实验一 普通光学显微镜
普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。
（一）显微镜的构造普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。
1、显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件
（1）镜座?镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。
（2）镜筒?镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。
从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。
（3）物镜转换器?物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。
（4）载物台? 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。
（5）推动器? 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。
（6）粗动螺旋?粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。
（7）微动螺旋? 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。
2、显微镜的光学系统显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。见图1—2。
（1）反光镜? 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。
（2）聚光器?聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明的需要。
聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8—1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。
（3）物镜? 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。
物镜的种类很多，可从不同角度来分类：
根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：
①干燥系物镜? 以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。
②油浸系物镜? 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×—100×，数值孔值大于1。
根据物镜放大率的高低，可分为：
①低倍物镜? 指1×—6×，NA值为0.04—0.15；
②中倍物镜? 指6×—25×，NA值为0.15— 0.40；
③高倍物镜? 指25×—63×，NA值为0.35—0.95；
④油浸物镜? 指90×—100×，NA值为1.25—1.40。
根据物镜像差校正的程度来分类可分为：
①消色差物镜? 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。
②复消色差物镜? 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。
③特种物镜? 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（Plan Apo）,超平场物镜（Splan，超平场复消色差物镜（Splan Apo）等。
（4）目镜?目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。
普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如要进行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。
（二）光学显微镜的成像原理显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。图1—4是显微镜的成像原理模式。AB为标本
（三）显微镜的性能显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。
1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。
数值孔径可用下式表示：
N.A=n.sin
α
2
式中：
n—物镜与标本之间的介质析射率
α—物镜的镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，见图1—5。
镜口角α总是小于180°。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05—0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。
几种物质的介质的折射率如下：
空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。
介质折射率对物镜光线通路的影响见图1—6。
2、分辨力
D可用下式表示：
D=λ/2N.A.
可见光的波长为0.4—0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。
3、放大率：
显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：
V=V1×V2
比较精确的计算方法，可从下列公式求得
M=
△
×
D
F1
F2
F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距? △=光学筒长，D=明视距离（=250毫米）
△
=接物镜的放大倍数
D
=接目镜放大倍数
M=显微镜放大倍数
F1
F2
设△=160毫米 F1=4毫米? D=250毫米? F2=150毫米则M=
△
×
D
=
160
×
250
=40×16.7=668倍
F1
F2
4
15
4、焦深：
在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。
二、显微镜的使用操作及注意事项显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。
（一）观察前的准备
1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。
2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。
3、调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。
将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。
4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。
（二）低倍镜观察? 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
（三）高倍镜观察? 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。
（四）油镜观察? 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
使用油镜按下列步骤操作：
1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。
2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。
4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。
5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。
6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
实验二 相差显微镜
（一）相差显微镜的特点 相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
（二）相差显微镜的成像原理?镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。
（三）相差显微镜的结构和装置? 相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。
1、环状光阑? 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。
2、相板? 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。
相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%—93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。
根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4λ，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效果是暗中之明。
如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿面的衍射光的相位，则被推迟了两个1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根据相消干涉原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。
负相差物镜（Negative contrast）用缩写字母“N”表示，正相差物镜（Positive? contrast）用缩写字母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如Olympus光的透过率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（High略写为H），中（Medium略写为M），低（Low略写为L）及低低（Low—Low略写成LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的相差物镜。
