动物繁殖学（四）：第十二章 配子与胚胎生物技术 (NXPowerLite)

第十二章 配子与胚胎生物技术
Biotechnologies of gamete and embryo
基本内容,
动物胚胎移植, 胚胎和卵母细胞的保存, 体外受
精, 性别控制, 胚胎干细胞, 动物克隆, 嵌合体,
显微受精和转基因动物等技术的原理, 技术环节,
应用和发展前景 。
基本要求,
1,了解动物胚胎和卵母细胞的保存, 体外受精, 性
别控制, 胚胎干细胞, 动物克隆, 转基因动物, 嵌
合体, 显微受精和转基因动物等技术的原理, 技术
环节；
2、掌握胚胎移植的生理学基础、原则、技术程序和
发展前景。
第一节 动物胚胎移植 Section 1 Embryo transfer
第二节胚胎和卵母细胞保存技术 Section2 Preservation
techniques of embryos and oocytes
第三节 动物体外受精 Section 3 In vitro fertilization
第四节 性别控制 Section 4 Sex control
第五节 胚胎干细胞技术 Section 5 Embryonic stem cells
technique
第六节 动物克隆 Section 6 Animal cloning
第七节 嵌合体 Section 7 Chimera
第八节 显微授精 Section 8 Microfertilization
第九节 转基因动物 Section 9 Transgenic Animal
第十二章 配子与胚胎生物技术
第一节 动物胚胎移植
Embryo transfer（ ET）
一, 概 述
二, 胚胎移植程序
三, 胚胎移植的效果, 影响因素及今后改进
之处
四, 胚胎移植的前景
一, 概 述
（ 一 ） 概念 （ 记忆, P253）
动物胚胎移植 (embryo transfer,ET),是将
一头优秀母畜配种后的早期胚胎用手术或非
手术的方法取出, 在显微镜下检出后, 移植
到另一头同种并且生理状态相同的母畜体内,
使之继续妊娠发育为新个体的技术, 也称 借
腹怀胎 。
提供胚胎的个体 ——供体 (donor)
接受胚胎的个体 ——受体 (recipient)
第一节 动物胚胎移植 Embryo transfer
?为了使供体 ♀ 多排卵，通常采用 超数排卵
（ superovulation）；
?国外将常规的胚胎移植称为 超数排卵胚胎移
植或称为多排卵胚胎移植 (multiple ovulation
and embryo transfer,MOET)；
?目前，用 体外生产胚胎 (in vitro production,
IVP)技术或克隆 (cloning)技术 等方法也可以生
产胚胎，扩大了优质胚胎的来源，降低了 ET
的成本。
（ 二 ） 发展历史
1890年剑桥大学 Walter Heape从一头纯种安
哥拉母兔取出 2个 4细胞胚胎，移植到一头纯
种比利时母兔输卵管上端 (用同种公兔交配后
3h),结果生出了 4只比利时种仔兔和 2只纯种
安哥拉仔兔。
这一结果说明早期发育的胚胎更换到另一个体的输
卵管 (或子宫角 )内，如果胚胎的发育阶段和所处的
环境条件相适应，它完全可以继续正常发育，并成
长为一个新个体。
? à′ 3é 1| ò? ?2 ?ê 2Y ?D ?? è? ?±
í? 1890 H e a pe
é? ?ò 1932 W a r w i c k & B e r r y
′ó êó 1933 N i c h ol a s
?′ ?ò 1933 W a r w i c k e t a l,
D? êó 1942 F e ke t e & L i t t l e
?￡ 1951 W i l l e t e t a l,
?í 1951 K v a n s n i c ki i
?í 1974 O g u r i & T s u t s u m i
è? 1978 S t e pt oe & E dw a r ds
The Milestone of ET
我国的 ET
?ET开始于 60年代, 主要发展开始于 70年代后
期, 先后在兔, 绵羊, 牛, 马, 山羊, 猪等
动物方面试验成功 。
?目前以牛的 ET工作做得最多，主要是高产奶
牛和优良肉牛，特别是从国外进口的优良肉
牛品种胚胎。
?目前，我们广西大力发展奶水平的 ET。
?目前我国的波尔山羊的 ET达国际先进水平。
（ 三 ） 动物胚胎移植的原理 （ 书 P255,记忆 ）
1、母畜发情后生殖器官的孕向发育,母畜发情后数
日甚至 10余日内，生殖系统的变化相同，即在相同
的时期，生理状态一致，子宫内的环境相同。
2、早期胚胎的游离状态,早期胚胎有透明带的保护，
可以机械性的移位而不受损害。
3、胚胎移植不存在免疫问题。 由于胎盘屏障的保护
和妊娠时母体免疫机能发生的变化，胚胎可以在受
体母畜子宫内存活，正常发育至分娩。
4、胚胎的遗传特性不受受体母畜的影响。 胚胎的遗
传特性和性别在母畜体内受精时就已经决定了，受
体母畜只是给移入的胚胎提供了一个孕育的环境，
胚胎的遗传特性不受受体母畜的影响。
（四）动物胚胎移植操作的原则 （ P256，记
忆）
