+H+
NADP+
谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还
原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物
积累。
② 抗生素类多肽
短杆菌肽 S
? 体内许多激素属寡肽或多肽
③ 激素类多肽
二, 蛋白质一级结构的测定
1.蛋白质一级结构,
蛋白质分子中氨基酸残基的 排列顺序,即氨基酸的
线性序列。 一级结构中包含的共价键主要指 肽键 和 二硫
键。 在基因编码的蛋白质中，这种序列是由 mRNA中的
核苷酸序列决定的。
蛋白质的一级结构 (Primary structure)包括,
(1)组成蛋白质的 多肽链数目 ;
(2)多肽链的 氨基酸顺序 ;
(3)多肽链内或链间 二硫键的数目和位置 。
★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白
质生物功能的基础 。
——
2.蛋白质一级结构测定的意义
① 是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质生理功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
胰岛素
一级结构
高级结构
正常红细胞与
镰刀形红细胞
的扫描电镜图
镰刀形
红细胞
正常红
细胞
?-链 N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8
Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…
Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…
不同生物与人的 Cytc的 AA差异数目
生物 与人不同的 AA数目
黑猩猩 0
恒河猴 1
兔 9
袋鼠 10
牛、猪、羊、狗 11
马 12
鸡、火鸡 13
响尾蛇 14
海龟 15
金枪鱼 21
角饺 23
小蝇 25
蛾 31
小麦 35
粗早链孢霉 43
酵母 44
不
同
生
物
来
源
的
细
胞
色
素
c
中
不
变
的
AA
残
基
14
10
6
100
1
34
32
30
29
27
18
17
67
59
52
51
48
45 41
38
87
84
82
80
70
68
91
Gly
Gly
Phe
Cys
Gly
Gly
Gly
Arg
Lys
Gly
Cys
Lys
Phe
His
Pro Leu
Gly
Arg
Tyr
Ala
Asn
Trp
Tyr 70
75
80
Lys
Lys
Lys
Pro
Pro
Tyr
Ile
Gly
Thr
Met
Asn
Leu
血红素
细胞色素 c分子的空间结构
不变 的 AA残基
35个不变的 AA残基，是 Cyt C 的生物功能所不
可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的
可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合
细胞色素还原酶和氧化酶。
3.一级结构测定的原则和基本流程
一级结构测定的原则,
将大化小，逐段分析，制成两套肽片段,找出重
叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的
完整序列 。
目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出
蛋白质的一级结构。
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
将肽段分离并测出顺序
专一性裂解
末端氨基酸测定
拆开二硫键
纯蛋白质 蛋白质顺序测 定基本战略
通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列
按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列
分离编码蛋白质的基因
测定 DNA序列
排列出 mRNA序列
一级结构测定的基本流程,
（ 1）拆分蛋白质分子的多肽链 ;
（ 2）鉴定多肽链的 N一末端和 C一末端残基 ;
（ 3）用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小
的片段 ;
（ 4）测定各肽段的氨基酸序列 ;
（ 5）重建完整多肽链的一级结构 ;
（ 6）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置；
（ 7）酰胺基位置的确定。
测定蛋白质的一级结构前的 准备工作
A,样品纯度必须 >97%以上；
聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带
B,测定蛋白质的相对分子质量；
SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法
C,测定蛋白质多肽链种类和数目；
种类,SDS-PAGE
数目,N末端氨基酸残基摩尔数 /蛋白质摩尔数
D,测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸
的个数；
E,测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
① 酸水解,常用 6 mol/L的盐酸或 4 mol/L的硫酸在 105-110℃ 条件下
进行水解，反应时间约 20小时。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化 。
缺点是 色氨酸 被沸酸完全 破坏 ；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸
有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧
基 。
② 碱水解,一般用 5 mol/L氢氧化钠煮沸 10-20小时。
由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏, 产率不高 。 部分
的水解产物发生 消旋 化 。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏 。
③ 酶水解,应用酶水解多肽不会破坏氨基酸, 也不会发生消旋化 。 水
解的产物为较小的肽段 。
4.蛋白质的一级结构测定
1）多肽链的拆分 ——获得单条线形多肽链
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆
分。如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体
等。
① 拆分非共价键：可用 8mol/L
尿素 或 6mol/L盐酸胍处理 。
② 拆分 二硫键：几条多肽链通过
二硫键交联在一起。可在
8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存
在下,用过量的 ?-巯基乙醇 处理，
使二硫键还原为巯基，然后用烷
基化试剂保护生成的巯基，以防
止它重新被氧化。
拆分
★ 巯基的保护
- O O C C H C H
2 S H
N H 3 +
I C H 2 C N H 2
O
C H 2 O C C l
O
C H 2 C l
- O O C C H C H
2 S
N H 3 +
O C C H 2
O
C H 2- O O C C H C H 2 S
N H 3 +
C H 2 C N H 2
O
- O O C C H C H
2 S
N H 3 +
2） N-末端和 C-末端氨基酸残基的确定 ——为氨
基
酸序列排列建立两个重要的参考
点
N端分析方法,① 二硝基氟苯法（ DNP法,DNFB法或 FDNB法）
② 丹磺酰氯法（ DNS法）
丹磺酰 -氨
基酸有很强
的荧光性质
③ 苯异硫氰酸 (酯 )法（ PITC法,PTC法,PTH法,Edman降解法 ）
由于其连续反应特性,
成为蛋白质序列分析仪
的分析原理！
④ 氨肽酶（ aminopeptidase,Apase）法
Ala Val
Gly
氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的 N-端逐个的
水解。 根据 不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数
量，从而知道蛋白质的 N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸
氨肽酶，水解以亮氨酸残基为 N-末端的肽键速度最大。
C末端分析方法
肼解法,多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸即从肽链
上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够
与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与 C-端氨基酸分离 。
H 2 N C H C
R O
H N C H C
R O OR n
CC HH N O H
n - 1
N- 端 氨 基 酸 C - 端 氨 基 酸
OR n
CC HH 2 N O HH 2 N C H C
R O
N H N H 2 +
H
+
N H 2 N H 2
氨 基 酸 酰 肼 C- 端 氨 基 酸
羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽
链的 C-端逐个的水解。
目前常用的羧肽酶有四种,A,B,C和 Y。 羧肽酶 A能
水解除 Pro,Arg和 Lys以外的所有 C-末端氨基酸残基；
B只能水解 Arg和 Lys为 C-末端残基的肽键 。
（ 3）多肽链部分裂解成较小的片段 ——化大为小,
获得短 肽段
? 酶解法,胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，
嗜热菌蛋白酶等。
? 化学法,溴化氰 水解法，它能选择性地切
割由 甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
C H 3 S,
C H 2
C H 2
C HN H C N H C H C
O OR
+ B r C
+
N
B r
-
C H 3 S
+
C H 2
C H 2
C HN H C N H C H C
O OR
C N
C H 3 S C N C H
2
C HN H C N H C H C
O OR
C H 2
+
H 2 O
+
C H 2
C HN H C
O
C H 2
O H 3 N
+
C H C
OR
高丝氨酸内酯
胰蛋白酶,
R1=赖氨酸 Lys和精氨酸
Arg侧链 （专一性较强，
水解速度快）。
N H C H C
O
R 4
N H C H C
O
R 3
N H C H C
O
R 2
N H C H C
O
R 1
或胰凝乳蛋白酶,
R1=苯丙氨酸 Phe,色氨
酸 Trp,酪氨酸 Tyr
N H C H C
O
R 4
N H C H C
O
R 3
N H C H C
O
R 2
N H C H C
O
R 1
糜蛋白酶
胃蛋白酶,
在疏水性氨基酸处部分水解，最
适反应 pH为 2~3。
（ 4）测定各短肽段的氨基酸序列
方法,蛋白质序列分析仪
原理,1,Edman 法
2,DNS- Edman 法
3,有色 - Edman 法
（ 5）重建完整多肽链的一级结构 -获得多肽链的完整序列
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交
错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
? 对角线电泳 步骤,
1.碘乙酰胺封闭 -SH
2.胃蛋白酶酶切蛋白质（ pH2）
3.第一向电泳（ pH6.5）
4.过甲酸氧化处理 -S-S-键生成 -SO3H
5.第二向电泳（ pH6.5）
6.分离出含二硫键的两条短肽
7.测序，与拼接出的多肽链比较，确定二硫键的位置。
（ 6 ）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置
对角线电泳动态图解
（ 7）酰胺基位置的确定
Asp—Asn,Glu—Gln
方法：酶解肽链，产生含有单个 Asx或 Glx的肽，用
电泳法确定是 Asp还是 Asn。
第六节 蛋白质的三维结构
蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、盘
绕或组装成特有的空间结构，亦称 高级结构 。
蛋白质的高级结构即蛋白质的构象。
构象 是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原
子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。构象的
改变不需要共价键的断裂和重新形成，只需单键的旋转即
可形成新的构象。
酰胺平面与 α-碳原子的二面角（ φ和 ψ ）
二面角
两相邻酰胺平面之间, 能以共同的 Cα为定
点而旋转, 绕 Cα-N键旋转的角度称 φ角, 绕 C-
Cα键旋转的角度称 ψ角 。 φ和 ψ称作二面角,
亦称构象角 。
肽链的主链可看成是由被 C?隔开的许多平面组成的。
N端 C端
R
H H
O
C
C? N
C?
C
R
O
N
O
C
N
C?
C
R
O
N
C?
H
H
H
H
C?