3、合轴调节望远镜? 是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
4、绿色滤光片?由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。
（四）相差显微镜的使用范围、操作步骤及注意事项
1、使用范围?相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。
2、操作步骤
（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。
（2）将标本片放到载物台上。
（3）进行光轴中心的调整。
（4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。
（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。
3、注意事项
（1）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。
（2）不同型号的光学部件不能互换使用。
（3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。
（4）切片不能太厚，一般以5—10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
（二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
（三）实验器材
1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）
2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油
3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜
（四）实验方法：
1、简单染色：
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。
（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）
（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。
（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
2、革兰氏染色：
（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
（2）晾干：与简单染色法相同。
（3）固定，与简单染色法相同
（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染5min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
（13）实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。
（五）实验作业给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
（六）注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验四 细菌的荚膜染色
（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：
（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。
（三）实验器材
1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。
2.染色液和试剂,Tyler法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。
3.器材,载玻片、玻片搁架,擦镜纸、显微镜等。
（四）实验方法推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。
1.负染色法：
（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。
（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。
（4）水洗：用水洗去复红染液。
（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。
（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。
结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。
2.湿墨水法
（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。
（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。
（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
3.干墨水法
（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。
（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。
（3）干燥：空气中自然干燥。
（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。
（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。
（6）染色：用甲基紫染1—2min。
（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。
（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。
4.Tyler法
（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。
（2）干燥：在空气中自然干燥。
（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。
（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。
（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。
结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。
（五）实验作业：
绘出Bacillus mucilaginosus的形态图，并注明各部位的名称
（六）注意事项
1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。
2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。
3.在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。
实验五 细菌的芽胞染色
（一）实验目的：学习细菌的芽胞染色法
（二）实验原理：细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。
（三）实验器材
1.活材料：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液[见附录二（一）6、5]。
3.器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。
（四）实验方法
1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。
（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。
（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。
结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。
2.Schaeffer与Fulton氏染色法
（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。
（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。
（3）染色：
①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。
②水洗：待玻片冷却后,用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。
③复染：用蕃红液染色5min。
（4）水洗、晾干或吸干。
（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。
结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。
（五）实验作业：
绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图。
（六）注意事项
1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。
2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。
3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。
实验六 细菌的鞭毛染色
（一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法
（二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。
（三）实验器材
1.活材料：培养12-16h的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。
2.染色液和试剂：硝酸银染色液（见附二、（一）、8）、Leifson染色液（见附二、（一—）、9）、香柏油、二甲苯。
3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。