1,胚胎移植前后所处环境的同一性,指胚胎移植后的生活环
境和胚胎的发育阶段相适应,
（ 1）供体和受体在分类学上的相同属性；
（ 2）供体和受体生理上的一致性，即发情时间的同期性；
（ 3）动物解剖部位上的一致性，即胚胎移植前后于生殖道内
的位置要相同。
2、胚胎发育期限。 胚胎的采集和移植时间不能迟于周期黄体
的寿命，更不能迟于开始附植时，一般在周期黄体开始退
化前几天，在供体发情配种后 3~8d内收集胚胎，受体也在
相同时间接受 ET。
3、胚胎的质量。 在胚胎收集和移植的全部操作过程中，胚胎
不能受到任何不良因素（物理、化学、病原）的影响而危
及生命力，经鉴定确认发育正常的胚胎才能移植。
（ 五 ） 胚胎移植的用途 （ P256,记忆 ）
1、充分发挥优良种母畜繁殖潜力，提高种母畜繁殖
效率；
2、加速品种改良，扩大良种畜群（ MOET育种方
案）；
3、诱发肉牛怀双胎，提高受胎率；
4、代替种畜引进；
5、保存品种资源，建立基因库；
6、防疫需要和克服不孕；
7、作为研究手段。
（ 六 ） 开展胚胎移植的条件 （ P257）
1、胚胎来源,从良种母畜获得大量胚胎；
2、数量足够的受体母畜；
3、技术条件,包括人员的技术水平及所需
的设备。
胚
胎
移
植
程
序
图
二、胚胎移植的技术程序（记忆）
（一） 供体和受体母畜的准备
（二）供体母畜的超排
（三）供体母畜的配种
（ 四 ） 胚胎的收集
（ 五 ） 胚胎的检查
（ 六 ） 胚胎的移植
二, 胚胎移植的技术程序 （ 记忆 ）
（ 一 ） 供体和受体母畜的准备
1、供体母畜
不仅应 具备优良的遗传品质, 而且其 生殖机能还
需要处于较高的水平 。牛、猪产后两个月以上才能
作为供体。
2、受体母畜
虽不要求具有优良的遗传品质，但应该 具有良好
的繁殖性能和健康体态，体型中等以上。供体与受
体的发情时间应该相同，前后差异不超过 1d。 必要
是时对供、受体进行同期发情处理。
（ 二 ） 供体母畜的超排 Superovulation
（三）供体母畜的配种
选择适当的时间,使用优良种公畜的精液 对供体母
畜进行输精。
为了得到较多的发育正常的胚胎，使用密度大、活
率高的精液输精，并且将输精次数增加到 2-3次,间隔
8-10h。
（四）胚胎的收集
是利用冲冼液将胚胎从生殖道内冲出，并收集在器
皿中。 胚胎的收集分手术法和非手术法,前者适用于
各种家畜或动物，后者仅用于牛、马等大动物，且只
能在胚胎进入子宫角中才能进行。
胚胎收集的时间,一般在配种后 3~8d，发育至 4~8
细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早
期进行收集和移植。
（ 四 ） 胚胎的收集 （ 续 ）
1、手术法收集胚胎 （各种家畜和实验动物）
（ 1）在腹部中线处作一切口, 然后将子宫角和
卵巢一起拉出，检查排卵点或血红体数量。
（ 2）冲冼胚胎,向子宫注入冲冼液并在输卵管
接取（牛、羊和兔等），或从输卵管注入冲
冼液再从子宫角处接取（猪、马等）。
2、非手术法收集胚胎（大家畜）
手术冲胚法：从子宫向输卵管伞方向冲洗
手术冲胚法：从输卵管伞向子宫方向冲洗
手术冲胚法：从子宫角子宫体冲洗
1、手术法收集胚胎（各种家畜和实验动物）
2、非手术法收集胚胎（大家畜）
（ 1）牛的非手术收集胚胎可利用三路式导管冲卵器。
外管前端连接以气囊，当将冲卵器插入子宫内时，
充气使气囊胀大，堵住子宫颈内口以免冲洗液经子
宫颈流出。将冲洗液通过内管注入子宫角内，然后
由另一导管导出冲洗液。
（ 2）每侧子宫角需冲洗 100-150ml。冲洗液的导出应
顺畅，并尽可能回收全部注入的容量。
（四）胚胎的收集（续）
母牛非手术冲卵示意图
3,胚胎冲洗液 Embryo flushing solution
一般多用杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS)
布林特氏液
合成输卵管液
惠屯氏液
海姆氏
TCM 199培养液
一般在其中都 加上 1~5%犊牛血清（ FCS）,
或 0.3~1%牛血清白蛋白（ BSA）。
（ 五 ） 胚胎的检查
收集到的冲冼液，需静置 10min，使胚胎下沉到容器
底部，然后移去上清液，再放于解剖镜下检查胚胎
的数量和发育情况，再将发育正常的胚胎收集到注
射器或移植管内供移植用。
胚胎的检查项目,
1、受精卵整体的形态和体积大小；
2、透明带形状，厚度及损伤程度；
3、发育正常胚胎的卵裂球应该具有整齐的外形，大
小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚龄一致；
4、卵细胞表面颗粒的状态和多少等。
不
同
发
育
阶
段
的
正
常
牛
胚
胎
牛的异常胚胎示意图
胚胎品质的衡量示意图
牛排
卵 8d
内胚
胎发
育情
况及
存在
部位
装胚实图
胚胎装管图
（ 六 ） 胚胎的
移植：手术和
非手术法
1,手术法移
植（各种家畜
和实验动物）
在受体腹部作
一切口，找到
排卵一侧的卵
巢并观察黄体
发育情况，然
后用注射器或
移植管将含有
胚胎的培养液
或冲冼液注入
到子宫角内或
输卵管内。
2,非手术法移植 （ 大家畜 ）
（ 1）先将胚胎装入 0.25ml的塑料细管内；
