第十五章 免疫标记技术
岳 华
西南民族大学
标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上, 连接
某一个特定的, 容易检测的分子或原子 (标记
物 ),利用标记抗体能与相应抗原结合的特性,
通过标记物的检测, 从而确定抗原的存在部位 。
标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体,
酶标记抗体和同位素标记抗体等 。 前二者主要用
于抗原定位, 而后者不仅可用于定性, 定量, 还
可用于定位 。 此外尚有铁蛋白标记抗体, 主要用
于免疫电镜的技术, 在亚细胞水平上进行抗原定
位 。
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一, 荧光抗体技术 (Fluorescent
antibody technique)
将荧光染料连接在提纯的抗体球蛋白分子上,
这种用荧光染料标记的抗体, 就叫荧光抗体 。 一
种物质受到短波光线 (如紫外线, 蓝紫光 )激发
后, 能放出波长比激发光长的可见光, 此种光称
为荧光染料, 抗体经过荧光染料标记后, 并不影
响其与抗原结合的能力和特异性 。 因此, 当荧光
抗体与相应的抗原结合时, 就形成带有荧光性的
抗原抗体复合物, 从而可在荧光显微镜下检出 。
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(一 )直接法 将提纯的抗体球蛋白 (主要为
IgG)与 FITC结合制成荧光抗体 。
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西南民族大学炭疽杆菌 24h培养物直接荧光抗体检测
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1、制片：
待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌
材料可做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗
原通常用冷丙酮固定 l5min，细菌抗原则用加
热固定即可。
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2、染色：
滴加荧光抗体，置 37℃ 染色 30～ 60min，用
磷酸缓冲盐水 (PBS)充分洗涤以除去未结合的
荧光抗体，加 pH9.0缓冲甘油 1滴，用盖玻片封
固。
3、镜检：
在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位
呈黄绿色荧光。
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4、设对照：
进行直接荧光染色时，应设以下对照：
（ 1）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无荧
涂片；
（ 2）将待检材料先用未标记的抗血清处理，再
用荧光抗体染色应不出现荧光。
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(二 )间接法 先
备制荧光标记的抗
抗体 （ 第二抗体 ）,
然后将提纯的羊抗
猪抗体用荧光素标
记, 即成羊抗猪荧
光抗体 。
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1,制片：同直接法
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2,染色,染色时, 标本先滴加抗血清, 在 37℃
处理 30～ 60min；
用 PBS充分洗涤后, 再用荧光标记的抗抗体
染色, 37℃ 30～ 60min,洗涤, 封固 。
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3,镜检：
抗抗体必须与抗血清是相应的, 如该抗血
清是猪源的, 则用羊抗猪荧光抗体 。
4、对照：
需用正常血清处理作为对照，此对照片应
无荧光。
西南民族大学间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒
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免疫组化法：
用酶代替荧光素标识抗体作生物组织中抗
原的鉴定和定位, 称为免疫组化法 。
酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (enzyme linked
immunosorbent assay)简称 ELISA：
用于可溶性抗原或抗体的定量, 是一种既
特异又敏感的方法 。
二、免疫酶技术
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用于标记的酶有辣根过氧化物酶 （ HRP）、
葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和 B-半
乳糖苷酶等。其中以 HRP应用最广。
HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢
体，无色的供氢体氧化后生成有色产物，从而使
不可见的抗原抗体反应转化为可见的呈色反应。
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酶抗体染色法和荧光抗体染色一样, 主要
有 直接法, 间接法 两种 。 直接法系用酶标记抗
体直接染色, 间接法则先用抗血清处理, 再用
酶标记的抗抗体染色 。
(一 )免疫酶组化染色法
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Antigen presenting Cell
Enzyme-conjugated
Primary Antibody
Substrate-chromogen
solution
直接法
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Antigen presenting Cell
Primary Antibody
Enzyme-conjugated
Secondary Antibody
Substrate-chromogen
solution
间接法
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酶标记抗体染色通常用冰冻切片, 亦可
用石蜡切片, 用 PBS洗净, 用直接法或间接法
染色, 洗去酶标识抗体后, 滴加基质反应液
显色 。 常用的反应液为 3,3`-二氨基联苯胺
(3,3,-diaminobenzlden,简称 DAB)溶液
(0.05%于 pH2.6Tris盐酸缓冲液中, 临用时加
入 0.02毫升 l%H2O2),洗净后即可在光学显微
镜下观察 。 抗原所在部位呈黄褐 。
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如又用苏木精 -伊红对比染色, 则细胞核呈
紫色, 与黄褐色的抗原对此明显, 效果较好 。
本法与荧光抗体技术相比, 它不需要特殊的荧
光显微镜, 且形态结构看得清楚, 定位比较精
确 。 酶标片子可长期保存, 有利于对结果作反
复对比, 不象荧光抗体片子只能短时间保存 。
由于酶促反应的产物能产生电子密度的改变,
这样就可进一步用电镜作亚细胞结构的定位观
察, 从而将光学显微水平和电子显微水平衔接
起来 。
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其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相
载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色
后，用肉眼或分光光度计判定结果，其 过程
如下。
(二 )酶联免疫吸附测定 (ELISA)
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包被抗原（抗体） 洗涤
底物显色 洗涤 抗体（抗原）
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1.抗原 (或抗体 )包被：
包被的蛋白质浓度通常为 1～ 10ug/ml,应
通过实验选择, 最适浓度按所需浓度溶于包被
液 (PH9.6,0.05molNa2CO3缓冲液 )加入聚苯乙
烯滴定板的平底小孔内, 4℃ 过夜, 用含助溶
剂吐温 20(0.05%)的 PBS洗涤 3次 。
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2.吸附：
先加入与包被抗体 (或抗原 )相对应的被检
物, 吸附后充分洗涤, 再加入与被检物对应的抗
抗体 (或其他对应物 ),再洗涤, 这样可以多层
次的叠加, 但最后一层必须连接酶, 以便与底物
作用显色, 吸附试验的方法主要有以下几种 。
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(1)间接法,用于测定抗体 。 先将抗原被覆, 洗
涤后加待检血清, 充分漂洗后加入酶标记的抗
抗体, 洗后即可供显色观察 。
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(2)夹心法,先用抗体 (IgG)被覆, 加待检抗原,
作用洗涤后, 加酶标记抗体 。
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(3)竞争法,用抗体被覆, 加一定量的标记抗原
和待检抗原混合物, 二者竞争与板上的抗体结
合, 显色后与加未标记抗原的对照组比较, 试
验孔颜色显著低于对照孔者为阳性孔, 待检抗
原含量越高, 颜色越浅, 此法适于小分子抗原
或半抗原的检测 。
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（ 4） 双夹心法,
先将抗体被覆,
第二层是待检抗
原, 洗后加酶标
记抗抗体 。 但第
三层抗体必须不
同于用于被覆的
抗体, 以避免假
阳性 。 本法适于
检查大分子抗原 。
特
异
性
相
同
，
来
源
不
同
