生化实验技术专题
主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例
介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事
项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原
理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸
测定的主要方法 。
目录
第一节 生物大分子物质的制备
第二节 几种主要的生物化学实验技术
第三节 生物分子的检测
第一节 生物大分子物质的制备
一, 一般过程
二, 注意事项
三, 纯化方案的设计和评价
例,宇佐美曲霉 537酸性蛋白酶的纯化
?材料的选择和处理
?确立测定方法
?细胞的破碎
?有效成分的抽提
?有效成分的浓缩
生物大分子分离纯化的一般步骤
层析法
电泳法
超离心法
超滤
?盐析 （ 硫酸铵盐析 ）
?等点电沉淀
?有机溶剂沉淀
?透析
│← 前处理 →│ ← 粗分级 → │ ← 细分级 →│
?材料选择与处理
?细胞破碎（机械破
碎、溶账和自溶、
酶解、化学处理）
生物组织 → 无细胞提取液 → 粗产品 → → 结晶
几种主要沉淀方法比较
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
注意事项
1,控制适当的 pH
2,控制低温
3,注意提取过程中的溶液环境
4,防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
宇佐美曲霉 537酸性蛋白酶的纯化
纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率
（ mg） （ U） （ U/mg蛋白） （ %）
1、粗酶液 80 4320 54 1 100
2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83
3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69
4、盐析 4 1771 464 8.52 41
5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27
6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
第二节 几种重要的生物化学实验技术
一,层析技术
二, 电泳技术
三, 离心技术
一．层析技术（ chromatography）
1,层析技术一般原理
2,层析技术分类及应用
层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法 。 无论何种层析, 其系统
通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相 （ 固体或吸附在固
体上的液体 ）, 一是流动相 （ 液体或气体 ） 。 层析时, 利用混
合物中各组分理化性质 （ 如吸附力, 分子形状和大小, 分子极
性, 分子亲和力, 溶解度等 ） 的差异, 使各组分不同程度地分
布在两相中, 随着流动相从固定相上流过, 不同组分以不同速
度移动而最终被分离 。
样品在层析时的移动速度可用迁移率 Rf值表示,
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
层析法分类（按装置分类 ）
纸层析
薄膜层析
柱层析
洗脱液
样品
填充物
分部收集
玻璃柱
氨基酸分析仪图解
缓冲液泵
显色反
应管
茚三酮泵
已分开的
氨基酸
离子交换柱
样品注入口
记录仪
光电倍
增管
光源
层析法 分类 及原理（按分离原理分类 ）
吸附层析
分配层析
凝胶过滤 （分子筛层析）
离子交换层析
亲和层析
聚焦层析
各类层析的原理和载体
类别 分离原理 基质或载体
吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝,羟基磷酸
分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土,硅胶
凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose, sephadex
离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂,纤维素,
葡聚糖
亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的 sepharose
特殊亲和力 或 sephadex
聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电
荷基团的配体相偶联的
sepharose 6B）
吸附层析 （ absorption chromatography）
原理,
以吸附剂作为固定相，选择适
当的溶剂作流动相。由于各种物质
的极性不同，被吸附剂吸附的程度
和在流动相中的溶解度不同。层析
时，当流动相从固定相上流过时，
各组分也就不同程度地被溶解（解
吸），然后又再被吸附、再溶解再
吸附，从而以不同速度随流动相向
前移动。
载体, 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰
应用：分离纯化蛋白质, 酶, 氨基酸, 核苷
酸 等生化物质
分配层析
原理,
分配层析实际上是一种连续抽提方式。
如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水
饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当
流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的
溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀
地分配在两相中，各种组分按其各自的分
配系数进行不断分配，从而使物质得到分
离和纯化。
载体, 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
分子筛层析 （ gel-filtration chromatography）
原理
基质 葡聚糖凝胶 （ sephadex）
琼脂糖凝胶 （ sepharose）
应用 测定分子量
脱盐和浓缩
分离提纯生物大分子
除去热原物质
离子交换层析 （ ion-change chromatography）
原理
基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂
应用 制备纯化生物物质
定量, 定性测定混合物中各组分
1.平衡阶段,离子交换剂
与反离子结合
2.吸附阶段：样品与反离
子进行交换
3,4,解吸附阶段：用
梯度缓冲溶液洗脱，先
洗下弱吸附物质，后洗
下强吸附物质
5.再生阶段：用原始平
衡液进行充分洗涤，既
可重复使用
1 2 3 4 5
原始缓冲溶
液的反离子 样品溶液 梯度浓度
亲和层析 （ affiuity chromatography）
应用 分离纯化酶,抗原、抗体
分离纯化核酸
研究酶的结构与功能
+
待纯化分子