H
事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很
少几种构象，而且相当稳定。
维持蛋白质分子构象的作用力
离子键 氢键
范德华力 疏水相互作用力
一,蛋白质的二级结构
（一）二级结构的概念
蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,
即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置,
并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。
主要的化学键, 氢键
1,?-螺旋 (?-helix)
2,?-折叠 (?-pleated sheet)
3,?-转角 (?-turn)
4,无规卷曲 (nonregular coil)
（ 二 ） 二级结构单元的种类
1） 绝大多数天然蛋白质
都是 右手螺旋 。
2） 每隔 3.6个氨基酸残基
螺旋上升一圈；每圈间距
0.54nm,即每个氨基酸
残基沿螺旋中心轴上升
0.15nm,旋转 100° 。
α -螺旋结构的主要特点,
1.α -螺旋 (α -helix)
3）每个氨基酸残基的
N-H都与前面（ C端）
第四个残基 C=O形成 氢
键 。
4)螺旋体中所有氨基酸残
基侧链都伸向外侧；链中
的全部 C=O和 N-H几乎都平
行于螺旋轴,氢键几乎平行
于中心轴 ;
* R为 Gly时，由于 Ca上有 2个氢，使 Ca-C,Ca-N的转动
的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大
大降低。 R基大 (如 Ile)也不易形成 α-螺旋。
* α -螺旋遇到 Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚
氨基酸且有刚性的环状结构。
* 带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋
的稳定性降低。
侧链在 ?-螺旋结构的影响,
* R基较小,且不带电荷的氨基酸利于 α -螺旋的形成,如
多聚丙氨酸在 pH7的水溶液中自发卷曲成 α -螺旋。
2.β -折叠 (β-pleated sheet)
β -折叠 是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结
而成的锯齿状片状结构 。
① 在 ?-折叠中,?-碳原子总是处于折叠的角上，氨基
酸的 R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基
酸之间的轴心距为 0.35nm 。
0.7nm
② ?-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可
以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与
链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。
（ a）平行式 （ b）反平行式
③ ?-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的
N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽
链的方向相反。后者更为稳定。
3.β-转角 （ β-turn）
也称 β -回折, 存在于球状蛋白中 。 其特点是肽链回
折 180°, 使得氨基酸残基的 C=O与第四个残基的 N-H形成
氢键 。 第二个氨基酸通常是 pro。
β -转角都在蛋白
质分子的表面，多数
为亲水氨基酸组成。
4.无规则卷曲 （ non-regular coil）
又称自由卷曲, 是指没有一定规律的松散肽
链结构, 但是其结构是明确而稳定的, 常常构成
酶的功能部位 。
无规卷曲常出现在 a-螺旋与 a-螺旋, a-
螺旋与 β -折叠, β -折叠与 β -折叠之间 。
它是形成蛋白质三级结构所必需的 。
二、蛋白质的超二级结构
（一）超二级结构的概念
指蛋白质中相邻的二级结构单位 (即单个
?-螺旋或 ?-转角 )组合在一起，形成有规则的
在空间上能辩认的二级结构组合体。
★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但
没有聚集成具有功能的结构域。
??：由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋
???：由两股 ?折叠片，中间加入 ?螺旋而形成
的片层结构
???：由三条或更多的反平行式 ?-链通过 ?-转
角或其它的肽段连接而成的结构
（ 二 ） 超二级结构的基本形式
超二级结构类型
βββ
αα β αβ
1 2 3 4 5
指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上
形成三级结构的局部折叠区, 它是相对独立的紧
密球状实体, 称为结构域 （ domain） 。
酵母己糖激酶的三级结构
结构域之间有一段柔性的肽链
相连 — 铰链区，使结构域之间
可以发生相对移动；结构域承
担一定的生物学功能，几个结
构域协同作用可体现出蛋白质
的总体功能；结构域间的裂缝
常为酶的活性部位，也是反应
物的出入口。
三、蛋白质的结构域
α+β结构域
乳酸脱氢酶结构域 1
α /β结构域
丙酮酸激酶结构域 4 3-P-甘油醛脱氢酶结构域 2
木瓜蛋白酶结构域 1 木瓜蛋白酶结构域 2
无规则卷曲 + α -螺旋结构域 无规则卷曲 +β-回折结构域
三级结构 （ tertiary structure）,指的是
多肽链在二级结构, 超二级结构和结构域的
基础上, 主链构象和侧链构象相互作用, 进
一步盘曲折叠形成 球状分子结构 。
四、蛋白质的三级结构
（一）三级结构的概念
（ 二 ） 球状蛋白的三级的结构特征
含有多种二级结构单元。
分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋
白质的活性中心。
大多数非极性侧链埋在分子内部，形成 疏水核 ；
而极性侧链在分子表面，形成 亲水面 。
蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。
分子呈现球状或椭圆状。
（ 三 ） 维持三级结构的作用力
二硫键 —— 共价键
疏水作用
非共价键（次级键）
氢键
离子键
范德华力
四级结构（ quaternary
structure）,由两条或两
条以上具有三级结构的多肽
链聚合而成、有特定三维结
构的蛋白质构象。每条多肽
链又称为 亚基 (subunit) 。
五、蛋白质的四级结构
例如，
血红蛋
白的四
级结构
（一）四级结构的概念
（ 二 ） 蛋白质四级结构的特点
? 1） 有多个亚基
? 2） 稳定性主要靠亚基间的 疏水作用 维持
? 3） 亚基单独存在时无生物活性或活性很小,
只有通过亚基相互聚合成四级结构后, 蛋
白质才具有完整的生物活性 。
? 4） 亚基见具有 协同性 和 别构效应 。
蛋
白
质
的
空
间
结
构
二级结构 超二级结构 结构域
三级结构 四级结构
六、蛋白质三维结构与功能的关系
（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构
Hb与 Mb一样能可逆地与 O2结合, Hb与
O2结合后称为 氧合 Hb。 氧合 Hb占总 Hb的百
分数 （ 称 百分饱和度 ） 随 O2浓度变化而改变 。
（二）血红蛋白的构象变化与结合氧
肌红蛋白 (Mb)和血红蛋白 (Hb)的氧解离曲线
1,协同效应 (cooperativity)
一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体
结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配
体结合能力的现象，称为 协同效应 。
如果是促进作用则称为 正协同效应
(positive cooperativity)
如果是抑制作用则称为 负协同效应
(negative cooperativity)
O2
血红素与氧结
合后, 铁原子半径
变小, 就能进入卟
啉环的小孔中, 继
而引起肽链位置的
变动 。
变构效应 (allosteric effect)
蛋白质空间结构的改变伴随其功
能的变化, 称为 变构效应 。
2,波尔效应（ Bohr）
1904年,Christian Bohr发现,
增加 CO2浓度、降低 pH能显著降低血红蛋白与 O2
的结合。
生理意义：波尔效应使血红蛋白运输 O2的效率提高。
? 2,3—二磷酸甘油酸（ BPG）通过与血红蛋白
的两个 β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧
态构象，因而降低了血红蛋白的氧亲合力。
3,BPG的别构效应
（三）蛋白质构象改变与疾病
蛋白质构象疾病,若蛋白质的折叠发生
错误, 尽管其一级结构不变, 但蛋白质的构
象发生改变, 仍可影响其功能, 严重时可导
致疾病发生 。
蛋白质构象改变导致疾病的机理,有些蛋
白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解
酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现
为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。
这类疾病包括,人纹状体脊髓变性病、老
年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。
疯牛病中的蛋白质构象改变
疯牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein,PrP)
引起的一组人和动物神经退行性病变。
正常的 PrP富含 α-螺旋，称为 PrPc。
PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全
为 β-折叠的 PrPsc，从而致病。
PrPc
α-螺旋
PrPsc
β-折叠
正常 疯牛病
第七节 蛋白质的理化性质与分离纯
化 一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外, 氨基酸残
基侧链中某些基团, 在一定的溶液 pH条件下都可解
离成带负电荷或正电荷的基团 。
* 蛋白质的等电点 ( isoelectric point,pI)
当蛋白质溶液处于某一 pH时，蛋白质解离成正、负
离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此
时溶液的 pH称为 蛋白质的等电点。 在等电点时蛋白
质的溶解度最小，在电场中不移动。
蛋白质的 等离子点 （ 特征常数 ）,
指在纯水中 （ 即没有其它盐类存在 ） 蛋白
质的正离子数等于负离子数的 pH值 。 因蛋白质
的等电点不是一成不变的, 它随溶剂性质, 离
子强变等因素而改变 。
二、蛋白质的胶体性质
由于蛋白质分子量很大, 在水溶液中形成 1-100nm的颗
粒, 因而具有胶体溶液的特征 （ 布郎运动, 丁道尔现象, 不
能透过半透膜 ） 。
1.蛋白质胶体稳定的因素
① 可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很
高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒表面形成 水化层,其可
防止分子互碰而聚集 ；
② 蛋白质在非等电点状态时带同种电荷，在 颗粒表面形成 电荷层，
同性电荷互斥，使分子不能聚集。
+
+
+
+
+
+
+
带正电荷的蛋白质
－ －
－
－ － － －
－
带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
水化层
+ +
+
+
+ +
+ +
带正电荷的蛋白质
－
－ －
－
－
－
－ －
带负电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
酸 碱
酸 碱
酸 碱
脱水作用 脱水作用 脱水作用
蛋白质的聚沉
蛋
白
质
胶
体
溶
液
沉
淀
作
用
示
意
图
2.蛋白质的沉淀作用
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或
失去水化层 （ 消除相同电荷, 除去水膜 ）, 蛋白质胶体溶
液就不再稳定并将产生沉淀 。
沉淀方法类别,
① 高浓度中性盐 （ 盐析 ）
② 等电点沉淀
③ 有机溶剂沉淀
④ 重金属盐类沉淀
⑤ 生物碱试剂和某些酸类沉淀
⑥ 加热变性沉淀
盐析 (salt precipitation)是将高浓度硫酸铵, 硫酸钠或
氯化钠等中性盐加入蛋白质溶液, 使蛋白质表面水化
膜被破坏, 导致蛋白质沉淀 。
*分段盐析：调节盐浓度, 可使混合蛋白质溶液中的
几
种蛋白质分段析出 。
例如：血清球蛋白 （ 50%(NH4)2SO4饱和度 ）,
清蛋白 （ 饱和 (NH4)2SO4)。
3.沉淀类型
A.可逆沉淀
在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构
并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再
溶于水溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析
作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电
点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。
B.不可逆沉淀 /变性沉淀
在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原
来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能
再溶解于原来溶剂或水溶液中的作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。
重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶
剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在而并不析出，例
如：在强酸碱中变性的蛋白质在强酸碱溶液中仍存在电荷效应，所以
不表现为沉淀现象。相对地，沉淀的蛋白质也未必都已变性。
* 蛋白质的凝固作用 (protein coagulation)
蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固
的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。
（三）蛋白质的变性与复性
蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其
特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构
变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改
变和生物活性的丧失。
1.蛋白质变性的概念
2.变性的本质
—— 破坏非共价键，不改变蛋白质的一级结构。
3.变性的因素
加热、有机溶剂、强酸、强碱、表面活性剂
（如十二烷基硫酸钠即 SDS）、还原性试剂
（尿素、盐酸胍）、紫外线、机械力等 。
4.变性蛋白质性质的改变
① 生物学功能的丧失（主要标志）；
② 分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被
酶消化；
③ 疏水基团外露，水化层被破坏,溶解度降低，易
形成沉淀析出，粘性增加，紫外吸收改变等；
④ 丧失结晶能力。
? 应用举例
?临床医学上，变性因素常被应用来消毒及
灭菌。
