第四章 药物定量分析与分析方法验证（不讲） [教学目的] 掌握定量分析方法验证的效能指标。 熟悉定量分析样品的前处理方法。 了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用。 [本章分配学时数] 4学时 [教学环节与教学内容] [复习引入] 2分钟 在上一章里，我们介绍了药物杂质检查的相关内容，其中包括11种一般杂质的检查方法以及以药物和杂质在物化性质上的差异为基础的特殊杂质的检查方法，另外我们还重点要求同学们着重掌握一些与药物杂质检查相关的概念。通过上一章的学习，同学们应该掌握了一般杂质检查的原理、方法和计算，并熟悉了特殊杂质检查的方法和原理。那么，在下一章里，同学们将会接触到药物分析基础知识的第三大部分，即药物定量分析与分析方法验证。通过本章的学习，同学们应该掌握定量分析方法验证的效能指标，熟悉定量分析样品的前处理方法，了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用。 [教授新课] 定量分析样品的前处理方法 概述 含金属或卤素的药物，如葡萄糖酸锑钠，硬脂酸镁，碘苯酯，磺溴肽钠等，在分析前需要经过不同方法处理后，方可进行测定。 处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪酸的碳原子相连接，则结合不牢固。 而含金属的有机药物，有两种情况：一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机药物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固，在水溶液中即可理解出金属离子，若有机结构部分不干扰分析时，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量测定；二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比较牢，称为有机金属药物，在溶液中其金属一般不能解离成离子状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。 不经有机破坏的分析方法 直接测定法 凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C-M（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方法进行测定。例如富马酸亚铁的含量测定，可用硫酸铈标准溶液直接进行滴定。 经水解后测定法 直接回流后测定法 本法是将含卤素的有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加NaOH溶液或AgNO3溶液后，加热回流使其水解，将有机结合的卤素经水解作用转变为无机的卤素离子，然后选用间接银量法进行测定。本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物，如卤素和脂肪酸链相连者。 例如：三氯叔丁醇的含量测定（银量法） 本品在NaOH溶液中加热回流使分解产生NaCl，与AgNO3生成AgCl沉淀，过量的AgNO3用硫氰酸铵液回滴定。   用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁含量测定 硬脂酸镁，与定量硫酸液共沸、水解生成硬脂酸和MgSO4，剩余的酸以NaOH液滴定。   经氧化还原后测定法 碱性还原后测定法 卤素结合于芳环上时，由于分子中碘的结合较牢固，需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流，使碳－碘键断裂，形成无机碘化物后测定。 例如：泛影酸含量测定（银量法）  酸性还原后测定法 例如：碘番酸含量测定 碘番酸在醋酸酸性条件下用锌粉还原，使碳－碘键断裂，形成无机碘化物后用银量法测定。 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（间接碘量法） 含锑药物 利用五价锑有机药物中可游离的Sb5＋的氧化性，在酸性液中氧化碘化钾，并定量析出碘，可用硫代硫酸钠滴定液滴定（如：葡萄糖酸锑钠的含量测定）。   含铁药物 将含铁药物加酸溶解后，便游离出Fe3＋，利用Fe3＋在酸性溶液中氧化碘化钾，析出的碘可用硫代硫酸钠滴定液滴定以测定含量。 经有机破坏的分析方法 条件：含金属有机药物及有机卤素药物结构中的金属原子、卤素与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原后测定方法难以将有机结合的金属原子及卤素转变为无机的金属化合物及卤素化合物。 湿法破坏 硝酸－高氯酸法 本法破坏能力强，反应比较强烈。故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的内容物蒸干，以免发生爆炸。 本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏。经本法破坏后，所得的无机金属离子，一般为高价态。本法对含氮杂环药物的破坏不够完全，此时宜选用干法烧灼进行破坏。 硝酸－硫酸法 本法适用于大多数有机物质的破坏，如燃料、中间体或药物等。经本法破坏分解所得的无机金属离子均为高价态。 因碱土金属可与硫酸形成不溶性的硫酸盐，将会吸附被测定的金属离子，使测定的结果偏低。所以本法不适用于含碱土金属有机药物的破坏。此时，可改用硝酸－高氯酸法进行破坏、 硫酸－硫酸盐法 本法所用硫酸盐为硫酸钾或硫酸钠，因硫酸钠为含水化合物，不利于有机破坏，故一般多采用硫酸钾。加入硫酸盐的目的，是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏完全。同时，也防止硫酸在加热过程中过早地分解为三氧化硫而损失。 经本法破坏分解所得的金属离子，多为低价态。本法常用于含砷或锑有机药物的破坏分解。因在有机物破坏时须经炭化过程，最后得到低价态的三价砷或锑离子。如用本法破坏低碳化合物时，宜添加适量的淀粉等多碳化合物，以保证在破坏过程中，经炭化，将金属离子都转变为低价态。 其它湿法 硝酸－硫酸－高氯酸法、硫酸－过氧化氢法、硫酸－高锰酸钾法等，其根据都是增加氧化剂。 注： 湿法破坏所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏烧瓶； 所用试剂及蒸馏水均不应含有被测金属离子或干扰测定的其它金属离子等组分； 由于整个操作过程所用矿酸量数倍于样品，所以必须按相同条件进行空白试验校正； 操作时应在通风櫉内进行。 