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(5) 酶抗酶抗体法：
将抗原吸附于载体上, 然
后加待检抗血清, 第三层
加抗抗体, 第四层是抗酶
抗体, 第五层是酶 。 其中
第二层的抗血清与第四层
抗酶抗体必须是同一制备
的 。 这样就可以利用抗抗
体搭桥, 它的二只手, 一
手拉住待检抗体, 一手拉
住抗酶抗体 。 此法不需事
先标记酶, 且可事先准备
好酶 -抗酶抗体复合物,
为其优点 。
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3.底物显色,与免疫酶组化染色法不同, 必
须用反应后能形成水溶溶性色素的供氢体, 常
用的有邻苯二胺 (CPD),联苯茴香胺, 5-氨基
水杨酸和邻联甲苯胺 。 于用前配制避光保存,
加入反应孔作用 20～ 30min,反应结束, 加浓
硫酸或浓碱液中止反应 。
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4.结果判定 在白色背景上，用肉眼观察，每
批试验均需有阴性对照。颜色反应明显深于
对照组者判为阳性。亦可用分光光度计测定，
待检孔
OD值 (P)与
对照孔 OD值
(N)的比值
(P/N)大于
1.5或 2.0者
为阳性。
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三、放射免疫测定
将抗原抗体反应的特异性与同位素测定技
术的敏感性相结合的一项新技术, 具有特异性
强, 灵敏度高, 准确性和精密度好等优点 。 而
且操作简便, 易于标准化, 其灵敏度可达 10－
9— 10－ 12g水平, 是其他分析方法所无法比拟的 。
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RIA常用的同位素是 8H和 125I和 3H。 3H标记需
要在特殊装置中进行，因其半衰期很长，故多
由放化试剂中心标记后做成试剂盒供应。 125I
半衰期 60天，可用氯胺 T法将其连接于酪胺残
基的芳香环上，形成碘化结合物。本法主要用
于激素等活性物质的超微量分析,常用的有液
相法和固相法 2种。
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1、竞争法：
系利用标记抗原和待检抗原竞争结合原理，
先按一定量标记抗原 (Ag*)和待测抗原 (Ag)
混合，然后加入抗血清 (Ab)，孵育一定时间，
使反应达到平衡，即形成结合型的标记抗原
Ag*-Ab(B)和游离型标记抗原 Ag*(F)。
(一 )液相放射免疫测定
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抗原抗体反应是一种可逆反应，反应稳定
时，标记的游离抗原 (F)和标记的结合抗原
(B)鞍平衡系数 K呈一定比例。如在上述反应中
加入未标记的抗原，则由于抗原的竞争性吸附，
F值增加,B相应减少。 B%的减少与末标记抗原
的量相关，如以已知递增的抗原量为横座标，
B%为纵座标，可画制出标准曲线。
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因此只要将结合的抗原抗体复合物 (B)与
游离的抗原抗体复合物 (F)分开，分别测定其
放射性同位素量，即可测出抗原和抗体的量。
此外，还可根据反应数值的分布特点，分别采
用 B/F,B0/B(B0为零标准管的脉冲数 )，分对
数 (logit)等作为纵座标作图。
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2,双抗体法,是先用与抗原相应的特异性
抗体 (第一抗体 )与定量标记抗原和待检抗原混
合, 作用一定时间后, 再加入与该特异抗体相
应的抗抗体 (第二抗体 ),使形成抗原抗体 -抗
抗体的巨大复合物, 离心沉淀后, 分别测定上
清液 (F)和沉淀物 (B)的放射性 即可根据标
准曲线, 计算出待检抗原的量 。
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活性炭的吸附能力很强, 但若在炭粒表面被
覆一层右旋糖苷, 白蛋白等化合物时, 就限制
炭粒对大分子化合物的吸附, 只允许较小的 F
吸附其上, 离心沉淀后, 即可将 B和 F分开 。
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(二 )固相放射免疫测定
抗原抗体反应在固相载体上进行, 其
操作过程类似 ELISA,载体可用聚苯乙烯
小管或薄型滴定板 。 常用的操作方法如下 。
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1,直接法,将待检物被覆于固相载体, 然后加
入过量的对应标记物, 经反应后, 洗去游离标
记物, 测放射性量, 即可算出待检物量 。
2,单层竞争法,将抗体被覆于载体, 加入不足
量的标记抗原和未知量的待检抗原, 二者竞争
与固相抗体结合, 待检物中抗原量愈多则 B/F
或 B%愈小 。
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3,夹心法,先制备固相抗体, 加入待检抗原,