?此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质
制剂（如疫苗等）的必要条件。
5.蛋白质的复性
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，
可缓慢地重新自发折叠 成原来的构象，恢复
或部分恢复其原有的构象和功能，称为 复性
(renaturation),这种变性也称为可逆变性 。
可逆变性作用
蛋白质复性
（尿素,β-巯基乙醇）
（ 去除尿素,β-巯基乙醇）
非折叠状态，无活性
天然状态，
有催化活性
（四）蛋白质的分子大小
蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大
于 6000，最高可达 40000000（烟草花叶病毒）。
目前常用的方法包括,扩散系数、沉降超离心、凝
胶过滤、渗透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
1.根据化学成分测定最小相对分子质量
利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素
的含量，并假定蛋白质分子中含 1个这种元素，即
可测算最低 Mr。
如：用化学分析法测定血红蛋白质中含 Fe 0.34％，
则
最低 Mr=55.84× 100/0.34=16700；
用其它方法测定，其实际 Mr为 16700的 4倍，由
此可知，血红蛋白含有 4个 Fe的原子，而不是 1
个 Fe。
2,超离心法
? 在 60 000～ 80 000r/min 的高速离心力作用下，蛋白
质分子会沿旋转中心向外周方向移动。
? 超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。
? 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心
沉降速度。
? 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉
降系数 S大体上和分子量成正比关系，故可应用超
速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不
对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
离
心
机
结
构
示
意
图
转头
转头腔
沉降样品
驱动马达
真空 冷冻
? 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用 S表示。
? 一个 S单位，为 1× 10-13秒。
? 相对分子质量越大,S值越大。
? 蛋白质的沉降系数,1～ 200S。
? 超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离
纯化蛋白质。
s = ———— v ω2x
v =沉降速度（ dx/dt）
ω=离心机转子角速度（弧度 /s）
x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（ cm）
? 由沉降系数 S可根据斯维得贝格 〔 Svedberg〕
方程计算蛋白质分子的相对分子质量,
M=RST/D〔 1－ iρ〕
R：气体常数 T：绝对温度
D：扩散系数 ρ：溶剂的密度
3.凝胶过滤法
? 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结
构。
? 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的
分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。
? 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液
体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程
长，后洗脱下来，洗脱体积大。
? 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：
Sephadex
? 洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶
（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的
洗脱液体积。
? 测定样品蛋白质分子量的方法,
① 测得几种标准蛋白质的洗脱体积 〔 Ve〕 ；
② 以相对分子质量对数（ logM）对 Ve作图,
得标准曲线；
③ 再测出未知样品洗脱体积 〔 Ve〕 ；
④ 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子
质量。
4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
? 聚丙烯酰胺凝胶,单体 —丙烯酰胺 （ acrylamide,简
称 Acr）和交联剂 —N,N-甲叉双丙烯酰胺
（ methylene-bisacrylamide,简称 Bis）在 加速剂 和 催化
剂 的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结
构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙
烯酰胺凝胶电泳（ polyacrylamide gel electrophoresis,
简称 PAGE）。
? SDS:十二烷基硫酸钠,变性剂
? 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、
大小、形状）
★ 此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量
? 方法,① 用 SDS和 巯基乙醇 （打开二硫键）处理
蛋白质变性（肽链伸展）并与 SDS结合，形成
SDS-蛋白质复合物，使得不同 蛋白质分子均带
负电 （ SDS带负电），且 荷质比相同 （蛋白质分
子大，结合 SDS多；分子小，结合 SDS少）；
不同蛋白质分子具有 相似的构象 。
② 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们
的迁移率作图
③ 测出待测样品的迁移率
④ 从标准曲线上查出样品的相对分子质量
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的一般原则
提纯的目标：尽量 提高蛋白质的纯度或比
活性,设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽
可能 提高蛋白质的产量 。
根据蛋白质的性质加以选择，如 分子大小，溶
解度、电荷、吸附性质及生物亲和力 等。
一般程序,
1,从组织细胞中溶解放出蛋白质, 并保持天然状态,
常用低温冰冻, 化学试剂及溶菌酶破壁, 破膜, 再用
溶剂提取 。
2,分离所需要蛋白质与其他蛋白质
a 等电点沉淀
b 盐析和有机溶剂分级分离
纯化,a 离子交换层析
b 凝胶过滤层析
c 亲和层 析
d 电泳方法
3、结晶提纯
a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白
b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液
各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。
防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。
（ 一 ） 根据分子大小不同的分离方法
1,透析和超过滤
透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质,
而
水和无机盐等小分子自由通过, 此方法只
能
将蛋白质和小分子物质分开, 不能将不同
蛋
白质分开 。
超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半
透膜, 蛋白质留在膜上 。
透析与超过滤简易装置
2,密度梯度离心
a.蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小也取决于
它的密度 。
b.颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时,
即停止不前 。
c.在离心力的作用下, 各种蛋白质在不同密度介
质中形成独立的区带 。
3,凝胶过滤
a.又称分子筛层析，是根据分子大小分离蛋白质
混合物最有效的方法之一。
b.常用葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex)和琼脂糖凝
胶（商品名为 Sepharose）。
c.网孔大小 — 用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比
例来实现
d.大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。
凝胶过滤法
（ 二 ） 利用溶解度差别的分离方法
1,等电点沉淀
利用各种蛋白质在等电点时, 溶解度最
小
这一性质, 可以通过调节蛋白质溶液的 PH
值, 将不同的蛋白质分开 。
2,盐溶和盐析
盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层,
使蛋白质溶解度增加；
盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层,
使蛋白质溶解度降低, 发生沉淀析出 。
分段盐析,不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同, 蛋白质
溶液中, 逐渐增大盐浓度, 不同蛋白质先后析出, 称分
段盐析 。
3.有机溶剂沉淀法
a 有机溶剂 （ 与水相溶 ） 争取蛋白质颗粒上的水
膜, 使之沉淀 。
b 有机溶剂：乙醇, 丙酮
c 低温操作, 边加入边搅拌, 防止局部过热, 引
起变性, 尽量缩短处理时间 。
（ 三 ） 根据电荷不同的分离方法
1, 电泳 原理与 AA的电泳相同
电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 分子大小不同 的
蛋白质所带 净电荷密度不同,迁移率不同，在电泳时可以
分开。
a,自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。
b,区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进
行电泳，不同组分形成带状区域。
1）纸电泳：用滤纸作支持物。
2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作
支持物。
1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。
2）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。
+
—
- +
纯化中应用最多的是 聚丙烯酰胺凝胶电
泳 和 等电聚焦电泳,它们既可以作为蛋
白质纯度检验方法，也可以纯化、制备
蛋白质。
PA
GE
垂
直
平
板
电
泳
示
意
图
低 浓度 浓缩 胶
高 浓度 分离 胶
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应,
①浓缩效应
②分子筛效应
③电荷效应
等电聚焦电泳,当蛋白质在其等电点时，
净电荷为零，在电场中不再移动。
+ + － －
－
－
+
－ －
－ － －
5.0
6.0
7.0
5.0
6.0
7.0
通电 + + － －
－
－
+
－ －
－ － －
+ + － －－ － + － － － － －
+ + － － － －
+
－ －
－ － －
2.离子交换层析法
1）根据蛋白质带电荷情况
2）不同载体,
离子交换纤维素
离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应
离子交换交联琼脂糖
离子交换层析法
（ 四 ） 蛋白质的选择吸附分离
1 极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳
等 具有吸附能力
2 吸咐层析法是利用物质与不同蛋白质的吸
附能力的强弱不同达到分离目的 。
3 蛋白质提纯中, 最广泛和最有效的是结晶
磷酸钙即羟基磷灰石 。
（ 五 ） 根据配体特异性的分离 —亲和层析
1,是一种极为有效的分离方法
2.根据蛋白质分子能与另一种称为配体的分子特异而非
共价地结合 。
3.将某一蛋白质的配体经适当的反应共价地连接到如琼
脂糖 （ 凝胶 ） 一类的载体表面 。
4.配体指能被生物大分子所识别并与之结合的 原子, 原
子团和分子, 如：酶的作用底物, 辅酶, 调节效应物及其
结构类似物, 激素和受体蛋白, 抗原和抗体互为配基 。
5,用含有自由配体的溶液洗脱蛋白质
亲
合
层
析
原
理
及
流
程
示
意
图
三,蛋白质含量分析和纯度鉴
定
（一） 含量的测定
1,凯氏定氮法,
2,双缩脲法
3.紫外线吸收法
4.福林 —酚试剂法,
a 福林 — 酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和
磷钼酸和磷钨酸的混合试剂
b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应
c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸
和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝, 蓝色的深浅
与蛋白含量质成正比 。
（ 二 ） 蛋白质纯度的鉴定
常用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法
高纯度：电泳得到均一的一条区带
低纯度：电泳得到几条区带
本章重点,
1.氨基酸的结构和性质
2.蛋白质的结构、性质、功能
3.蛋白质一级结构的测定
4.蛋白质的结构与功能的关系
5.氨基酸、蛋白质分离纯化的基本原理与方法
BIOCHEMISTRY
第一章 绪论
一、生物化学发展简历
二、生物化学的基本内涵
三、生物化学在专业学习中的地位与作用
四、如何学好生物化学
五、学习本课程的基本要求
二、生物化学的基本内涵
生物化学
是研究生命活动过程中 物质基础
及其 化学反应规律 的一门科学。
1、生命活动的物质基础
? 几乎所有生物体都使用 相同的生物分子,但生
物分子的形式是 多样性 的，这是生命现象多样
性的物质基础。
（ 1）功能基团（ Functional groups）
（ 2）构件分子（ Building molecules）
（ 3）生物大分子（ Biomacromolecules）
（ 4）化学键（ Chemical bonds）
? 细胞大约由 10,000种不同的分子构成，
其中水占到 5-95%,Na+,K+和
Ca2+占 1%，其它为有机化合物。构
成细胞的分子统称为生物分子。
? 生物分子主要由 C,H,O,N,P和
S等 6种元素构成。
常
见
的
功
能
基
团
1) Functional groups are clusters of atoms with
characteristic structure and functions,
2) Most biomolecules contain more than one
functional group,
3) Different families of organic compounds result
when hydrogen atoms on organic molecules are
replaced by different functional groups,
