华中农业大学：细胞工程学：细胞工程文本教案

华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 细胞工程文本教案 教学目的与要求： 细胞工程是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工 具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为 从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术 基础。 理论知识方面，重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞 工程中的指导作用；培养条件下的细胞分化和器官发生的调控；离体培养条件下的遗传 与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现 代生物学与生物技术领域的 用 与发 。 技能方面，重点掌握细胞工程的基本 作技术— 作；掌握 体 、 组织和 体 导、器官发生调控 基本技术；了解细胞大 培养方法，原生 体分离与体细胞 技术。 课程学时及其分 ： 课程 学时 ，其中课 教授 学时， ? 学时。 课 讲授￠￡及学时分 ? ￥? ￠ ￡ 学时 §论 2 currency1'￥ “??及技术原理 2 currency1?￥ 细胞全能性与fifl发生 6 currency1 ￥ 离体培养下的遗传与变异 4 currency1–￥ 物组织和器官培养 5 currency1?￥ 物细胞培养及?生代·产物生产 5 currency1 ￥ 原生 体培养 4 currency1?￥ 物体细胞 4 currency1?￥ ?工?” 2 currency1?￥ 物? …‰离体 ? `′ 2 currency1?￥ ?物细胞工程ˉ? 4 1 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 § 论˙2学时¨ 教学目的与要求 全面了解细胞工程与现代生物技术的关 ；了解细胞工程的发 与相关学科的? ； 了解细胞工程在现代? ??中的 。 currency1'? 细胞工程在生物技术领域中的ˇ— '、生物技术ˉ? 生物技术是 生物科学为基础， 用生物 体 生物器官、组织、细胞的特性和 能，? 建具有 性 的 物? 品 ˙ 细胞 ¨， 及与工程原理相 产品?工生产的 性技术体 。 生物技术的￠a主要是： 用现代生物学理论与科学技术 细胞的遗传物 ，培 ????要的生物 品 ?； 工业o ˇ 用现有生物体 ，制 生物产品； 生物体 ， 生物化学工程代 化学工程，制 工业产品； 发 相 的科学理论与工程技术。 主要技术 ? ：基 工程、细胞工程、 工程、发 工程 及生化工程。 现代生物技术特?： 学科性； 业性；o 化。 ?、细胞工程的ˉ?及研究 ? 细胞工程˙cell engineering¨是 用细胞生物学和分”生物学方法，??工程学的 ? 方法 技术，在细胞 研究 生物遗传特性和生物学特性， 得特定的细 胞、细胞产品 生物体的有关理论和技术方法的学科。 广义的细胞工程 所有的生物组织、器官及细胞离体 作和培养技术，狭义的细 胞工程则是指细胞融 和细胞培养技术。 根据研究对象不同，细胞工程可分为?物细胞工程和 物细胞工程。 2 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?物细胞工程 ：细胞培养技术˙ 组织培养、器官培养¨；细胞融 技术； 胎工程技术 ˙核移 、 胎分割 ¨；克隆技术˙单细胞 克隆、器官克隆、 体克 隆¨。 物细胞工程 ： 物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生 体融 与培 养技术；亚细胞 的 作技术 。 、细胞工程与其它相关学科的关 1．细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发 2．为生物学研究提供 的 体 3．细胞工程必须与其它生物技术相 才能更好ˇ发挥作用 –、细胞工程在现代生物技术中的ˇ—及其 意义 1． 善农业生产技术 2．`护自然…‰，维护生fl 衡 3．生物医药开发 currency1?? ?物物细胞工程的发 '．融 现象的发现 19?纪30年代，Muller, Schwann, Virchow 相继在肺 核、天花、 痘、麻疹 病理 组织中观察到 核细胞现象，但当时并没有引起??的关注，认为这只是'?特殊现象。 1849年Lobing在骨髓中也发现了 核现象的′在，1855年～1858年，科学家?在 肺组织和各?正常组织及发尖和坏死部—都发现了 核细胞。至此，自然 中广泛′在 着 核细胞的事 ，才被生命科学工作者接受。 1859年，A. Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫′在着由单 细胞核融 fi成 核的原生 团的情况。据此，他认为 核细胞是由单 细胞彼此融 而fi成的。 ?. ?物组织细胞培养技术的建立 1907年，美国 胎学家R. Harrison将蛙的 神?管区的'片组织移 到蛙的淋巴液 凝块中，这片组织在体 不但′活了若干星 ，而且还从细胞中长?了轴突(神?纤维) 细胞，解决了当时关于轴突起‰的争论，并?明了 用体 ′活的组织 研究的 可能性。他所采用的把培养物放在盖 片 并?于 片 中培养的方法还' 用至 3 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 。 Carrel (1911)发现了 ?液对于某些细胞的生长具有 的 ，还把 技术引到了组织培养技术中。作为他的技术 是，他在不 的培养条件下 细胞维 生′了34年， 继代3400?， 明?物细胞有可能在体 ˇ 生长。 1914年，Thomson创立了 '条 全不同的体 组织培养 器官培养法， 被Strangeways和Fell所发 。 