洗涤后再加入标记抗体, 洗去游离标记抗体,
测放射性, 既可算出待检物中抗原浓度 。
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四、免疫印迹法
印迹法（ blotting）是一种新方法，原理是
生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径
转移到固相载体上的过程。 与凝胶相比，固相
载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。
转移后的固相载体经过试剂处理后，可与相应
探针反应，然后用适当的溶液漂洗，置于含底
物或探针的溶液中孵育，即可显示出谱带。本
方法所消耗试剂少，灵敏度高，应用普遍。
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目前常用的印迹法有四种：
Southern blot 检测 DNA
Northern blot 检测 RNA
Western blot 检测蛋白质
Eastern blot 双相蛋白质印迹法, 用于检测
蛋白质组 。
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印迹法最常用的固体材料是硝酸纤维素膜
（ NC膜 ）, 因为该膜成本低, 背景清晰 。
为减少非特异性的干扰, 使印迹更加清晰,
常对固相载体进行淬灭处理, 即用一种与待测
物不反应的物质如蛋白质, 核酸, 吐温 20等封
闭载体上印迹以外的剩余吸附点, 使探针仅与
印迹物反应, 且不吸附到载体上 。
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探针是指用化学方法将有特异性配位能力
的物质如抗原, 激素, 核酸等与某些能识别的
标示物如酶, 同位素或荧光物质, 地高辛等结
合结合成为复合物 。
现以 western blot为例介绍之 。
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蛋白质混合样本经过 SDS-PAGE电泳后, 分离
为不同的条带, 其中含有能与特异性抗血清或单
克隆抗体相应的待检测蛋白质 （ 抗原蛋白 ） 。
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电转印,将 PAGE胶上的蛋白质条带转移到 NC膜
上（粗糙面贴在胶上）。
—
+
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将 NC膜与抗血清一起孵育，使抗血清（一
抗）与特异蛋白条带结合，再与经过荧光素、
酶或同位素标记的二抗反应，即可检测出样品
中待检抗原及其含量。
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标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上, 连接
某一个特定的, 容易检测的分子或原子 (标记
物 ),利用标记抗体能与相应抗原结合的特性,
通过标记物的检测, 从而确定抗原的存在部位 。
标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体,
酶标记抗体和同位素标记抗体等 。 前二者主要用
于抗原定位, 而后者不仅可用于定性, 定量, 还
可用于定位 。 此外尚有铁蛋白标记抗体, 主要用
于免疫电镜的技术, 在亚细胞水平上进行抗原定
位 。
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一, 荧光抗体技术 (Fluorescent
antibody technique)
将荧光染料连接在提纯的抗体球蛋白分子上,
这种用荧光染料标记的抗体, 就叫荧光抗体 。 一
种物质受到短波光线 (如紫外线, 蓝紫光 )激发
后, 能放出波长比激发光长的可见光, 此种光称
为荧光染料, 抗体经过荧光染料标记后, 并不影
响其与抗原结合的能力和特异性 。 因此, 当荧光
抗体与相应的抗原结合时, 就形成带有荧光性的
抗原抗体复合物, 从而可在荧光显微镜下检出 。
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(一 )直接法 将提纯的抗体球蛋白 (主要为
IgG)与 FITC结合制成荧光抗体 。
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西南民族大学炭疽杆菌 24h培养物直接荧光抗体检测
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1、制片：
待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌
材料可做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗
原通常用冷丙酮固定 l5min，细菌抗原则用加
热固定即可。
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2、染色：