4) The distinct chemical properties of
each functional group contribute to the behavior of
any molecule that contains it,
Functional groups
构件分子
——构成生物大分子的基本单位
1) 单糖、双糖
2) 甘油、脂肪酸
3) 氨基酸
4) 核苷酸
葡 萄 糖
单 糖
双 糖
Fa
tty
ac
ids
Structure of an amino acid
生 物 大 分 子
1) 多 糖：淀粉、糖原、纤维素等
2) 蛋白质：结构蛋白、酶、转录因子等
3) 核 酸,DNA,RNA,dsRNA etc
Starch
Glycogen
Cellulose
Structure of cellulose as it occurs in a plant cell wall
Lipids are composed of three fatty acids (usually) covalently
bonded to a 3-carbon glycerol,
? Functions,Long-term energy storage; Structural components;
Hormones; insulators and cushions,
Structure of a phospholipid,
Phospholipids and
glycolipids are important
structural components of cell
membranes,Phospholipids
are modified so that a
phosphate group (PO4-) is
added to one of the fatty
acids,The addition of this
group makes a polar "head"
and two nonpolar "tails",
Proteins are very important in biological systems as control
and structural elements,The building block of any protein is
the amino acids,
HIV p17 protein and similarities of its structure
to gamma interferon,
化 学 键
? 共价键 ? 非共价键
氢键
离子键
静电作用力
范氏引力
疏水作用力
Formation of a
covalent bond between
two Hydrogen atoims,
Formation of
covalent bonds in
methane
Table Salt Crystal
Formation of a crystal of sodium
chloride,Each positively charged
sodium ion is surrounded by six
negatively charged chloride ions;
likewise each negatively charged
chloride ion is surrounded by six
positively charged sodium ions,
The overall effect is electrical
neutrality,
Ionic bond
Formation of a hydrogen bond between the hydrogen
side of one water molecule and the oxygen side of
another water molecule,
The presence of polar areas in the amino acids that
makeup a protein allows for hydrogen bonds to form,
giving the molecule a three-dimensional shape that is
often vital to that protein's proper functioning,
Electrostatic interactions
? Electrostatic interactions occur between oppositely
charged atoms or groups,
? An important aspect of all electrostatic interactions in
aqueous solution is the hydration of ions,Because
water molecules are polar,they are attracted to
charged ions,
? As ions become hydrated,the attractive force between
them is reduced,and the charged species dissolves in
the water,
Dissolution of an ionically bonded compound,
sodium chloride,by water molecules,
van der Waals forces
? van der Waals forces are relatively week,transient
electrostatic interactions,They occur between
permanent and / or induced dipoles,They may be
attractive or repulsive,depending on the the distance
between the atoms or groups involved,
? There are three types of van der Waals forces,
Dipole – dipole interactions
Dipole – induced dipole interactions
Induced dipoles – induced dipoles interactions,
The mean van der
Waals diameter of
water is identical
with that of
isoelectronic neon
(2.82 ?),
Hydrophobic interactions
As soon as nonpolar substances are mixed with water,
they coalesce into droplets because water-water
interactions are stronger than water-nonpolar
substance interactions,This process results from
hydrophobic interactions,
功 能 基 团
化 学 键
构 件 分 子
生 物 大 分 子
化 学 键
化 学 键
氢 键 （ h y d r o g e n b o n d ）
离 子 键 （ i o n i c ）
静 电 作 用 力 （ e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n ）
范 氏 作 用 力 （ v a n d e r W a a l s f o r c e s ）
疏 水 作 用 力 （ h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s ）
共 价 键 （ c o v a l e n t b o n d ）
非 共 价 键 （ n o n - c o v a l e n t b o n d ）
小 结
2、生物化学反应的基本规律
① 生命活动过程是由数千化学反应
组成的，相关联的化学反应形成
代谢途径，不同的代谢途径连接
形成代谢网络。
Chemical reactions
Metabolic pathways
Metabolic networks
A?B,B?C,C?D,
C?E,E?F
A?B?C?D
C?E?F
A?B?C?D
?
E?F
2、生物化学反应的基本规律
② 生物化学反应是由酶催化的，反应的
基本原理是相同的。
氧化还原反应
亲核反应
异构化反应
水解反应
合成反应
etc
反应很多，但反
应的机制是相对
较少的
2、生物化学反应的基本规律
③ 生物化学反应实现了生命必须的物质转
换、能量传递和信息交流的统一。
物质转换 ?生化反应的表现形式 ?生命平台
能量传递 ?生化反应的催化动力 ?生命活力
信息交流 ?生化反应的目标实现 ?生命意义
2、生物化学反应的基本规律
④ 生物化学反应发生在细胞中，
体现出生命的系统性。
生物分子的相互作用
细胞器之间的相互作用
细胞内的信号
细胞生命活动的协调与统一
etc
2、生物化学反应的基本规律
⑤ 生物化学发应是动态的，具有方向性。
物质转换、能量传递、信息交流是无时不停的；
生化反应是可以调节的；
生化反应的平衡是动态的；
生化反应是有方向的。
三、生物化学在本专业学习中
地位与作用
? 基础理论作用 （学习后续课程的基础）
? 实践动手作用 （基本实验技能的培训）
? 生物思想作用 （生化的角度看生命现象）
四、如何学好生物化学
? 4R法（ Read,Remember,
Repeat,Review）
? 做好笔记
? 做好习题
? 教学互动
理 解
掌 握
了 解
认 识
概 括
重 复
记 忆
阅 读
方 法 过 程
学习生物化学的“分子哲学”法
五、学习本课程的基本要求
? 需要掌握的核心内容
氨基酸的基本结构、性质、分离鉴定方法
蛋白质的基本结构、性质、功能、研究方法
酶催化的基本理论和调节，特别是米氏方程
核酸的基本组成单位、结构、性质、功能、研究方法
DNA复制,RNA合成及蛋白质合成的基本过程
基本糖代谢途径及生物氧化
脂肪酸分解与合成的基本过程
蛋白质和氨基酸分解与合成的一般概念
代谢途径的相互关系及代谢调控的基本概念
五、学习本课程的基本要求
?上课保证、作业、习题练习
?教材阅读
?实验技能
教材与参考书
教 材,生物化学，王镜岩等编，高等教育出版社
生物化学实验指导书，生物化学课程组编
生物化学课堂同步训练，生物化学课程组编
参 考 书,生物化学，王希成编，清华大学出版社
生物化学与生物物理进展（杂志）
Instant Notes in Biochemistry,B.D.Hams
（影印版，科学出版社）
参考网站,剑桥大学出版社，生物化学电子版
台湾大学，生物化学教学课件
第二章 蛋白质化学
本章内容
? 第一节 氨基酸的结构与分类
? 第二节 氨基酸的性质
? 第三节 氨基酸混合物的分离
? 第四节 蛋白质概论
? 第五节 蛋白质的一级结构
? 第六节 蛋白质的三维结构
? 第七节 蛋白质的理化性质与分离纯化
第一节 氨基酸的结构与分类
氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组
成蛋白质的基本单位（构件分子）。从各
种生物体内发现的氨基酸已有 180多种，但
参与蛋白质组成的常见氨基酸只有 20种，
这 20种 氨基酸称为 常见氨基酸 或基本氨基
酸。
amino acid,aa 或 AA
一,氨基酸的结构
氨基酸的结构通式
H 3 N C H
C O O
R
-
+ α
H 2 N C H
C O O H
R
α或
氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的 R基不同，
（除脯氨酸外）都为 L-α -氨基酸。
H
甘氨酸
CH3
丙氨酸 L-氨基酸的通式
R
C
+
N H
3
C O O
-
H
据 R基团
化学结构
分类
脂肪族Ａ A（ 16种）
芳香族Ａ A (Phe,Tyr,Trp)
杂环ＡＡ (His,Pro)
据 R基团
极性 分类
极性 R基团 AA
非极性 R基团 AA
不带电荷
带电荷
带正电荷 （３ 种）
带负电荷 （２ 种）
据 酸碱性质
分类
中性ＡＡ （ 一氨基一羧基 ）
酸性ＡＡ (一氨基二羧基 ) Glu,Asp
碱性ＡＡ ()（二氨基一羧基） Lys,His,Arg
据 营养
学分类
必需 ＡＡ
非必需 ＡＡ
人的必需氨基酸
Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr
假 设 来 借 一 两 本 书
Arg,His Trp,Cys
二、基本氨基酸的分类
甘氨酸
（ Gly,G）
丙氨酸
（ Ala,A）
缬氨酸
（ Val,V）
亮氨酸
（ Lue,L）
异亮氨酸
（ Ile,I）
1,侧链只是烃链（ 5种）
脂肪族氨基酸
2,侧链含有羟基 （ 2种）
丝氨酸
（ Ser,S）
苏氨酸
（ Thr,T）
3,侧链含硫原子（ 2种）
半胱氨酸
（ Cys,C） 甲硫氨酸 （ Met,M）
4,侧链含有羧基或酰胺基（ 4种）
天冬氨酸
（ Asp,D）
谷氨酸
（ Glu,E）
天冬酰胺
（ Asn,N）
谷氨酰胺
（ Gln,Q）
5,侧链含有碱性基团（ 3种）
赖氨酸
（ Lys,K）
精氨酸
（ Arg,R）
组氨酸
（ His,H）
芳香族氨基酸
苯丙氨酸
（ Phe,F）
酪氨酸
（ Tyr,Y）
色氨酸
（ Trp,W）
杂环氨基酸
组氨酸
（ His,H）
脯氨酸
（ Pro,P）
非
极
性
氨
基
酸
极
性
中
性
氨
基
酸
带正电荷的氨基酸
带负电荷的氨基酸
三、不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸
在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为 不
常见蛋白质氨基酸 。这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的
基本氨基酸衍生而来的。
N
H
HO
C O O H
4- 羟基脯氨酸
H
2
N C H
2
C H C H
2
C H
2
C H C O O H
O H N H
2
5- 羟基赖氨酸
N H
2
C H
3
N H C H
2
C H C H
2
C H
2
C H C O O H
6- N - 甲基赖氨酸
HO
I
I
C H
2
C H C O O H
N H
2
3,5- 二碘酪氨酸
非蛋白质氨基酸, 存在于生物体内，但不组成蛋白质
的呈游离或结合态的氨基酸，约 150种，具有多种生理功能。
（ 1） L-α-氨基酸的衍生物
L-瓜氨酸和 L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。
（ 2） D-α-氨基酸
D-Ala存在于肽聚糖中,D-Phe是短杆菌肽 S的组分。
（ 3） β,γ,δ-氨基酸
β-Ala是泛酸的前体,γ-氨基丁酸是传递神经冲动的化
学介质。
第二节 氨基酸的性质
一, 氨基酸的构型、旋光性和光吸收
构型,组成蛋白质的氨基酸除 Gly以外都有手性碳原子，
在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，
这两种不同的构型分别称为 D-型和 L-型。
以丙氨酸为例,
如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称
为Ｄ -,Ｌ -，Ｄ别 -和Ｌ别 -氨基酸。
H 2 N C H
C O O H
C
C H 3
O HH
H C N H 2
C O O H
C
C H 3
O HH
H C N H 2
C O O H
C
C H 3
HH O
H 2 N C H
C O O H
C
C H 3
HH O
L-苏氨酸
(L-threonine)
D-苏氨酸
(D-threonine)
L-别 -苏氨酸
(L-allo-threonine)
D-别 -苏氨酸
(D-allo-threonine)
自然界中组成蛋白质的氨基酸都是 L-型。
(Gly除外 )
旋光性,
组成蛋白质的氨基酸除 Gly以外，都有手性碳原子,
所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋
