第3章细胞培养的必备设 施、常用器材和培养基 本章主要内容: 细胞培养的必备设施 细胞培养常用器材及处理方法 常用溶液、培养液及其配制 第一节细胞培养的必备 设施 一、无菌实验室 ?防止微生物污染和有害因素的影响 ?工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟 尘。 无菌室 二、净化工作台 净化工作台 三、恒温培养箱 ?变通电热恒温培养箱 ?CO2培养箱 二氧化碳培养箱 GNP-9160隔水式恒温培养箱 Heraeus BB5060UVC02培养箱 低温（-20℃）冷藏冰柜 四、其他设备 ?倒置显微镜 ?电热鼓风干燥箱 ?电子天平 ?恒温水浴箱 ?离心机 ?压力蒸汽消毒器 ?液氮储存罐 OLYMPUS CK40倒置显微镜 OLYMPUS CKX41倒置荧光显微镜 电热鼓风干燥箱 电热干燥箱 电子天平 电子天平 恒温水浴箱 恒温水浴箱 离心机 14 LD4-2低速离心机 TGL-16G高速离心机 TGL-16G高速冷冻离心机 BECKMAN J2-HS高速冷冻离心机 压力蒸汽消毒器 LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器 液氮储存罐 液氮储存罐 金属滤器 第二节细胞培养常用器材 及处理方法 一、玻璃器材 ?培养皿 ?滴流瓶 ?刻读吸管、离心管等 ?培养瓶 ?烧杯、量筒等 ?三角烧瓶 培养皿 培养皿 滴流瓶 滴流瓶 刻读吸管、离心管等 刻读吸管、离心管等 培养瓶 培养瓶 烧杯、量筒等 烧杯、量筒等 三角烧瓶 三角烧瓶 玻璃器材的消毒处理方法 ?清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或用 洁消精?自来水冲10次?单蒸水洗 2次 ?培养瓶再用三蒸水浸泡过夜?凉干 ?包装?灭菌 二、塑料器材 ?多孔培养板 ?培养皿 ?培养瓶 塑料器材的消毒处理方法 ?用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过 夜（单用或交叉处理）?水洗10 次?单蒸水2次?三蒸水浸泡过夜 ?凉干?紫外线或辐射灭菌 三、橡皮器材 ?橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或 试管的塞子、盖子。 橡皮器材的消毒处理方法 ? 5%NaOH煮?水洗?4%盐酸煮? 水洗8~10次?单蒸水洗三次、二蒸 水洗一次。 四、金属器材 ?剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血 管钳、组织镊、眼科镊及各种型号 针头等 金属器材 金属器材 金属器材的消毒处理方法 ?纸擦去表面的油脂?洗衣粉煮沸， 或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟?水 洗? 95%酒精纱布擦干?包装灭 菌 五、其他物品 ?纱布 ?注射器和针头 第三节常用溶液、培养液及其配制 ?一、平衡盐溶液 ?细胞培养中常用的基本液体。 配液时的注意事项 ?（1）称量要准确 ?（2）物质的纯度 ?（3）物质的可溶性 ?（4）物质的不稳定性 ? (5) 贮存液 (二)几种常用溶液的配制方法 ? 1、无钙、镁、离子溶液(1000ml) ? 2、磷酸盐缓冲液 ? 3、Hanks液 1、无钙、镁、离子溶液(1000ml) ?氯化钠(NaCl) 8g 磷酸二氢钠 (NaH2PO4H20) 0.05g ?氯化钾(KCl) 0.2g 碳酸氢钠 (NaHCO3) 1g ?柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20)1g 葡萄糖 1g ?加去离子水或双蒸水至1000mL 2、磷酸盐缓冲液 ?甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 ?磷酸氢二钠(无水) 28.4g 氯化钠8.77g ?加去离子水或双蒸水至1000mL ?乙液：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液 ?磷酸二氢钠(无水) 2.4g 氯化钠8.77g ?加去离子水或双蒸水至1000mL ?甲、乙液于4℃保存，使用时按表3-2所示比例， 配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。 3、Hanks液 ? (1)母液甲(20x)配法 ?①NaCl(A.R) 160g ? KCl(A.R) 8g ? MgSO4.7H2O（A.R) 2g ? MgCl.6H2O(A.R) 2g ?依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一 种。 ?②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌 （此液应单配，单溶）。 ?待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸 水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保 存。 ? (2)母液乙(20×)配法 ?①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g ? KH2PO4(A.R) 1.20g ?葡萄糖(A.R) 20.0g ?溶于800ml双蒸水中。 ?②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N NaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量 瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保 存。 ?待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至 1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。 ? (3)使用液（1×）配法 ?取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18 份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以 115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)， 置室温后4℃保存，可使用几个月。临用 前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。 二、其他溶液 ?（一）pH调节液: ?（二）消化液: ?（三）抗生素溶液 ?（四）0.5%台盼兰(Trypan blue)液 ?（五）0.1%结晶紫的配制 ?三、培养基（维持液、营养液） ? (一)天然培养基(组成=平衡盐液+天然动物 成分) ? 1、血清（马、兔、鸡、小牛、新生小牛和 胎牛（200~300天）） ?（1）收集与保存 ?（2）小牛血清对细胞的作用 ?提供细胞增殖所必须的生长因子（A因子? 促进；B、C因子对细胞有抑制生长作用； D因子促进细胞粘连） ?对细胞附壁有利 ?保护作用解除毒性物质对细胞的毒性作 用；免受冻存，搅拌，损伤 ?其他：利于染色体分布良好 ?（3）影响血清作用的因素 ?年龄；血型（AB>A或O）；血色素；胆红 质脂肪酸；红细胞生成素；肿瘤患者血 清；浓度；支原体污染 ? 2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin) ?乳蛋白经蛋白酶和肽酶混合物水解而得的 制品，常用浓度为0.2%～0.5%，用平衡盐 溶液配制。0.4%浓度的水解乳蛋白经分解 后几乎与人血浆中氨基酸成分相当。 ? 3、酵母浸出液：它还含有丰富的维生素， 对增加细胞的生长率特别有利。常用浓度 为0.1%。 ? 4、鸡胚浸出液（加过程） ? 5、鸡血浆 ? 6、胰酶消化牛心肌浸液 ? (二)人工合成培养基（加配制） ? 1、种类：199，Eagle 、RPMI1640、HAMF12、 NCT109等。 ? 2、优点： ?已知成分配制，培养条件一致 ?有利于定量研究代谢成分 ?可延长培养时间，节省人力、物力 ?无潜在病毒污染 ?便于细胞大量生产 ? 2、人工合成培养基的成分 ?人工合成培养基的主要成分是氨基酸、维 生素、碳水化合物、无机离子及其他一些 辅助物质。