（四）实验方法
1.镀银法染色
（1）清洗玻片? 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。
（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1—2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。
用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。
（3）染色
①滴加A液，染4—6min。
②用蒸馏水充分洗净A液。
③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5—1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。
④用蒸馏水洗，自然干燥。
（4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。
结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。
2.改良Leifson染色法
（1）清洗玻片法同1。
（2）配制染料? 见附录二（一）9。染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好。
（3）菌液的制备及涂片
①菌液的制备同1。
②用记号笔在洁净的玻片上划分3—4个相等的区域。
③放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。
④干燥? 在空气中自然干燥。
（4）染色
①加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。
②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。
③干燥：自然干燥。
（5）镜检? 先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。
结果：菌体和鞭毛均染成红色。
（五）实验作业：给出鞭毛菌的形态图
（六）注意事项
1.镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。
2.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。
3.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。
4.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。
附：细菌的运动性观察
（一）实验原理?细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。
悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。
大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。
（二）实验器材
1.活材料：培养12-16h小时的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）。
2.试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。
3.器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。
（三）实验方法：
1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。
2.涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。
3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。
4.盖凹玻片? 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。
若制水封片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。
5.镜检? 先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。
结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。
（四）实验作业：绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。
（五）注意事项
1.检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。
2.制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。
3.若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一滴。
实验七 用玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态（附插片培养法）
（一）实验目的：用放线菌的玻璃纸培养物观察放线菌的个体形态
（二）实验原理：
放线菌自然生长的个体形态的观察现多用玻璃纸琼脂透析培养法。
玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采用玻璃纸琼脂平板透析培养，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可见到放线菌自然生长的个体形态。
采用插片培养法也能观察放线菌的个体形态。
（三）实验器材：
1、活材料：培养5-7天的紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus）的斜面菌种、吸水链霉菌5102（Streptomyces hygroscopicus var.Yingchengensis(5102)）斜面菌种。
2、培养基：高氏一号琼脂培养基（见附录一、10）
器材：无菌平皿、玻璃纸,9ml无菌水若干支、酒精灯、火柴、接种环、镊子、玻璃刮铲、1ml无菌吸管、剪刀、载玻片、显微镜。
（四）实验方法：
（1）将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。
（2）将放线菌斜面菌种制成10—3的孢子悬液。
（3）将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。
（4）分别用1ml无菌吸管取0.2ml吸水链霉菌（5102）孢子悬液，紫色直丝链霉菌孢子悬液分别滴加在两个玻璃纸琼脂平板培养基上，并用无菌玻璃刮铲涂抹均匀。
（5）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。
（6）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在无菌环境下。打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜观察。
（五）实验作业
（1）绘出吸水链霉菌（5102）和紫色直丝链霉菌自然生长的个体形态图。
（2）为什么在培养基上放了玻璃纸后，放线菌仍能生长？
附：插片培养法：
放线菌的插片培养是将放线菌菌种制成孢子悬液后（浓度以10—2—10—3为好），取0.2ml放在适合放线菌生长的平板培养基上，用玻璃刮铲涂布均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置28—32℃下培养，3—5天后取出盖玻片放在载玻片上镜检，可见放线菌的自然生长的个体形态。
实验八 霉菌水浸标本片的制备与观察
（一）实验目的：学习自制水浸片观察霉菌的形态
（二）实验原理：霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。
霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。
利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。
（三）实验器材
1.活材料：在马铃薯琼脂平板上或用玻璃纸透析培养法培养3—4天的根霉（Rhizpus sp.）、青霉（Penicillum sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）；
2.染色液和试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液（附录二、（一）、10）、50%酒精（V/V）。
3.器材：剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜。
（四）实验方法
1.制水浸制片观察法? 在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片），先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。
2.玻璃纸透析培养观察法
（1）玻璃纸的选择与处理? 要选择能够允许营养物质透过的玻璃纸。也可收集商品包装用的玻璃纸，加水煮沸，然后用冷水冲洗。经此处理后的玻璃纸若变硬，必定是不可用的，只有那些软的可用。将那些可用的玻璃纸剪成适当大小，用水浸湿后，夹于旧报纸中，然后一起放入平皿内121℃灭菌30min备用。
（2）菌种的培养? 按无菌操作法，倒平板，冷凝后用灭菌的镊子夹取无菌玻璃纸贴附于平板上，再用接种环沾取少许霉菌孢子，在玻璃纸上方轻轻抖落于纸上。然后将平板置28—30℃下培养3—5天，曲霉菌和青霉菌即可在玻璃纸上长出单个菌落（根霉菌的气生性强，形成的菌落铺满整个平板）。
（3）制片与观察? 剪取玻璃纸透析法培养3—4天后长有菌丝和孢子的玻璃纸一小块，先放在50%乙醇中浸一下，洗掉脱落下来的孢子，并赶走菌体上的气泡，然后正面向上贴附于干净载玻片上，滴加1—2滴乳酸石炭酸棉蓝液，小心地盖上盖玻片（注意不要产生气泡），且不要移动盖玻片，以免搞乱菌丝。
标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小等。
（五）实验作业：
给出根霉、青霉、曲霉的个体形态图，并注明各部位名称。
实验九 微生物细胞大小测定一、实验目的
了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。
二、实验原理?