干法破坏 本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品置于瓷坩埚或镍坩埚、铂坩埚中，常加无水碳酸钠或轻质氧化镁等以助灰化，混合均匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全，即可。 应注意的问题 加热或灼烧时，应控制温度在420℃以下，以防止某些被测金属化合物的挥发。 灰化完全与否，直接影响测定结果的准确性。 经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。 本法适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂环类有机药物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏。 氧瓶燃烧法 氧瓶燃烧法（oxygen flask combustion method）是将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别，检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素的有机药物。 本法是快速分解有机物的简单方法，它不需要复杂设备，就能够使有机化合物中的待测元素定量分解成离子型。 该方法的详细介绍及举例请参阅教材P67~69。 定量分析方法特点 容量分析法 容量分析法是将已知浓度的滴定液（中国药典中称滴定液）由滴定管滴加到待测药物的溶液中，直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，就可以计算出被测药物的含量。 容量分析的关键问题是如何确定等当点。 当滴定液与被测药物完全作用时，反应达到了化学计量点即等当点，在进行容量分析时，都希望在等当点时停止滴定。 在等当点时，常常没有任何外观现象的变化，为此必须借助指示剂的变色来确定滴定终点。 滴定终点与等当点不一定恰好符合，二者之间的误差称为滴定误差。这是容量分析误差的来源之一，为了减少滴定误差，就需要选择合适的指示剂，使滴定终点尽可能接近等当点。 容量分析通常用于测定高含量或中含量组分，即被测组分的含量在1％以上。容量分析法比较准确，一般情况下相对误差可达0.2％以下。 容量分析法操作简便、快速、比较准确，所用仪器普通易得，在药品检验工作中具有很大的实用价值。 容量分析法的计算问题 滴定度 指每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量。中国药典用毫克（mg）表示。 滴定度（T）的计算 在容量分析中，被测药物（B）与滴定液（A）之间都按一定的摩尔比进行反应，反应可表示为：  滴定度（T）可按下式计算：  M－滴定液的摩尔浓度 b－被测药物的摩尔数 a－滴定液的摩尔数 B－被测药物的毫摩尔质量（分子量） 百分含量计算 在测定药物含量时，常用直接滴定法和回滴定法，其计算方法如下： 直接滴定法 此法是用滴定液直接滴定，以求得被测药物的含量。  T－滴定度值 W－供试品取量 V－消耗滴定液的体积 在实际工作中，所配制的滴定液的摩尔浓度与药典中规定的摩尔浓度不一定恰好符合，此时就不能直接应用药典上所给出的滴定度（T），但只要乘以滴定液浓度校正因数（F）即可换算成实际的滴定度（T’），即  式中  于是，被测药物的百分含量可由下式求得：   在学习过程中应注意记忆滴定液与被测药物在反应中的摩尔比，即反应式中a与b的数值。只有这样，才能正确计算滴定液和百分含量。 回滴定法（剩余滴定法） 此法是先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应，待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A。 不做空白试验时百分含量计算方法  VA－先加入的定量过量的滴定液A体积 VB－滴定液B消耗体积 FA－滴定液A浓度校正因数 FB－滴定液B浓度校正因数 W－供试品取量 T－滴定度 做空白试验的百分含量计算方法  V0－空白试验消耗硫酸滴定液体积 VB－样品测定试验消耗滴定液体积 T－滴定度 F－滴定液浓度校正因数 W－供试品取样量（g） 光谱分析法 当物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁。记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得的图谱称为光谱，利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法，简称光谱法。如紫外－可见分光光度法、荧光分析法、原子吸收分光光度法和红外分光光度法等。 紫外－可见分光光度法 特点 紫外－可见分光光度法是根据物质分子对波长为200nm～760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的光谱分析方法。主要特点如下： 灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml。 准确度高，相对误差为2％～5％。 仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。 应用广泛。许多化合物都可以采用此法进行测定，同时，还可以应用计算分光光度法不经分离而直接测定混合物中各组分的含量。 朗伯－比耳定律 仪器校正和检定 对溶剂的要求 测定法 详见教材P72～74 对照品比较法 吸收系数法 计算分光光度法 荧光分析法 特点 某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。当激发光停止照射后，荧光随之消失。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可以发射相同波长的荧光。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度（也叫发射光强度）与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。本法特点为： 灵敏度高，荧光分析法的灵敏度一般较紫外－可见分光光度法为高，其灵敏度可达10-10g/ml～10-12g/ml。 浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使荧光强度下降，导致荧光强度与浓度不成正比，因此，荧光分析法应在低浓度溶液中进行。 荧光分析法因灵敏度高，故干扰因数也多，因此必须做空白试验。 对易被光分解的样品，为使仪器灵敏度定标准确避免因激发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。在测定供试品溶液时用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。 能产生荧光的物质数量不多，但如果采用荧光衍生试剂，常使无荧光或弱荧光物质得到强荧光性产物，从而提高了分析方法的灵敏度和选择性，更扩大了荧光分析法的应用范围。 取样少，方法快速，在药物分析领域中是重要的分析手段之一。 荧光分析仪（详见教材P74） 含量测定（详见教材P74～75） 色谱分析法 色谱分析法（又称层析法）根据其分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱。 又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 色谱分析法是一种分离分析方法，它先将各组分从混合物中分离再逐个分析，因此是分析混合物的最有力手段。此法具有高灵敏度（可达10-12g/ml～10-15g/ml）、高选择性、高效能、高速度及应用广泛等特点。 高效液相色谱法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 对仪器的一般要求（见教材P75～76） 系统适用性试验（见教材P76～77） 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 色谱柱的理论板数（n） 分离度 重复性 拖尾因子 测定法（见教材P77～78） 定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定供试品中主成分含量时，常用下面两种方法： 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 外标法测定供试品中主成分含量 标准曲线法 外标一点法 气相色谱法、 气相色谱法的流动相为气体，称为载气；色谱柱分为填充柱和毛细管柱两种，填充柱内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体。毛细管柱内壁或载体经涂渍或交联固定液。注入进样口的供试品被加热气化，并被载气带入色谱柱，在柱内各成分被分离后，先后进入检测器，色谱信号用记录仪或数据处理器记录。 对仪器的一般要求 所用的仪器为气相色谱仪。除另有规定外，载气为氮气；色谱柱为填充柱或毛细管柱，填充柱的材质为不锈钢或玻璃，载体用直径为0.25mm～0.18mm、0,18mm～0.15mm或0.15mm～0.125mm经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球；常用玻璃或弹性石英毛细管柱的内径为0.20mm或0.32mm。进样口温度应高于柱温30℃～50℃；进样量一般不超过数微升；柱径越细进样量越少。检测器为氢火焰离子化检测器，检测温度一般高于柱温，并不得低于100℃，以免水气凝结，通常为250℃～350℃。 系统适用性试验（同高效液相色谱法项下规定） 测定法（同高效液相色谱法项下规定） 药品质量标准分析方法验证 药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求，在起草药品质量标准时，分析方法需经验证；在药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。 需验证的分析项目有：鉴别试验，杂质定量或限度检查，原料药或制剂中有效成分含量测定以及制剂中其它成分（如降解产物、防腐剂等）的测定。药品溶出度、释放度等功能检查中，其溶出量等测试方法也应作必要验证。 验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。 准确度 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（％）表示。准确度应在规定的范围内建立。 含量测定方法的准确度 原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。 制剂的含量测定 要考查辅料对回收率是否有影响。采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收率试验及计算相对标准误差（RSD），还应作单独辅料的空白测定，每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三份，共提供9个数据进行评价。回收率的RSD一般应在2％以内。用UV和HPLC法时，一般回收率可达到98％～102％。容量分析法的回收率一般可达到99.7％～100.3％。回收率计算可按下式：  如该法已建立了精密度、线性和专属性，准确度有时也能推算出来，不必再做。 数据要求 在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，例如制备3个不同浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率（％），或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。 精密度 精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。含量测定和杂质定量测定考虑方法的精密度。 精密度表示方法 偏差（deviation，d）  相对误差（relative deviation，RD）：  若两份平行操作，设A、B为两次测得值，则其相对偏差为：  最大相对偏差：相对偏差用来表示测定结果的精密度，根据对分析工作的要求不同而制订的最大值（也称“允许差”）。 一般，各种含量测定的允许差如下：容量分析法为0.3％；重量分析法为0.5％；凯氏定氮法为1％；氧瓶燃烧法为0.5％；仪器分析法为3％。 