（ 2） 直肠检查黄体位置后,最好先作硬膜外腔麻醉,然后似人
工授精般将胚胎用移植管通过子宫颈放入到与 黄体同侧 的子宫
角的大 弯或大弯深处 内，或两侧子宫角各放一枚胚胎。
移植胚胎操作图
? 一般来说，用非手术法移植不如手术成功率
高，因为容易损伤子宫角引起炎症，使胚胎
不能顺利附植。
? 非手术法成功率为 25％ -45％，而手术法可达
60％ -65％。
三、胚胎移植的效果、影响因素及今后改
进之处
（一）胚胎移植效果（了解）
? 新鲜一级和优级胚及自然发情受体受胎率 50-60%
? 新鲜一级和优级胚及同期发情受体受胎率 40-50%
? 体内一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率 35-45%
? 体内一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率 30-40%
? 体外一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率 25-30%
? 体内一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率 20-30%
（二）影响胚胎移植效果的因素（熟悉）
1、胚胎的质量；
2、精子的质量；
3、母牛的生殖状况；
4、胚胎保存过程中的技术水准；
5、移植人员的技术水平及移植的部位；
6、受体与供体的发情同期化程度；
7、受体牛发情鉴定的准确性；
8、移植后受体母牛的饲养管理。
（三）今后胚胎移植发展仍需改进之处
1、提高超排的效果
2、提高胚胎的回收率
3、降低胚胎移植各过程的成本
4、提高参与胚移人员的技术水平
四、胚胎移植的发展前景（以牛、羊为例）
1、牛胚胎移植技术应用前景
因为牛的经济价值高、单胎、繁殖周期长、常年发
情，所以采用胚胎移植技术生产优质奶牛、肉牛，正
适于当今国内奶牛、肉牛生产旺盛需求，其更具广阔
发展空间和持续发展前景。
2、羊胚胎移植技术应用前景
相比之下，羊的经济价值不及牛，繁殖率较牛高，
繁殖周期较牛短，且移植术目前仅限于手术法，供体
可利用次数少等因素制约。但从近期发展态势看，又
强于牛，其主要原因是：优质羊价位高，公母羊都有
一个良好市场。
请观看录像 —— 奶牛的胚胎移植技术
第二节 胚胎和卵母细胞的冷冻保存（自学）
Section 2 Preservation techniques of embryos
and oocytes
一, 保存液的组成和培养条件
二, 胚胎的室温保存
三, 胚胎的低温保存
四, 胚胎的超低温冷冻保存
五, 胚胎和卵母细胞的冷冻保存
自学 P266-272
第三节 动物体外受精
In vitro fertilization,IVF
一, 概念
二, 发展历史
三, 意义
四, IVF的基本程序
五, IVF的应用前景
体
外
受
精
技
术
路
线
示
意
图
一、概念 （ P272，记忆）
在自然条件下，哺乳动物精子和卵子的受精过程是
在体内完成的。如将精子和卵子分别从公、母畜体
内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下
结合的过程，称为 体外受精 (in vitro fertilization，
IVF)。
由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故
通过这一技术而产下的动物又称为,试管动物”,
如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。
第三节 动物体外受精 In vitro fertilization
体外受精的主要内容包括,
? 卵母细胞的体外成熟（ in vitro maturation,IVM）
? 卵子和精子的体外受精（ in vitro fertilization,IVF）
? 受精卵的体外培养（ in vitro culture,IVC）
二、发展历史
?1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚 Austin发现精子
capacitation现象以来，哺乳动物体外受精技术的已经
走过了半个世纪的历程。
?于 1970年,1974年和 1978年分别产下了世界首例试管
小白鼠、试管大白鼠和试管婴儿。
?1982年，美国人 Brackett等成功报道了世界首例体内
成熟的卵母细胞经体外受精后获得试管犊牛。
?我国学者卢克焕在爱尔兰建立了一整套牛体外受精技
术体系，并利用该技术体系于 1987年生产了世界上数
量最多的试管牛群，并于 1988年初又研究成功了世界
首例完全体外的试管双犊。
?蒋和生等于 1993年利用体外成熟的卵母细胞进行 IVF，
获得了我国首例试管水牛。
三、意义（ P273，熟悉）
（ 一） IVF技术的确立，使在体外进一步研究精子和
卵子的受精机理与调控、受精条件与调节变成可能。
（二） IVF技术为其他动物繁殖生物技术，如动物克
隆、动物转基因工程和胚胎干细胞等研究打下了技
术基础。同时也为这些技术的研究提供廉价的材料，
如成熟的卵母细胞、受精卵、早期胚胎等。
（三） IVF技术可为 ET提供充足而廉价的胚胎。尤其
