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第二讲 固定化酶和固定化菌体
第一节 微生物酶
第二节 酶的特性
第三节 固定化酶
第四节 固定化菌体
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第一节 微生物酶
一 生物催化剂 ——酶
二 微生物酶的优越性
三 菌体内酶与菌体外酶
本节内容,
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一 生物催化剂 ——酶
? 微生物酶,微生物生活细胞产生的具有催化作
用和专一激活能力的蛋白质。
? 在常温、常压下对复杂的生物化学反应
有特异的催化作用。在物理化学条件下
不稳定。可通过改变物理、化学条件控
制酶的反应。
在发酵过程中就是利用微生物的酶系统调节
代谢和控制生产。
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二 微生物酶的优越性
1 酶的来源：动物、植物、微生物。
（ 1）微生物生长速度快，易于大量培养。
（ 2）通过菌种选育改进培养条件，便于人为提高
产量。
（ 3）菌种不同，产生酶的种类有差异。
（ 4）利用微生物酶反应，以活菌体进行催化，简
化工艺，缩短反应周期。
（ 5）产量高、成本低、不受季节限制，便于工业
化生产。
2 微生物酶的优越性
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三 菌体内酶与菌体外酶
1 菌体内酶
产生的酶分布在微生物细胞内，又叫 胞内酶 。
胞内酶的使用,
（ 1）把酶从菌体细胞内抽提出来。繁杂、易
失活
（ 2）固定化细胞。用一定的方法将微生物菌
体固定在载体上制成 固定化菌体 。简单、利用
率高、不易失活。
如,大肠杆菌 产生的 青霉素酰胺酶 的利
用。
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2 菌体外酶
产生的酶分泌到菌体外，又叫 胞外酶 。
胞外酶的使用,
（ 1）除去菌体，把含酶的培养滤液直接用于
生物催化反应。
（ 2）把酶抽提出来用一定的方法制成, 固定
化酶, 。
如,葡萄糖淀粉酶 与 羧甲基纤维素 （ CMC） 离
子结合制成的 固定化酶
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第二节 酶的特性
一 酶的催化性
二 酶的专一性
三 影响酶反应速度的因素
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一 酶的催化性
A+B C+D——酶反应 enzymetic resction酶
底物,接收酶催化的化学反应的物质。 A,B
酶的催化性,
?改变底物原子排列并增进反应速度的功能
?微生物酶的催化性是在常温、常压下起作用
的
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二 酶的专一性
?绝对专一性,一定的酶只能作用于一定的底物。酶对底
物有很强的选择性。能从多种复杂的底物
混合物中与特定底物反应。如：脲酶只能
作用于尿素。
?相对专一性,一种酶除能与特定底物作用外，也能与同底
物化学结构相类似的底物起作用。
酶对底物的选择性较低。如,D－ 氨基酸氧化
酶能催化多种 D－ 氨基酸脱氨。
?立体异构专一性,一种酶只能作用于旋光异构体的一种
或顺反异构体的一种。如,L－ 乳酸
脱氢酶只能作用于 L－ 乳酸。反丁烯
二酸酶只能作用于分丁烯二酸。
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三 影响酶反应速度的因素
最适反应温度,能形成 最大反应速度 的温
度,在适温范围内，随温度
上升，反应速度上升。温
度每增高 10℃,速度提高
1～ 2倍
受温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等因素影响。
1 温度
微生物体内 30～ 60℃
1 B-半乳糖苷酶
2 酰化氨基酸水解酶
3 葡萄糖异构酶
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2 氢离子浓度
酶蛋白是两性电解质 。酶活性在特定的电荷状态下发挥。
酸性系统,越倾向于酸，正电荷越多。
碱性系统,越倾向于碱，负电荷越多。
酸碱都会降低酶活
甚至失活。
最适 PH值,能保持最大
酶活性的 PH
值 约在 5～
10。中性居
多。
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3 酶浓度对反应速度的影响
底物充足、条件适合，酶反应速度与酶浓度成正比。
4 底物浓度对反应速度的影响
米－门公式,V= V最大 S
Km+S
V,反应速度
V最大,最大反应速度
Km,米氏常数
S,底物浓度
（ 1） 当 Km=S时,V=
（ 2） S,Km时,V= V与 S成正比。一级反应
（ 3） S, Km时,V=V最大 V与 S无关。 零级反应
V最大
2
V最大 S
Km
跳转到第一页米－门公式图示
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纵上所述，直接利用微生物酶 ——
（ 1） 不稳定 。在高温、高压、强酸、强碱下。
（ 2） 易失活 。即使在最适合的条件下反应。
（ 3） 回收困难 。用适当方法提取目的产物后，残存酶回
收困难。
（ 4） 反应速度减慢。 随着反应时间的推移。
（ 5） 经济上不合算。 一次性反应后不能再次使用。
阻碍了微生物酶的应用和发展。
研制固定化酶和固定化菌体
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第三节 固定化酶
一 固定化酶的源流
二 酶固定化后的性质变化
三 固定化酶的形态和作用模型
四 酶的固定化方法举例
五 制备和应用固定化酶需注意的几个方面
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一 固定化酶的源流
固定化酶 immobilized enzyme是 1971年 在美国举行
的第一次世界酶会议上推荐确定的。又称 水不溶性
酶、固相酶。
固定化酶,水溶性酶通过物理和化学的方法，使之
与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。
50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧
肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定
化酶
1969年。 用固定化氨基酰化酶拆分 DL-氨基酸
。第一个工业生产的固定化酶。