转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的
称右旋，用“＋”号表示。是 AA的物理常数，与结构、
PH值有关。
消旋
外消旋
内消旋
光吸收,
组成蛋白质的氨基酸中，
Trp,Tyr和 Phe对 紫外光
有一定的吸收，这是因为
它们分子中含有苯环，是
苯环的共轭双键造成的，
这三个氨基酸的光吸收都
在 280nm附近。
pH=pI
+OH-
pH>pI
+H+
+OH-
+H+
pH<pI
带电荷为零 带电荷为正 带电荷为负
CH
NH 3 +
C OO -R CH
NH 2
COO -RCH CO O HR
NH 3 +
完全质子化 完全去质子化 兼性离子
二、氨基酸的 两性解离及等电点
(pK′1) (pK′2)
不同 pH时氨基酸以不同的离子化形式存在！
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。
? 等电点 (isoelectric point,pI)
– 在某一 pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及
程度相等，成为兼性离子，呈电中性,在电场中既不向阳极
也不向阴极移动。 此时溶液的 pH值 称为 该氨基酸的等电点 。
– 氨基酸等电点的特点,
1.净电荷数等于零，在电场中不移动；
2.此时氨基酸的溶解度最小。
氨基酸等电点的确定,
根据 pK值（该基团在此 pH一半解离）计算,
等电点等于两性离子两侧 pK值的算术平均数。
pI = ———— pK1+pK2 2 或（ pI = ————） pK2+pK3
2
氨
基
酸
的
酸
碱
滴
定
Henderson-Hasselbalch方程
pH=pKa + lg [质子受体 ] [质子供体 ]
酸性氨基酸，以 Asp为例,
碱性氨基酸，以 Lys为例,
（ 1）与 HNO2的反应
三、氨基酸的化学反应
（ 2）与茚三酮的反应,
脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色。在 570nm（蓝紫色）
或 440nm（黄色）定量测定（ 0.5-50μ g/ml）。
(3)与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法
OH 中和滴定
? 反应特点
A,为 α- NH2的反应
B,在常温，中性条件，甲醛与 α- NH2很快反应，生成羟甲
基衍生物，释放氢离子。
? 应用：氨基酸定量分析 —甲醛滴定法（间接滴定）
A.直接滴定，终点 pH过高（ 12），没有适当指示剂。
B.与甲醛反应，滴定终点在 9左右，可用酚酞作指示剂。
C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比 1,1）
D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。
? 反应特点
A.为 α- NH2的反应
B,在弱碱性条件下，与 DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸
? 应用：鉴定多肽或蛋白质的 N-末端氨基酸。
首先由 Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构。
(4) 与 2,4-二硝基氟苯（ DNFB）的颜色反应
（黄色）
N C S N H C H C
O
R 2
N C H C
O
R 1
H
H
N
H
S,C
C H C
O
R 1
H N N H C H C
O
R 2
SN
H
C
N H OC
R 1
C HN H 2 C H C
O
R 2
N
C
O C H
N H
SC
R 1
(5)与苯异硫氰酸酯（ PITC）的反应
? 由 Edman于 1950年首先提出
? 为 α- NH2的反应
? 用于 N末端分析，又称 Edman降解法
- OOC - CH - CH
2 - S
+ NH
3
S - CH 2 - CH - C OO -
+ NH
3
+
胱氨酸 二硫键
-HH
- OOC - CH - CH
2 - SH
+ NH
3
HS - CH 2 - CH - C OO -
+ NH
3
（ 6）半胱氨酸的氧化与还原反应
pI
PK2=4.25
PK3=9.67
PK1=2.19
PK2 PK3 PK1
pI
PK1=1.82
PK2=6.0
PK3=9.17
PK2 PK1 PK3
第三节 氨基酸混合物的分离
一、层析技术
纸层析、薄层层析、离子交换层析、高效液相层析
二、电泳技术
纸电泳
一、层析技术
层析技术又称色谱技术 （ Chromatography），是一
种根据被分离物质的物理、化学及生物学特性的差异，
使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的
方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体
化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力
的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动
相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达
到彼此分离的目的。
1,层析技术的分类
? 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸
层析、薄层层析和柱层析。
? 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层
析和气相层析。
? 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为
吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交
换层析、亲和层析等。
吸附层析 是以吸附剂为固定相，根据待分离物与
吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层
析技术。
分配层析 是根据在一个有两相同时存在的溶剂系
统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的
的一种层析技术。
凝胶过滤层析 是以具有网状结构的凝胶颗粒作为
固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层
析技术。
离子交换层析 是以离子交换剂为固定相，根据
物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技
术。
亲和层析 是根据生物大分子和配体之间的特异
性亲和力（如酶和底物、抗体和抗原、激素和
受体等），将某种配体连接在载体上作为固定
相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进
行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物
大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。
原理,组成层析系统的固定相和流动相具有相反
的极性。被分析的样品（如 aa混合物）中的各组
分依据其自身极性的强弱，与此两相的亲和力不
同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流
动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分
离的目的。
2,分配层析
（ 1）纸层析
单向纸层析 迁移率,Rf
双向纸层析图
（ 2）薄层层析
2．离子交换层析
原理,分离氨基酸时，用 离子交换树脂 作为支持物，利
用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换
反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固
程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移
动，从而达到分离的目的。
离
子
交
换
原
理
及
流
程
示
意
图
+
树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯
组成的具有网状结构的高分子聚合物。
洗脱顺序主要与各种离子所带电荷有关，在电
荷相同时，与极性、非极性有关。
阳离子交换树脂：活性基团是酸性的,如磺酸基 -SO3H
（强酸型），羧基 -COOH（弱酸型）
阴离子交换树脂：活性基团是碱性的,如季胺基 -N+(CH3)3OH-
基本步骤,
装柱 上样 分步洗脱 分步收集
强酸型阳
离子交换
树脂
pH2~3，使所有
氨基酸带正电荷，
正电荷大小顺序：
碱性 AA>中性
AA>酸性 AA
逐步提高洗
脱液 pH和离
子强度
习题举例,
有一种蛋白质水解物,在 pH6时,用阳离子交换柱层
析分离,第一个被洗脱的氨基酸是 ( )
A,Val (pI5.96) B,Lys (pI9.74) C,Asp(pI2.77)
D,Arg(pI10.76) E,Tyr (pI5.66)
二、电泳
氨基酸在 pH高于或低于其 pI的溶液中为带电的颗粒，
在电场中能向正极或负极移动。这种通过氨基酸在电场中
泳动而达到分离各种氨基酸的技术,称为 电泳
(elctrophoresis) 。
分离氨基酸混合物常用 纸电泳 。
第四节 蛋白质概论
一、蛋白质的定义
蛋白质 (Protein,pr),是一切生物
体中普遍存在的，由天然氨基酸按
照一定的顺序，通过肽键连接而成
的一条或多条肽链构成的生物大分
子；其种类繁多，各具有一定的相
对分子质量，复杂的分子结构和特
定的生物功能；是表达生物遗传性
状的一类主要物质。
二、蛋白质的生物学重要性
1,蛋白质是生物体重要组成成分
分布广 含量高
2,蛋白质具有重要的生物学功能
1）催化生物化学反应（酶）
2）结构成分 (结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白 )
3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）
5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6）激素功能（胰岛素）
7）防御功能（抗体、血凝蛋白）
8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）
9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
3,氧化供能
三、蛋白质的元素组成
主要有 C,H,O,N 和 S。
有些蛋白质含有少量 磷 或金属元素 铁、铜、锌、锰、
钴、钼,个别蛋白质还含有 碘 。
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为 16％,这是凯氏定氮法
测蛋白质含量的理论依据,
蛋白质含量＝蛋白质含 N量 × 6.25
1,按组成分类
﹡ 单纯蛋白质
这类蛋白质 只含有 ?-氨基酸组成,不含其它成分。
例如,RNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋
白等。
﹡ 结合蛋白
由 简单蛋白与其它非蛋白 成分结合而成，这些非蛋
白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。
糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。
脂蛋白：如血清 ?-,?-脂蛋白等。
核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。
色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。
四,蛋白质的 分类
2.按 蛋白质的外形分类
﹡ 球状蛋白质
外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数
蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。
﹡ 纤维状蛋白质
分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和
不溶性纤维状蛋白质。
不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如
胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等。
可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。
3.按 多肽链条数分类
﹡ 单体蛋白质
仅含一条多肽链。
﹡ 多聚蛋白质
含两条或多条多肽链。
例如,
牛核糖核酸酶,一条多肽链
胰岛素,两条（两种）多肽链
血红蛋白：四条（两种）多肽链
胰岛素
牛核糖核酸酶 血红蛋白
五、蛋白质的分子结构层次
一级结构 (primary structure)
二级结构 (secondary structure)
三级结构 (tertiary structure)
四级结构 (quaternary structure)
高级
结构
蛋白质的一级结构决定高级结构！
第五节 蛋白质的一级结构
一、肽（ peptide）
1.肽的结构和命名
肽是由 一个氨基酸的 ?-羧基 与 另一个氨基酸的 ?-
氨基 脱水缩合而形成的无分支线形聚合物 。 其中的氨
基酸单位称 氨基酸残基 。
氨基酸间缩水形成的共价键称 肽键 (peptide bond)。
NH
2
- CH - C
H
O
OH
甘 氨 酸甘 氨 酸
+
-HOH
甘氨酰甘氨酸 肽键
NH 2 - CH - C - N - CH - C
O
OHHHH
O
NH - CH - C
H OH
O
H
甘 氨 酸
甘氨酰甘氨酸
*两分子氨基酸缩合形成 二肽,三分子氨基酸缩合则形成 三肽 ……
*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为 寡肽 (oligopeptide),由更多
的氨基酸相连形成的肽称 多肽 (polypeptide)。
* 多肽链 (polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而
成的一种结构 。
N 末端：多肽链中有自由氨基的一端
C 末端：多肽链中有自由羧基的一端
多肽链有两端
氨基酸的顺序是 N 端 → C 端的排列顺序。如上述五肽可表示为,
Ser-Val-Tyr-Asp-Gly
丝氨 酰 缬氨 酰 酪氨 酰 天冬氨 酰 谷氨 酸
C C N C C N C C N C C N C
C H
2
C H C H
2
C H
2
C H
2
C O O
-
O H C O
2
H C H
2
C O N H
2
O H
C H
3
H
3
N
+
O O O O
H H H H H
H H H H
S e r V a l T y r A s p G l n
C H
3
N- 端 C- 端
肽键
COOH
２,肽键的结构特点,
氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽
键中的 C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。所
以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面
称为 肽平面 。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结
构存在。
Ｎ Ｃ
Ｏ
酰胺平面 —— 由肽键周围的 6个原子组成的刚性平面
— C — NH —
O
O
C? — C N — C?