1940年，Earle建立了可 传代的' C3H 的 组织细胞 L 。?是 1951年，Gay建立了currency1' ?体细胞 ?体 ?￠Hela细胞 . 细胞融 技术的建立和 ￡技术的?生 1958年, Okada发现￥ ?活的§currency1病'可引起“?? ￡细胞彼此融 。由于§currency1 病'能?定ˇ 发细胞融 而引起了fi 科学家的fl ，60年代，Harris(1965) 导不 同的?物体细胞融 得成 并能′活下–。Lifflefield(1964)根据?本细胞的 ?· ， 用HAT 性培养基能 ?本细胞死?而只?下异 融 细胞，并能不?ˇ?”， 从此fi成了细胞融 到 ?细胞 、培养的'?…技术。 这'技术在此 广泛ˇ 用 于遗传学、病'学、‰ 学、细胞学 ?学科的研究工作中。 1975年，‰ 学家Kohler和Milstein 用§currency1病' 导? `细胞‰ 的 ′细 胞与 骨髓￡细胞融 ， 到能分?单' 体的 ?细胞。? ?细胞具有在 体￠和体 培养条件下大 ˉ”的能 ，并能长 ˇ分?单克隆 体，从而建立了 淋巴细胞 ￡技术。这'技术的?生把细胞融 技术从 ?˙¨ 了 用研究?˙， 了?物细胞工程的??发 。 –. ?物克隆技术的建立 1891，Heape ? ???了家ˇ 胎移 成 的 —，他?把 家ˇ 胎移 时ˇ，得到了4只 家ˇ。 本?纪30年代 ， 在 、 、 ?物的 胎移 得成 。?过 ?年的 不? 善和 ， 成为' 成 的ˉ”生物学技术。 克隆?物成 的??是在1962年， 国学者Grudon把 ? a 细胞 的核注 同? 异? ? a 受精?(?￥ ??o 死?细胞核)中， 有1 的重 组?发 成为成 蛙。 这'成 开创了由体细胞培 ?物 体的 ，其 在于： 明了 4 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 全分化的 细胞?然具有 分化细胞的全部遗传 ，并能在'定的条件下发 成 ?物 体，从而 明了?物细胞?然具有全能性； ?建立了体细胞核移 的 体 ， 明在体细胞核 至 胎发 方 的 ，?细胞 对体细胞核的发 能起着 关?性的调?作用，其作用 ”可能是细胞 中的mRNA与有关的?? 。 1997年2?， 国科学家Wilmut 在? Nature ??了? currency1 '只克隆 的?生。它的 在于： 明了哺乳?物高度分化的细胞同样 有全… 遗传 ，亦能在'定条件下发 成?物 体， '? 明了?物细胞的全能性。 ** ?生的技术路?： 取6岁供体 乳腺细胞 — 血清饥饿培养 细胞处于G0 ?GnRH处理取?细胞 — 移去?细胞的细胞核 将培养的乳腺细胞的核移 到去核的?细胞中 重组细胞 currency1'受体 输?管中培养至 泡 (桑椹 ) 桑椹 再移 currency1?受体 ” ￠发 至分娩 currency1 ? 物细胞工程的发 物细胞工程是'门 物组织和细胞的离体 作为基础的 性学科。它是 物组织细胞为基本单—，在离体条件下 培养、ˉ” ?为的精细 作， 细胞的某 些生物学特性按??的意愿发生 变，从而 良品? 创 物?， ?速ˉ” 物 体， 得有用物 的过程统称为 物细胞工程。 物细胞工程是在 物组织培养的基 础 发 起–的， 此， 物细胞工程亦是广义ˉ? 的 物组织培养。 '．探索?˙ 在这'?˙中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提?为组织培养技术的产生奠 定了理论基础。在这些理论的指导下所开 的有关? ，对组织培养技术的建立 了 有益的探索。 细胞学说˙cell theory¨是Schleiden和Schwann分别于1838年和1839年提?的， 其核 ￠￡是，细胞是有机体，亦是生物体的基本 单—，由它 成? 生物 体。 同时， 物细胞 是在生理和发 具有 在全能性的 能单—。随 ，Schwann在 1839年更明确的指?：“如—具有与有机体￠'样的条件时，每 细胞 ?可 独立 生活和发 ”。这'论点 成为组织培养研究的思想基础。 细胞全能性学说是德国著名 物学家G. Haberlandt在细胞学说的基础 于1902年提? 的。他认为，高 物的组织、器官可 不?分割， 到单 细胞。如—每 细胞都有 物 体'样的性 和能 ，那么，可 通过 物细胞培养 单 细胞发 成为' 体。 5 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?．培养技术建立?˙ 作为'门技术，它必须具有'定的程序性。也就是说，它 ?具有'定的技术 式。 在这'?˙， 物组织培养建立了两 与培养技术有关的重要 式，'是培养基 式， ?是激 调控 式。 ． 用研究?˙ 其'，组织培养领域的研究迅速在? 各国的有关 “广泛 开。 其?，技术体 更? 善。这'?˙的技术体 ：根据不同的培养目的 体 的取材和? 方法，不同 体及其培养产物的培养程序，适 于不同 物?类和 体类 的培养基 。 其 ，fi成了 为 ?的理论体 。在 物组织培养研究的基础 ， 物细胞工程 现 fi成了 细胞全能性为基本理论基础， 细胞脱分化和再分化调控为中 的理论体 。 其–，研究目的性更?明确，并 广泛 用到生物科学研究的各 领域， 细胞工 程为基础的 生物技术产业正在fl起。 –． 物细胞工程 用 在 物 ? 的 用 将常o 物 ?技术与 物组织培养技术相 ，可 得常o技术难 法 得的? 材料，缩短 ?周 ，提高 ? 率。 快速 得特殊倍性材料；克服远缘 不?和；克服 ? 夭折；导 ‰基 ；突变体筛 ；? …‰`′ ?苗脱病'与快速ˉ” 细胞培养生产有用?生产物 在细胞生物学和发 生物学研究中的 用 在 物遗传、生理生化 及 物病理 基础研究中的 用 思考题 1．细胞工程的ˉ?、研究 ?、在生命科学中与其它学科的关 。 2．?物细胞工程发 的主要 性?˙。 