配体
a,待纯化分子和配体间具有亲和性
+
基质
b,活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+ + 杂质
c,待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
d,偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
原理,
基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶,
sepharose,sephadex
聚焦层析（ Chromatofocusing）
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依
据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在 pH梯度环境中进
行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成 (由多缓冲剂和多缓冲交换剂形
成 )是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成 pH梯度的层析柱上
时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的 pH
处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在
等电点 pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加
入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，
其聚焦过程都能顺利完成。
层析时的聚焦效应示意图 pH梯度溶液的形成示意图
蛋白质 1（ pI=7） 蛋白质 2（ pI=8）
流速
移动速率
几种主要层析方法比较
二, 电泳技术
1,电泳的一般原理
2,电泳技术的类别,原理及应用
电泳的一般原理
电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极
移动的现象 。 许多生物分子都带有电荷, 其电荷的多少取
决于分子组成, 性质及其所在介质的 pH。 如果混合物中各组
分的结构组成不同, 在某一 pH溶液中, 各组分所带电荷性质
,电荷数量不同, 加之其分子量不同, 在同一电场的作用下
,各组分泳动的方向和速度也各异, 而达到分离鉴定各组分
的目的 。
电泳技术分类（按实验装置分类）
纸电泳
薄膜电泳
凝胶电泳
毛细管电泳
垂直板凝胶电泳
毛细管电泳
常用电泳技术
1、醋酸纤维薄膜电泳
2,聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylamide gel
electrophoresis,PAGE）
3,SDS-PAGE
4,PAGE等电点聚焦
3、琼脂糖电泳
4,毛细管电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ PAGE）
? 凝胶聚合反应及催化系统
? 不连续 PAGE
? 可产生的三种效应,
电荷效应,
分子筛 效应,
浓缩效应
SDS-PAGE
原理,
当 SDS（ Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子
即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白
质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在 SDS的作用
下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种 SDS -蛋白质复合物在电泳
时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分
子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示,
Log M=a – b
应用, 测定蛋白质分子量
测定蛋白质亚基数
等电点聚焦（ isoelectric focusing）
原理,
在一定抗对流介质 （ 如凝胶 ） 中加入两性电解质载体 (Ampholyte,是
一种多氨基多羧基的混合物, 由异构物和同系物组成, 其 pK和 pI值各
自相异却又相近 ）, 当直流电通过时, 便形成一个由阳极到阴极 pH值
逐步上升的梯度 。 两性化合物在此电泳过程中, 就被浓集在与其等电
点相等的 pH区域, 从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离 。
应用,
高效率分离纯化蛋白质
测定蛋白质分子量
免疫电泳 immunoelectrophoresis
微量多槽免疫电泳
火箭免疫电泳
毛细管电泳
毛细管电泳 又称毛细管区带电泳, 它是在毛细管 （ ?2-
75μ m） 中装入缓冲液, 从其一端注入样品, 在毛细管两端
加高压直流电实现对样品的分离, 分离后的样品依次通过
设在毛细管一端的检测器检出 。 该法克服了传统区带电泳
的热扩散和样品扩散的问题, 实现了快速和高效分离 。
毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是
90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分
析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸
,DNA序列测定 及 PCR产物的分析鉴定等。
毛细管电泳装置示意图
高压电源
光源
光电倍
增管
数据采集
毛细管
缓冲液 -样品 缓冲液
三,离心技术
1,离心机类别
普通离心机 ?6000转 /分
高速离心机 2-3万转 /分
超速离心机 ?3万转 /分
2,沉降系数 （ S） 概念
3,超离心法类别
沉降速度法 （ sedimentation velocity）
沉降平恒法 （ sedimentation eguilibrium）
超
速
离
心
机
工
作
原
理
图
解
光
源 转轴
转
头
样
品
池
光学
系统
液
面
沉降
界面
沉降
物质
平
衡
池
沉降界
面峰
浓度对距离的图谱
沉降系数（ S）
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉
降系数 。 即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下, 从
静止 状态到达 极限速度所 需要的时 间 。 其单位 用
Svedberg,即 S表示, S=1× 10-13秒 。
沉降系数（ S）与分子量（ M）的关系
M = RTS D(1-??) Svederg方程,
生物分子的检测
1、蛋白质的测定 凯氏定氮法（ 含 N量 ? 6,25）
双缩脲法,Folin-酚法
紫外光度法（ ?max=280nm）
离心沉降法、电泳法、层析法
2、酶活力的测定 终点法、动力学法
3、氨基酸的测定 茚三酮法
Sangerf法,Edmam法,DNS法
4、核酸的测定 紫外光度法（ ?max=260nm）
分子杂交法
离心沉降法、电泳法