标准偏差（Standard deviation，SD或S）  相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）也称变异系数（coefficient of variation，CV）  容量分析法用原料药精制品考查方法的精密度，平行试验5个样本，试验数据的RSD一般应不大于0.2％；UV法用适当浓度的精制品进行测定精密度，其RSD一般不大于1％（n＝3～5）；而HPLC法则要求RSD小于2％（n＝3～5），其做法同UV法。 重复性、中间精密度及重现性 重复性 在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。 在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，如制备3个不同浓度的样品，各测定3次，或把被测物浓度当作100％，用至少测定6次的结果进行评价。 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。 为考查随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同提起、不同分析人员、不同设备。 重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。 当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。 数据要求 均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。 专属性 专属性是指在其它成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考查其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。 鉴别反应 应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，不含被测成分的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。 含量测定和杂质测定 色谱法和其它分离方法，应附代表性图谱，以说明专属性。图中应标明诸成分的位置，色谱法中的分离度应符合要求。 在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考查测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果，对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考查杂质能否得到分离。 在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的或药典方法比较结果，用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解，或氧化的方法进行加速破坏，以研究降解产物。含量测定方法应比对二法的结果，杂质测定应比对检出的杂质个数，必要时可采用光二极管阵列检测和质谱检测，进行纯度检查。 检测限 检测限（limit of detection，LOD）是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标，即反映方法与仪器的灵敏度或噪音的大小，也表明样品经处理后空白（本底）值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。根据所采用的分析方法来确定检测限。 常用的方法 非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度和量。 仪器分析时的测定法 当用紫外分光光度法和荧光分析法时 可做多次空白试验，求得其背景响应值的标准偏差，再将3倍空白标准偏差作为检测限的估计算。为使计算得到的LOD值与实际测得的LOD值相一致，可应用校正系数来校正，如紫外分光光度法： 荧光分析： 然后根据LOD的校正值制备几份检测限浓度附近的样品溶液分别测定，最后确定LOD值。 当用GC法和HPLC法时 可用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以S/N=2或S/N=3时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。 数据要求 应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。 定量限 定量限（limit of quantitation，LOQ）是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 线性 线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比系的程度。 如UV法：要求浓度点为 n = 5；吸收度A一般在0.3～0.7；相关系数r>0.9999。 如HPLC法：要求浓度点为 n = 5～7；相关系数r>0.9999。 范围 范围是指能达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限浓度或量的空间。 耐用性 耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。 生物样品分析方法的基本要求 在测定生物样品中药物及其代谢物时，样品的前处理是十分重要的。除了少数情况，将体液经简单处理后进行直接测定外，一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。 常用样品的种类、采集和贮藏 生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液。 血样 血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶细胞）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。 供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。对于病人，通常采取静脉血，有时根据血药浓度和分析方法灵敏度，也可用毛细管采血。由采集的血液制取血浆或血清。 血浆的取得是在加肝素、构椽酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，其量约为全血量的一半。