3． 物细胞工程技术的发 ?˙与 性成就。 4． 物细胞工程的作用与 用领域。 6 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1'￥ “??及'般技术˙2学时¨ 教学目的与要求： 了解细胞工程的通用技术， ?掌握细胞工程 技术中的培养基 制、? 及 作的原理与 作方法。 currency1'? “?? 细胞工程 “它必须满足 基本的?要，即： 准 ， 培养基 制，洗 涤与? ； 作；控制培养。 '． “组成 1．基本实验室 准 “ 准 “的 能就是 '切与 有关的准 工作。要求宽敞明亮，通风 条件好。 接?“ 接?“的 能是 作。要求封闭性好，干燥清洁，能 长时间` 。房间'般不宜过大，其o 根据 ?要而定。接?“除了? 口和通气口 ， 密闭。 培养“ 培养“的 能是对离体材料 控制培养。其 要要求是要能控制光?和 度，其?为防止微生物感染，培养“ ` 干燥和清洁。 2．辅助实验室 细胞学 “ 其 能是对培养材料 细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥， 各?光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影“及暗“ 其 能是 培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下 可建立此 “。 生化分析“ 在 培养细胞产物为主要目的的 “中， 建立相 的分析化 “， 便于对培养物的有 成分随时 取样检查。 细胞工程 “布局的其基本要求是：便于隔离、便于 作、便于? 、便于观察。 ?．基本? 制 基本? 冰箱、天 、酸度 、、纯 器、 、培养基分 器、 器。 ? ? ? 、干 ' 、过 ? ?、 '器、￥ 。 作? 化工作currency1、接?箱。 7 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 光 控制? 时间程序控制器、 调及 度感 器。 细胞培养? 培养? 根据?要而定， 培养 、培养箱、 、生物 器 。 细胞学鉴定? 光学研究 微 、 体 微 、 ? 微 。 除 ?基本? ，如—有条件和?要还可 制摄影? 、生化分析? 。 ．培养器 及 用具 器 材料器 材 用具 currency1?? 基本技术 '．洗涤技术 1．洗涤液 酸洗涤液是用重 酸 (K2Cr2O7)与 酸(H2SO4) 制而成，可根据?要 制成 、 中、 ?。 用重 酸 50g? ? 1L，? ￠化，￡? 再￥?? § 酸90ml。 中 用重 酸 50g? ? 100ml，? ￠化，￡? 再￥?? § 酸 875ml。 与§ 酸? 的同时￥?? currency1'的重 酸 ， 到重 酸 “到?和为止。 '般§ 酸1L? 重 酸 50g。 2．洗涤方法 器 洗涤 ?料用品洗涤 用品洗涤 ?．? 、 '技术 理方法：物理? 干 、湿 、o?处理 物理除 过 、离 ?fi 化学方法： 'fl、 ? 1．培养基灭菌 2．玻璃器皿灭菌 3．金属用具灭菌 8 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 4．接种室灭菌 5．外植体灭菌 ?常用 'fl的 — ' fl 用§度( ) '时间(分) — 液去除难– ??酸? 10 5～30 好 – ??酸· 2～5 5～30 好 – 洁 ? 10～20 5～30 好 – ?化? 0.1～1 2～10 ?好 ?难 过?化? 10～12 5～15 好 ?– 4～50mgl-1 30～60 好 难 currency1 ? 培养条件 '．光? 1．光照强度 2．光质 3．光照时间 ?． 度 ?1.2 度对”? 组织细胞生长的影… 培养 度( ) 接?时单 细胞 ‰ 重(微 克) 到指?生长 单 细胞重(微克) 10.0 0.44 0.20 15.0 0.42 0,12 25.0 0.44 0.07 30.0 0.42 0.06 32.0 0.52 0.03 ．湿度 组织培养中湿度的影…有两 方面，'是培养￡器￠的湿度条件，'是`′的湿 度条件。￡器￠的湿度 ?是100%的相对湿度，?是`′的相对湿度'般要求70～ 80%。 –．pH? 通常 用的pH? ˉ是5.5～6.5。pH在4.0 下 7.0 培养物就不能正常生长。 9 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?．?˙ ．通气条件 currency1–? 离体培养的¨养?求 体–讲用于 物离体培养的培养基至 机?；有机化 物；生长调?fl 大基本组成 及根据不同?要的其它??成分。 '． 机?类 必? 在体￠的生理作用主要 – 方面： '是组成各?化 物，?与机体的建 ，成为 物 ； ?是 成'些特殊的生理活性物 ，如 物激 、 及 的活化fl，?与 物的 代·活?； 是这些 ?间相ˇ—调， 维 离”§度 衡、胶体?定、 衡 生物 化 学方面的作用； –是在发 过程中，影…组织器官的建成。 ?．有机化 物 类 可作为C‰， 可维 培养基的?˙ 。 物组织培养中常 用 ，在 某些特殊培养类 中，亦 用 、 、— 、纤维? 、 。 维生 为了 培养物生长得更好，根据培养目的不同常在培养基中 ?'? ?维生 。常用的维生 VB1˙?酸 ¨、VB6˙?酸 ¨、Vpp( 酸)、 VH (生物 )、VBc˙?酸¨、VB5˙泛酸?¨ 。 化学名称`a 。 本 并没有 生长的作用，但它在 类的相ˇ 化、维生 、激 的 用相 具有重要的 作用，所 它能 培养物快速生长，对 体和 的fi成有良好的影…。 腺 腺 是 成各?细胞分 的?体?'， ‰ ?腺 有 于细胞 —调自 成细胞分 ，有 于细胞的分 和分化， 的fi成和生长。 ?基酸 ?基酸是?? 的组成成分。常用的?基酸为 ?酸及 ??基酸的? 物如 解o??、 解乳?? 。 ． 