实验二十二 过氧化物酶活性的测定  一、目的 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 通过本实验学习并掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。 二、原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：  红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．? 材料 水稻根系，马铃薯块茎等。 2．? 仪器 （1）分光光度计 （2）移液管 （3）离心机（4 000r/min） （4）秒表 （5）研钵 （6）天平 3．药品 （1）0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.5） 取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加水稀释，用HCl调pH8.5后定容1 000mL。 （2）0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH6.0） 贮备液A：0.2 mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1 000mL）。 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O配成1 000mL）。 分别取贮备液A 87.7mL与贮备液B 12.3mL充分混匀并稀释至200mL。 （3）反应混合液 取0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）50mL，过氧化氢0.028mL，愈创木酚0.019mL混合。 四、操作步骤 1．酶液提取：取不同水稻根系（根系表面水分吸干）1g，剪碎置于研钵中，加5mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.5），研磨成匀浆，以4 000r/min离心5min，倾出上清液，必要时残渣再用5mL缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱（或冷处）备用。 2．取光径1cm比色杯2个，向其中之一加入上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之），再加入反应混合液3mL，立即开启秒表记录时间；而向另一比色杯中加入0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH6.0），作为零对照。用分光光度计在470nm波长下测定反应5min时的光密度值。 五、结果计算 以每分钟光密度变化（以每分钟OD470nm变化0.01为1个活力单位）表示酶活性大小，即 过氧化物酶活力 = △OD470nm    min·mg（FW）  六、附注 1．酶的提取纯化需在低温下进行。 七、思考题 1．试述酶活力的定义？ 2．测定酶的活力要注意控制哪些条件？ 参考答案 1．过氧化物酶活力是以每分钟光密度变化（OD470nm变化）0.01为1个活力单位来表示酶活性大小的。 2．酶的活力测定时：（1）保持待测材料的酶活；（2）测定时注意控制反应时间；