H
键长介于单
双键之间
O –
— C NH — +
? 虽是单键却有 双键 性质
? 周边六个原子在 同一平面 上
? 前后两个 ?-carbon在对角 (trans)
C
N C H ?
N C
O C ?
0.123nm
0.132nm 0.153nm
0.147nm
C-N 0.149 nm
C=N 0.127 nm
相关名词,
? 肽单元：参与肽键的 6个原子被约束于一个平面上，与此相应
的 -Cα-CO-NH-Cα-则称为肽单元 。
? 多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长
链骨架 (…Cα -CO-NH-Cα….) 为多肽链的主链。
或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链,
称为主链。
? 多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团
为多肽侧链。或：氨基酸残基的 R-基连在主链上
成为侧链。
说明,各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（ R-基）
的顺序即氨基酸的顺序各不相同 。
３,肽的理化性质 —— 类似于氨基酸性质
１）旋光性
２）两性解离及等电点
３）化学反应
双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物 与碱
性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色
越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定
量测定及测定蛋白质水解程度。
４,天然存在的活性肽
在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白
质的亚单位。
有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这
类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为 活性肽 。
如,脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘
肽；蛇毒多肽 等。
① 谷胱甘肽 (glutathione,GSH)
γ-
GSH过氧
化物酶
H2O2 2GSH
2H2O GSSG
GSH还原酶
NADPH+H+
NADP+
谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还
原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物
积累。
② 抗生素类多肽
短杆菌肽 S
? 体内许多激素属寡肽或多肽
③ 激素类多肽
二, 蛋白质一级结构的测定
1.蛋白质一级结构,
蛋白质分子中氨基酸残基的 排列顺序,即氨基酸的
线性序列。 一级结构中包含的共价键主要指 肽键 和 二硫
键。 在基因编码的蛋白质中，这种序列是由 mRNA中的
核苷酸序列决定的。
蛋白质的一级结构 (Primary structure)包括,
(1)组成蛋白质的 多肽链数目 ;
(2)多肽链的 氨基酸顺序 ;
(3)多肽链内或链间 二硫键的数目和位置 。
★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白
质生物功能的基础 。
——
2.蛋白质一级结构测定的意义
① 是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质生理功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
胰岛素
一级结构
高级结构
正常红细胞与
镰刀形红细胞
的扫描电镜图
镰刀形
红细胞
正常红
细胞
?-链 N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8
Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…
Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…
不同生物与人的 Cytc的 AA差异数目
生物 与人不同的 AA数目
黑猩猩 0
恒河猴 1
兔 9
袋鼠 10
牛、猪、羊、狗 11
马 12
鸡、火鸡 13
响尾蛇 14
海龟 15
金枪鱼 21
角饺 23
小蝇 25
蛾 31
小麦 35
粗早链孢霉 43
酵母 44
不
同
生
物
来
源
的
细
胞
色
素
c
中
不
变
的
AA
残
基
14
10
6
100
1
34
32
30
29
27
18
17
67
59
52
51
48
45 41
38
87
84
82
80
70
68
91
Gly
Gly
Phe
Cys
Gly
Gly
Gly
Arg
Lys
Gly
Cys
Lys
Phe
His
Pro Leu
Gly
Arg
Tyr
Ala
Asn
Trp
Tyr 70
75
80
Lys
Lys
Lys
Pro
Pro
Tyr
Ile
Gly
Thr
Met
Asn
Leu
血红素
细胞色素 c分子的空间结构
不变 的 AA残基
35个不变的 AA残基，是 Cyt C 的生物功能所不
可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的
可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合
细胞色素还原酶和氧化酶。
3.一级结构测定的原则和基本流程
一级结构测定的原则,
将大化小，逐段分析，制成两套肽片段,找出重
叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的
完整序列 。
目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出
蛋白质的一级结构。
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
将肽段分离并测出顺序
专一性裂解
末端氨基酸测定
拆开二硫键
纯蛋白质 蛋白质顺序测 定基本战略
通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列
按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列
分离编码蛋白质的基因
测定 DNA序列
排列出 mRNA序列
一级结构测定的基本流程,
（ 1）拆分蛋白质分子的多肽链 ;
（ 2）鉴定多肽链的 N一末端和 C一末端残基 ;
（ 3）用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小
的片段 ;
（ 4）测定各肽段的氨基酸序列 ;
（ 5）重建完整多肽链的一级结构 ;
（ 6）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置；
（ 7）酰胺基位置的确定。
测定蛋白质的一级结构前的 准备工作
A,样品纯度必须 >97%以上；
聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带
B,测定蛋白质的相对分子质量；
SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法
C,测定蛋白质多肽链种类和数目；
种类,SDS-PAGE
数目,N末端氨基酸残基摩尔数 /蛋白质摩尔数
D,测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸
的个数；
E,测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
① 酸水解,常用 6 mol/L的盐酸或 4 mol/L的硫酸在 105-110℃ 条件下
进行水解，反应时间约 20小时。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化 。
缺点是 色氨酸 被沸酸完全 破坏 ；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸
有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧
基 。
② 碱水解,一般用 5 mol/L氢氧化钠煮沸 10-20小时。
由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏, 产率不高 。 部分
的水解产物发生 消旋 化 。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏 。
③ 酶水解,应用酶水解多肽不会破坏氨基酸, 也不会发生消旋化 。 水
解的产物为较小的肽段 。
4.蛋白质的一级结构测定
1）多肽链的拆分 ——获得单条线形多肽链
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆
分。如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体
等。
① 拆分非共价键：可用 8mol/L
尿素 或 6mol/L盐酸胍处理 。
② 拆分 二硫键：几条多肽链通过
二硫键交联在一起。可在
8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存
在下,用过量的 ?-巯基乙醇 处理，
使二硫键还原为巯基，然后用烷
基化试剂保护生成的巯基，以防
止它重新被氧化。
拆分
★ 巯基的保护
- O O C C H C H
2 S H
N H 3 +
I C H 2 C N H 2
O
C H 2 O C C l
O
C H 2 C l
- O O C C H C H
2 S
N H 3 +
O C C H 2
O
C H 2- O O C C H C H 2 S
N H 3 +
C H 2 C N H 2
O
- O O C C H C H
2 S
N H 3 +
2） N-末端和 C-末端氨基酸残基的确定 ——为氨
基
酸序列排列建立两个重要的参考
点
N端分析方法,① 二硝基氟苯法（ DNP法,DNFB法或 FDNB法）
② 丹磺酰氯法（ DNS法）
丹磺酰 -氨
基酸有很强
的荧光性质
③ 苯异硫氰酸 (酯 )法（ PITC法,PTC法,PTH法,Edman降解法 ）
由于其连续反应特性,
成为蛋白质序列分析仪
的分析原理！
④ 氨肽酶（ aminopeptidase,Apase）法
Ala Val
Gly
氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的 N-端逐个的
水解。 根据 不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数
量，从而知道蛋白质的 N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸
氨肽酶，水解以亮氨酸残基为 N-末端的肽键速度最大。
C末端分析方法
肼解法,多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸即从肽链
上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够
与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与 C-端氨基酸分离 。
H 2 N C H C
R O
H N C H C
R O OR n
CC HH N O H
n - 1
N- 端 氨 基 酸 C - 端 氨 基 酸
OR n
CC HH 2 N O HH 2 N C H C
R O
N H N H 2 +
H
+
N H 2 N H 2
氨 基 酸 酰 肼 C- 端 氨 基 酸
羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽
链的 C-端逐个的水解。
目前常用的羧肽酶有四种,A,B,C和 Y。 羧肽酶 A能
水解除 Pro,Arg和 Lys以外的所有 C-末端氨基酸残基；
B只能水解 Arg和 Lys为 C-末端残基的肽键 。
（ 3）多肽链部分裂解成较小的片段 ——化大为小,
获得短 肽段
? 酶解法,胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，
嗜热菌蛋白酶等。
? 化学法,溴化氰 水解法，它能选择性地切
割由 甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
C H 3 S,
C H 2
C H 2
C HN H C N H C H C
O OR
+ B r C
+
N
B r
-
C H 3 S
+
C H 2
C H 2
C HN H C N H C H C
O OR
C N
C H 3 S C N C H
2
C HN H C N H C H C
O OR
C H 2
+
H 2 O
+
C H 2
C HN H C
O
C H 2
O H 3 N
+
C H C
OR
高丝氨酸内酯
胰蛋白酶,
R1=赖氨酸 Lys和精氨酸
Arg侧链 （专一性较强，
水解速度快）。
N H C H C
O
R 4
N H C H C
O
R 3
N H C H C
O
R 2
N H C H C
O
R 1
或胰凝乳蛋白酶,
R1=苯丙氨酸 Phe,色氨
酸 Trp,酪氨酸 Tyr
N H C H C
O
R 4
N H C H C
O
R 3
N H C H C
O
R 2
N H C H C
O
R 1
糜蛋白酶
胃蛋白酶,
在疏水性氨基酸处部分水解，最
适反应 pH为 2~3。
（ 4）测定各短肽段的氨基酸序列
方法,蛋白质序列分析仪
原理,1,Edman 法
2,DNS- Edman 法
3,有色 - Edman 法
（ 5）重建完整多肽链的一级结构 -获得多肽链的完整序列
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交
错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
? 对角线电泳 步骤,
1.碘乙酰胺封闭 -SH
2.胃蛋白酶酶切蛋白质（ pH2）
3.第一向电泳（ pH6.5）
4.过甲酸氧化处理 -S-S-键生成 -SO3H
5.第二向电泳（ pH6.5）
6.分离出含二硫键的两条短肽
7.测序，与拼接出的多肽链比较，确定二硫键的位置。
（ 6 ）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置
对角线电泳动态图解
（ 7）酰胺基位置的确定
Asp—Asn,Glu—Gln
方法：酶解肽链，产生含有单个 Asx或 Glx的肽，用
电泳法确定是 Asp还是 Asn。
第六节 蛋白质的三维结构
蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、盘
绕或组装成特有的空间结构，亦称 高级结构 。
蛋白质的高级结构即蛋白质的构象。
构象 是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原
子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。构象的
改变不需要共价键的断裂和重新形成，只需单键的旋转即
可形成新的构象。
酰胺平面与 α-碳原子的二面角（ φ和 ψ ）
二面角
两相邻酰胺平面之间, 能以共同的 Cα为定
点而旋转, 绕 Cα-N键旋转的角度称 φ角, 绕 C-
Cα键旋转的角度称 ψ角 。 φ和 ψ称作二面角,
亦称构象角 。
肽链的主链可看成是由被 C?隔开的许多平面组成的。
N端 C端
R
H H
O
C
C? N
C?