物激 生长 类 常用的生长 有IAA( 酸)、NAA ( 酸 )、2,4-D(?? ? 酸) 10 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 和IBA( 酸) 。 细胞分 类 常用的细胞分 有KT (激? )、BA(6-?基腺 )、2-ip(异 ?基 ) ? 。 年–TDZ˙ 基 ??基?¨亦作为'? 的细胞分 在fi 离体培养研究中 用。 ?? 类 此 ，根据不同培养目的， ABA(脱 酸)、 、B9、CCC( ) 生长 制物 有时也被用于调?培养物的生长发 过程，如 导某些变fl器官的发生 。 –．其它 天然提取物 如椰乳、番茄汁、YE( 母提取物) 琼脂 活性炭 思考题 1． 物细胞工程 “的基本组成与要求。 2．培养基的组成成分有哪 类，在离体培养中的 能是什么？ 3． 物离体培养的`′条件及对培养的影…。 11 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1?￥ 细胞全能性与fifl发生˙6学时¨ 教学目的与要求： 掌握细胞离体培养的基本理论基础，从而深 理解培养条件下组织细胞脱分化和再 分化的调控原理，了解体细胞 fi成过程及其与 ” 的差异。 currency1'? 细胞全能性及其?“ '、细胞全能性ˉ? 简单ˇ讲，' 生活细胞所具有的产生 ?生物 体的 在能 称?为细胞的全 能性。 ???物细胞研究分类类 ， 物细胞也可分为 类： currency1'类是茎尖、根尖及fi成层细胞，这类细胞始终` 分 能 ，从' 周 ' 周 ，为周 细胞。 currency1?类是筛管、导管、气孔`卫细胞 特化细胞，他?为永久失去分 能 的细胞， 为终端分化细胞。 currency1 类是? 细胞及各?薄壁细胞，这类细胞在通常情况下不分 ，但在受到 刺激 可重 启?分 ，称为Go细胞 ' 物细胞 分生 fl回复过程所能 的程度，取决于它在自然部— 所处 的—?和生理 fl。 ?、培养条件下的细胞脱分化 培养条件下 ' 分化的细胞回复到原始 分化 fl 分生细胞 fl的过程就 是细胞脱分化˙dedifferentiation¨。 1．细胞脱分化过程中生理活?与细胞 的变化 脱分化过程中细胞 会发生急剧变化。这些变化 体 ：细胞 著变§， 大液泡 失，核体积??并逐渐移—至细胞中央，细胞器??。 液泡??体的?现和 体 变为原 体被认为是细胞脱分化的重要特?。 根据脱分化过程的时 顺序，细胞的脱分化过程可分为 ?˙： currency1'?˙为启??˙，?现为细胞 ?生，并开始 细胞中央伸?细胞 丝，液泡 ??体?现； currency1??˙为演变?˙，此时细胞核开始 中央移?， 体演变成原 体； currency1 ?˙为脱分化终 ，细胞回复到分生细胞 fl，细胞分 即将开始。 12 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2．细胞脱分化的调控机理 细胞周 调控 激 的作用 PSK的调控作用 染色体变化 3．细胞分 与 组织fi成 脱分化是细胞生理 fl的 变，而fi成 组织是离体培养中的' ?˙。 、细胞分化 所谓细胞分化˙differentiation¨，是指导致细胞fi成不同 ，引起 能 变 在发 方式 变的过程˙fi智宏，1998¨。 ' 细胞在不同的发 ?˙ 可 有不同的fifl和机能，这是在时间 的分化； 同'?细胞 代，由于所处的`′˙如部—¨不同而可 有相异的fifl和机能，这是 在 间 的分化。 单细胞生物仅有时间 的分化，如噬 体的￠ 和￠原 。 细胞生物的细胞不 但有时间 的分化，而且由于在同' 体 的各 细胞所处的—?不同， 而发生机 能 的分工，于是 有 间 的分化，如' 物 体在其顶端、根、茎、? 不同部— 具有不同的细胞。 1．细胞分化与基 组变化 染色体重复复制 DNA的差异扩? 基 重排 2．极性与细胞分化 所谓极性是指 物的器官、组织、甚至单 细胞在不同的轴 ′在的某?fifl 及生理生化 的梯度差异。极 性 论在? 物 高 物中‰普遍′在。 极性'旦建立，在'般情况下不可逆 。 在 情况下，细胞的不‰ 分 是细胞极性建立的 。 3．TE细胞分化及其调控 作为维管 统的主要成分，管 分”˙tracheary elements，TEs¨在维管 统的fi 13 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 成中具有中 作用。在 物 统发 条件下，TEs由根和 的原fi成层 ?生fi成层细 胞分化fi成。在离体培养条件下，TEs则由 组织薄壁细胞分化fi成，这也是 组 织细胞分化器官的?提。 4．激 在细胞分化中的调控作用 激 在 物生长发 中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分 化和再分化的主要 ，其中生长 和细胞分 是两类主要的调控培养条件下细胞 生长和分化的 物激 。此 ，在有些? 中也 示，GA3、ABA、 也在细胞分化 中起到'定的调?作用。 currency1?? 器官发生 物的离体器官发生是指培养条件下的组织 细胞团˙ 组织¨分化fi成不定 根˙adventitious roots¨、不定 ˙adventitious shoots¨ 器官的过程。 '、离体培养中器官发生的方式 通过器官发生fi成再生 株大体 有 ?方式： currency1'?方式是 根 currency1??方式为 根 currency1 ?方式是在 组织的不同部—fi成 和根，再通过维管组织的? fi成 ? 株。 ?、器官分化过程 离体培养条件下，?过 组织再分化器官'般要?过 生长?˙。 currency1'?˙是 体?过 导fi成 组织。 currency1??˙是“生长中 ”fi成。当把 组织 移到有 于有序生长的条件下 ， 在若干部—成丛?现类似fi成层的细胞群，通常称?为“生长中 ”，也称为 分生组织，它?是 组织中fi成器官的部—。 