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二 酶固定化后的性质变化
酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。
1 对底物的特异性 。尤其注意立体结构对催化底物特异
性的影响。
2 酶反应最适 PH值的改变 。酶固定化后，酶蛋白质的电
子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规
律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。
3 动力学常数的改变 。米氏常数和最大反应速度会改变
4 酶反应温度的改变
5 增加酶的稳定性 。对热,PH值、有机溶媒、蛋白质变
性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。 连续化反应稳定性
好。 ——固定化酶的最大好处
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三 固定化酶的形态和作用模型
1 制备固定化酶的方法
2 固定化酶的形态结构模型
3 固定化酶的作用模型及其反应机理
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1 制备固定化酶的方法
化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种 。
制备时应注意,
（ 1）保护酶蛋白的立体结构不变。
（ 2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用
（ 3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等
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（ 1） 化学方法 制备的固定化酶的形态结构模型
1 离子结合法
2 交联法
3 载体结合法
4 架桥法
5 网络结合
6 酶网
共
价
键
结
合
法
1 2 3
4 5 6
2 固定化酶的形态结构模型
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（ 2） 物理方法
制备的固定化
酶的形态结构
模型
1 物理吸附法
2 包埋法
3 微型胶囊法
4 凝胶格子型
5 空心纤维型
6 纤维丝型
1 2
3 4
5 6
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（ 3） 物理化学结合法 制备的固定化酶的形态结构模型
1 架桥、包埋结合法； 2 包埋与离子结合法； 3 共价结合包埋法
1 2 3
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3 固定化酶的作用模型及其反应机理
（ 1）作用模型
可以连续进行催化
反应（适宜的底物
浓度、温度,pH值
）
以 羧甲基纤维素 固定
葡萄糖淀粉酶 水解 淀
粉生产葡萄糖 为例说
明。
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（ 2）反应机理
载体的作用, ▼ 保持酶的立体结构
▼ 保护酶的活性中心
▼ 保证酶的连续催化反应
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四 酶的固定化方法举例
（ 一） 载体结合法制备固定化酶
（二） 包埋法制备固定化酶
（三） 交联法制备固定化酶
（四） 固定化酶的制法及其特性比较
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（一）载体结合法制备固定化酶
1 常用载体
粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分
的量、化学组成等方面考虑。
纤维素、右旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺
凝胶、多孔玻璃
2 常用方法
按载体结合形式分为,共价键结合法
离子键结合法
物理吸附法
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备
固定化酶的方法。即，通过 化学共价键,把与 酶
蛋白活性无关的氨基酸功能基团 连接在不溶于水
的 载体 上。
（ 1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链 C－ 末端的 α –羧基，天门冬酰氨酸
，谷氨酸的 β － γ 羧基
游离氨基：肽链 N－ 末端的 δ － 氨基，
赖氨酸 ε － 氨基
巯基：半胱氨酸
羟基：丝氨酸，苏氨酸
酚基：酪氨酸
咪唑基：组氨酸
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
（ 2）所用载体
重氮化法,具有氨基的不溶性载体（ R－ NH2）。
以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。
多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃
烷 化 法, 卤族的乙酰衍生物 （氯乙酰纤维素、溴乙酰纤
维素、碘乙酰纤维素）
含卤族的高聚物 （氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
（ 3）固定化酶的制备机理
将与载体反应
的功能基团与
各种 重氮化剂
,烷化剂 等反
应形成 共价键
制备固定化酶
。
纤维素
+盐酸甲醇
CMC－ 甲酯
＋肼
CMC－ 酰肼
CMC－ 叠氮化物
＋ NH2 酶
亚硫酸钠
盐酸＋
固定化酶 － CH2CO-NH 酶
CMC － CH2COOH
制备酰肼
叠氮化物
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
（ 4）优缺点
优点,酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长
时间使用。
缺点,制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏
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2 常用方法之二 ——离子键结合法
酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶
（ 1）所用载体
纤维素的衍生物，离子交换树脂
（ 2）固定化酶的制备机理
酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载
体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到
离子交换剂上。
（ 3）优缺点
优点,操作简便，处理条件温和，酶的高级结构
和活性中心不易破坏，有利于制备高活性
酶
缺点,载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下
酶易从载体上脱落
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2 常用方法之三 ——物理吸附法
（ 1）常用载体
无机物
有机物
高分子化合物
活性炭、白陶土、
氧化铝、多孔玻璃、
硅胶、碳酸钙凝胶
淀粉麸质、大孔树脂、
DEAE纤维素、
DEAE葡聚糖凝胶
（ 2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（ 3）优缺点
优点,酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的
高级结构 ;方法简单，成本低。
缺点,酶吸附不牢固，易脱落；
防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
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物理吸附法固定化酶举例
载体 固定化酶
活性炭 α － 淀粉酶,β － 淀粉酶
蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶
多孔玻璃 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶
脂肪酶、葡萄糖氧化酶
氧化铝 葡萄糖氧化酶
碳酸钙凝胶 亮氨酸氨肽酶
纤维素 胰蛋白酶、核糖核酸酶
麸素 Β － 淀粉液化酶
硅胶 磷酸化酶
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（二） 包埋法制备固定化酶
酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在
凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。
包埋方法有两种,
1 格子型固定化酶
2 微型胶囊法
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1 格子型固定化酶
（ 1）原理
以 丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂 等材料，在酶存
在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的
网状格子中。反应为厌氧反应。
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酶液
丙烯酰
胺
N,N－
双丙烯
酰胺
氢气
催化剂：四
甲基乙二胺
、明矾胺
引聚剂：
过硫酸钾、核黄素
光照
聚合反应 凝胶酶块
固定化
酶
切
割
（ 2）方法（ 以丙烯酰胺为材料是最常用的方法 ）
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凝胶或膜 酶
聚丙烯酰胺凝胶 α, β － 淀粉酶
葡萄糖氧化酶
乳酸脱氢酶
淀粉 胆碱酯酶
琼脂 青霉素酰胺酶
（ 3）制备的固定化酶
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2 微型胶囊法
（ 1）原理
把 酶包在 超薄半透性
的 聚合物膜 中，制成
球状含酶 微型胶囊 。
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（ 2）特点
?微囊直径几微米～几百微米。
?低分子底物 可以自由通过并 进入微囊 内。
?与酶反应后的 生成物被排除在微囊外,
?酶本身 是高分子物质不能通过微囊而 被留在微囊中,
?外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内
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表
面
聚
合
法
以 亲水性单体 和 疏水性单体 在表面发生聚合反应将
酶包围起来，形成微型胶囊酶。分 三 步：
常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类
亲水性单体 疏水性单体 生成的聚合物
聚胺 聚异氰衍生物 聚胺、聚酯
乙二醇、多元醇 聚异氰衍生物 聚胺、聚酯
（ 3）方法 ——
表面聚合法,液中干燥法、相分离法
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A 乳化分散,取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不
溶于水的有机溶媒中充分乳化。
B 表面聚合,将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上
述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起
来形成微型胶囊球。
三步,
C 清洗,反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩
余单体
1
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（ 4）微型胶囊法形成的固定化酶
胶囊制法 囊膜的素材 应用的酶
表面聚合法
尼龙 乳糖酶
羧基脱氢酶
聚合脲 天门冬酰胺酶
液中干燥法 聚苯乙烯
过氧化氢酶
脂肪酶
脲酶
相分离法
火棉胶 过氧化氢酶
天门冬酰胺酶
硝酸纤维素 天门冬酰胺酶
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缺点, 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防
治酶的失活和变性。
优点, A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。
B 能很好地保存天然酶的活性和特性。
C 大小可任意调节，制备时间短。
（ 5）微型胶囊法优缺点
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（三） 交联法制备固定化酶
概念, 双功能试剂或多功能试剂 与酶蛋白质中的 氨
基酸残基 作用，使酶与酶之间交联成 网,
凝集成固定化酶
1 发生作用的氨基酸残基,
