第 17章 核酸技术
Technology of Nucleic Acid
本章主要内容：
? DNA重组技术
? 基因鉴定
? 核酸技术的应用
对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具
酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使
我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有
机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组
DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。
一个梦想已成真
生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了, 硕鼠,
1.DNA重组技术
DNA重组技术 是利用多种限制性内切酶和 DNA连接酶等工具酶，以 DNA
为操作对象，在细胞外将一种外源 DNA（来自原核或真核生物）和载体
DNA重新组合连接（重组），形成重组 DNA，然后将重组 DNA转入宿主细胞
（如大肠杆菌等），使外源基因 DNA在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增
殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有
的遗传性状。, 基因工程, （ gene engineering）或, 分子克隆,
（ molecular cloning）。
基因重组技术的
两个基本目的
1.直接利用基因
主导生长的基因、
作物的抗性基因、
基因诊断、基因治疗、
指纹图谱等
2.利用基因的表达产物
疫苗、药物、
组织激活物、
生长因子、
珍稀蛋白等
50年来，核酸酶学的进步为 DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的
核酸酶有：
DNA聚合酶（ DNA polymerase ）
klenow 片段,Taq 酶
限制性核酸内切酶 （ restriction endonuclease ）
逆转录酶（ Reverse transcriptase）
S1核酸酶（ S1 nuclease）
连接酶（ Ligase）
拓扑异构酶（ Topoisomerase）等
核酸酶学
限制性核酸内切酶 —— 一把神奇的, 手术刀,
具有内切和甲基化两种功能
能够识别外源的核酸并将它切除
有特异的识别位点，通常为 4-8对碱基的旋转对称结构
在其切口处留下黏性末端（ sticky end） —— 具有互补序列
的单股链，或者平头末端（ blunt end）
有 3种类型,II型为主
例如：
EcoRI
属
种 品系
排序
限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下 黏性末端 ）
目的基因克隆的技术路线
获得目的基因
选择合适的可以携带目的基因的载体
把目的基因插入到载体中去，得到重组载体
将重组载体导入宿主细胞进行克隆（ 通过无性繁殖，随着宿主目的基
因也得以扩增 ）
对重组的克隆进行筛选
使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因
黏性末端
（如质粒，噬菌体等）
（如细菌）
目的基因克隆的技术路线
利用表型特性，核酸杂交
以及免疫化学等方法对克
隆进行筛选
目的基因的制备
? 直接从染色体中分离
? 人工合成
? 逆转录合成 cDNA
cDNA文库：用细胞全部 mRNA经反转录制备全套 cDNA后建库。
? 构建基因文库
? PCR扩增
质粒是可以独立复制
并在细菌之间转移的
遗传单位，质粒还能
赋予宿主菌某种表型
其他的基因载体还有
如：噬菌体，病毒等
目的基因的载体
plasmid DNA
Genomic DNA
含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过
规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）
古
埃
及
一
具
木
乃
伊
的
一
个
DN
A
片
段
已
经
得
到
克
隆
打
开
了
人
们
窥
探
过
去
的
窗
户
2.基因鉴定
聚合酶连锁反应 （ PCR,DNA polymerase chain reaction ）
目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增
一个温度和时间可以控制的反应体系
含有双链 DNA模板
耐热的 DNA聚合酶（如 Taq酶）
一对设计适当的 RNA引物,dNTP原料，过量
经, 变性 ---退火 ---延伸, 多次循环使目的 DNA得以扩增
DNA核苷酸序列分析
Sa
ng
er
双
脱
氧
链
终
止
法
利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股
DNA或 RNA片段 —— 探针 （ probe），
可以：
? 研究 DNA之间的亲缘关系；
? 发现基因的缺失或突变；
? 测定某种遗传信息的量；
? 鉴定某种基因
? 基因治疗等
分子杂交 （ Molecular hybridization）
分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础