滴加荧光抗体，置 37℃ 染色 30～ 60min，用
磷酸缓冲盐水 (PBS)充分洗涤以除去未结合的
荧光抗体，加 pH9.0缓冲甘油 1滴，用盖玻片封
固。
3、镜检：
在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位
呈黄绿色荧光。
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4、设对照：
进行直接荧光染色时，应设以下对照：
（ 1）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无荧
涂片；
（ 2）将待检材料先用未标记的抗血清处理，再
用荧光抗体染色应不出现荧光。
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(二 )间接法 先
备制荧光标记的抗
抗体 （ 第二抗体 ）,
然后将提纯的羊抗
猪抗体用荧光素标
记, 即成羊抗猪荧
光抗体 。
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1,制片：同直接法
西南民族大学
2,染色,染色时, 标本先滴加抗血清, 在 37℃
处理 30～ 60min；
用 PBS充分洗涤后, 再用荧光标记的抗抗体
染色, 37℃ 30～ 60min,洗涤, 封固 。
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3,镜检：
抗抗体必须与抗血清是相应的, 如该抗血
清是猪源的, 则用羊抗猪荧光抗体 。
4、对照：
需用正常血清处理作为对照，此对照片应
无荧光。
西南民族大学间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒
西南民族大学
免疫组化法：
用酶代替荧光素标识抗体作生物组织中抗
原的鉴定和定位, 称为免疫组化法 。
酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (enzyme linked
immunosorbent assay)简称 ELISA：
用于可溶性抗原或抗体的定量, 是一种既
特异又敏感的方法 。
二、免疫酶技术
西南民族大学
用于标记的酶有辣根过氧化物酶 （ HRP）、
葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和 B-半
乳糖苷酶等。其中以 HRP应用最广。
HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢
体，无色的供氢体氧化后生成有色产物，从而使
不可见的抗原抗体反应转化为可见的呈色反应。
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酶抗体染色法和荧光抗体染色一样, 主要
有 直接法, 间接法 两种 。 直接法系用酶标记抗
体直接染色, 间接法则先用抗血清处理, 再用
酶标记的抗抗体染色 。
(一 )免疫酶组化染色法
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Antigen presenting Cell
Enzyme-conjugated
Primary Antibody
Substrate-chromogen
solution
直接法
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Antigen presenting Cell
Primary Antibody
Enzyme-conjugated
Secondary Antibody
Substrate-chromogen
solution
间接法
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酶标记抗体染色通常用冰冻切片, 亦可
用石蜡切片, 用 PBS洗净, 用直接法或间接法
染色, 洗去酶标识抗体后, 滴加基质反应液
显色 。 常用的反应液为 3,3`-二氨基联苯胺
(3,3,-diaminobenzlden,简称 DAB)溶液
(0.05%于 pH2.6Tris盐酸缓冲液中, 临用时加
入 0.02毫升 l%H2O2),洗净后即可在光学显微
镜下观察 。 抗原所在部位呈黄褐 。
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如又用苏木精 -伊红对比染色, 则细胞核呈
紫色, 与黄褐色的抗原对此明显, 效果较好 。
本法与荧光抗体技术相比, 它不需要特殊的荧
光显微镜, 且形态结构看得清楚, 定位比较精
确 。 酶标片子可长期保存, 有利于对结果作反
复对比, 不象荧光抗体片子只能短时间保存 。
由于酶促反应的产物能产生电子密度的改变,
这样就可进一步用电镜作亚细胞结构的定位观
察, 从而将光学显微水平和电子显微水平衔接
起来 。
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其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相