酪氨酸的酚基
胱氨酸的 SH巯基
N－ 末端的 a－ 氨基。
2 常用的双功能或多功能试剂,
戊二醛
聚甲叉双碘乙酰胺
双重氮联苯胺
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3 酶网载体交联法
先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂
戊二醛 与 酶蛋白的氨基 之间 交联 起来，形成 酶网 包围在
载体表面。
常用载体,硅胶、离子交换树脂。
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（四） 固定化酶的制法及其特性比较
特性 制备方法
共价键
结合法
离子
结合法
物理
吸附法 包埋法
制法 难 易 易 难
酶活力 高 高 高低
底物特异性 易变 不变 不变 不变
结合能力 弱 中 弱 弱
再生 不可 可能 可能 不可
交联法
难
中
易变
强
不可
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五 需注意的几个方面问题
（一 ） 酶活性的测定方法
（二） 制备过程中保持酶活性稳定的方法
（三） 固定化酶的保存方法
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（一）酶活性的测定方法
1 测定酶的固定化量
固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）
中残存的酶含量。
2 测定颗粒直径
固定化酶的粒径越小，酶活性越高。 固定化酶颗粒直径
大小影响酶活性。
3 测定酶反应最适 pH值
酶固定化后反应的最适 pH较原来的酶有所变化。
4 检查酶是否脱落
测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经
过适当保温检查是否还继续进行反应,如果溶液中出现酶
反应，说明酶脱落。
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（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法
1 包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化
反应时,预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶
的活性中心,而后再进行固定化反应。
2 以酶的前体状态进行固定化,然后经过活化制备固定
化酶。
3 防止酶在催化反应中活性下降
下降原因 （ 1） 酶的变性
（ 2） 吸附了酶的抑制物质。
（ 3） 被微生物污染
（ 4） 酶脱落
（ 5） 载体崩溃或变形分解
（ 6） 操作失误
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（三）固定化酶的保存方法
使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。
1 真空冷冻干燥保存（长期保存）
2 低温保存
3 多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体
更适于长期保存。
4 无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具
有较好的保存性。
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第四节 固定化菌体
固定化菌体概念,把菌体细胞中特定的 酶不经过分离提纯
,直接 用适当的方法 将菌体加以固定
来催化各种特定的生物化学反应。
优点,不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成
本低 ——与固定化酶比较
制备方法,与固定化酶相同，有 包埋法、载体结合法
、交联法、热处理法、射线处理法 。
其中 包埋法是最理想的方法 。
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一 包埋法
1 原理
在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其
包进 半透性的多聚物膜 内。 小分子的底物和产物均可
自由出入,而 菌体细胞却不会漏出 。
2 方法
常用的包埋材料 是,聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂
以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例
将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚
丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸
胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合
。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达 72.5
％
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包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 菌种 酶系 用途
琼脂 大肠杆菌
大肠杆菌
谷氨酸脱羧酶
青霉素酰胺酶
制造 γ -酪蛋白
生产 6-氨基青霉烷酸
(6-APA)
明胶－戊二醛 短乳杆菌
链霉菌
葡萄糖异构酶 从葡萄糖生产高果糖
浆
聚丙烯酰胺 大肠杆菌 天门冬氨酸酶
醋酸纤维素 大肠杆菌 青霉素酰胺酶
（裂解）
青霉素酰胺酶
（合成）
生产 6－ APA
生产半合成青霉素
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二 载体结合法（吸附法）
1 原理
微生物细胞表面带有 电荷,在适当的条件下可以
与载体的 离子交换基团 形成络合物 或 吸附在载体 上。
2 常用载体
离子交换纤维素。阴离子树脂,DEAE－ 纤维素。
3 优缺点
优点,方法简单、载体易于再生。
缺点,结合力弱，菌体细胞易脱落。
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载体结合法制备固定化菌体举例
载体 菌体 酶 用途
离子交换纤维素 丝状菌孢子 转化酶 蔗糖的转化
阴离子树脂 放线菌 葡萄糖异构酶 制造果糖
DEAE-纤维素 巨大芽孢杆菌 青霉素酰胺酶 制造 6APA
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第二讲 固定化酶和固定化菌体