C
R
O
N
O
C
N
C?
C
R
O
N
C?
H
H
H
H
C?
H
事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很
少几种构象，而且相当稳定。
维持蛋白质分子构象的作用力
离子键 氢键
范德华力 疏水相互作用力
一,蛋白质的二级结构
（一）二级结构的概念
蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,
即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置,
并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。
主要的化学键, 氢键
1,?-螺旋 (?-helix)
2,?-折叠 (?-pleated sheet)
3,?-转角 (?-turn)
4,无规卷曲 (nonregular coil)
（ 二 ） 二级结构单元的种类
1） 绝大多数天然蛋白质
都是 右手螺旋 。
2） 每隔 3.6个氨基酸残基
螺旋上升一圈；每圈间距
0.54nm,即每个氨基酸
残基沿螺旋中心轴上升
0.15nm,旋转 100° 。
α -螺旋结构的主要特点,
1.α -螺旋 (α -helix)
3）每个氨基酸残基的
N-H都与前面（ C端）
第四个残基 C=O形成 氢
键 。
4)螺旋体中所有氨基酸残
基侧链都伸向外侧；链中
的全部 C=O和 N-H几乎都平
行于螺旋轴,氢键几乎平行
于中心轴 ;
* R为 Gly时，由于 Ca上有 2个氢，使 Ca-C,Ca-N的转动
的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大
大降低。 R基大 (如 Ile)也不易形成 α-螺旋。
* α -螺旋遇到 Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚
氨基酸且有刚性的环状结构。
* 带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋
的稳定性降低。
侧链在 ?-螺旋结构的影响,
* R基较小,且不带电荷的氨基酸利于 α -螺旋的形成,如
多聚丙氨酸在 pH7的水溶液中自发卷曲成 α -螺旋。
2.β -折叠 (β-pleated sheet)
β -折叠 是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结
而成的锯齿状片状结构 。
① 在 ?-折叠中,?-碳原子总是处于折叠的角上，氨基
酸的 R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基
酸之间的轴心距为 0.35nm 。
0.7nm
② ?-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可
以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与
链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。
（ a）平行式 （ b）反平行式
③ ?-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的
N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽
链的方向相反。后者更为稳定。
3.β-转角 （ β-turn）
也称 β -回折, 存在于球状蛋白中 。 其特点是肽链回
折 180°, 使得氨基酸残基的 C=O与第四个残基的 N-H形成
氢键 。 第二个氨基酸通常是 pro。
β -转角都在蛋白
质分子的表面，多数
为亲水氨基酸组成。
4.无规则卷曲 （ non-regular coil）
又称自由卷曲, 是指没有一定规律的松散肽
链结构, 但是其结构是明确而稳定的, 常常构成
酶的功能部位 。
无规卷曲常出现在 a-螺旋与 a-螺旋, a-
螺旋与 β -折叠, β -折叠与 β -折叠之间 。
它是形成蛋白质三级结构所必需的 。
二、蛋白质的超二级结构
（一）超二级结构的概念
指蛋白质中相邻的二级结构单位 (即单个
?-螺旋或 ?-转角 )组合在一起，形成有规则的
在空间上能辩认的二级结构组合体。
★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但
没有聚集成具有功能的结构域。
??：由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋
???：由两股 ?折叠片，中间加入 ?螺旋而形成
的片层结构
???：由三条或更多的反平行式 ?-链通过 ?-转
角或其它的肽段连接而成的结构
（ 二 ） 超二级结构的基本形式
超二级结构类型
βββ
αα β αβ
1 2 3 4 5
指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上
形成三级结构的局部折叠区, 它是相对独立的紧
密球状实体, 称为结构域 （ domain） 。
酵母己糖激酶的三级结构
结构域之间有一段柔性的肽链
相连 — 铰链区，使结构域之间
可以发生相对移动；结构域承
担一定的生物学功能，几个结
构域协同作用可体现出蛋白质
的总体功能；结构域间的裂缝
常为酶的活性部位，也是反应
物的出入口。
三、蛋白质的结构域
α+β结构域
乳酸脱氢酶结构域 1
α /β结构域
丙酮酸激酶结构域 4 3-P-甘油醛脱氢酶结构域 2
木瓜蛋白酶结构域 1 木瓜蛋白酶结构域 2
无规则卷曲 + α -螺旋结构域 无规则卷曲 +β-回折结构域
三级结构 （ tertiary structure）,指的是
多肽链在二级结构, 超二级结构和结构域的
基础上, 主链构象和侧链构象相互作用, 进
一步盘曲折叠形成 球状分子结构 。
四、蛋白质的三级结构
（一）三级结构的概念
（ 二 ） 球状蛋白的三级的结构特征
含有多种二级结构单元。
分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋
白质的活性中心。
大多数非极性侧链埋在分子内部，形成 疏水核 ；
而极性侧链在分子表面，形成 亲水面 。
蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。
分子呈现球状或椭圆状。
（ 三 ） 维持三级结构的作用力
二硫键 —— 共价键
疏水作用
非共价键（次级键）
氢键
离子键
范德华力
四级结构（ quaternary
structure）,由两条或两
条以上具有三级结构的多肽
链聚合而成、有特定三维结
构的蛋白质构象。每条多肽
链又称为 亚基 (subunit) 。
五、蛋白质的四级结构
例如，
血红蛋
白的四
级结构
（一）四级结构的概念
（ 二 ） 蛋白质四级结构的特点
? 1） 有多个亚基
? 2） 稳定性主要靠亚基间的 疏水作用 维持
? 3） 亚基单独存在时无生物活性或活性很小,
只有通过亚基相互聚合成四级结构后, 蛋
白质才具有完整的生物活性 。
? 4） 亚基见具有 协同性 和 别构效应 。
蛋
白
质
的
空
间
结
构
二级结构 超二级结构 结构域
三级结构 四级结构
六、蛋白质三维结构与功能的关系
（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构
Hb与 Mb一样能可逆地与 O2结合, Hb与
O2结合后称为 氧合 Hb。 氧合 Hb占总 Hb的百
分数 （ 称 百分饱和度 ） 随 O2浓度变化而改变 。
（二）血红蛋白的构象变化与结合氧
肌红蛋白 (Mb)和血红蛋白 (Hb)的氧解离曲线
1,协同效应 (cooperativity)
一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体
结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配
体结合能力的现象，称为 协同效应 。
如果是促进作用则称为 正协同效应
(positive cooperativity)
如果是抑制作用则称为 负协同效应
(negative cooperativity)
O2
血红素与氧结
合后, 铁原子半径
变小, 就能进入卟
啉环的小孔中, 继
而引起肽链位置的
变动 。
变构效应 (allosteric effect)
蛋白质空间结构的改变伴随其功
能的变化, 称为 变构效应 。
2,波尔效应（ Bohr）
1904年,Christian Bohr发现,
增加 CO2浓度、降低 pH能显著降低血红蛋白与 O2
的结合。
生理意义：波尔效应使血红蛋白运输 O2的效率提高。
? 2,3—二磷酸甘油酸（ BPG）通过与血红蛋白
的两个 β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧
态构象，因而降低了血红蛋白的氧亲合力。
3,BPG的别构效应
（三）蛋白质构象改变与疾病
蛋白质构象疾病,若蛋白质的折叠发生
错误, 尽管其一级结构不变, 但蛋白质的构
象发生改变, 仍可影响其功能, 严重时可导
致疾病发生 。
蛋白质构象改变导致疾病的机理,有些蛋
白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解
酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现
为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。
这类疾病包括,人纹状体脊髓变性病、老
年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。
疯牛病中的蛋白质构象改变
疯牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein,PrP)
引起的一组人和动物神经退行性病变。
正常的 PrP富含 α-螺旋，称为 PrPc。
PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全
为 β-折叠的 PrPsc，从而致病。
PrPc
α-螺旋
PrPsc
β-折叠
正常 疯牛病
第七节 蛋白质的理化性质与分离纯
化 一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外, 氨基酸残
基侧链中某些基团, 在一定的溶液 pH条件下都可解
离成带负电荷或正电荷的基团 。
* 蛋白质的等电点 ( isoelectric point,pI)
当蛋白质溶液处于某一 pH时，蛋白质解离成正、负
离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此
时溶液的 pH称为 蛋白质的等电点。 在等电点时蛋白
质的溶解度最小，在电场中不移动。
蛋白质的 等离子点 （ 特征常数 ）,
指在纯水中 （ 即没有其它盐类存在 ） 蛋白
质的正离子数等于负离子数的 pH值 。 因蛋白质
的等电点不是一成不变的, 它随溶剂性质, 离
子强变等因素而改变 。
二、蛋白质的胶体性质
由于蛋白质分子量很大, 在水溶液中形成 1-100nm的颗
粒, 因而具有胶体溶液的特征 （ 布郎运动, 丁道尔现象, 不
能透过半透膜 ） 。
1.蛋白质胶体稳定的因素
① 可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很
高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒表面形成 水化层,其可
防止分子互碰而聚集 ；
② 蛋白质在非等电点状态时带同种电荷，在 颗粒表面形成 电荷层，
同性电荷互斥，使分子不能聚集。
+
+
+
+
+
+
+
带正电荷的蛋白质
－ －
－
－ － － －
－
带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
水化层
+ +
+
+
+ +
+ +
带正电荷的蛋白质
－
－ －
－
－
－
－ －
带负电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
酸 碱
酸 碱
酸 碱
脱水作用 脱水作用 脱水作用
蛋白质的聚沉
蛋
白
质
胶
体
溶
液
沉
淀
作
用
示
意
图
2.蛋白质的沉淀作用
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或
失去水化层 （ 消除相同电荷, 除去水膜 ）, 蛋白质胶体溶
液就不再稳定并将产生沉淀 。
沉淀方法类别,
① 高浓度中性盐 （ 盐析 ）
② 等电点沉淀
③ 有机溶剂沉淀
④ 重金属盐类沉淀
⑤ 生物碱试剂和某些酸类沉淀
⑥ 加热变性沉淀
盐析 (salt precipitation)是将高浓度硫酸铵, 硫酸钠或
氯化钠等中性盐加入蛋白质溶液, 使蛋白质表面水化
膜被破坏, 导致蛋白质沉淀 。
*分段盐析：调节盐浓度, 可使混合蛋白质溶液中的
几
种蛋白质分段析出 。
例如：血清球蛋白 （ 50%(NH4)2SO4饱和度 ）,
清蛋白 （ 饱和 (NH4)2SO4)。
3.沉淀类型
A.可逆沉淀
在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构
并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再
溶于水溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析
作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电
点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。
B.不可逆沉淀 /变性沉淀
在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原
来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能
再溶解于原来溶剂或水溶液中的作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。
重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶
剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在而并不析出，例
如：在强酸碱中变性的蛋白质在强酸碱溶液中仍存在电荷效应，所以
不表现为沉淀现象。相对地，沉淀的蛋白质也未必都已变性。
* 蛋白质的凝固作用 (protein coagulation)
蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固
的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。
（三）蛋白质的变性与复性
蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其
特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构