主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例
介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事
项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原
理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸
测定的主要方法 。
目录
第一节 生物大分子物质的制备
第二节 几种主要的生物化学实验技术
第三节 生物分子的检测
第一节 生物大分子物质的制备
一, 一般过程
二, 注意事项
三, 纯化方案的设计和评价
例,宇佐美曲霉 537酸性蛋白酶的纯化
?材料的选择和处理
?确立测定方法
?细胞的破碎
?有效成分的抽提
?有效成分的浓缩
生物大分子分离纯化的一般步骤
层析法
电泳法
超离心法
超滤
?盐析 （ 硫酸铵盐析 ）
?等点电沉淀
?有机溶剂沉淀
?透析
│← 前处理 →│ ← 粗分级 → │ ← 细分级 →│
?材料选择与处理
?细胞破碎（机械破
碎、溶账和自溶、
酶解、化学处理）
生物组织 → 无细胞提取液 → 粗产品 → → 结晶
几种主要沉淀方法比较
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
注意事项
1,控制适当的 pH
2,控制低温
3,注意提取过程中的溶液环境
4,防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
宇佐美曲霉 537酸性蛋白酶的纯化
纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率
（ mg） （ U） （ U/mg蛋白） （ %）
1、粗酶液 80 4320 54 1 100
2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83
3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69
4、盐析 4 1771 464 8.52 41
5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27
6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
第二节 几种重要的生物化学实验技术
一,层析技术
二, 电泳技术
三, 离心技术
一．层析技术（ chromatography）
1,层析技术一般原理
2,层析技术分类及应用
层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法 。 无论何种层析, 其系统
通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相 （ 固体或吸附在固
体上的液体 ）, 一是流动相 （ 液体或气体 ） 。 层析时, 利用混
合物中各组分理化性质 （ 如吸附力, 分子形状和大小, 分子极
性, 分子亲和力, 溶解度等 ） 的差异, 使各组分不同程度地分
布在两相中, 随着流动相从固定相上流过, 不同组分以不同速
度移动而最终被分离 。
样品在层析时的移动速度可用迁移率 Rf值表示,
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
层析法分类（按装置分类 ）
纸层析
薄膜层析
柱层析
洗脱液
样品
填充物
分部收集
玻璃柱
氨基酸分析仪图解
缓冲液泵
显色反
应管
茚三酮泵
已分开的
氨基酸
离子交换柱
样品注入口
记录仪
光电倍
增管
光源
层析法 分类 及原理（按分离原理分类 ）
吸附层析
分配层析
凝胶过滤 （分子筛层析）
离子交换层析
亲和层析
聚焦层析
各类层析的原理和载体
类别 分离原理 基质或载体
吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝,羟基磷酸
分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土,硅胶
凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose, sephadex
离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂,纤维素,
葡聚糖
亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的 sepharose
特殊亲和力 或 sephadex
聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电
荷基团的配体相偶联的
sepharose 6B）
吸附层析 （ absorption chromatography）
原理,
以吸附剂作为固定相，选择适
当的溶剂作流动相。由于各种物质
的极性不同，被吸附剂吸附的程度
和在流动相中的溶解度不同。层析
时，当流动相从固定相上流过时，
各组分也就不同程度地被溶解（解
吸），然后又再被吸附、再溶解再
吸附，从而以不同速度随流动相向
前移动。
载体, 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰
应用：分离纯化蛋白质, 酶, 氨基酸, 核苷
酸 等生化物质
分配层析
原理,
分配层析实际上是一种连续抽提方式。
如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水
饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当
流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的
溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀
地分配在两相中，各种组分按其各自的分
配系数进行不断分配，从而使物质得到分
离和纯化。
载体, 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
分子筛层析 （ gel-filtration chromatography）
原理
基质 葡聚糖凝胶 （ sephadex）
琼脂糖凝胶 （ sepharose）
应用 测定分子量
脱盐和浓缩
分离提纯生物大分子
除去热原物质
离子交换层析 （ ion-change chromatography）
原理
基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂
应用 制备纯化生物物质
定量, 定性测定混合物中各组分
1.平衡阶段,离子交换剂
与反离子结合
2.吸附阶段：样品与反离
子进行交换
3,4,解吸附阶段：用
梯度缓冲溶液洗脱，先
洗下弱吸附物质，后洗
下强吸附物质
5.再生阶段：用原始平
衡液进行充分洗涤，既
可重复使用
1 2 3 4 5
原始缓冲溶
液的反离子 样品溶液 梯度浓度
亲和层析 （ affiuity chromatography）
应用 分离纯化酶,抗原、抗体
分离纯化核酸
研究酶的结构与功能
+
待纯化分子
配体