第一节 微生物酶
第二节 酶的特性
第三节 固定化酶
第四节 固定化菌体
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第一节 微生物酶
一 生物催化剂 ——酶
二 微生物酶的优越性
三 菌体内酶与菌体外酶
本节内容,
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一 生物催化剂 ——酶
? 微生物酶,微生物生活细胞产生的具有催化作
用和专一激活能力的蛋白质。
? 在常温、常压下对复杂的生物化学反应
有特异的催化作用。在物理化学条件下
不稳定。可通过改变物理、化学条件控
制酶的反应。
在发酵过程中就是利用微生物的酶系统调节
代谢和控制生产。
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二 微生物酶的优越性
1 酶的来源：动物、植物、微生物。
（ 1）微生物生长速度快，易于大量培养。
（ 2）通过菌种选育改进培养条件，便于人为提高
产量。
（ 3）菌种不同，产生酶的种类有差异。
（ 4）利用微生物酶反应，以活菌体进行催化，简
化工艺，缩短反应周期。
（ 5）产量高、成本低、不受季节限制，便于工业
化生产。
2 微生物酶的优越性
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三 菌体内酶与菌体外酶
1 菌体内酶
产生的酶分布在微生物细胞内，又叫 胞内酶 。
胞内酶的使用,
（ 1）把酶从菌体细胞内抽提出来。繁杂、易
失活
（ 2）固定化细胞。用一定的方法将微生物菌
体固定在载体上制成 固定化菌体 。简单、利用
率高、不易失活。
如,大肠杆菌 产生的 青霉素酰胺酶 的利
用。
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2 菌体外酶
产生的酶分泌到菌体外，又叫 胞外酶 。
胞外酶的使用,
（ 1）除去菌体，把含酶的培养滤液直接用于
生物催化反应。
（ 2）把酶抽提出来用一定的方法制成, 固定
化酶, 。
如,葡萄糖淀粉酶 与 羧甲基纤维素 （ CMC） 离
子结合制成的 固定化酶
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第二节 酶的特性
一 酶的催化性
二 酶的专一性
三 影响酶反应速度的因素
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一 酶的催化性
A+B C+D——酶反应 enzymetic resction酶
底物,接收酶催化的化学反应的物质。 A,B
酶的催化性,
?改变底物原子排列并增进反应速度的功能
?微生物酶的催化性是在常温、常压下起作用
的
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二 酶的专一性
?绝对专一性,一定的酶只能作用于一定的底物。酶对底
物有很强的选择性。能从多种复杂的底物
混合物中与特定底物反应。如：脲酶只能
作用于尿素。
?相对专一性,一种酶除能与特定底物作用外，也能与同底
物化学结构相类似的底物起作用。
酶对底物的选择性较低。如,D－ 氨基酸氧化
酶能催化多种 D－ 氨基酸脱氨。
?立体异构专一性,一种酶只能作用于旋光异构体的一种
或顺反异构体的一种。如,L－ 乳酸
脱氢酶只能作用于 L－ 乳酸。反丁烯
二酸酶只能作用于分丁烯二酸。
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三 影响酶反应速度的因素
最适反应温度,能形成 最大反应速度 的温
度,在适温范围内，随温度
上升，反应速度上升。温
度每增高 10℃,速度提高
1～ 2倍
受温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等因素影响。
1 温度
微生物体内 30～ 60℃
1 B-半乳糖苷酶
2 酰化氨基酸水解酶
3 葡萄糖异构酶
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2 氢离子浓度
酶蛋白是两性电解质 。酶活性在特定的电荷状态下发挥。
酸性系统,越倾向于酸，正电荷越多。
碱性系统,越倾向于碱，负电荷越多。
酸碱都会降低酶活
甚至失活。
最适 PH值,能保持最大
酶活性的 PH
值 约在 5～
10。中性居
多。
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3 酶浓度对反应速度的影响
底物充足、条件适合，酶反应速度与酶浓度成正比。
4 底物浓度对反应速度的影响
米－门公式,V= V最大 S
Km+S
V,反应速度
V最大,最大反应速度
Km,米氏常数
S,底物浓度
（ 1） 当 Km=S时,V=
（ 2） S,Km时,V= V与 S成正比。一级反应
（ 3） S, Km时,V=V最大 V与 S无关。 零级反应
V最大
2
V最大 S
Km
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纵上所述，直接利用微生物酶 ——
（ 1） 不稳定 。在高温、高压、强酸、强碱下。
（ 2） 易失活 。即使在最适合的条件下反应。
（ 3） 回收困难 。用适当方法提取目的产物后，残存酶回
收困难。
（ 4） 反应速度减慢。 随着反应时间的推移。
（ 5） 经济上不合算。 一次性反应后不能再次使用。
阻碍了微生物酶的应用和发展。
研制固定化酶和固定化菌体
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第三节 固定化酶
一 固定化酶的源流
二 酶固定化后的性质变化
三 固定化酶的形态和作用模型
四 酶的固定化方法举例
五 制备和应用固定化酶需注意的几个方面
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一 固定化酶的源流
固定化酶 immobilized enzyme是 1971年 在美国举行
的第一次世界酶会议上推荐确定的。又称 水不溶性
酶、固相酶。
固定化酶,水溶性酶通过物理和化学的方法，使之
与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。
50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧
肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定
化酶
1969年。 用固定化氨基酰化酶拆分 DL-氨基酸
。第一个工业生产的固定化酶。
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二 酶固定化后的性质变化
酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。
1 对底物的特异性 。尤其注意立体结构对催化底物特异
性的影响。
2 酶反应最适 PH值的改变 。酶固定化后，酶蛋白质的电
子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规
律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。
3 动力学常数的改变 。米氏常数和最大反应速度会改变
4 酶反应温度的改变
5 增加酶的稳定性 。对热,PH值、有机溶媒、蛋白质变
性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。 连续化反应稳定性
好。 ——固定化酶的最大好处
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三 固定化酶的形态和作用模型
1 制备固定化酶的方法
2 固定化酶的形态结构模型
3 固定化酶的作用模型及其反应机理
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1 制备固定化酶的方法
化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种 。
制备时应注意,
（ 1）保护酶蛋白的立体结构不变。
（ 2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用
（ 3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等
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（ 1） 化学方法 制备的固定化酶的形态结构模型
1 离子结合法
2 交联法
3 载体结合法
4 架桥法
5 网络结合
6 酶网
共
价
键
结
合
法
1 2 3
4 5 6
2 固定化酶的形态结构模型
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（ 2） 物理方法
制备的固定化
酶的形态结构
模型
1 物理吸附法
2 包埋法
3 微型胶囊法
4 凝胶格子型
5 空心纤维型
6 纤维丝型
1 2
3 4
5 6
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（ 3） 物理化学结合法 制备的固定化酶的形态结构模型
1 架桥、包埋结合法； 2 包埋与离子结合法； 3 共价结合包埋法
1 2 3
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3 固定化酶的作用模型及其反应机理
（ 1）作用模型
可以连续进行催化
反应（适宜的底物
浓度、温度,pH值
）
以 羧甲基纤维素 固定
葡萄糖淀粉酶 水解 淀
粉生产葡萄糖 为例说
明。
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（ 2）反应机理
载体的作用, ▼ 保持酶的立体结构
▼ 保护酶的活性中心
▼ 保证酶的连续催化反应
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四 酶的固定化方法举例
（ 一） 载体结合法制备固定化酶
（二） 包埋法制备固定化酶
（三） 交联法制备固定化酶
（四） 固定化酶的制法及其特性比较
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（一）载体结合法制备固定化酶
1 常用载体
粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分
的量、化学组成等方面考虑。
纤维素、右旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺
凝胶、多孔玻璃
2 常用方法
按载体结合形式分为,共价键结合法
离子键结合法
物理吸附法
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备
固定化酶的方法。即，通过 化学共价键,把与 酶
蛋白活性无关的氨基酸功能基团 连接在不溶于水
的 载体 上。
（ 1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链 C－ 末端的 α –羧基，天门冬酰氨酸
，谷氨酸的 β － γ 羧基
游离氨基：肽链 N－ 末端的 δ － 氨基，
赖氨酸 ε － 氨基
巯基：半胱氨酸
羟基：丝氨酸，苏氨酸
酚基：酪氨酸
咪唑基：组氨酸
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
（ 2）所用载体
重氮化法,具有氨基的不溶性载体（ R－ NH2）。
以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。
多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃
烷 化 法, 卤族的乙酰衍生物 （氯乙酰纤维素、溴乙酰纤
维素、碘乙酰纤维素）
含卤族的高聚物 （氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
（ 3）固定化酶的制备机理
将与载体反应
的功能基团与
各种 重氮化剂
,烷化剂 等反
应形成 共价键
制备固定化酶
。
纤维素
+盐酸甲醇
CMC－ 甲酯
＋肼
CMC－ 酰肼
CMC－ 叠氮化物
＋ NH2 酶
亚硫酸钠
盐酸＋
固定化酶 － CH2CO-NH 酶
CMC － CH2COOH
制备酰肼
叠氮化物
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
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2 常用方法之一 ——共价键结合法
（ 4）优缺点
优点,酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长
时间使用。
缺点,制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏
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2 常用方法之二 ——离子键结合法
酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶
（ 1）所用载体
纤维素的衍生物，离子交换树脂
（ 2）固定化酶的制备机理
酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载
体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到
离子交换剂上。
（ 3）优缺点
优点,操作简便，处理条件温和，酶的高级结构
和活性中心不易破坏，有利于制备高活性
酶
缺点,载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下
酶易从载体上脱落
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2 常用方法之三 ——物理吸附法
（ 1）常用载体
无机物
有机物
高分子化合物
活性炭、白陶土、
氧化铝、多孔玻璃、
硅胶、碳酸钙凝胶
淀粉麸质、大孔树脂、
DEAE纤维素、
DEAE葡聚糖凝胶
（ 2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（ 3）优缺点
优点,酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的
高级结构 ;方法简单，成本低。
缺点,酶吸附不牢固，易脱落；
防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
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物理吸附法固定化酶举例
载体 固定化酶
活性炭 α － 淀粉酶,β － 淀粉酶
蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶
多孔玻璃 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶
脂肪酶、葡萄糖氧化酶
氧化铝 葡萄糖氧化酶
碳酸钙凝胶 亮氨酸氨肽酶
纤维素 胰蛋白酶、核糖核酸酶
麸素 Β － 淀粉液化酶
硅胶 磷酸化酶
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（二） 包埋法制备固定化酶
酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在
凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。
包埋方法有两种,
1 格子型固定化酶
2 微型胶囊法
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1 格子型固定化酶
（ 1）原理
以 丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂 等材料，在酶存
在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的
网状格子中。反应为厌氧反应。
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酶液
丙烯酰
胺
N,N－
双丙烯
酰胺
氢气
催化剂：四
甲基乙二胺
、明矾胺
引聚剂：
过硫酸钾、核黄素
光照
聚合反应 凝胶酶块
固定化
酶
切
割
（ 2）方法（ 以丙烯酰胺为材料是最常用的方法 ）
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凝胶或膜 酶
聚丙烯酰胺凝胶 α, β － 淀粉酶
葡萄糖氧化酶
乳酸脱氢酶
淀粉 胆碱酯酶
琼脂 青霉素酰胺酶
（ 3）制备的固定化酶
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2 微型胶囊法
（ 1）原理
把 酶包在 超薄半透性
的 聚合物膜 中，制成
球状含酶 微型胶囊 。
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（ 2）特点
?微囊直径几微米～几百微米。
?低分子底物 可以自由通过并 进入微囊 内。
?与酶反应后的 生成物被排除在微囊外,
?酶本身 是高分子物质不能通过微囊而 被留在微囊中,
?外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内
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表
面
聚
合
法
以 亲水性单体 和 疏水性单体 在表面发生聚合反应将
酶包围起来，形成微型胶囊酶。分 三 步：
常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类
亲水性单体 疏水性单体 生成的聚合物
聚胺 聚异氰衍生物 聚胺、聚酯
乙二醇、多元醇 聚异氰衍生物 聚胺、聚酯
（ 3）方法 ——
表面聚合法,液中干燥法、相分离法
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A 乳化分散,取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不
溶于水的有机溶媒中充分乳化。
B 表面聚合,将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上
述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起
来形成微型胶囊球。
三步,
C 清洗,反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩
余单体
1
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（ 4）微型胶囊法形成的固定化酶
胶囊制法 囊膜的素材 应用的酶
表面聚合法
尼龙 乳糖酶
羧基脱氢酶
聚合脲 天门冬酰胺酶
液中干燥法 聚苯乙烯
过氧化氢酶
脂肪酶
脲酶
相分离法
火棉胶 过氧化氢酶
天门冬酰胺酶
硝酸纤维素 天门冬酰胺酶
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缺点, 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防
治酶的失活和变性。
优点, A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。
B 能很好地保存天然酶的活性和特性。
C 大小可任意调节，制备时间短。
（ 5）微型胶囊法优缺点
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（三） 交联法制备固定化酶
概念, 双功能试剂或多功能试剂 与酶蛋白质中的 氨
基酸残基 作用，使酶与酶之间交联成 网,
凝集成固定化酶
1 发生作用的氨基酸残基,
