PCR (Polymerase Chain Reaction)
聚合酶链反应
目 的,
熟悉 PCR技术的基本原理和操作
1983.4 Kary Mullis在开
车前去北加利福尼亚红树
县 Redwood country 的一
条被 月光笼罩 的山路上构
思了 PCR
随后卖给了 Roche公司
价格,10.000$
1993 Nobel prize
历 史
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
一生二，二生四，四生万物
PCR三步曲
变性 90～ 97℃
退火 45～ 55℃
延伸 72℃ 左右
PCR过程
PCR引物设计
1,一对引物，分别与 5 ′ 和 3′ 端互补
2,长度,15～ 30个核苷酸
3,引物内、引物间不应有互补序列
4,引物与非特异扩增区无同源性
PCR反应体系的五要素,
引物,酶, dNTP、模板和 Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性
Mg2+依赖性
无校读功能
PCR反应体系的准备
+ primers
+ nucleotides
+Taq polymerase (Thermus aquaticus )
+ salts (ions)
+ DNA fragment
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Step 1, Denaturation 变性
94° C
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT
ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Step 2, Annealing 退火
T° primer-dependent
CGTAGTAGCA
GCTGCTACGTAG
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT
ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Step3, Extension 延伸
72° C
CGTAGTAGCA
GCTGCTACGTAG
Taq Polymerase
Taq Polymerase
TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC
GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Next step, Cooling
You get two copies of your DNA
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
PCR Process
1 cycle 2 cycle 3 cycle
Process
变性
退火
延伸
加样器的使用
模板的制备
DNA
1.从细胞中提取 DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、
精斑、口腔上皮细胞
2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶 K消化
RNA
新鲜 组织或细胞
所用器皿和试剂必需经高温灭菌或 DEPC处理
(一 ) 组织处理,
取新鲜大鼠肝用预冷的生理盐水洗去表面
血液，每克肝脏加 2ml的裂解液，匀浆器中
匀浆
（一） 引物,
5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’
5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’
引物的设计可以参照,
两分钟 StepByStep学会引物设计软件
Primer premier5.0/oligo软件
www.dxy.cn
核酸基因技术讨论版 /生物信息学讨论版 / PCR技术讨论版
PCR反应
（二） 无菌 eppendorf管中加
双 /三蒸水 9 ?l
10× 缓冲液 2 ?l
dNTP混合物 3 ?L
引物 2 ?l
模板 DNA 2 ?l
25mmol/L Mg2+ 2.5 ?l
液体石蜡 10 ?l
混匀离心 5sec,94℃ 水浴,2min
+ Taq DNA聚合酶 0.55 ?l
程序设臵,
94℃ 30s
55℃ 30s
72℃ 30s 35 个循环
（一般在 72℃ 时酶催化核苷酸的标准速率可
达 35～ 100个核苷酸 /秒） 反应结束后加 中止液 10
?l
（三）扩增结果,220-242 bp
对于 100～ 300bp之间的短序列片段，采用
快速、简便的双温循环是行之有效的。 双温 PCR（ two-
temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火
与延伸温度。一般常用温度是 94-95℃ 和 46-47℃
PCR中的注意事项
PCR反应中可能出现的问题,
? 假阴性，不出现扩增条带
? 假阳性
? 出现非特异扩增带
（一）防止污染
试剂小量分装
吸头及 EP管一次性使用
器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照,
阳性对照,阳性模板
阴性对照,阴性模板
试剂对照,除模板外的所有组分
PCR的反应特点
1,特异性强
2,灵敏度高, PCR产物的生成量是以指数方式增
加的，能将 pg=10- 12级的起始待测模板扩增
到微克 (?g= 10 -6)水平
3,简便、快速, PCR反应一般在 2～ 4 小时完成
扩增反应
4,对标本的纯度要求低,
DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用
临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组