currency1 ?˙是器官原基及器官fi成。 在有些情况下， 体不?过典 的 组织即可fi成器官原基。这' 有两? 情况： '是 体中 ′在器官原基， '?培养即fi成相 的组织器官 而再生 株， 如茎尖、根尖分生组织培养； '?情况是 体某些部—的细胞，在重 分 接fi成分生细胞团，然 14 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 由分生细胞团fi成器官原基。这?不?过 组织 接发生器官的 在 品?ˉ”为 目的的离体培养中具有重要的 意义。 研究?明，在?肉细胞再生 株过程中，? 分 细胞的currency1'?分 轴 是?分 重要的。在不?过 组织的器官分化中，这? 周分 是?肉细胞的脱分化，同 时也是?细胞 变发 方式极性的确定。现在，有?把? 启?分 的这些细胞称? 为感受fl细胞。 、起始材料对器官分化的影… 1．母体 株的遗传基础 ?1.1 不同基 器官分化能 的 物?类 及 体类 基 ˙品?/自 ¨ 组织 导率˙ ¨ 器官分化 率˙ ¨ …料–‰ 大豆： 轴 汾豆33 晋豆19 晋遗21 晋豆11 汾豆38 汾豆17 汾豆51 晋 125 94 93 91 93 93 93 92 91 34 28 22 20 23 23 16 12 程林梅 ，2001 薯：?片 ?南` 宁 331 千 682 100 100 11 22 9 0 张宝`，1993 ：幼 鄂 12 鄂恩1号 89 11 ?阳26 鄂55072 荆35 98 96 10 100 100 100 36 32 4 4 4 12 覃建兵和何光‰， 2001 15 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?：幼 340 7922 Mol 17 4112 8902 846 477 吉853 吉921 444 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 78 86 62 53 57 38 47 11 32 0.4 杜娟 ，2002 2． 体的类 体对 导 及其再生能 的影…体现在 体的生理 fl 。 体–讲，生 理 fl年轻，–‰于生长活跃 生长 大的组织和器官的细胞更有 于培养，但具 体到不同的 物类 则有 大差异。 体 取 理与否，不仅影…培养的难–，而且有时甚至影…分化的程度和器 官类 。1974年Tran Thanh Van 取 草正在开花的 株的薄层? 培养， —不 同部—的? 体所fi成的 的类 不同。 –、激 对器官分化的调控 激 在细胞生长与 体发 中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化，在大 ?情况下是通过 ‰提供适宜的 物激 而 现的。在众 的 物激 中，生长 与 细胞分 是两类主要的 物激 ，在离体器官分化调控中占有主导ˇ—。 离体培养中， ‰激 在细胞￠的吸收和代·影…到激 的活性从而影…其培养 —。 ?2.2 ‰生长 在胡萝卜 轴培养细胞中的 和游离生长 * 培养时间 ‰生长 §度˙ng/g FW¨ 生长 游离fi式 §度 1周 2，4 D 23,247.4±3,912.7 21,979.4±2,526.3 NAA 99.3±9.7 1,776.7±50.1 [2H4]IAA 30.3±3.5 7,557.0±279.0 4周 2，4 D 20,003.8±4,365.9 33,119.4±3,835.0 NAA 64.8±17.5 1,637.0±509.8 [2H4]IAA 3.4±1.4 763.5±420.0 * 引自Ribnicky ，1996。 16 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?、光?对器官分化的影… 光?时间、 度 及光 对器官分化‰有影…。 由于培养条件下光 作用能 ?， 此光?的作用更大程度 是调?细胞的分 化 fl，而不是 成光 产物。 光?对器官发生的调?可能与其对培养物￠‰激 衡的调?有关。 ．器官分化的基 调控 同‰框˙homebox¨基 ： Kn1˙KNOTTED1¨ STM˙Shootmeristemless¨ cdc2 ESR1 bZIP˙PKSF1¨ SRD1、SRD2和SRD3 currency1 ? 体细胞 胎发生 离体培养下没有?过受精过程，但?过了 胎发 过程所fi成的 的类似物˙不 管培养的细胞是体细胞还是生”细胞¨，统称为体细胞 体。 这'定义有 下 方面的 定： 其'，体细胞 是离体培养的产物，只 于在离体培养 ˉ 用， 区别于 融 生” ； 其?，体细胞 起‰于 ”细胞， 区别于 ” ； 其 ，体细胞?过了 胎发 过程， 区别与离体培中器官发生fi成 体的 ˙崔凯荣和戴若兰，2000¨。 '、体细胞 的fi成 1．体细胞 从 体 接发生 在 ?片为 体的培养中，体细胞 的 接fi成可分为两 ?˙： currency1' ?˙为 导 。在此?˙中，?片? 细胞 亚? 细胞感受培养刺激， 分 fl。 currency1? ?˙是 胎发 。在这'?˙，fi成的￡ 物继续发 ，?过球fi 、 fi 发 过程，? fi成体细胞 。 17 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2．?过 组织的体细胞 发生 ?过 组织的 胎发生?要 培养?˙： currency1'?˙是 导 体fi成 组织； currency1??˙是 导 组织 性化； currency1 ?˙是体细胞 fi成。 在 幼 、 及”?为 体时，通常可 接 导 性 组织产生， 而发 生体细胞 。 此，?过 组织的体细胞 胎发生， 性 组织的fi成是培养的关 ?。 而发生原 ，?过不同时 成体细胞 胎发 ˙图1.12¨。 图1.12 蝴蝶兰茎˙ 体?过 组织的体细胞 发生˙引自Lin ，2000¨ 3．