是对双胎肉用牛的生产具有特殊的意义。
（四）通过 IVF技术，使因年老、疾病或伤残而淘汰
或死亡的优良母畜仍可继续繁殖后代变成可能。
四、体外受精的基本
程序
体外受精的基本程序,
卵母细胞的采集；
卵母细胞的 IVM；
卵母细胞的 IVF；
早期胚胎的 IVC等 。
四、体外受精的基本程序
（一）卵母细胞的采集
1、离体卵巢采卵,是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细
胞（主要来源）
（ 1）卵泡抽吸法
（ 2）卵巢解剖法
2、活体采卵,是从活母畜的卵巢采集卵母细胞 （优
良品种）
B超引导法,借助超声波 (B超 )探头和屏幕的引导，从活母畜
卵巢采集卵母细胞。操作员先将带有 B超探头和采卵针的采
卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。根据
B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺卵泡并同时抽
吸卵母细胞。其优点是可反复进行采卵而对母畜伤较少。其
缺点是技术难度较大，而且需要较昂贵的 B超设备。
（二）卵母细胞的体外成熟（ IVC）
1、培养液,用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培
养液是 M199。培养时尚要加入一定的血清和激素。
2、温度和气相,牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体
外成熟培养的温度一般为 38～ 39℃ 。所有哺乳动物
卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含 5％ C02
的空气和最大湿度的环境。
3、培养时间,牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间
一般为 22～ 24h，而马为 30～ 36h，猪为 40～ 44h。
4、培养方法,卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用
微滴法、封闭法和 开放法 三种。
（三）卵母细胞的体外受精（ IVF）
1、精子的制备,悬浮法（ swim up） ；直接离心法；
哌可（ Percoll）密度梯度离心法
2、精子获能处理,肝素处理法 ；钙离子载体法；高
渗溶液处理法
3、受精液,通常使用 Tyrode’s改良液
4、受精方法,微滴法,四孔培养板法
5、精卵共培养的时间、温度和气相,受精后，卵母
细胞应立即放入温度 39℃,含 5％ CO2的空气和最大
相对湿度的 CO2培养箱中培养 24～ 44h，其中牛 22～
24h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期
胚胎体外培养液中继续培养 18～ 33h。受精后 40～
44h检查受精卵的分裂率
（四）早期胚胎的体外培养（ IVC）
1、培养液,基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生
素、碳水化合物和蛋白质等。
2、胚胎体外培养系统,常规培养系统、输卵管离体培
养系统,与体细胞共培养系统 。
3．培养方法,卵子在受精 24h后，转移到预先制备好
的颗粒单层中继续培养。一般使用微滴培养法。
4、培养的温度和气相环境,和卵母细胞成熟的条件一
样。
5．胚胎的回收及其质量评定,以牛为例，整个体外受
精程序，从卵母细胞成熟培养开始，经过体外受精
和体外培养直至受精卵发育到囊胚阶段，一共经历
8d的时间。如定受精当天为 0d，则受精后第 5～ 6d即
可回收桑椹胚，第 7～ 8d回收囊胚。
山羊 A,B,C三类卵母细胞
（五）影响体外受精的主要因素（ P278-279）
1、卵巢质量
2、卵泡大小和形态
3、卵母细胞的类型和形状
4、精子的质量
5、水的质量
6、培养环境
7、血清、血清白蛋白及其他化学试剂的质量
五、应用前景（ P279-280，记忆）
1,IVF技术是解决胚胎来源的一项非常重要的
技术。
2,VF技术将使“小牛生小牛”变为现实。
3,IVF技术将使具有优良遗传性状但因老、弱、
病、残而淘汰或死亡的母畜继续繁殖其后代
变为现实。
4,IVF是其他动物繁殖生物技术的关键和核心
技术
第八节 显微授精 Microfertilization
透明带下注射 (Subzonal injection,SUZI)
透明带钻孔 (Zona drilling,ZD) 活精子
透明带部分切口 (Partial zona dissection,PZD)
卵母细胞质内注射 (Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)
这些通过对哺乳类配子进行显微操作以协助其受精的技术
称为 显微受精。
精
子
显
微
注
射
受
精
的
技
术
路
线
精子显微注射体外受精技术
卵母细胞内精子注射产生仔兔
兔精子被注入超排产生的兔卵子胞质内，于 ICSI后 5-6h产生雄原核和雌原核，
于 72h后形成囊胚。移植 113枚胚胎产生 7只仔兔。