织等扩增检测
电泳操作步骤
2、胶床准备
①取出胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或
胶带纸，形成约 5～ 8mm的挡墙
②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床
面有 1mm的间隙
③将胶床放在调整好的水平台上
1、凝胶准备 用 0.5× TBE配制 1％琼脂糖凝胶。
① 称 1g琼脂糖臵三角瓶中，加 100ml 0.5× TBE
② 微波炉加热大约 1分钟，熔化琼脂糖
③ 熔化的琼脂糖自然冷却到 60～ 70℃ 时，加入 EB
0.5μl,并轻轻混匀
3、铺胶, 将冷却致 60℃ 的凝胶倒入准备好的胶
床内,凝胶厚度 3～ 5mm
4、室温下静臵 1小时左右，凝胶固化。 撕去胶床
两端的胶带纸，将带凝胶的胶床臵于电泳槽中,
并使样品孔位于电场负极
5、向电泳槽中加入 0.5× TBE电泳缓冲液, 越
过凝胶表面即可
6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。
原梳齿处 (样品孔 )即被缓冲液充满，如发现
有气泡，应设法去除
7、样品准备,向核酸样品中加入约为样品体积
1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀
8、上样,用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝
胶的样品孔中。加样量一般 10μl
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳
开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。
电泳条件：电压 50v；时间 0.5小时左右
10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析,
①紫外检测仪直接观察电源条带
②摄影记录
注意事项,
1,凝胶浓度选择 根据样品 DNA分子大小而定,
所以电泳前应对 DNA片段大小有粗略的估计
2、用胶布封闭胶床两端时，要确保严密，以免
灌胶时有胶液漏出
3、用微波炉熔化琼脂糖时，以免突然产生气泡，使
琼脂糖溢出来
4、凝胶冷却至 60℃ 左右，立即铺胶，以防凝固
5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除
6、电泳前，确认样品孔位于电场负极
7、因 EB存在，全部操作过程要带防护手套
琼脂糖凝胶浓度与 DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 线性 DNA分子大小（ kb）
0.3 5～ 60
0.6 1～ 20
0.7 0.8～ 10
0.9 0.5～ 7
1.2 0.4～ 6
1.5 0.2～ 4
2.0 0.1～ 3
maker
聚合酶链反应
目 的,
熟悉 PCR技术的基本原理和操作
1983.4 Kary Mullis在开
车前去北加利福尼亚红树
县 Redwood country 的一
条被 月光笼罩 的山路上构
思了 PCR
随后卖给了 Roche公司
价格,10.000$
1993 Nobel prize
历 史
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
一生二，二生四，四生万物
PCR三步曲
变性 90～ 97℃
退火 45～ 55℃
延伸 72℃ 左右
PCR过程
PCR引物设计
1,一对引物，分别与 5 ′ 和 3′ 端互补
2,长度,15～ 30个核苷酸
3,引物内、引物间不应有互补序列
4,引物与非特异扩增区无同源性
PCR反应体系的五要素,
引物,酶, dNTP、模板和 Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性
Mg2+依赖性
无校读功能
PCR反应体系的准备
+ primers
+ nucleotides
+Taq polymerase (Thermus aquaticus )
+ salts (ions)
+ DNA fragment
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Step 1, Denaturation 变性
94° C
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT
ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Step 2, Annealing 退火
T° primer-dependent
CGTAGTAGCA
GCTGCTACGTAG
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT
ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Step3, Extension 延伸
72° C
CGTAGTAGCA
GCTGCTACGTAG
Taq Polymerase
Taq Polymerase
TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC
GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
Next step, Cooling
You get two copies of your DNA
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA
PCR Process
1 cycle 2 cycle 3 cycle
Process
变性
退火
延伸
加样器的使用
模板的制备
DNA