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，
图 20-1目镜测微尺
由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌种、枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。
2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。
四、实验方法
1．目镜测微尺的校正? 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图20-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm
用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
2．细胞大小的测定
(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）
(2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
（4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。
五、实验作业：
将实验结果填入下列表格表20-1 目镜测微目尺校正结果物镜 目尺格数 台尺格数 目尺校正值（μm）
10×
40×
100×
表20-2? 酵母菌大小测定记录? （格）
1? 2? 3? 4? 5? 6? 7? 8? 9? 10? 11? 12? 13? 14? 15? 平均值
长宽
表20-3 枯草杆菌大小测定记录? （格）
细胞数 1? 2? 3?4? 5? 6? 7? 8? 9? 10? 11? 12? 13? 14? 15? 平均值
长宽
结果计算? 长μm＝平均格数×校正值宽μm＝平均格数×校正值大小表示：宽μm×长μm
实验十 微生物的显微直接计数法一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中：
计数次数
每个大方格菌数
稀 释倍 数
试管斜面中的总菌数
平均值
1
2
3
4
5
第一次
第二次
实验十一 稀释平板测数法一、实验目的了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
二、实验原理
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
三、实验器材
1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）
3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。
四、实验方法
1．样品稀释液的制备? 准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。
图22-1? 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．平板接种培养? 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法? 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。
（2）涂抹平板计数法? 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中稀释度
10-7
10-8
10-9
菌落数
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1g样品活菌数
计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。
（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。
（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。
选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。
混合平板计数法：
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数涂抹平板计效法：
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数实验十二 稀释培养测数法（MPN）
一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；
稀释度 lO-3 10-410-5 lO-6 10-7 10-8
重复数 5 5 5 5 5 5
出现生长的管数 55 5 4 1 0
根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。
在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。
如某一微生物生理群稀释培养记录为：
稀释度 lO-110-2 10-3lO-4 10-510-6
重复数 4 4 4 4 4 4
出现生长的管数 4 4 3 2 1 0
以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。按照重复次数的不同，最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。
应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。对土壤样品而言，分析每个生理群的微生物需5—7个连续稀释液分别接种，微生物类群不同，其起始稀释度不同(见附表1)；二是每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果。
若要求出土样中每克干土所含的活菌数，则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数（烘干后的土样质量／原始土样的质量）。
计算式为：
三、实验器材
1,土壤样品：肥沃菜园土
2,培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养液(附录三、15)22管(每管装5ml，加1cm×4.5cm滤纸l条)
3,器材：90ml无菌水（装入250 ml三角瓶中，并装有15—20个玻璃珠）、9ml无菌水、lml刻度无菌吸管、试管架、记号笔。
四、实验方法
1．称取10克土样，放入90ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1—10-6的土壤稀释液。
2．将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上，第一纵列的4支试管上标以10-2，第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6（即采用5个稀释度，4个重复），另外2支试管留作对照。
3,用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中，再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中。对照管不加稀释液。
4．将所有试管置28—30℃培养7天后观察结果。
5．精确称取3份10克稀释用土，放入称量瓶中，置105-110℃烘2h后放入干燥器中，至恒重后称重，然后计算干土在土样中所占的质量份数。
五、实验作业：
培养7天后，取出试管，检查实验结果。
凡有固氮菌生长的试管，则培养液与滤纸接触处有黑褐色或粘液状菌膜，即为阳性，否则为阴性。对照管应为阴性。依次检查每管生长情况，将结果填入下表，计算每克干土所含的活菌数。
土壤稀释度
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
重复次数
4
4
4
4
4
固氮菌生长管数
数量指标
干土的质量分数
菌数近视值
每克干土固氮菌数
个/克干土
附表23-1 几种主要微生物生理群MPN计数法一览表微生物生理群
培养基
常用稀释度
常用重复次数
培养时间 (天)
主 要 检 查 方 法
氨化细菌
蛋白胨氨化培养基
0-6—10-9
4
7
根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。
亚硝酸细菌
铵盐培养基
0-2—10-7
3
14
根据培养液加格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ的反应，出现绛红色证明有NO-2生成；或在培养中加锌碘淀粉试剂及体积比值为20%的H2SO4，若出现蓝色，证明有NO-3生成。
硝酸细菌
亚硝酸盐培养基
0-2—10-6
3
14
根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有NO-3生成。
反硝化细菌
反硝化细菌培养基
0-4—10-8
3
14
根据杜氏小管有无气体，确定有无N2生成；利用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无NO-2生成及有无NH3存在，判断反硝化作用进行情况。
好气性自生固氮菌
阿须贝无氮培养基
0-2—10-6
3
7-14
根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性自生固氮菌生长。
好气性 纤维素分解菌
赫奇逊噬纤维培养基
0-1—10-5
3
14
根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有无好气性纤维素分解细菌的生长。
厌气性纤维素分解菌
嫌气性纤维素分解细菌培养基
0-1—10-5
3
14-21
根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤维素分解细菌的生长。
硫化细菌
硫化细菌培养基
0-2—10-8
3
21-23
在每管培养液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出现，则证明有硫化菌活动。
反硫化细菌
斯塔克反硫化细菌培养基
0-2—10-7
3
21-30
根据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。
普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。