实际工作中制备血浆时最常用的抗凝剂为肝素，它是一种含硫酸盐的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般lml的全血需加0.1～0.2mg的肝素，加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。 血清则是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，经离心其量约为全血量的30％～50％。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时，血凝过程较慢，可将血液置37℃温度下加速血清析出。 全血也应加入抗凝剂混匀，防止凝血后影响测定。对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据。由于全血的净化较血浆和血清麻烦，特别是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。 采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即测定时，应妥善储存。短期保存时置冰箱（4℃），长期保存时要在冷冻櫉（库）（-20℃）中冷冻保存。 唾液 唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的，平时所说的唾液就是指此混合液。一般成人每天分泌1L～1.5L，但个体差异大，即使是同一个人每日之内也有变动；各腺体分泌的唾液组成也会有很大差异。此外还受有无刺激、刺激类型、强度、持续时间、年龄、性别、疾病与药物等因素的影响。 唾液的相对密度为1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。 唾液的采集应尽可能在刺激少的安静状态下进行。一把在漱口后15min收集。分泌量多的，可以将自然贮存于口腔内的唾液吐入试管中，1min内大约可取1ml的唾液。必要时也可转动舌尖，以促进唾液的分泌。采集的时间要10min。采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及乳白色沉淀部分三层。分层后，以3000r/min离心分离10min，取上清液作为药物浓度测定的样品。 也可以采用物理的（如嚼石蜡块、橡胶、海绵）或化学的（如酒石酸）等方法刺激，使在短时间内得到大量的唾液。 唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。 用唾液作为样品测定药物浓度的几个优点 与采取血样不同，患者制剂可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集； 采集时无痛苦无危险； 有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。 缺点 由于唾液是由腮腺、颌下腺及舌下腺等各腺体分泌的组成不同的混合液体，其组成也会发生经时变动； 唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比容易变动； 唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值（S/P）只有少数药物是恒定值； 有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低很多，需要高灵敏度的分析方法才能检测； 对有些患者（如癫痫、昏迷）不能采集唾液样品。 尿液 采用尿样测定药物浓度的目的与血液、唾液样品不同。 尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型（代谢速率，MR）等。 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugates）等形式排出。尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，收集也方便。但尿液浓度通常变化较大。 尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类 健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色，成人一日排尿量为1L～5L，尿液相对密度1.015～1.020，pH值在4.8～8.0之间。放置后会析出盐类，并有细菌繁殖、固体成分的崩解，因而使尿液混浊。由于这些原因，必须加入防腐剂保存。 采集的尿是自然排尿 尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。测定尿中药物浓度时应采用时间尿，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。（见教材P86） 尿样的缺点 尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性差； 受试者的肾功能正常与否直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采集尿样； 婴儿的排尿时间难于掌握； 尿液不易采集完全并不易保存。 采集的尿样应立即测定 若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯、二甲苯、氯仿、麝香草酚以及醋酸、浓盐酸等。利用甲苯等可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性来抑制细菌的生长。保存时间为24h～36h，可置冰箱（4℃）中；长时间保存时，应冰冻（－20℃）。 生物样品分析前处理技术 生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。 样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。（举例见教材P86～87） 根据被测定药物的结构、理化性质及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。（举例见教材P87） 样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。