1.从细胞中提取 DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、
精斑、口腔上皮细胞
2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶 K消化
RNA
新鲜 组织或细胞
所用器皿和试剂必需经高温灭菌或 DEPC处理
(一 ) 组织处理,
取新鲜大鼠肝用预冷的生理盐水洗去表面
血液，每克肝脏加 2ml的裂解液，匀浆器中
匀浆
（一） 引物,
5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’
5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’
引物的设计可以参照,
两分钟 StepByStep学会引物设计软件
Primer premier5.0/oligo软件
www.dxy.cn
核酸基因技术讨论版 /生物信息学讨论版 / PCR技术讨论版
PCR反应
（二） 无菌 eppendorf管中加
双 /三蒸水 9 ?l
10× 缓冲液 2 ?l
dNTP混合物 3 ?L
引物 2 ?l
模板 DNA 2 ?l
25mmol/L Mg2+ 2.5 ?l
液体石蜡 10 ?l
混匀离心 5sec,94℃ 水浴,2min
+ Taq DNA聚合酶 0.55 ?l
程序设臵,
94℃ 30s
55℃ 30s
72℃ 30s 35 个循环
（一般在 72℃ 时酶催化核苷酸的标准速率可
达 35～ 100个核苷酸 /秒） 反应结束后加 中止液 10
?l
（三）扩增结果,220-242 bp
对于 100～ 300bp之间的短序列片段，采用
快速、简便的双温循环是行之有效的。 双温 PCR（ two-
temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火
与延伸温度。一般常用温度是 94-95℃ 和 46-47℃
PCR中的注意事项
PCR反应中可能出现的问题,
? 假阴性，不出现扩增条带
? 假阳性
? 出现非特异扩增带
（一）防止污染
试剂小量分装
吸头及 EP管一次性使用
器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照,
阳性对照,阳性模板
阴性对照,阴性模板
试剂对照,除模板外的所有组分
PCR的反应特点
1,特异性强
2,灵敏度高, PCR产物的生成量是以指数方式增
加的，能将 pg=10- 12级的起始待测模板扩增
到微克 (?g= 10 -6)水平
3,简便、快速, PCR反应一般在 2～ 4 小时完成
扩增反应
4,对标本的纯度要求低,
DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用
临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组
织等扩增检测
电泳操作步骤
2、胶床准备
①取出胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或
胶带纸，形成约 5～ 8mm的挡墙
②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床
面有 1mm的间隙
③将胶床放在调整好的水平台上
1、凝胶准备 用 0.5× TBE配制 1％琼脂糖凝胶。
① 称 1g琼脂糖臵三角瓶中，加 100ml 0.5× TBE
② 微波炉加热大约 1分钟，熔化琼脂糖
③ 熔化的琼脂糖自然冷却到 60～ 70℃ 时，加入 EB
0.5μl,并轻轻混匀
3、铺胶, 将冷却致 60℃ 的凝胶倒入准备好的胶
床内,凝胶厚度 3～ 5mm
4、室温下静臵 1小时左右，凝胶固化。 撕去胶床
两端的胶带纸，将带凝胶的胶床臵于电泳槽中,
并使样品孔位于电场负极
5、向电泳槽中加入 0.5× TBE电泳缓冲液, 越
过凝胶表面即可
6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。
原梳齿处 (样品孔 )即被缓冲液充满，如发现
有气泡，应设法去除
7、样品准备,向核酸样品中加入约为样品体积
1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀
8、上样,用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝
胶的样品孔中。加样量一般 10μl
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳
开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。
电泳条件：电压 50v；时间 0.5小时左右
10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析,
①紫外检测仪直接观察电源条带
②摄影记录
注意事项,
1,凝胶浓度选择 根据样品 DNA分子大小而定,
所以电泳前应对 DNA片段大小有粗略的估计
2、用胶布封闭胶床两端时，要确保严密，以免
灌胶时有胶液漏出
3、用微波炉熔化琼脂糖时，以免突然产生气泡，使
琼脂糖溢出来
4、凝胶冷却至 60℃ 左右，立即铺胶，以防凝固
5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除
6、电泳前，确认样品孔位于电场负极
7、因 EB存在，全部操作过程要带防护手套
琼脂糖凝胶浓度与 DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 线性 DNA分子大小（ kb）
0.3 5～ 60
0.6 1～ 20
0.7 0.8～ 10
0.9 0.5～ 7
1.2 0.4～ 6
1.5 0.2～ 4
2.0 0.1～ 3
maker