a,待纯化分子和配体间具有亲和性
+
基质
b,活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+ + 杂质
c,待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
d,偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
原理,
基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶,
sepharose,sephadex
聚焦层析（ Chromatofocusing）
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依
据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在 pH梯度环境中进
行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成 (由多缓冲剂和多缓冲交换剂形
成 )是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成 pH梯度的层析柱上
时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的 pH
处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在
等电点 pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加
入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，
其聚焦过程都能顺利完成。
层析时的聚焦效应示意图 pH梯度溶液的形成示意图
蛋白质 1（ pI=7） 蛋白质 2（ pI=8）
流速
移动速率
几种主要层析方法比较
二, 电泳技术
1,电泳的一般原理
2,电泳技术的类别,原理及应用
电泳的一般原理
电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极
移动的现象 。 许多生物分子都带有电荷, 其电荷的多少取
决于分子组成, 性质及其所在介质的 pH。 如果混合物中各组
分的结构组成不同, 在某一 pH溶液中, 各组分所带电荷性质
,电荷数量不同, 加之其分子量不同, 在同一电场的作用下
,各组分泳动的方向和速度也各异, 而达到分离鉴定各组分
的目的 。
电泳技术分类（按实验装置分类）
纸电泳
薄膜电泳
凝胶电泳
毛细管电泳
垂直板凝胶电泳
毛细管电泳
常用电泳技术
1、醋酸纤维薄膜电泳
2,聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylamide gel
electrophoresis,PAGE）
3,SDS-PAGE
4,PAGE等电点聚焦
3、琼脂糖电泳
4,毛细管电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ PAGE）
? 凝胶聚合反应及催化系统
? 不连续 PAGE
? 可产生的三种效应,
电荷效应,
分子筛 效应,
浓缩效应
SDS-PAGE
原理,
当 SDS（ Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子
即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白
质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在 SDS的作用
下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种 SDS -蛋白质复合物在电泳
时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分
子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示,
Log M=a – b
应用, 测定蛋白质分子量
测定蛋白质亚基数
等电点聚焦（ isoelectric focusing）
原理,
在一定抗对流介质 （ 如凝胶 ） 中加入两性电解质载体 (Ampholyte,是
一种多氨基多羧基的混合物, 由异构物和同系物组成, 其 pK和 pI值各
自相异却又相近 ）, 当直流电通过时, 便形成一个由阳极到阴极 pH值
逐步上升的梯度 。 两性化合物在此电泳过程中, 就被浓集在与其等电
点相等的 pH区域, 从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离 。
应用,
高效率分离纯化蛋白质
测定蛋白质分子量
免疫电泳 immunoelectrophoresis
微量多槽免疫电泳
火箭免疫电泳
毛细管电泳
毛细管电泳 又称毛细管区带电泳, 它是在毛细管 （ ?2-
75μ m） 中装入缓冲液, 从其一端注入样品, 在毛细管两端
加高压直流电实现对样品的分离, 分离后的样品依次通过
设在毛细管一端的检测器检出 。 该法克服了传统区带电泳
的热扩散和样品扩散的问题, 实现了快速和高效分离 。
毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是
90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分
析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸
,DNA序列测定 及 PCR产物的分析鉴定等。
毛细管电泳装置示意图
高压电源
光源
光电倍
增管
数据采集
毛细管
缓冲液 -样品 缓冲液
三,离心技术
1,离心机类别
普通离心机 ?6000转 /分
高速离心机 2-3万转 /分
超速离心机 ?3万转 /分
2,沉降系数 （ S） 概念
3,超离心法类别
沉降速度法 （ sedimentation velocity）
沉降平恒法 （ sedimentation eguilibrium）
超
速
离
心
机
工
作
原
理
图
解
光
源 转轴
转
头
样
品
池
光学
系统
液
面
沉降
界面
沉降
物质
平
衡
池
沉降界
面峰
浓度对距离的图谱
沉降系数（ S）
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉
降系数 。 即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下, 从
静止 状态到达 极限速度所 需要的时 间 。 其单位 用
Svedberg,即 S表示, S=1× 10-13秒 。
沉降系数（ S）与分子量（ M）的关系
M = RTS D(1-??) Svederg方程,
生物分子的检测
1、蛋白质的测定 凯氏定氮法（ 含 N量 ? 6,25）
双缩脲法,Folin-酚法
紫外光度法（ ?max=280nm）
离心沉降法、电泳法、层析法
2、酶活力的测定 终点法、动力学法
3、氨基酸的测定 茚三酮法
Sangerf法,Edmam法,DNS法
4、核酸的测定 紫外光度法（ ?max=260nm）
分子杂交法
离心沉降法、电泳法