（举例见教材P87） 去除蛋白质 在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限 加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。 加入中性盐 加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。 酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不仅可使组织酶解，并可使药物析出。 缀合物的水解（见教材P88～89） 分离、纯化与浓集 液－液提取法（liquid－liquid extraction，LLE） 见教材P89～90 液－固提取法（liquid－solid extraction，LSE） 见教材P90～91 被测组分的浓集 见教材P91 化学衍生化 目的 使药物变成具有能被分离的性质； 提高检测的灵敏度； 增强药物的稳定性； 提高对光学异构体的能力。 药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含－COOH、－OH、－NH2、－NH－、－SH等官能团的药物都可被衍生化。 GC中化学衍生化法 见教材P92 HPLC中化学衍生化法 见教材P92 定量分析方法验证 由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质的干扰（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素影响生物样品测定，为了保证方法的可靠性，必须建立生物样品分析方法，并对方法进行验证。 特异性 标准曲线与线性范围 精密度与准确度 最低定量限 样品稳定性 见教材P92～93 提取回收率 质控样品 质量控制 [新课小结] 定量分析样品的前处理方法 不经有机破坏的分析方法 直接测定法、经水解后测定法、经氧化还原后测定法 经有机破坏的分析方法 湿法破坏、干法破坏、氧瓶燃烧法 定量分析方法的特点 容量分析法、光谱分析法（紫外－可见分光光度法、荧光分析法）、色谱分析法（高效液相色谱法、气相色谱法） 药品质量标准分析方法验证 生物样品分析方法的基本要求 血样、唾液、尿液等常用样品的采集和贮藏 生物样品分析前处理技术 去除蛋白质，缀合物的水解，分离、纯化与浓集，化学衍生化 定量分析方法验证 概念 氧瓶燃烧法、滴定度、光谱、光谱法、高效液相色谱法、准确度、精密度、重复性、中间精密度、重现性、专属性、检测限、定量限、线性、范围、耐用性 [作业] 一、掌握定量分析方法验证的效能指标 二、熟悉定量分析样品的前处理方法 三、牢记相关概念 [练习题与答案] [A型题] 药品的鉴别是证明 A．未知药物的真伪 B．已知药物的真伪 C．已知药物的疗效 D．药物的纯度 E．药物的稳定性 2．相对标准差表示的应是 A．准确度 B．回收率 C．精密度 D．纯净度 E．限度 3．用移液管量取的25ml溶液，应记成 A．25ml B．25.0ml C．25.00ml D．25.000ml E．25±1ml 4．以下三个数字0.5362、0.0014、0.25之和应为 A．0.79 B．0.788 C．0.787 D．0.7876 E．0.8 5．表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用 A．相关规律 B．比例常数 C．相关常数 D．相关系数 E．精密度 6．减小偶然误差的方法是 A．做空白试验 B．做对照实验 C．做回收试验 D．增加平行测定次数 E．选用多种测定方法 [B型题] 1～4 A．1.23 B．1.22 C．2.54 D．2.53 E．2.51 1．1.2252 2．2.5351 3．2.5348 4．2.5068 5～8 A．空白试验 B．对照试验 C．回收试验 D．鉴别试验 E．检测试验 5．以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验 6．在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验 7．用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验 8．取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色 9～12 A．精密度 B．回收率 C．定量限 D．线性回归 E．相关系数 9．某法测得一组测量值间彼此符合的程度 10． 测得量-样品含量 --------------- ×100% 加入量 11．SD或RSD（CV）表示 12．可测得被测药物的最低水平参数 [X型题] 1．药物分析方法的效能指标有 A．检测限 B．耐用性 C．准确度 D．专属性 E．代表性 2．对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有 A．耐用性 B．专属性 C．检测限 D．准确度 E．线性与范围 3．用碘量法测定维生素C原料药时，要求碘量法应具备 A．专属性 B．定量限 C．精密度 D．粗放度 E．线性 4．系统误差来源于 A．分析方法 B．所用试剂 C．操作者 D．所用仪器 E．工作环境 5．消除系统误差的方法为 A．校正所用的仪器 B．作对照实验 C．做空白试验 D．做预试验 E．做回收试验 6．以下所列仪器哪些使用前需进行校正 A．滴定管 B．量瓶 C．量杯 D．移液管 E．碘量瓶 7．中国药典（2000年版）在正文部分的检查项下应包括 A．药物的真伪 B．有效性 C．均一性 D．纯度要求 E．安全性 8．进行药品检验时，要从大量样品中取出少量样品应考虑取样的 A．多样性 B．真实性 C．代表性 D．科学性 E．可靠性 9．用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为 A．1∶1 B．2∶1 C．3∶1 D．4∶1 E．5∶1 10．检验报告应有以下内容 A．供试品名称 B．外观性状 C．检验结果、结论 D．送检人盖章 E．报告的日期 二、答案精讲 [A型题] 1．B 2.C 3.C 4.A 5.D 6.D [B型题] 1．A 2.C 3.D 4.E 5.A 6.C 7.B 8.D 9.A 10.B 11．A 12.C [X型题] 1．ABCD 2.ABC 3.ACD 4.ABCD 5.ABCE 6．ABD 7.BCDE 8.BCD 9.BC 10.ABCE