细胞悬浮培养的体细胞 胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中，体细胞 胎fi成的细胞学观察?明，其培养物中′在 两?类 的细胞：'是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞'般 不具 胎发生 ；?是成簇成团的体积 而细胞 致密的细胞，这类细胞具有成 能 ， 而，把这类细胞团 称为 性细胞团。 性细胞团 移到适宜的 胎发生培养基 ，其 ˉ的fi 细胞开始currency1'? 不‰ 分 ，靠 细胞团方 的' 细胞 大， 发 成类似 柄的 。 ' 细 胞则继续分 fi成类似原 的 ， ?过类似于体￠的发 过程，?球fi 、 fi 发 ?˙fi成 ?的体细胞 ˙李浚明，1991¨。 通过悬浮细胞 再生体细胞 ，由于 性细胞可 继代?”， 此可 提高 胎 的生产 率。 ?、体细胞 的 与发 特点 与器官发生fi成 体的 相 ： 体细胞 发 再生 株有两 明 的特点。'是体细胞 具有双极性˙double polarity¨，?是体细胞 fi成 与母体的维管束 统连 ，即?现所谓的生理隔 离˙physiological isolation¨现象。 由于大 ?体细胞 起‰于单细胞， 此对于单 株–讲，通过体细胞 fi成 的再生 株，其遗传特性相对?定。 与 ” 相 ： ” 在发 具有明 的 柄，而体细胞 '般没有真正的 柄只有类似 柄的 。特别是那些发 类似于?物 胎发 的体细胞 ，这'点更为明 。 18 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ” 的”?是相当o 的，可 作为分类的依据，而体细胞 的”?常不o ， 有时具有两片 的”?。 与相同 物 ，体细胞 的体积明 于 ” 。 体细胞 没有休眠而体细胞 则 接fi成 株。 ” 在 胎发 全 ”? ，?过' 列的物 积累和脱 就 休眠。 、影…体细胞 发生的 1． ‰激 对体细胞 胎发生的调控 2，4 D是 用?为广泛的生长 。 2，4 D的 用有着o 性的变化。 是在 高§度下 导 性细胞的fi成，然 在 ?2，4 D的§度下产生 胎，'般在球fi fi成 ，除去生长 则有 于体细胞 的继续发 。 2．培养基及培养条件对体细胞 fi成的影… 体细胞 的产生要求培养基中 有'定§度的还原fl 。 球fi fi成 ，如— ?培养基的 机?§度，可 著 体细胞 的 '? 发 。 在'些? 中还发现，体细胞 发 ? §度，也有 于 的继续发 和提高体细胞 的成苗率。 3．不同基 间体细胞 fi成能 的差异 体细胞 的产生在不同类 的 物间具有明 差异。 在 成 得体细胞 的 物中， 自然条件下￡–产生 融 生” 的 物为 ， 且培养条件相对 为简单，如 物、 科 物 。 即 是同类 物的不同基 ，在体细胞 导的难–、fi成时间 及单 体 产生体细胞 的? 也′在明 差异。 薯18 不同基 品?的体细胞 fi成能 的 研究 示， 接? 体与体细胞 能否fi成的…料统 ，有7 品?的体细 胞 发生率为100 ，而 率??则只有10 。 –、体细胞 胎发生的生化与分”基础 1．体细胞 fi成过程中￠‰生长 的变化 体细胞 胎发 研究?明， ‰生长 对体细胞 产生和发 的调控是通过调?￠ ‰激 的 成、代·、极性 输和 衡而起作用的。 体细胞 胎发生中， ‰生长 的 用 式 者说o ，在大 ? 物中是相似的， 如 导 性细胞产生， 导 组织 化为 性 组织，‰?要高§度的生长 。 19 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 当球fi fi成 ，则?要 ?生长 才能 成体细胞 的继续发 。 研究 示，生长 的这' 用o 与 胎发 过程中￠‰激 的变化是'致的。 2．体细胞 发生过程中的特异?? 有关体细胞 fi成中?? 和组分的变化， 管不同研究在 对 不 相 同，但 体 ‰?现?，体细胞 fi成过程中 ￠性??明 ??。 ?2.4 不同 组织˙干重¨可￠性?? ˙μgmg-1¨* 可￠性?? 性 组织 性 组织 继代10?的 组织 ￠性?? ?￠性?? ￠性?? ￠性?? 136.3 30.0 10.6 13.2 94.5 17.6 14.4 14.4 115.3 24.5 10.9 13.6 *引自李中 ，1993。 乳 ??˙AGPs¨ 某些病程相关??可能也与体细胞 的fi成有关。 3．体细胞 fi成的基 ?“调控 通过基 ?“的差异 示和 胎发 突变体 技术， 分离? ? 与体细胞 发 相关的基 。除了'些典 的激 调控基 ，还有其它类 的基 。 ?2.5 胡萝卜体细胞 fi成相关的部分基 基 ?“产物 ? “ 时 … 料 – ‰ DC8 LEA˙Grp3¨ fi Borrkird ，1986；Franz ， 1989；Halzopoulos ，1990 DC59 Oleosin fi Choi ，1987；Hatzopoulos ， 1990 DC3 LEA˙Grp3¨ 原 、球fi 、 fi Wilde ，1988 EMB-1 LEA˙Grp1¨ 球fi 、 fi Ulrich ，1990；Wurtele ， 1993 ECP31 LEA˙Grp4¨ 原 ECP40 LEA˙Grp2¨ 原 Kiyosue ，1992，1993 20 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 EP2 Lipid transfer 原 De Vries ，1988；Sterk ， 1991 EP3 Chintinase 原 De Jong ，1992 DC2.1 Pro-rich protein 球fi 、 fi 、 DC7.1 Gly-rich protein 球fi 、 fi DC9.1 Gly-rich protein 性细胞、原 Aleith和Richter，1990 EF1-a Elongation factor 球fi Apuya和Zimmerman，1992 CEM1 EF1-a 原 、球fi 、 fi 、 Kawahara ，1992 Gea14 Lipid transfer 性细胞、球fi 、 fi Gea 31 PR-protein 性细胞、球fi 、 fi 、 、 株 Gea41 Heat-shock 球fi 、 fi Liu ，1996 思考题 1．