实验二 显微镜的使
用和细菌形态与染色
一、实验目的
? 1．学习、掌握油镜的使用；
? 2．学习、掌握细菌涂片染色；
? 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色；
? 4．建立, 无菌操作, 的概念，学习
其技术。
二、实验原理 1
?显微镜的构造
1.光学部分,目镜, 物镜,
照明装置 (聚光镜,虹彩光
圈,反光镜等 )。它使检视
物放大,生成物象。
2.机械部分,镜座、镜臂、镜筒、
物镜转换器、载物台、载物台
转移器、粗调节器、细调节器
等部件,它起着支持 调节 固定
等作用,
? 油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光
线由反光镜通过玻片与镜头
之间的空气时，由于空气与
玻片的密度不同，使光线受
到曲折，发生散射，降低了
视野的照明度。若中间的介
质是一层油（ 其折射率与玻
片的相近 ），则几乎不发生
折射，增加了视野的进光量，
从而使物象更加清晰。
?根据公式 D=λ/2n·sin(α/2 ),增大分母，使得 D值
减小，分辨率增大。
? 显微镜的放大倍数和分辨率
1,放大倍数,物镜放大倍数 × 目镜
放大倍数
2,显微镜的分辨率,是表示显微镜辨
析两点之间距离的能力。可用公式
表示为,
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中 D,物镜分辨出物体两点间的最
短距离。
?,可见光的波长（平均 0.55?m)
n,物镜和被检标本间介质的折射率。
?,镜口角（即入射角）。
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，
以保证光洁度
3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，
最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用
油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻
片或损伤镜面。
4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生
霉菌而腐蚀镜片 。
显微镜保养和使用中的注意事项
? 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、
和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及
它的特殊构造等。
? 复染色法：用两种或两种以上染色液进行
染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称
鉴别染色法。常用的有,
革兰氏染色法,抗酸染色法、芽孢染色法、
鞭毛染色法等。
革兰氏染色
? 丹麦 C.Gram创立，用于细菌分类学研究
? 细菌细胞壁的结构
? G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂
质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了
类脂质，增加了细胞的通透性，使初染
的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙
黄复染呈红色。
? G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，
肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细
菌仍保留初染时的紫色。
三、实验材料
? 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌
（ 24h培养物）
? 载玻片、接种环、酒精灯,香柏油、二甲苯、
擦镜纸、吸水纸等。
? 革兰氏染色液一套
四、实验步骤
1,细菌单染色,（ 1） 分别制备标号为 1、
2及牙垢涂片并染色； （ 2） 步骤：彻底
清洗载玻片 —— 中心加半滴水 —— 无菌
操作取菌 —— 涂布于水中
（ 1cm2± ） —— 干燥 —— 火焰固定 —
— 染色 （ 1min） —— 水洗 —— 吸水 —
— 凉干 —— 观察 —— 记录图示 /描述判
定各菌
2,革兰氏（ Gram）染色法
1,涂片
2,初染：在做好的涂面上滴加草酸
铵结晶紫染液，染 1分钟，倾去
染液，流水冲洗至无紫色。
3,媒染：先用新配的路哥氏碘液冲
去残水，而后用其覆盖涂面 1分
钟，后水洗。
4,脱色,除去残水后，滴加 95%酒
精进行脱色约 15－ 20秒，后立即
用流水冲洗。
5,复染：滴加番红染色液，染 3－ 5
分钟，水洗后用吸水纸吸干。
6,镜检：观察染色结果并绘图。
五、实验结果
?记录所观察到的三种菌革兰氏
染色结果的差别，判断是 G－ /
G＋。绘图描述各菌形态。
六、问题与讨论
?1使用高倍镜与油镜调焦时应注
意什么？
?2革兰氏染色涂片为何不宜太浓
厚？实验关键步骤？
?3对一株未知菌进行革兰氏染色
时，怎样才能确证你的结论正确？
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！
请第一组同学留下值日