印迹技术（ Blotting）
Southern blot—— 用探针鉴定 DNA
Northern blot—— 用探针鉴定 RNA
原位杂交（ Hybridization in situ）
指纹分析（ Finger printing）
基因芯片（ DNA microarray）
分子杂交等技术可用来筛选重组克隆
用探针鉴定 DNA
称为 Southern
印迹,鉴定 RNA称
为 Northern印迹
Southern-blot印迹杂交原理示意图
染
色
体
的
原
位
杂
交
基因芯片的应于
发育生物学研究
在基础研究和应用领域具有广泛用途的 DNA 芯片
同一物种不同生态型之间 DNA多态性产生的 RFLP
DNA指纹 （ DNA fingerprint）
DN
A
指
纹
分
析
应
用
于
刑
侦 1,5,9,Marker,8,10 都是对照
2,嫌疑人 A血细胞 DNA
3,被害人衣服上残留精液 DNA
4,嫌疑人 B血细胞 DNA
6,被害人阴道取样 DNA
7,被害人血 DNA
8,实验对照
从上世纪 90年代初开始，用了 10年时间，人类完成了
对自身染色体的 30亿对碱基的序列测定，这就是所谓
的 人类基因组项目（ HGP）
在人类基因组项目基本完成之后,人类蛋白质
组项目 将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋
白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后
基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，
控制疾病的意义将难以估量。
3.核酸技术的应用
? 在生命科学研究中的应用
? 在动物疾病诊断中的应用
? 在动物遗传育种中的应用
? 在生物制药中的应用
? 在农业中的应用
动物生物化学练习（ 3）
1.氨基酸参与了动物体内一些重要含 N 小分子的合成。请指出以下 3种物
质的主要功能，它们各由哪些氨基酸为原料转变而成。
a,肾上腺素； b,磷酸肌酸； c,嘧啶
2.DNA的复制包括哪些主要阶段？为什么复制具有半保留性？为什么说子
链的合成是半不连续的？
3.转录的终止出现在 DNA分子中特定的碱基顺序上。原核 DNA转录的终止顺
序有明显的结构特点，请予描述。除此以外，还有什么其它的终止转录的
方式？
4,关于蛋白质多肽链的翻译过程，请你
a.说明氨基酰 -tRNA合成酶的特点；
b.图示原核 70S 起始复合物；
c.解释延伸因子 Tu的作用；
d.指出何时肽酰基转移酶起作用。
5,简述肾上腺素通过 cAMP/PKA途径中酶的级联放大效应催化肌肉糖原
分解的生物化学原理。
Technology of Nucleic Acid
本章主要内容：
? DNA重组技术
? 基因鉴定
? 核酸技术的应用
对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具
酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使
我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有
机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组
DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。
一个梦想已成真
生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了, 硕鼠,
1.DNA重组技术
DNA重组技术 是利用多种限制性内切酶和 DNA连接酶等工具酶，以 DNA
为操作对象，在细胞外将一种外源 DNA（来自原核或真核生物）和载体
DNA重新组合连接（重组），形成重组 DNA，然后将重组 DNA转入宿主细胞
（如大肠杆菌等），使外源基因 DNA在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增
殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有
的遗传性状。, 基因工程, （ gene engineering）或, 分子克隆,
（ molecular cloning）。
基因重组技术的
两个基本目的
1.直接利用基因
主导生长的基因、
作物的抗性基因、
基因诊断、基因治疗、
指纹图谱等
2.利用基因的表达产物
疫苗、药物、
组织激活物、
生长因子、
珍稀蛋白等
50年来，核酸酶学的进步为 DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的
核酸酶有：
DNA聚合酶（ DNA polymerase ）
klenow 片段,Taq 酶
限制性核酸内切酶 （ restriction endonuclease ）
逆转录酶（ Reverse transcriptase）
S1核酸酶（ S1 nuclease）
连接酶（ Ligase）
拓扑异构酶（ Topoisomerase）等
核酸酶学
限制性核酸内切酶 —— 一把神奇的, 手术刀,
具有内切和甲基化两种功能
能够识别外源的核酸并将它切除
有特异的识别位点，通常为 4-8对碱基的旋转对称结构
在其切口处留下黏性末端（ sticky end） —— 具有互补序列