变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改
变和生物活性的丧失。
1.蛋白质变性的概念
2.变性的本质
—— 破坏非共价键，不改变蛋白质的一级结构。
3.变性的因素
加热、有机溶剂、强酸、强碱、表面活性剂
（如十二烷基硫酸钠即 SDS）、还原性试剂
（尿素、盐酸胍）、紫外线、机械力等 。
4.变性蛋白质性质的改变
① 生物学功能的丧失（主要标志）；
② 分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被
酶消化；
③ 疏水基团外露，水化层被破坏,溶解度降低，易
形成沉淀析出，粘性增加，紫外吸收改变等；
④ 丧失结晶能力。
? 应用举例
?临床医学上，变性因素常被应用来消毒及
灭菌。
?此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质
制剂（如疫苗等）的必要条件。
5.蛋白质的复性
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，
可缓慢地重新自发折叠 成原来的构象，恢复
或部分恢复其原有的构象和功能，称为 复性
(renaturation),这种变性也称为可逆变性 。
可逆变性作用
蛋白质复性
（尿素,β-巯基乙醇）
（ 去除尿素,β-巯基乙醇）
非折叠状态，无活性
天然状态，
有催化活性
（四）蛋白质的分子大小
蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大
于 6000，最高可达 40000000（烟草花叶病毒）。
目前常用的方法包括,扩散系数、沉降超离心、凝
胶过滤、渗透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
1.根据化学成分测定最小相对分子质量
利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素
的含量，并假定蛋白质分子中含 1个这种元素，即
可测算最低 Mr。
如：用化学分析法测定血红蛋白质中含 Fe 0.34％，
则
最低 Mr=55.84× 100/0.34=16700；
用其它方法测定，其实际 Mr为 16700的 4倍，由
此可知，血红蛋白含有 4个 Fe的原子，而不是 1
个 Fe。
2,超离心法
? 在 60 000～ 80 000r/min 的高速离心力作用下，蛋白
质分子会沿旋转中心向外周方向移动。
? 超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。
? 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心
沉降速度。
? 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉
降系数 S大体上和分子量成正比关系，故可应用超
速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不
对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
离
心
机
结
构
示
意
图
转头
转头腔
沉降样品
驱动马达
真空 冷冻
? 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用 S表示。
? 一个 S单位，为 1× 10-13秒。
? 相对分子质量越大,S值越大。
? 蛋白质的沉降系数,1～ 200S。
? 超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离
纯化蛋白质。
s = ———— v ω2x
v =沉降速度（ dx/dt）
ω=离心机转子角速度（弧度 /s）
x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（ cm）
? 由沉降系数 S可根据斯维得贝格 〔 Svedberg〕
方程计算蛋白质分子的相对分子质量,
M=RST/D〔 1－ iρ〕
R：气体常数 T：绝对温度
D：扩散系数 ρ：溶剂的密度
3.凝胶过滤法
? 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结
构。
? 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的
分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。
? 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液
体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程
长，后洗脱下来，洗脱体积大。
? 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：
Sephadex
? 洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶
（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的
洗脱液体积。
? 测定样品蛋白质分子量的方法,
① 测得几种标准蛋白质的洗脱体积 〔 Ve〕 ；
② 以相对分子质量对数（ logM）对 Ve作图,
得标准曲线；
③ 再测出未知样品洗脱体积 〔 Ve〕 ；
④ 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子
质量。
4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
? 聚丙烯酰胺凝胶,单体 —丙烯酰胺 （ acrylamide,简
称 Acr）和交联剂 —N,N-甲叉双丙烯酰胺
（ methylene-bisacrylamide,简称 Bis）在 加速剂 和 催化
剂 的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结
构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙
烯酰胺凝胶电泳（ polyacrylamide gel electrophoresis,
简称 PAGE）。
? SDS:十二烷基硫酸钠,变性剂
? 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、
大小、形状）
★ 此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量
? 方法,① 用 SDS和 巯基乙醇 （打开二硫键）处理
蛋白质变性（肽链伸展）并与 SDS结合，形成
SDS-蛋白质复合物，使得不同 蛋白质分子均带
负电 （ SDS带负电），且 荷质比相同 （蛋白质分
子大，结合 SDS多；分子小，结合 SDS少）；
不同蛋白质分子具有 相似的构象 。
② 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们
的迁移率作图
③ 测出待测样品的迁移率
④ 从标准曲线上查出样品的相对分子质量
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的一般原则
提纯的目标：尽量 提高蛋白质的纯度或比
活性,设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽
可能 提高蛋白质的产量 。
根据蛋白质的性质加以选择，如 分子大小，溶
解度、电荷、吸附性质及生物亲和力 等。
一般程序,
1,从组织细胞中溶解放出蛋白质, 并保持天然状态,
常用低温冰冻, 化学试剂及溶菌酶破壁, 破膜, 再用
溶剂提取 。
2,分离所需要蛋白质与其他蛋白质
a 等电点沉淀
b 盐析和有机溶剂分级分离
纯化,a 离子交换层析
b 凝胶过滤层析
c 亲和层 析
d 电泳方法
3、结晶提纯
a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白
b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液
各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。
防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。
（ 一 ） 根据分子大小不同的分离方法
1,透析和超过滤
透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质,
而
水和无机盐等小分子自由通过, 此方法只
能
将蛋白质和小分子物质分开, 不能将不同
蛋
白质分开 。
超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半
透膜, 蛋白质留在膜上 。
透析与超过滤简易装置
2,密度梯度离心
a.蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小也取决于
它的密度 。
b.颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时,
即停止不前 。
c.在离心力的作用下, 各种蛋白质在不同密度介
质中形成独立的区带 。
3,凝胶过滤
a.又称分子筛层析，是根据分子大小分离蛋白质
混合物最有效的方法之一。
b.常用葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex)和琼脂糖凝
胶（商品名为 Sepharose）。
c.网孔大小 — 用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比
例来实现
d.大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。
凝胶过滤法
（ 二 ） 利用溶解度差别的分离方法
1,等电点沉淀
利用各种蛋白质在等电点时, 溶解度最
小
这一性质, 可以通过调节蛋白质溶液的 PH
值, 将不同的蛋白质分开 。
2,盐溶和盐析
盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层,
使蛋白质溶解度增加；
盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层,
使蛋白质溶解度降低, 发生沉淀析出 。
分段盐析,不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同, 蛋白质
溶液中, 逐渐增大盐浓度, 不同蛋白质先后析出, 称分
段盐析 。
3.有机溶剂沉淀法
a 有机溶剂 （ 与水相溶 ） 争取蛋白质颗粒上的水
膜, 使之沉淀 。
b 有机溶剂：乙醇, 丙酮
c 低温操作, 边加入边搅拌, 防止局部过热, 引
起变性, 尽量缩短处理时间 。
（ 三 ） 根据电荷不同的分离方法
1, 电泳 原理与 AA的电泳相同
电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 分子大小不同 的
蛋白质所带 净电荷密度不同,迁移率不同，在电泳时可以
分开。
a,自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。
b,区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进
行电泳，不同组分形成带状区域。
1）纸电泳：用滤纸作支持物。
2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作
支持物。
1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。
2）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。
+
—
- +
纯化中应用最多的是 聚丙烯酰胺凝胶电
泳 和 等电聚焦电泳,它们既可以作为蛋
白质纯度检验方法，也可以纯化、制备
蛋白质。
PA
GE
垂
直
平
板
电
泳
示
意
图
低 浓度 浓缩 胶
高 浓度 分离 胶
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应,
①浓缩效应
②分子筛效应
③电荷效应
等电聚焦电泳,当蛋白质在其等电点时，
净电荷为零，在电场中不再移动。
+ + － －
－
－
+
－ －
－ － －
5.0
6.0
7.0
5.0
6.0
7.0
通电 + + － －
－
－
+
－ －
－ － －
+ + － －－ － + － － － － －
+ + － － － －
+
－ －
－ － －
2.离子交换层析法
1）根据蛋白质带电荷情况
2）不同载体,
离子交换纤维素
离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应
离子交换交联琼脂糖
离子交换层析法
（ 四 ） 蛋白质的选择吸附分离
1 极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳
等 具有吸附能力
2 吸咐层析法是利用物质与不同蛋白质的吸
附能力的强弱不同达到分离目的 。
3 蛋白质提纯中, 最广泛和最有效的是结晶
磷酸钙即羟基磷灰石 。
（ 五 ） 根据配体特异性的分离 —亲和层析
1,是一种极为有效的分离方法
2.根据蛋白质分子能与另一种称为配体的分子特异而非
共价地结合 。
3.将某一蛋白质的配体经适当的反应共价地连接到如琼
脂糖 （ 凝胶 ） 一类的载体表面 。
4.配体指能被生物大分子所识别并与之结合的 原子, 原
子团和分子, 如：酶的作用底物, 辅酶, 调节效应物及其
结构类似物, 激素和受体蛋白, 抗原和抗体互为配基 。
5,用含有自由配体的溶液洗脱蛋白质
亲
合
层
析
原
理
及
流
程
示
意
图
三,蛋白质含量分析和纯度鉴
定
（一） 含量的测定
1,凯氏定氮法,
2,双缩脲法
3.紫外线吸收法
4.福林 —酚试剂法,
a 福林 — 酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和
磷钼酸和磷钨酸的混合试剂
b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应
c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸
和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝, 蓝色的深浅
与蛋白含量质成正比 。
（ 二 ） 蛋白质纯度的鉴定
常用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法
高纯度：电泳得到均一的一条区带
低纯度：电泳得到几条区带
本章重点,
1.氨基酸的结构和性质
2.蛋白质的结构、性质、功能
3.蛋白质一级结构的测定
4.蛋白质的结构与功能的关系
5.氨基酸、蛋白质分离纯化的基本原理与方法