显微受精技术在动物受精和发育机理研究、
畜牧业生产及人医临床实践中有着广阔的
应用前景,
? 精液的利用率 可成百万倍的提高，可以使优良种公畜
得到最充分的应用；
? 精子的保存 技术将大为简化，将来或许只要精子核物
质完整就可以达到受精的目的，这对世界珍稀动物资
源的保护将产生深远的影响；
? 与其他技术结合,如将已经过性别鉴定的精子注入卵
子受精，可人为控制家畜后代的性别。
第四节 性别控制 Sex control
一, 性别控制的定义和意义
二、研究历史
三、受精前的性别控制
四、胚胎性别鉴定
一, 性别控制的定义和意义
（一）定义（记忆）,指通过人为地干预并按
人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代
的一种繁殖新技术。
受精之前 —— 通过在体外对精子进行干预，使
在受精之前便决定后代的性别。
受精之后 —— 通过对胚胎性别鉴定，从而获得
所需性别的后代。
（二）性别控制的意义（熟悉）,
1,可使受性别限制的生产性状 (如泌乳性状 )和
受性别影响的生产性状 (如肉用,毛用性状等 )
能获得更大的经济效益 。
2,可增强良种选种中的强度和提高育种效率,
以获得最大的遗传进展 。
3,对人类来说,通过精子性别的选择,可以避免
怀孕一个与 X相关隐性疾病的婴儿 。 而与 X相
关的隐性疾病至今已有 370多种 。
4,性别控制对于平衡一个家庭后代的性比例也
将起到积极的作用,从而可以控制人口的增长 。
二、研究历史
?物理法时期 (1925-1970)：离心，电泳
?免疫法时期 (1971-1989),H-Y抗原（雄性特
异的组织性相容性抗原）
?流动细胞仪分离法时期 (1990-)：最科学，最
可靠
三、受精前的性别控制
（ 一 ） 物理分离法
1,沉积分离法
2,自由流动电泳法
3,层流分离法
4,白蛋白液柱分离法
5,传递逆流电流法
这些方法都是以 X和 Y精子之间存在物理差异为依
据, 如密度, 重量, 形态, 大小, 活力和表面电荷 。
（ 二 ） 免疫学分离法 （ H-Y抗原测定法 ）
? 1971年, 发现精子表面存在雄性特异的组织性相容
性抗原 （ 即 H-Y抗原 ） 。
? 然后开始用 H-Y抗体选择性结合 Y精子来改变动物
性别的研究 （ 用抗 H-Y抗血清处理兔阴道, 抑制 Y
精子, 从而选择 X精子 —74%为雌性 。 ）
? 但是, 当用流动细胞测定技术检测用免疫法分离的
X,Y精子, 发现 X,Y精子与 H-Y抗原的结合物无
差异性, 这表明 X,Y精子可能共同存在相同的表
面抗原 。 所以, 目前对之持怀疑态度 。
（三）流动细胞仪分离检索法 （ 最科学，最可靠）
1、分离精子的理论基础
? X和 Y精子 DNA含量差异（ X>Y）。
? 荧光染料 Hoechst 33342 着色差异 (该荧光染料定量
于 DNA结合 )。
? 荧光信号差异 --X强于 Y。
各种动物 X,Y染色体 DNA含量差异
根据哺乳动物 X和 Y精子 DNA含量存在差异的原理,
用流动细胞检索仪进行分离 X和 Y精子的程序（记忆）,
? 将精子稀释并与荧光染料 Hoechst 33342共同培养，
这种染料则定量地与 DNA结合。
? 当精子通过检索仪时被定位从而被激光束激发，由
于 X精子比 Y精子含较多的 DNA，所以 X精子放射出
较强的荧光信号。放射出的信号通过仪器和计算机
系统扩增，分析并分辨出哪些是 X精子或是 Y精子，
或是分辨模糊的精子。
? 含有单个精子的液滴被充上正电荷或负电荷，并借
助两块各自带正电或负电的偏斜板，把 X或 Y精子分
别导到两个收集管中。
精
子
分
离
流
程
示
意
图
精子分离 Chamber
（三）流动细胞仪分离检索法
2、精子分离效率和准确性
92-97年 200-300个 /秒
98-00 年 1000-2000个 /秒
2001年 3000-5000个 /秒
准确率 90%
我们实验室在性别控制上的水平,
已初步建立了水牛、山羊精子分离的方法，其中分离
X,Y精子的准确率达 85-95%，分离速度达 500个 /秒，
其成果具有国内领先水平，并正在申请相关专利。
3、精子分离后的人工授精
已有的研究结果表明,
?冷冻分离精子与新鲜分离精子授精后的怀孕率没有
差异；
?在授精剂量对比试验中，有结果显示，分离冷冻精
子的授精剂量为 100~150万精子数与 300万的怀孕率
也没有差异；
?一般而言，冷冻分离精子授精后的怀孕率约为对照
组的 80％～ 90％；
?用 X精子授精后所产下犊牛的性别准确率为 83％，
而 Y精子为 90％。
性别分离精子输精后所产犊牛的性比
处理 /
输精部位
输入精
子数
输精母
牛数
31~33天
受胎率
64~67天
受胎率
♀ 犊牛
%
分离 /5°C
子宫角
3x105 45 20(44%) 19(42%) 18(95)
对照 /5°C
子宫角
3x105 28 15(54%) 15(54%) 5(53)
对照 /冷冻
子宫体
40x106 29 16(55%) 15(52%) 11(73)
经过分离的 X精子输精后，受胎率为常规精子输精的 90%，
产雌犊率达 90%。
Insemination of Mares with Low Numbers