的单股链，或者平头末端（ blunt end）
有 3种类型,II型为主
例如：
EcoRI
属
种 品系
排序
限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下 黏性末端 ）
目的基因克隆的技术路线
获得目的基因
选择合适的可以携带目的基因的载体
把目的基因插入到载体中去，得到重组载体
将重组载体导入宿主细胞进行克隆（ 通过无性繁殖，随着宿主目的基
因也得以扩增 ）
对重组的克隆进行筛选
使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因
黏性末端
（如质粒，噬菌体等）
（如细菌）
目的基因克隆的技术路线
利用表型特性，核酸杂交
以及免疫化学等方法对克
隆进行筛选
目的基因的制备
? 直接从染色体中分离
? 人工合成
? 逆转录合成 cDNA
cDNA文库：用细胞全部 mRNA经反转录制备全套 cDNA后建库。
? 构建基因文库
? PCR扩增
质粒是可以独立复制
并在细菌之间转移的
遗传单位，质粒还能
赋予宿主菌某种表型
其他的基因载体还有
如：噬菌体，病毒等
目的基因的载体
plasmid DNA
Genomic DNA
含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过
规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）
古
埃
及
一
具
木
乃
伊
的
一
个
DN
A
片
段
已
经
得
到
克
隆
打
开
了
人
们
窥
探
过
去
的
窗
户
2.基因鉴定
聚合酶连锁反应 （ PCR,DNA polymerase chain reaction ）
目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增
一个温度和时间可以控制的反应体系
含有双链 DNA模板
耐热的 DNA聚合酶（如 Taq酶）
一对设计适当的 RNA引物,dNTP原料，过量
经, 变性 ---退火 ---延伸, 多次循环使目的 DNA得以扩增
DNA核苷酸序列分析
Sa
ng
er
双
脱
氧
链
终
止
法
利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股
DNA或 RNA片段 —— 探针 （ probe），
可以：
? 研究 DNA之间的亲缘关系；
? 发现基因的缺失或突变；
? 测定某种遗传信息的量；
? 鉴定某种基因
? 基因治疗等
分子杂交 （ Molecular hybridization）
分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础
印迹技术（ Blotting）
Southern blot—— 用探针鉴定 DNA
Northern blot—— 用探针鉴定 RNA
原位杂交（ Hybridization in situ）
指纹分析（ Finger printing）
基因芯片（ DNA microarray）
分子杂交等技术可用来筛选重组克隆
用探针鉴定 DNA
称为 Southern
印迹,鉴定 RNA称
为 Northern印迹
Southern-blot印迹杂交原理示意图
染
色
体
的
原
位
杂
交
基因芯片的应于
发育生物学研究
在基础研究和应用领域具有广泛用途的 DNA 芯片
同一物种不同生态型之间 DNA多态性产生的 RFLP
DNA指纹 （ DNA fingerprint）
DN
A
指
纹
分
析
应
用
于
刑
侦 1,5,9,Marker,8,10 都是对照
2,嫌疑人 A血细胞 DNA
3,被害人衣服上残留精液 DNA
4,嫌疑人 B血细胞 DNA
6,被害人阴道取样 DNA
7,被害人血 DNA
8,实验对照
从上世纪 90年代初开始，用了 10年时间，人类完成了
对自身染色体的 30亿对碱基的序列测定，这就是所谓
的 人类基因组项目（ HGP）
在人类基因组项目基本完成之后,人类蛋白质
组项目 将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋
白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后
基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，
控制疾病的意义将难以估量。
3.核酸技术的应用
? 在生命科学研究中的应用
? 在动物疾病诊断中的应用
? 在动物遗传育种中的应用
? 在生物制药中的应用
? 在农业中的应用
动物生物化学练习（ 3）
1.氨基酸参与了动物体内一些重要含 N 小分子的合成。请指出以下 3种物
质的主要功能，它们各由哪些氨基酸为原料转变而成。
a,肾上腺素； b,磷酸肌酸； c,嘧啶
2.DNA的复制包括哪些主要阶段？为什么复制具有半保留性？为什么说子
链的合成是半不连续的？
3.转录的终止出现在 DNA分子中特定的碱基顺序上。原核 DNA转录的终止顺
序有明显的结构特点，请予描述。除此以外，还有什么其它的终止转录的
方式？
4,关于蛋白质多肽链的翻译过程，请你
a.说明氨基酰 -tRNA合成酶的特点；
b.图示原核 70S 起始复合物；
c.解释延伸因子 Tu的作用；
d.指出何时肽酰基转移酶起作用。
5,简述肾上腺素通过 cAMP/PKA途径中酶的级联放大效应催化肌肉糖原
分解的生物化学原理。
