实 验 三
培养基的配制及湿热灭菌；玻
璃器皿的干热灭菌
一,实验目的
? 明确培养基的配制原理；通过对基础培
养基的配制，掌握配制培养基的一般方
法和步骤。
? 学习高压蒸汽灭菌的操作方法；学习干
热灭菌的操作技术。
实验原理
培养基
据组成成分可分为,
1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物
质配制而成。
3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
剧用途可分为
1.基础培养基：能满足各种微生物的营养需求
加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，
使其快速生长，便于分离
3.选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目
标微生物得到富集，便于分离
4.鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。
? 从培养基的物理状态可分为
1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。
2.固体培养基：在液体培养基中加入 2%左右的凝固剂
的固体状态的培养基或农副产品培养基。
3.半固体培养基：在液体培养基中加入 0.2— 0.5%凝固
剂而成的半固体状培养基。
? 消毒,使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的
方法。
? 灭菌,采用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物的方
法。
? 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器
? 加压蒸汽灭菌法其步骤如下,
1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。
2.接通电源，进行加热
3,排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大
气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到
0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到 0时再关闭排气
阀。
4.当压力达 1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为 1210C，
维持 30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸
等物时，应适当降低压力，延长时间。
5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开
排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。
? 间歇灭菌法,
待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，
每天蒸煮 1次，每次煮沸 1h，连续 3d
重复进行。在每两次蒸煮之间，将物
品（指培养基）放在 370C恒温条件下
培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未
杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便
下次蒸煮时杀灭。
? 过滤除菌法,
不能用加热灭菌的液体物质（如维生
素、血清），一般可用细菌过滤器进
行除菌。
? 紫外线灭菌法,
一般 30W灯管,9m3空间，距地面 2m每次打开
紫外线照射 0.5h，就使室内空气灭菌。若照射
紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强
灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透
力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫
外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。
? 化学药剂消毒灭菌,
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲
醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、
漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是
杀菌剂，有的是抑菌剂。
三、实验材料
? 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、
蔗糖；可溶性淀粉,K2HPO4,KNO3、
MgSO4?7H2O,FeSO4?7H2O等 。
? 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、
紫外线杀菌灯。
? 其它：天平、牛角匙、电炉,1N HCl,1N NaOH、
pH试纸、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带棉塞的
无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、包装
纸、防水纸、绳、棉花、标签等。
四、实验步骤
? 培养基的配制
? 分离培养微生物常用器皿的准备
? 培养基和玻璃器材的灭菌
（一）、培养基的配制方法和步骤
? 称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。
? 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加
热溶解。
? 调 pH值：用 NaOH或 HCl调 pH，用 pH试纸对照 。
? 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补
水。
? 分装：注意不要污染棉塞。
? 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何
种培养基。
? 灭菌备用：培养基灭菌后必须在 370C下恒温培养
24h，确定无菌生长，方可使用。
培养基的配制方法和步骤
（二）高压蒸汽灭菌 适用于培养基、无
菌水、工作服等物品的灭菌。
加水 —— 装料 —— 加盖 —— 排气 —— 升
压 —— 保压 —— 降压 —— 无菌检查
（三）干热灭菌法 适用于玻璃器皿，如
试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭
菌。
装入待灭菌物品 —— 升温 —— 恒温 ——
降温 —— 取出灭菌物品（待烘箱内温度
降到 70℃ 以下后，才能打开箱门，取出
灭菌物品）
检查培养基灭菌是否彻底。
五、实验结果
六、思考题
? 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问
题？
? 培养基中加琼脂的作用是什么？
? 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有
何不同？
? 如何检查培养基灭菌是否彻底？
培养基的配制及湿热灭菌；玻
璃器皿的干热灭菌
一,实验目的
? 明确培养基的配制原理；通过对基础培
养基的配制，掌握配制培养基的一般方
法和步骤。
? 学习高压蒸汽灭菌的操作方法；学习干
热灭菌的操作技术。
实验原理
培养基
据组成成分可分为,
1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物
质配制而成。
3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
剧用途可分为
1.基础培养基：能满足各种微生物的营养需求
加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，
使其快速生长，便于分离
3.选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目
标微生物得到富集，便于分离
4.鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。
? 从培养基的物理状态可分为
1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。
2.固体培养基：在液体培养基中加入 2%左右的凝固剂
的固体状态的培养基或农副产品培养基。
3.半固体培养基：在液体培养基中加入 0.2— 0.5%凝固
剂而成的半固体状培养基。
? 消毒,使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的
方法。
? 灭菌,采用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物的方
法。
? 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器
? 加压蒸汽灭菌法其步骤如下,
1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。
2.接通电源，进行加热
3,排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大
气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到
0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到 0时再关闭排气
阀。
4.当压力达 1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为 1210C，
维持 30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸
等物时，应适当降低压力，延长时间。
5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开
排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。
? 间歇灭菌法,
待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，
每天蒸煮 1次，每次煮沸 1h，连续 3d
重复进行。在每两次蒸煮之间，将物
品（指培养基）放在 370C恒温条件下
培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未
杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便
下次蒸煮时杀灭。
? 过滤除菌法,
不能用加热灭菌的液体物质（如维生
素、血清），一般可用细菌过滤器进
行除菌。
? 紫外线灭菌法,
一般 30W灯管,9m3空间，距地面 2m每次打开
紫外线照射 0.5h，就使室内空气灭菌。若照射
紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强
灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透
力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫
外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。
? 化学药剂消毒灭菌,
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲
醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、
漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是
杀菌剂，有的是抑菌剂。
三、实验材料
? 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、
蔗糖；可溶性淀粉,K2HPO4,KNO3、
MgSO4?7H2O,FeSO4?7H2O等 。
? 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、
紫外线杀菌灯。
? 其它：天平、牛角匙、电炉,1N HCl,1N NaOH、
pH试纸、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带棉塞的
无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、包装
纸、防水纸、绳、棉花、标签等。
四、实验步骤
? 培养基的配制
? 分离培养微生物常用器皿的准备
? 培养基和玻璃器材的灭菌
（一）、培养基的配制方法和步骤
? 称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。
? 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加
热溶解。
? 调 pH值：用 NaOH或 HCl调 pH，用 pH试纸对照 。
? 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补
水。
? 分装：注意不要污染棉塞。
? 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何
种培养基。
? 灭菌备用：培养基灭菌后必须在 370C下恒温培养
24h，确定无菌生长，方可使用。
培养基的配制方法和步骤
（二）高压蒸汽灭菌 适用于培养基、无
菌水、工作服等物品的灭菌。
加水 —— 装料 —— 加盖 —— 排气 —— 升
压 —— 保压 —— 降压 —— 无菌检查
（三）干热灭菌法 适用于玻璃器皿，如
试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭
菌。
装入待灭菌物品 —— 升温 —— 恒温 ——
降温 —— 取出灭菌物品（待烘箱内温度
降到 70℃ 以下后，才能打开箱门，取出
灭菌物品）
检查培养基灭菌是否彻底。
五、实验结果
六、思考题
? 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问
题？
? 培养基中加琼脂的作用是什么？
? 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有
何不同？
? 如何检查培养基灭菌是否彻底？