（一）显微镜的构造普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。
1、显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件
（1）镜座?镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。
（2）镜筒?镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。
从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。
（3）物镜转换器?物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。
（4）载物台? 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。
（5）推动器? 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。
（6）粗动螺旋?粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。
（7）微动螺旋? 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。
2、显微镜的光学系统显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。见图1—2。
（1）反光镜? 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。
（2）聚光器?聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明的需要。
聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8—1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。
（3）物镜? 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。
物镜的种类很多，可从不同角度来分类：
根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：
①干燥系物镜? 以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。
②油浸系物镜? 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×—100×，数值孔值大于1。
根据物镜放大率的高低，可分为：
①低倍物镜? 指1×—6×，NA值为0.04—0.15；
②中倍物镜? 指6×—25×，NA值为0.15— 0.40；
③高倍物镜? 指25×—63×，NA值为0.35—0.95；
④油浸物镜? 指90×—100×，NA值为1.25—1.40。
根据物镜像差校正的程度来分类可分为：
①消色差物镜? 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。
②复消色差物镜? 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。
③特种物镜? 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（Plan Apo）,超平场物镜（Splan，超平场复消色差物镜（Splan Apo）等。
（4）目镜?目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。
普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如要进行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。
（二）光学显微镜的成像原理显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。图1—4是显微镜的成像原理模式。AB为标本
（三）显微镜的性能显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。
1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。
数值孔径可用下式表示：
N.A=n.sin
α
2
式中：
n—物镜与标本之间的介质析射率
α—物镜的镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，见图1—5。
镜口角α总是小于180°。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05—0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。
几种物质的介质的折射率如下：
空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。
介质折射率对物镜光线通路的影响见图1—6。
2、分辨力
D可用下式表示：
D=λ/2N.A.
可见光的波长为0.4—0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。
3、放大率：
显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：
V=V1×V2
比较精确的计算方法，可从下列公式求得
M=
△
×
D
F1
F2
F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距? △=光学筒长，D=明视距离（=250毫米）
△
=接物镜的放大倍数
D
=接目镜放大倍数
M=显微镜放大倍数
F1
F2
设△=160毫米 F1=4毫米? D=250毫米? F2=150毫米则M=
△
×
D
=
160
×
250
=40×16.7=668倍
F1
F2
4
15
4、焦深：
在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。
二、显微镜的使用操作及注意事项显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。
（一）观察前的准备
1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。
2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。
3、调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。
将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。
4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。
（二）低倍镜观察? 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
（三）高倍镜观察? 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。
（四）油镜观察? 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
使用油镜按下列步骤操作：
1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。
2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。
4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。
5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。
6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
实验二 相差显微镜
（一）相差显微镜的特点 相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
（二）相差显微镜的成像原理?镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。
（三）相差显微镜的结构和装置? 相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。
1、环状光阑? 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。
2、相板? 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。
相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%—93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。
根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4λ，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效果是暗中之明。
如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿面的衍射光的相位，则被推迟了两个1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根据相消干涉原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。
负相差物镜（Negative contrast）用缩写字母“N”表示，正相差物镜（Positive? contrast）用缩写字母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如Olympus光的透过率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（High略写为H），中（Medium略写为M），低（Low略写为L）及低低（Low—Low略写成LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的相差物镜。