载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色
后，用肉眼或分光光度计判定结果，其 过程
如下。
(二 )酶联免疫吸附测定 (ELISA)
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包被抗原（抗体） 洗涤
底物显色 洗涤 抗体（抗原）
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1.抗原 (或抗体 )包被：
包被的蛋白质浓度通常为 1～ 10ug/ml,应
通过实验选择, 最适浓度按所需浓度溶于包被
液 (PH9.6,0.05molNa2CO3缓冲液 )加入聚苯乙
烯滴定板的平底小孔内, 4℃ 过夜, 用含助溶
剂吐温 20(0.05%)的 PBS洗涤 3次 。
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2.吸附：
先加入与包被抗体 (或抗原 )相对应的被检
物, 吸附后充分洗涤, 再加入与被检物对应的抗
抗体 (或其他对应物 ),再洗涤, 这样可以多层
次的叠加, 但最后一层必须连接酶, 以便与底物
作用显色, 吸附试验的方法主要有以下几种 。
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(1)间接法,用于测定抗体 。 先将抗原被覆, 洗
涤后加待检血清, 充分漂洗后加入酶标记的抗
抗体, 洗后即可供显色观察 。
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(2)夹心法,先用抗体 (IgG)被覆, 加待检抗原,
作用洗涤后, 加酶标记抗体 。
西南民族大学
(3)竞争法,用抗体被覆, 加一定量的标记抗原
和待检抗原混合物, 二者竞争与板上的抗体结
合, 显色后与加未标记抗原的对照组比较, 试
验孔颜色显著低于对照孔者为阳性孔, 待检抗
原含量越高, 颜色越浅, 此法适于小分子抗原
或半抗原的检测 。
西南民族大学
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（ 4） 双夹心法,
先将抗体被覆,
第二层是待检抗
原, 洗后加酶标
记抗抗体 。 但第
三层抗体必须不
同于用于被覆的
抗体, 以避免假
阳性 。 本法适于
检查大分子抗原 。
特
异
性
相
同
，
来
源
不
同
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(5) 酶抗酶抗体法：
将抗原吸附于载体上, 然
后加待检抗血清, 第三层
加抗抗体, 第四层是抗酶
抗体, 第五层是酶 。 其中
第二层的抗血清与第四层
抗酶抗体必须是同一制备
的 。 这样就可以利用抗抗
体搭桥, 它的二只手, 一
手拉住待检抗体, 一手拉
住抗酶抗体 。 此法不需事
先标记酶, 且可事先准备
好酶 -抗酶抗体复合物,
为其优点 。
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3.底物显色,与免疫酶组化染色法不同, 必
须用反应后能形成水溶溶性色素的供氢体, 常
用的有邻苯二胺 (CPD),联苯茴香胺, 5-氨基
水杨酸和邻联甲苯胺 。 于用前配制避光保存,
加入反应孔作用 20～ 30min,反应结束, 加浓
硫酸或浓碱液中止反应 。
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4.结果判定 在白色背景上，用肉眼观察，每
批试验均需有阴性对照。颜色反应明显深于
对照组者判为阳性。亦可用分光光度计测定，
待检孔
OD值 (P)与
对照孔 OD值
(N)的比值
(P/N)大于
1.5或 2.0者
为阳性。
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三、放射免疫测定
将抗原抗体反应的特异性与同位素测定技
术的敏感性相结合的一项新技术, 具有特异性
强, 灵敏度高, 准确性和精密度好等优点 。 而
且操作简便, 易于标准化, 其灵敏度可达 10－
9— 10－ 12g水平, 是其他分析方法所无法比拟的 。
西南民族大学
RIA常用的同位素是 8H和 125I和 3H。 3H标记需
要在特殊装置中进行，因其半衰期很长，故多
由放化试剂中心标记后做成试剂盒供应。 125I
半衰期 60天，可用氯胺 T法将其连接于酪胺残
基的芳香环上，形成碘化结合物。本法主要用
于激素等活性物质的超微量分析,常用的有液
相法和固相法 2种。
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1、竞争法：
系利用标记抗原和待检抗原竞争结合原理，
先按一定量标记抗原 (Ag*)和待测抗原 (Ag)
混合，然后加入抗血清 (Ab)，孵育一定时间，
使反应达到平衡，即形成结合型的标记抗原
Ag*-Ab(B)和游离型标记抗原 Ag*(F)。
(一 )液相放射免疫测定
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抗原抗体反应是一种可逆反应，反应稳定
时，标记的游离抗原 (F)和标记的结合抗原
(B)鞍平衡系数 K呈一定比例。如在上述反应中