下周再见！
用和细菌形态与染色
一、实验目的
? 1．学习、掌握油镜的使用；
? 2．学习、掌握细菌涂片染色；
? 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色；
? 4．建立, 无菌操作, 的概念，学习
其技术。
二、实验原理 1
?显微镜的构造
1.光学部分,目镜, 物镜,
照明装置 (聚光镜,虹彩光
圈,反光镜等 )。它使检视
物放大,生成物象。
2.机械部分,镜座、镜臂、镜筒、
物镜转换器、载物台、载物台
转移器、粗调节器、细调节器
等部件,它起着支持 调节 固定
等作用,
? 油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光
线由反光镜通过玻片与镜头
之间的空气时，由于空气与
玻片的密度不同，使光线受
到曲折，发生散射，降低了
视野的照明度。若中间的介
质是一层油（ 其折射率与玻
片的相近 ），则几乎不发生
折射，增加了视野的进光量，
从而使物象更加清晰。
?根据公式 D=λ/2n·sin(α/2 ),增大分母，使得 D值
减小，分辨率增大。
? 显微镜的放大倍数和分辨率
1,放大倍数,物镜放大倍数 × 目镜
放大倍数
2,显微镜的分辨率,是表示显微镜辨
析两点之间距离的能力。可用公式
表示为,
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中 D,物镜分辨出物体两点间的最
短距离。
?,可见光的波长（平均 0.55?m)
n,物镜和被检标本间介质的折射率。
?,镜口角（即入射角）。
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，
以保证光洁度
3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，
最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用
油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻
片或损伤镜面。
4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生
霉菌而腐蚀镜片 。
显微镜保养和使用中的注意事项
? 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、
和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及
它的特殊构造等。
? 复染色法：用两种或两种以上染色液进行
染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称
鉴别染色法。常用的有,
革兰氏染色法,抗酸染色法、芽孢染色法、
鞭毛染色法等。
革兰氏染色
? 丹麦 C.Gram创立，用于细菌分类学研究
? 细菌细胞壁的结构
? G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂
质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了
类脂质，增加了细胞的通透性，使初染
的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙
黄复染呈红色。
? G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，
肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细
菌仍保留初染时的紫色。
三、实验材料
? 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌
（ 24h培养物）
? 载玻片、接种环、酒精灯,香柏油、二甲苯、
擦镜纸、吸水纸等。
? 革兰氏染色液一套
四、实验步骤
1,细菌单染色,（ 1） 分别制备标号为 1、
2及牙垢涂片并染色； （ 2） 步骤：彻底
清洗载玻片 —— 中心加半滴水 —— 无菌
操作取菌 —— 涂布于水中
（ 1cm2± ） —— 干燥 —— 火焰固定 —
— 染色 （ 1min） —— 水洗 —— 吸水 —
— 凉干 —— 观察 —— 记录图示 /描述判
定各菌
2,革兰氏（ Gram）染色法
1,涂片
2,初染：在做好的涂面上滴加草酸
铵结晶紫染液，染 1分钟，倾去
染液，流水冲洗至无紫色。
3,媒染：先用新配的路哥氏碘液冲
去残水，而后用其覆盖涂面 1分
钟，后水洗。
4,脱色,除去残水后，滴加 95%酒
精进行脱色约 15－ 20秒，后立即
用流水冲洗。
5,复染：滴加番红染色液，染 3－ 5
分钟，水洗后用吸水纸吸干。
6,镜检：观察染色结果并绘图。
五、实验结果
?记录所观察到的三种菌革兰氏
染色结果的差别，判断是 G－ /
G＋。绘图描述各菌形态。
六、问题与讨论
?1使用高倍镜与油镜调焦时应注
意什么？
?2革兰氏染色涂片为何不宜太浓
厚？实验关键步骤？
?3对一株未知菌进行革兰氏染色
时，怎样才能确证你的结论正确？
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！
请第一组同学留下值日
下周再见！