酪氨酸的酚基
胱氨酸的 SH巯基
N－ 末端的 a－ 氨基。
2 常用的双功能或多功能试剂,
戊二醛
聚甲叉双碘乙酰胺
双重氮联苯胺
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3 酶网载体交联法
先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂
戊二醛 与 酶蛋白的氨基 之间 交联 起来，形成 酶网 包围在
载体表面。
常用载体,硅胶、离子交换树脂。
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（四） 固定化酶的制法及其特性比较
特性 制备方法
共价键
结合法
离子
结合法
物理
吸附法 包埋法
制法 难 易 易 难
酶活力 高 高 高低
底物特异性 易变 不变 不变 不变
结合能力 弱 中 弱 弱
再生 不可 可能 可能 不可
交联法
难
中
易变
强
不可
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五 需注意的几个方面问题
（一 ） 酶活性的测定方法
（二） 制备过程中保持酶活性稳定的方法
（三） 固定化酶的保存方法
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（一）酶活性的测定方法
1 测定酶的固定化量
固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）
中残存的酶含量。
2 测定颗粒直径
固定化酶的粒径越小，酶活性越高。 固定化酶颗粒直径
大小影响酶活性。
3 测定酶反应最适 pH值
酶固定化后反应的最适 pH较原来的酶有所变化。
4 检查酶是否脱落
测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经
过适当保温检查是否还继续进行反应,如果溶液中出现酶
反应，说明酶脱落。
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（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法
1 包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化
反应时,预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶
的活性中心,而后再进行固定化反应。
2 以酶的前体状态进行固定化,然后经过活化制备固定
化酶。
3 防止酶在催化反应中活性下降
下降原因 （ 1） 酶的变性
（ 2） 吸附了酶的抑制物质。
（ 3） 被微生物污染
（ 4） 酶脱落
（ 5） 载体崩溃或变形分解
（ 6） 操作失误
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（三）固定化酶的保存方法
使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。
1 真空冷冻干燥保存（长期保存）
2 低温保存
3 多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体
更适于长期保存。
4 无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具
有较好的保存性。
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第四节 固定化菌体
固定化菌体概念,把菌体细胞中特定的 酶不经过分离提纯
,直接 用适当的方法 将菌体加以固定
来催化各种特定的生物化学反应。
优点,不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成
本低 ——与固定化酶比较
制备方法,与固定化酶相同，有 包埋法、载体结合法
、交联法、热处理法、射线处理法 。
其中 包埋法是最理想的方法 。
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一 包埋法
1 原理
在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其
包进 半透性的多聚物膜 内。 小分子的底物和产物均可
自由出入,而 菌体细胞却不会漏出 。
2 方法
常用的包埋材料 是,聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂
以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例
将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚
丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸
胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合
。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达 72.5
％
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包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 菌种 酶系 用途
琼脂 大肠杆菌
大肠杆菌
谷氨酸脱羧酶
青霉素酰胺酶
制造 γ -酪蛋白
生产 6-氨基青霉烷酸
(6-APA)
明胶－戊二醛 短乳杆菌
链霉菌
葡萄糖异构酶 从葡萄糖生产高果糖
浆
聚丙烯酰胺 大肠杆菌 天门冬氨酸酶
醋酸纤维素 大肠杆菌 青霉素酰胺酶
（裂解）
青霉素酰胺酶
（合成）
生产 6－ APA
生产半合成青霉素
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二 载体结合法（吸附法）
1 原理
微生物细胞表面带有 电荷,在适当的条件下可以
与载体的 离子交换基团 形成络合物 或 吸附在载体 上。
2 常用载体
离子交换纤维素。阴离子树脂,DEAE－ 纤维素。
3 优缺点
优点,方法简单、载体易于再生。
缺点,结合力弱，菌体细胞易脱落。
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载体结合法制备固定化菌体举例
载体 菌体 酶 用途
离子交换纤维素 丝状菌孢子 转化酶 蔗糖的转化
阴离子树脂 放线菌 葡萄糖异构酶 制造果糖
DEAE-纤维素 巨大芽孢杆菌 青霉素酰胺酶 制造 6APA
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