3、合轴调节望远镜? 是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
4、绿色滤光片?由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。
（四）相差显微镜的使用范围、操作步骤及注意事项
1、使用范围?相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。
2、操作步骤
（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。
（2）将标本片放到载物台上。
（3）进行光轴中心的调整。
（4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。
（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。
3、注意事项
（1）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。
（2）不同型号的光学部件不能互换使用。
（3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。
（4）切片不能太厚，一般以5—10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
（二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
（三）实验器材
1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）
2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油
3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜
（四）实验方法：
1、简单染色：
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。
（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）
（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。
（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
2、革兰氏染色：
（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
（2）晾干：与简单染色法相同。
（3）固定，与简单染色法相同
（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染5min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
（13）实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。
（五）实验作业给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
（六）注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验四 细菌的荚膜染色
（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：
（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。
（三）实验器材
1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。
2.染色液和试剂,Tyler法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。
3.器材,载玻片、玻片搁架,擦镜纸、显微镜等。
（四）实验方法推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。
1.负染色法：
（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。
（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。
（4）水洗：用水洗去复红染液。
（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。
（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。
结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。
2.湿墨水法
（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。
（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。
（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
3.干墨水法
（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。
（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。
（3）干燥：空气中自然干燥。
（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。
（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。
（6）染色：用甲基紫染1—2min。
（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。
（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。
4.Tyler法
（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。
（2）干燥：在空气中自然干燥。
（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。
（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。
（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。
结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。
（五）实验作业：
绘出Bacillus mucilaginosus的形态图，并注明各部位的名称
（六）注意事项
1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。
2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。
3.在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。
实验五 细菌的芽胞染色
（一）实验目的：学习细菌的芽胞染色法
（二）实验原理：细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。
（三）实验器材
1.活材料：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液[见附录二（一）6、5]。
3.器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。
（四）实验方法
1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。
（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。
（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。
结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。
2.Schaeffer与Fulton氏染色法
（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。
（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。
（3）染色：
①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。
②水洗：待玻片冷却后,用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。
③复染：用蕃红液染色5min。
（4）水洗、晾干或吸干。
（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。
结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。
（五）实验作业：
绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图。
（六）注意事项
1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。
2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。
3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。
实验六 细菌的鞭毛染色
（一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法
（二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。
（三）实验器材
1.活材料：培养12-16h的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。
2.染色液和试剂：硝酸银染色液（见附二、（一）、8）、Leifson染色液（见附二、（一—）、9）、香柏油、二甲苯。
3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。