of Sexed Spermatozoa
精子稀释液 输精
头数
输精时间 输入
精子
类型
输入
总精
子数
受胎
率
胎儿
性 别比
例
Skim milk
extender
11 GnRH注
射后 34h
X 或
Y
25 3
106
30% 100%
X 或 Y
Skim milk
extender +
4% egg
yolk
10 GnRH注
射后 34h
X 或
Y
25 3
106
50% 100%
X 或 Y
4、精子分离后的体外受精
? 英国剑桥动物生物有限公司 (ABC)最早于 1993年开展用
分离精于进行牛 IVF研究并获得成功,
? 单精子胞质内注射 (ICSI)也是 IVF的另一种选择。此法
对于充分利用由于分离数量较少以及活力可能降低的分
离精子来说意义更大。
5、分离精子在人临床上的应用
美国弗吉尼亚州的遗传与体外受精研究所 (Genetic &
IVF Institute,Virginia)已率先进行分离人精子的研
究和临床应用。其目的,
（ 1）是防止与性别有关联的遗传疾病；
（ 2）平衡家庭中的性别比例。
6、分离精子在畜牧业上的应用
目前 分离精子市场处于供不应求的状况,分离精子的
销路,
（ 1）是销售给牧场主，由牧场自行 AI；
（ 2）是该公司为其下属农户的供体牛作超排处理后进
行 AI或活体采卵后 IVF。
四、胚胎性别鉴定（受精后的性别控制）
? 鉴定移植前胚胎性别是 受精后 对后代进行性别选择
的一种方法。因为在自然条件下，公母的性比例接
近 50,50，当选择一种性别胚胎时，必然弃掉另一
半的性别胚胎。
? 胚胎性别鉴定的方法有多种，如性染色质鉴定法、
染色体组型鉴定法、雄性特异抗原鉴定法、细胞毒
性鉴定法、免疫荧光定法和 PCR鉴定法等 。
五、应用前景
? AI,ET,IVF和性别控制等四大繁殖新技术的相结
合，对畜牧业生产的发展将起到无可估量的作用和
产生极其深远的影响。
? 如将性别控制技术应用于动物克隆和转基因技术之
中，毫无疑问，整个生物工程将按照人们的意愿更
快更有效的发展和应用 。
第五节 胚胎干细胞技术
Embryonic Stem cells (ES cells)
一、概述
二,ES细胞分离培养的基本程序
三,ES细胞的应用前景
第五节 胚胎干细胞技术
Embryonic Stem cells (ES cells)
一、概述
? 哺乳动物胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ES细胞 )
一般是指从附植前胚胎内细胞团 (ICM) 或原始生殖
细胞 (PGCs)经体外分化抑制培养分离出来的具有全
能性和多能性的细胞。
? ES细胞是由 Evans和 Kauf-man1981年首次从延迟小
鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为 EK细
胞。以后称之为胚胎干细胞。
人胚胎干细胞分离技术途径
ICM PGCs
ES细胞的特点,
? ES细胞具有胚胎细胞的特性,在 形态上 表现为体
积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生长；
在 功能上, ES细胞具有发育的全能性，即具有分
化为成年动物体内任何一种细胞类型的能力。
? ES细胞具有细胞系的特征,在饲养层上能维持未
分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，也
可冷冻保存。
二,ES细胞分离培养的基本程序
书 P288-290 自学
三,ES细胞的应用前景 P290
?ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有
价值的工具；
?ES细胞是研究 细胞分化 的理想手段； 图
?ES细胞是研究基因功能的首选细胞；
?Es细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；
?ES细胞治疗技术将引起一场医学革命；
?ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。
人 ES细胞用途
第五节 动物克隆 Animal cloning
一, 概述
二, 细胞核移植的方法
三, 影响核移植效果的主要因素
四, 核移植的应用前景
一, 概述 （ 书 P291）
（ 一 ）, 克隆, 的定义
? 动物克隆 （ 记忆 ）, 是指由一个动物经无性繁殖
（ asexual reproduction） 或孤雌生殖而产生的多个
具有与亲本相同遗传信息的同质性后代, 包括孤雌
激活生殖, 卵裂球分离与培养, 胚胎分割 以及核移
植等 。
? 胚胎分割 （ 记忆 ）,人为的将早期胚胎分割成两个
或几个, 然后移植给受体母畜可以获得一卵双胎甚
至多胎 。
? 克隆动物 （ 记忆 ）, 通常将所有非受精方式繁殖所
获得的动物均称为克隆动物, 将产生克隆动物的方
法称之为克隆技术 。
? 根据供体细胞核的来源分为：胚胎细胞克隆和体细
胞克隆
哺
乳
动
物
卵
裂
球
培
养
示
意
图
牛胚胎分割的主要用途