加入未标记的抗原，则由于抗原的竞争性吸附，
F值增加,B相应减少。 B%的减少与末标记抗原
的量相关，如以已知递增的抗原量为横座标，
B%为纵座标，可画制出标准曲线。
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因此只要将结合的抗原抗体复合物 (B)与
游离的抗原抗体复合物 (F)分开，分别测定其
放射性同位素量，即可测出抗原和抗体的量。
此外，还可根据反应数值的分布特点，分别采
用 B/F,B0/B(B0为零标准管的脉冲数 )，分对
数 (logit)等作为纵座标作图。
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2,双抗体法,是先用与抗原相应的特异性
抗体 (第一抗体 )与定量标记抗原和待检抗原混
合, 作用一定时间后, 再加入与该特异抗体相
应的抗抗体 (第二抗体 ),使形成抗原抗体 -抗
抗体的巨大复合物, 离心沉淀后, 分别测定上
清液 (F)和沉淀物 (B)的放射性 即可根据标
准曲线, 计算出待检抗原的量 。
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活性炭的吸附能力很强, 但若在炭粒表面被
覆一层右旋糖苷, 白蛋白等化合物时, 就限制
炭粒对大分子化合物的吸附, 只允许较小的 F
吸附其上, 离心沉淀后, 即可将 B和 F分开 。
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(二 )固相放射免疫测定
抗原抗体反应在固相载体上进行, 其
操作过程类似 ELISA,载体可用聚苯乙烯
小管或薄型滴定板 。 常用的操作方法如下 。
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1,直接法,将待检物被覆于固相载体, 然后加
入过量的对应标记物, 经反应后, 洗去游离标
记物, 测放射性量, 即可算出待检物量 。
2,单层竞争法,将抗体被覆于载体, 加入不足
量的标记抗原和未知量的待检抗原, 二者竞争
与固相抗体结合, 待检物中抗原量愈多则 B/F
或 B%愈小 。
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3,夹心法,先制备固相抗体, 加入待检抗原,
洗涤后再加入标记抗体, 洗去游离标记抗体,
测放射性, 既可算出待检物中抗原浓度 。
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四、免疫印迹法
印迹法（ blotting）是一种新方法，原理是
生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径
转移到固相载体上的过程。 与凝胶相比，固相
载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。
转移后的固相载体经过试剂处理后，可与相应
探针反应，然后用适当的溶液漂洗，置于含底
物或探针的溶液中孵育，即可显示出谱带。本
方法所消耗试剂少，灵敏度高，应用普遍。
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目前常用的印迹法有四种：
Southern blot 检测 DNA
Northern blot 检测 RNA
Western blot 检测蛋白质
Eastern blot 双相蛋白质印迹法, 用于检测
蛋白质组 。
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印迹法最常用的固体材料是硝酸纤维素膜
（ NC膜 ）, 因为该膜成本低, 背景清晰 。
为减少非特异性的干扰, 使印迹更加清晰,
常对固相载体进行淬灭处理, 即用一种与待测
物不反应的物质如蛋白质, 核酸, 吐温 20等封
闭载体上印迹以外的剩余吸附点, 使探针仅与
印迹物反应, 且不吸附到载体上 。
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探针是指用化学方法将有特异性配位能力
的物质如抗原, 激素, 核酸等与某些能识别的
标示物如酶, 同位素或荧光物质, 地高辛等结
合结合成为复合物 。
现以 western blot为例介绍之 。
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蛋白质混合样本经过 SDS-PAGE电泳后, 分离
为不同的条带, 其中含有能与特异性抗血清或单
克隆抗体相应的待检测蛋白质 （ 抗原蛋白 ） 。
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电转印,将 PAGE胶上的蛋白质条带转移到 NC膜
上（粗糙面贴在胶上）。
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将 NC膜与抗血清一起孵育，使抗血清（一
抗）与特异蛋白条带结合，再与经过荧光素、
酶或同位素标记的二抗反应，即可检测出样品
中待检抗原及其含量。
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