（四）实验方法
1.镀银法染色
（1）清洗玻片? 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。
（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1—2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。
用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。
（3）染色
①滴加A液，染4—6min。
②用蒸馏水充分洗净A液。
③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5—1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。
④用蒸馏水洗，自然干燥。
（4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。
结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。
2.改良Leifson染色法
（1）清洗玻片法同1。
（2）配制染料? 见附录二（一）9。染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好。
（3）菌液的制备及涂片
①菌液的制备同1。
②用记号笔在洁净的玻片上划分3—4个相等的区域。
③放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。
④干燥? 在空气中自然干燥。
（4）染色
①加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。
②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。
③干燥：自然干燥。
（5）镜检? 先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。
结果：菌体和鞭毛均染成红色。
（五）实验作业：给出鞭毛菌的形态图
（六）注意事项
1.镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。
2.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。
3.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。
4.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。
附：细菌的运动性观察
（一）实验原理?细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。
悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。
大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。
（二）实验器材
1.活材料：培养12-16h小时的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）。
2.试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。
3.器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。
（三）实验方法：
1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。
2.涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。
3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。
4.盖凹玻片? 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。
若制水封片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。
5.镜检? 先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。
结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。
（四）实验作业：绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。
（五）注意事项
1.检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。
2.制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。
3.若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一滴。
实验七 用玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态（附插片培养法）
（一）实验目的：用放线菌的玻璃纸培养物观察放线菌的个体形态
（二）实验原理：
放线菌自然生长的个体形态的观察现多用玻璃纸琼脂透析培养法。
玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采用玻璃纸琼脂平板透析培养，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可见到放线菌自然生长的个体形态。
采用插片培养法也能观察放线菌的个体形态。
（三）实验器材：
1、活材料：培养5-7天的紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus）的斜面菌种、吸水链霉菌5102（Streptomyces hygroscopicus var.Yingchengensis(5102)）斜面菌种。
2、培养基：高氏一号琼脂培养基（见附录一、10）
器材：无菌平皿、玻璃纸,9ml无菌水若干支、酒精灯、火柴、接种环、镊子、玻璃刮铲、1ml无菌吸管、剪刀、载玻片、显微镜。
（四）实验方法：
（1）将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。
（2）将放线菌斜面菌种制成10—3的孢子悬液。
（3）将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。
（4）分别用1ml无菌吸管取0.2ml吸水链霉菌（5102）孢子悬液，紫色直丝链霉菌孢子悬液分别滴加在两个玻璃纸琼脂平板培养基上，并用无菌玻璃刮铲涂抹均匀。
（5）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。
（6）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在无菌环境下。打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜观察。
（五）实验作业
（1）绘出吸水链霉菌（5102）和紫色直丝链霉菌自然生长的个体形态图。
（2）为什么在培养基上放了玻璃纸后，放线菌仍能生长？
附：插片培养法：
放线菌的插片培养是将放线菌菌种制成孢子悬液后（浓度以10—2—10—3为好），取0.2ml放在适合放线菌生长的平板培养基上，用玻璃刮铲涂布均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置28—32℃下培养，3—5天后取出盖玻片放在载玻片上镜检，可见放线菌的自然生长的个体形态。
实验八 霉菌水浸标本片的制备与观察
（一）实验目的：学习自制水浸片观察霉菌的形态
（二）实验原理：霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。
霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。
利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。
（三）实验器材
1.活材料：在马铃薯琼脂平板上或用玻璃纸透析培养法培养3—4天的根霉（Rhizpus sp.）、青霉（Penicillum sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）；
2.染色液和试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液（附录二、（一）、10）、50%酒精（V/V）。
3.器材：剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜。
（四）实验方法
1.制水浸制片观察法? 在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片），先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。
2.玻璃纸透析培养观察法
（1）玻璃纸的选择与处理? 要选择能够允许营养物质透过的玻璃纸。也可收集商品包装用的玻璃纸，加水煮沸，然后用冷水冲洗。经此处理后的玻璃纸若变硬，必定是不可用的，只有那些软的可用。将那些可用的玻璃纸剪成适当大小，用水浸湿后，夹于旧报纸中，然后一起放入平皿内121℃灭菌30min备用。
（2）菌种的培养? 按无菌操作法，倒平板，冷凝后用灭菌的镊子夹取无菌玻璃纸贴附于平板上，再用接种环沾取少许霉菌孢子，在玻璃纸上方轻轻抖落于纸上。然后将平板置28—30℃下培养3—5天，曲霉菌和青霉菌即可在玻璃纸上长出单个菌落（根霉菌的气生性强，形成的菌落铺满整个平板）。
（3）制片与观察? 剪取玻璃纸透析法培养3—4天后长有菌丝和孢子的玻璃纸一小块，先放在50%乙醇中浸一下，洗掉脱落下来的孢子，并赶走菌体上的气泡，然后正面向上贴附于干净载玻片上，滴加1—2滴乳酸石炭酸棉蓝液，小心地盖上盖玻片（注意不要产生气泡），且不要移动盖玻片，以免搞乱菌丝。
标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小等。
（五）实验作业：
给出根霉、青霉、曲霉的个体形态图，并注明各部位名称。
实验九 微生物细胞大小测定一、实验目的
了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。
二、实验原理?