? 细胞核移植（ nuclear transplantation or nuclear
transfer,NT，记忆）,是指通过特殊的人工手段，
以显微操作、电融合、复合活性化处理等技术为主线，
将发育不用时期的胚胎或动物体细胞核，移入到除去
单倍染色体 DNA的成熟的未受精的卵母细胞中，进行
体外重构、体外培养、胚胎移植，从而达到扩繁同种
基因型动物种群的目的。
? 核供体细胞,被移植的细胞核
? 受体卵细胞质,接受核供体细胞的成熟的未受精卵母
细胞质
? 核供体细胞（广为应用）：①初期胚胎细胞；② ES细
胞）；③各种体细胞：如胎儿成纤维细胞，乳腺细胞，
皮肤细胞（耳、成体、胎儿），肌肉细胞，卵丘细胞，
内脏细胞（肝、脾、心、肺、肠、舌）；④生殖系列
细胞,PGCs、精母细胞、足细胞和精巢细胞。
（二）动物克隆研究的历史和现状
体细胞克隆首例
2004,2005 广西大学 水牛
胚
胎
细
胞
核
移
植
体
细
胞
核
移
植
细
胞
核
移
植
的
方
法
动物核移植技术程序
二、细胞核移植的方法
（一）核供体 细 胞的准 备
胚胎细胞、体细胞,ES细胞
1、胚胎细胞作为核供体
– 先用 1%的链酶蛋白酶或 pH2.5的台氏液去掉透明
带，再用机械吹打或酶消化发使其分散为单个游
离的卵裂球。
– 一般选择 16～ 32-细胞期或晚期桑椹的胚胎细胞较
为 合适。
2、体细胞作为核供体
? 经 0.25%胰蛋白酶 +0.1%EDTA消化后，将细胞接种
培养于 DMEM 。之后放入 5%CO2培养箱中培养，
待细胞长至 70%～ 80%时进行传代。传代 3～ 8代的
细胞用于核移植。
? 细胞周期调控：血清饥饿法。即用含 0.5%血清的培
养液饥饿培养已形成单层细胞的体细胞 3～ 5d，使其
诱离生长周期而静止在 G0期。
3、胚胎干细胞作为核供体
? ES细胞既具有胚胎细胞所不具备的数量优势，又具
有体细胞所不能保持的低分化。 ES细胞是全能的，
在一定条件下，它可以分化成各种功能细胞。
（二）受体卵母细胞的准备
? 大量实验表明,MII期卵母细胞适用于所有的供体
核，目前基本上都采用去核的 MII期卵母细胞作为
受体胞质。
? 受体卵母细胞在核移植前需要进行去核。
? 目前常用的去核方法有如下几种：盲吸法，荧光
引导去核法，微分干涉及极性显微镜去核法，离
心去核法，化学试剂去核法，末期去核法，吸引
法去核，挤压法去核，点击法去核
1、盲吸法,吸取极体附近的部分细胞质。
PB1
2、荧光引导去核法,用 Hoechst 33342（ 2～ 8mg/ml）染
色 10～ 15min，然后，在荧光显微镜下确定核的位置。
3、微分干涉和极性显微镜去核法,在装有纺锤体图像观察系统
（ Spindle view）的显微镜下，可直接观察到牛等卵母细胞的
纺锤体。
SP SP
PB
Spindle-View系统去核法
纺锤体图象观察系统，利用 MII期卵母细胞的细胞质和纺锤
体对光的不同折射特性，在显微镜光学系统上附加偏振光系
统，并将该系统捕获的图象用计算机进行图象处理，显示出
MII期染色体所处的位置，并通过显微操作去核。
4、离心去核法,根据细胞核的密度大于细胞质，用
离心的方法可使没有透明带的卵母细胞核被甩向一
侧而最后脱离卵母细胞。
5、化学试剂去核法,用化学试剂处理处于第一次减
数分裂中期的小鼠卵母细胞，使染色体相互紧密结
合，形成染色体复合体，在卵母细胞排出第一极体
时，染色体复合体随极体一起排出。
6、末期去核法,激活处理成熟卵母细胞，使其排出
第二极体，然后吸取其周围附近的细胞质。
7、吸引法去核,在注入核供体的同时吸引除掉原有
卵母细胞核。
8、挤压法去核,在 PB1附近，将透明带切开，调准切口，
固定卵母细胞，使切割针与其成垂直方向，向下挤压
除去 PB1连同下面的一小部分细胞质。
9、点击法去核,在第一极体附近，将卵母细胞透明
带切开 1/3，调准切口，使其与切割针成垂直方向，
固定卵母细胞，用显微针点击透明带，除去第一极
体连同下面的一小部分细胞质。
（三）移核
1、带下注射移核法
2、卵母细胞质内注核法
（四）细胞融合系统
1、化学法
2、仙台病毒法
3、电融合法
融合过程
（五）激活系统
1、化学激活
⑴ 7%乙醇：处理时间 5～ 7min
⑵ 离子霉素,4umol/L,5min
⑶ 钙离子载体（ A23187）,5umol/L,5min
⑷ 6-DMAP,1.9～ 2.0mmol/L； 3～ 5h或更长
⑸星形胞菌素,2umol/L； 15～ 30min
2、电激活
如在本试验室条件下 (水牛和牛 )：一般采用强度
100v/mm，持续时间为 50～ 80us，直流脉冲 1次。
（六）核移植重构胚的培养
1、体内培养：用琼脂包埋，移入暂时的中间受体（如
羊、兔）的输卵管内，培养 4～ 5天后，然后回收胚胎
进行移植。
2、体外培养：重组胚激活后，在现有的胚胎体外培养
系统中进行培养。
（七）继代细胞核移植
又叫 连续细胞核移植,即将核移植胚胎的卵裂球分开，
作为供核细胞，再进行连续多代的核移植，以便从一
枚胚胎得到更多的克隆胚胎。
（八）克隆胚胎的移植
如牛,先做同期发情处理，然后将胚胎移到受体动物如
牛何水牛的黄体侧子宫角。
来源于水牛颗粒细胞的核移植发育胚胎 (100X)
三、影响核移植效果的主要因素（自学，