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，
图 20-1目镜测微尺
由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌种、枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。
2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。
四、实验方法
1．目镜测微尺的校正? 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图20-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm
用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
2．细胞大小的测定
(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）
(2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
（4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。
五、实验作业：
将实验结果填入下列表格表20-1 目镜测微目尺校正结果物镜 目尺格数 台尺格数 目尺校正值（μm）
10×
40×
100×
表20-2? 酵母菌大小测定记录? （格）
1? 2? 3? 4? 5? 6? 7? 8? 9? 10? 11? 12? 13? 14? 15? 平均值
长宽
表20-3 枯草杆菌大小测定记录? （格）
细胞数 1? 2? 3?4? 5? 6? 7? 8? 9? 10? 11? 12? 13? 14? 15? 平均值
长宽
结果计算? 长μm＝平均格数×校正值宽μm＝平均格数×校正值大小表示：宽μm×长μm
实验十 微生物的显微直接计数法一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中：
计数次数
每个大方格菌数
稀 释倍 数
试管斜面中的总菌数
平均值
1
2
3
4
5
第一次
第二次
实验十一 稀释平板测数法一、实验目的了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
二、实验原理
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
三、实验器材
1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）
3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。
四、实验方法
1．样品稀释液的制备? 准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。
图22-1? 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．平板接种培养? 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法? 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。
（2）涂抹平板计数法? 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中稀释度
10-7
10-8
10-9
菌落数
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1g样品活菌数
计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。
（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。
（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。
选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。
混合平板计数法：
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数涂抹平板计效法：
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数实验十二 稀释培养测数法（MPN）
一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；
稀释度 lO-3 10-410-5 lO-6 10-7 10-8
重复数 5 5 5 5 5 5
出现生长的管数 55 5 4 1 0
根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。
在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。
如某一微生物生理群稀释培养记录为：
稀释度 lO-110-2 10-3lO-4 10-510-6
重复数 4 4 4 4 4 4
出现生长的管数 4 4 3 2 1 0
以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。按照重复次数的不同，最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。
应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。对土壤样品而言，分析每个生理群的微生物需5—7个连续稀释液分别接种，微生物类群不同，其起始稀释度不同(见附表1)；二是每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果。
若要求出土样中每克干土所含的活菌数，则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数（烘干后的土样质量／原始土样的质量）。
计算式为：
三、实验器材
1,土壤样品：肥沃菜园土
2,培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养液(附录三、15)22管(每管装5ml，加1cm×4.5cm滤纸l条)
3,器材：90ml无菌水（装入250 ml三角瓶中，并装有15—20个玻璃珠）、9ml无菌水、lml刻度无菌吸管、试管架、记号笔。
四、实验方法
1．称取10克土样，放入90ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1—10-6的土壤稀释液。
2．将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上，第一纵列的4支试管上标以10-2，第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6（即采用5个稀释度，4个重复），另外2支试管留作对照。
3,用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中，再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中。对照管不加稀释液。
4．将所有试管置28—30℃培养7天后观察结果。
5．精确称取3份10克稀释用土，放入称量瓶中，置105-110℃烘2h后放入干燥器中，至恒重后称重，然后计算干土在土样中所占的质量份数。
五、实验作业：
培养7天后，取出试管，检查实验结果。
凡有固氮菌生长的试管，则培养液与滤纸接触处有黑褐色或粘液状菌膜，即为阳性，否则为阴性。对照管应为阴性。依次检查每管生长情况，将结果填入下表，计算每克干土所含的活菌数。
土壤稀释度
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
重复次数
4
4
4
4
4
固氮菌生长管数
数量指标
干土的质量分数
菌数近视值
每克干土固氮菌数
个/克干土
附表23-1 几种主要微生物生理群MPN计数法一览表微生物生理群
培养基
常用稀释度
常用重复次数
培养时间 (天)
主 要 检 查 方 法
氨化细菌
蛋白胨氨化培养基
0-6—10-9
4
7
根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。
亚硝酸细菌
铵盐培养基
0-2—10-7
3
14
根据培养液加格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ的反应，出现绛红色证明有NO-2生成；或在培养中加锌碘淀粉试剂及体积比值为20%的H2SO4，若出现蓝色，证明有NO-3生成。
硝酸细菌
亚硝酸盐培养基
0-2—10-6
3
14
根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有NO-3生成。
反硝化细菌
反硝化细菌培养基
0-4—10-8
3
14
根据杜氏小管有无气体，确定有无N2生成；利用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无NO-2生成及有无NH3存在，判断反硝化作用进行情况。
好气性自生固氮菌
阿须贝无氮培养基
0-2—10-6
3
7-14
根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性自生固氮菌生长。
好气性 纤维素分解菌
赫奇逊噬纤维培养基
0-1—10-5
3
14
根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有无好气性纤维素分解细菌的生长。
厌气性纤维素分解菌
嫌气性纤维素分解细菌培养基
0-1—10-5
3
14-21
根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤维素分解细菌的生长。
硫化细菌
硫化细菌培养基
0-2—10-8
3
21-23
在每管培养液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出现，则证明有硫化菌活动。
反硫化细菌
斯塔克反硫化细菌培养基
0-2—10-7
3
21-30
根据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。