P297）
补充：目前，核移植技术（克隆技术）存在的问题,
? 结果不稳定，效率低（ 1～ 6%）；
? 克隆动物怀孕期长、出生体重异常偏大、生后对
环境的适应性差；
? 存活率低；
? 细胞质的遗传问题。
四、核移植的应用前景（记忆,298-299）
（一）扩大优良畜种和稀有动物的数量
（二）提高转基因动物效率
（三）核 -质间互作关系的研究
（四）克隆技术的医学价值
治疗性克隆,通过体细胞核移植并培育到囊胚期，
并从这个囊胚分离出 ES细胞，体外定向诱导分化成
有特定功能的细胞，就能为需要的病人提供不具有
排斥反应的细胞、组织和器官 。
治疗型克隆的主要技术程序
核
移
植
产
生
的
弥
猴
美国俄
勒岗州
灵长类
研究中
心通过
早期胚
胎卵裂
球移植
入卵母
细胞后
产生的
幼猴。
日本克隆牛的过程
日本克隆的梅山猪
我国首例体细胞克隆牛胚胎移植后代 ——“蓓蓓”
董雅娟博士、柏学进教授和刚出生的蓓蓓在一起
请观看克隆牛之梦（上） —— 电视录像
请观看克隆牛之梦（下） —— 电视录像
第七节 嵌合体 Chimera（自学）
嵌合体动物,指由 2个以上不同的受精卵或 3个以上
的配子相结合, 有不同基因型的细胞群所构成的
复合体 。
嵌合体动物制作方法,
1,集合 （ 凝集 ） 法, 在卵裂阶段使 2个以上的胚胎发
生粘着和结合 。
2,注入法, 在临近着床的胚泡期, 用显微操作方法将
另一个体的细胞注入到囊胚腔中 。
研究现状,
家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间取得成
功 （ 绵羊, 牛等 ）, 而且在异种间也得到了活
的后代, 如绵山羊人工嵌合体, 该技术对遗传
学研究具有重要意义, 塑造特异性状的新奇物
种, 从而为动物园展示了新的前景, 嵌合体也
被用来研究免疫学系统的机理 。
第九节 转基因动物 Transgenic Animal
一, 概述
二, 转基因动物的应用
三, 制备转基因动物的基本程序
四, 转基因技术
五, 转基因动物的前景
一, 概述
? 1980年, Gordon应用显微注射法首次成功地将重组的外源
DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中, 获得了携带外源基因小鼠 。
Gordon和 Ruddle（ 1981） 将外源基因导入小鼠实验中, 首次
将带有外源基因的小鼠称为转基因小鼠 （ transgenic mice） 。
? 1982年 Palmiter将大鼠的生长激素基因用微注射方法导入小鼠
的受精卵中获得巨型小鼠 （ supermouse）, 从而在理论上和实
践意义上都将转基因技术提高一步, 引起生物学界极大的关注,
为基因工程育种提供诱人的前景 。
? 转基因技术（记忆）,用实验室方法将所
需要的目的基因导入动物的受精卵，使外
源基因与动物本身基因整合在一起，在动
物发育过程中表达，并能稳定地遗传给后
代的技术。
? 在基因组中稳定地整合有人工的外源基因
的动物称 转基因动物 (transgenetic animal
（记忆）。
二, 转基因动物的应用 （ 了解 ）
1,改善动物生产性能
肉牛, 双肌, 基因, 绵羊多胎基因, GH促进生长发育
2,抗病育种
将阻断猪瘟病毒复制的基因转进去 — 获得抗猪瘟病毒的转
基因猪
3,生产有特殊经济价值的药用蛋白
作为乳腺反应器, 或者说生物反应器
4,利用转基因猪生产人类所需要的器官
转基因动物技术的发展可以将携带人类免疫系统基因的转
基因猪, 作为给人类进行异种器官移植的供体 。
5,基因治疗
从基因角度讲是用正常功能基因区置换或增补有缺陷的基
因, 从治疗角度上讲是将新的遗传物质转移到某个体的
细胞中获得治疗效果 。
三、制备转基因动物的基本程序
1、转基因的设计和构建
目的基因
2、培育
将目的基因转入 -培养 -产下后代
3、检测
是否是转基因动物
三, 转基因技术 ——转入外源基因方法
（ 一 ） 磷酸钙沉淀法,经典, 简单的方法 。
先将需要被导入的 DNA溶解在钙盐溶液中, 然后在不停地搅
拌下逐滴加入磷酸盐溶液中, 形成磷酸钙微结晶与 DNA的
共沉淀物, 再将这种共沉淀物与受体细胞混合, 保温,
DNA可以进入细胞核内, 并整合到寄主染色体上, 本法多
用于单层细胞的培养, 也可用于悬浮培养的细胞 。
（ 二 ） 电脉冲法
将供体 DNA与受体细胞充分混匀, 在高压电场作用下, 受体
细胞出现瞬间可逆性穿孔, 外源基因借此进入细胞内, 该法
具有快速, 简便, 对质粒纯度要求不高等特点 。
（ 三 ） 细胞融合法
用聚乙二醇 （ PEG） 为融合剂, 用于哺乳动物培养细胞融合 。
（ 四 ） 显微注射法 -微
注 射 法
（ microinjection）
它是创造转基因
动物的有效途径 。
（ 五 ） 精子载体法
意大利 Lavitrano等 1989年首次报道利用精子作为
载体获得了转基因小鼠。
（ 六 ） 生殖细胞转染法
（七）逆转录病毒介导法
（八）细胞核移植法
胚胎干细胞法生产转基因动物的流程图
鸡的转基因技术
转入
GFP
基因
的恒
河猴
Expression of GFP in virus-infected fish