细胞学说与细胞全能性的ˉ?。 2．细胞分化的?˙及细胞 的变化。 3．真核生物细胞周 调控的分”机理。 4．为什么说luxury gene是细胞 能分化的调控基 ？ 5．离体条件下生长 与细胞分 在细胞分化中的作用。 6．器官发生的影… 及调控机理。 7．体细胞 与 ” 在fi成 和 的异同。 8．影…体细胞 fi成的 及调控。 9．根据体细胞 fi成的生化和分”基础，思考如何深 体细胞 fi成的理论与技 术研究。 21 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1 ￥ 离体培养下的遗传与变异˙5学时¨ 教学目的与要求： 掌握离体培养中体细胞变异的特点和o ；了解体细胞变异的细胞遗传学和分”遗 传学基础；掌握体细胞变异的 用 和 方法。 细胞组织的离体培养 于 性ˉ” ?。从理论 –说， 论是细胞还是组织培养， 再生的 体‰ 传了母体的遗传基础，这也是离体培养技术作为 物快速ˉ” 用的 基础。 由于培 过程的影…，离体培养的细胞、 组织 及再生 株‰普遍′在着变异。 由于离体培养条件下并没有发生 ”的受精， 此，Larkin和Scowcroft˙1981¨ 提?把由 何fi式的细胞培养所产生的 株统称为体细胞 性 ˙somaclones¨，而 把这些 株所?现?–的变异称?为体细胞 性 变异˙somaclonal variation¨。 就对生物遗传的影…而 ，细胞工程技术本 了双重性：遗传的?定性和变 异性。 currency1'? 离体培养中的遗传与变异特点 '、离体培养中的遗传?定性 离体培养的细胞学基础是有丝分 。有丝分 的DNA `?复制和染色体‰ 分 机制，从理论 可 ` 离体培养物在'般情况下的遗传?定性。 在准确 培养方式的?提下，离体 性ˉ”可 具有 高的遗传?定性˙Phillip ，1994¨。正是基于这'理论， 用离体培养技术建立了 ? 物的 性ˉ”体 。 离体培养的遗传?定性?现的 ' 方面是，即 发生某些变异，也可 即时 变异。 ?、离体培养条件下遗传变异的特点 普遍性： 变异可发生在各?培养类 中； 变异发生在各? 物的培养中； 22 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 变异发生与培养类 有关。 ?3.1 部分 物离体培养再生 株的? 变异 率* 物 ? 类 再生 株–‰ 变异 率˙ ¨ 草 体细胞 组织 10 组织 71.9 幼? 组织 >18 ? 体细胞 组织 14 花 株 12.7 大 花 株 10-15 番 茄 幼? 组织 >5.8 薯 ?肉原生 体 100 萝 ? 组织 7 ￠ 组织 34 ￡ 组织 98 幼— 组织 100 * 引自李宝?和￥? ，1990。 局 性： 从? §，在不同 物类 中?常发生的体细胞变异主要是 株fifl˙株高、? fi、?色 ¨、生长 、 性、某些 性 性 的变异。 从生理生化特性 §，￡–?现同 currency1、?生代·的 长 变异。 '些单基 控制的性 不仅发生'fi突变，也发生 性突变。 “ 性： “ 性是指同'有机体中同时′在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常? 的现象。 23 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?3.2 Triticum durum 6 性 株体细胞染色体?* ˙ 号 为 体?， 号￠为染色体?¨ 序号 2n<14 2n=14 2n=15～27 2n=28 2n=29～55 2n=56 2n>58 1 1˙7¨ 7 37˙16～24, 26¨ 76 8˙29, 39, 40¨ 4 2 2 3 5˙17, 20, 23¨ 11 1˙33¨ 1 3 5˙9, 11, 12¨ 6 21˙15,18,21～ 27¨ 33 3 4 3˙7¨ 1 4˙16, 21, 22, 27¨ 22 3 5 1˙11¨ 6 5˙15, 22, 26¨ 14 1˙32¨ 6 2˙12¨ 1 18˙18, 20～26¨ 21 1˙40¨ 2 * 引自张?生，1989。 、影…体细胞遗传与变异的 1．供体 物 供体 物倍性 ；基 ； 体细胞分化程度 ?3.3 ?”体细胞 性 R2的变异 率* 基 R2 株 ? 变异株 变 异 株 株 ? fi分率 ?定 变异 分离 变异 fl?1号 fl?5号 高39 407 –?14号 C445 宁? 210 120 170 121 55 70 100 201 104 152 110 39 47 83 95.7 86.7 89.4 90.9 70.9 67.1 83.0 0 5 3 3 4 0 6 0 4.2 8 2.5 7.3 0 6.0 9 11 15 8 12 23 11 4.3 9.1 8.8 6.6 21.8 32.9 11.0 4.3 13.3 10.6 9.1 29.1 32.9 17.0 * 引自?现· ，2002。 2．培养基及培养方式 不同的激 §度可 有 ˇ 导不同倍性的细胞的分 。 激 除了引起染色体倍性的?? ，在'些培养中还发现染色体倍性 的现象。 培养基的物理 fl 及培养类 也会引起细胞的变异。'般–讲，悬浮培养的细胞 24 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?体培养的细胞–产生变异。 3．继代培养的?? '般–讲，继代时间?长，继代??? ，细胞变异的 率就?高。 ?3.4 培养时间对掌? ? 组织染色体变异的影…* 培养时间 ˙?¨ 观察细胞? 亚?倍体 ?倍体 倍体和 ?倍体 细胞 ? fi分 率 细胞 ? 细胞 ? 1 3 12 18 92 51 50 83 14 6 15 29 15.2 11.8 30.0 34.9 65 39 27 33 70.7 76.5 54.0 39.8 9 6 7 19 9.8 11.8 14.0 22.9 * 引自李亮亮 ，1998。 currency1?? 体细胞变异的细胞遗传学基础 '、DNA核￠重复复制 DNA在核￠重复复制˙endoreduplication¨但不发生细胞分 ，其 —是染色体组? ??，fi成同‰ 倍体。如—这?DNA重复复制 ?发生，细胞￠DNA 就会不? ?。 ?3.5 ”? 中 轴培养中DNA?的变化* 培养天? 不同DNA?细胞 ˙ ¨ <2c 2c～4c <8c 8c >8c 0 88.3 11.7 5 80.7 16.8 2.5 13 4.8 79.5 6.6 9.1 17 9.7 81.5 7.9 0.9 * 引自张?生，1989。 ?、染色体? 与重组 染色体 变异是体细胞变异的 '重要类 。染色体? 与重组是离体培养中染 25 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 色体 变异的主要原 ?'，也是体细胞变异中?常发生的现象。 染色体 变异的细胞学特?是，分 中 ?现? 的染色体片˙、 染色体 及染色体…，其 —是在体细胞中?现染色体–—、?失、 — ?类 的 变异。 、 正常有丝分 离体培养中，染色体除了?倍性变异 ，还可观察到大 的 ?倍性变异，这? 组织‰‰分化能 ?下，再生 株大 生长不正常，有性ˉ”的遗传?定性差。 ?体fi成异常 得有丝分 不正常是其原 ?'。 正常有丝分 极 ?体fi成和核 。 currency1 ? 体细胞变异的分”遗传学基础 '、 基突变 基突变是指DNA序列中 基的 变。如— 变 基的DNA序列处于 基 的 —? 调控序列的—?，就可能导致遗传 fl的 变。 基突变是产生体细胞变异的重 要 ?'。 对于单基 控制的遗传性 ，大 ? 基突变可 ?定遗传，而且 `德 遗 传分离o ，这'点 在 、 草和 ?的体细胞变异中得 ˙张′义和??·， 1994¨。 ?、DNA序列的 性扩?与ˉ失 在fi 物中‰观察到，DNA分”中'些重复序列在培养条件下发生了扩?。 Lapitan ˙1988¨ 生物 记的480 bp重复序列DNA片˙为探?，发现 ˙ ?再生 株当代7R染色体短¨端?—? 的这?重复序列发生了扩?，而且这?扩? 可 遗传至 代。 在fi 物?类中还观察到，在组织培养过程中， 及?组织培养再生的 株， 甚至在这些 株的 代中，有时也会发生DNA序列ˉ失的现象。 现有…料 示，DNA序列ˉ失 发生在rDNA及其间隔序列，某些重复序列DNA 区域也–发生ˉ失。 研究还发现，DNA的 不仅发生在核DNA中，也有发生在? 体基 组中。' 些DNA序列的 只发生在 组织fi成?˙， 株再生过程中 ?复到正常 fl， 目?还不清?这?变化的生物学意义。 26 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 、 ”活化 ”˙transposon¨ 是由McClintock在 ?中发现的，现 它是引起fi 遗传不?定现象的重要原 。 ?纪80年代，Larkin和Scowcroft 提?， ”的活化可能是体细胞 性 变异的原 ?'。 ?国学者?至清˙1991¨认为，也可能是 ”在培养`′中 被激活而 ， 从而 成染色体的 变异。 目?关于 ”引起体细胞变异的 接 据还?分有 ，但fi 学者认为， 用 ”解ˇ体细胞变异有fi 理性，如变异 率高、?—基 活化 。 此，有关 ”在体细胞 性 变异中的作用，也是将–体细胞遗传变异研究的 点。 –、DNA 基化 DNA 基化˙methylation¨在基 ?“调控中具有重要作用。 离体培养再生 株的 基化变化 在 ?体细胞 性 再生 株中发现。–自 ?幼 再生 株的某些 性 与供体相 发生了 基化，而 '些再生 株?只在 与G相 的C 发生 基化，而且这? 基化在基 组中的分布是不‰ 的。 胡萝卜、番茄、 薯 ? 物的培养细胞 再生 株中，‰??发现了 DNA 基化 变而产生的体细胞变异˙?现·和 ，1994¨。 除了DNA 基化程度的?? ，离体培养中的某些变异还–自于DNA 基化程 度的 ?。?典 的 ”是 体细胞 株由于 基化的 而 成的 性化变 异。˙Rival，1997¨。 currency1–? 体细胞 性 变异的 导与 体细胞 性 变异的?示方法主要有两?： '?是Chaleff˙1981¨提?的 R0、R1、R2、 分别代?体细胞 性 变异的当代 和自 的?代； '?是由Larkin和Scowcroft˙1983¨提?的 SC1、RC2、RC3、 –分别代?体 细胞 性 变异的当代和自 的?代。现在，这两???方式在体细胞 性 变异 研究中‰有 用。 离体条件下的体细胞 性 变异的筛 有 下'些明 的 点： ˙1¨由于筛 可 在离体条件下 ，从而可 在 间￠对大 体 。 ˙2¨细胞突变体的筛 可 在 细胞周 ￠ 成，且不受 ? 制， 此筛 率高。 27 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ˙3¨ 为? 是在?工? 的培养条件下 的， 此 变和筛 条件可 根据 ?要 调?和控制，从而提高了? 的重复性。 ˙4¨由于变异是在单细胞 的， 此，' 突变体就是–自' 细胞， 不会有 突变细胞的干 ， ‰了?体 株 性变异常 现?的“ 体， 而 可 去变异分离的麻 。 ˙5¨在细胞培养 统中，理化 变fl可 ‰ ˇ接?细胞， 此可 引起培养细 胞相对 高 率ˇ发生突变，??了 机会。 '、体细胞变异 导材料的 起始材料?根据? 目 确定，'般?考 下 方面的a题： 其'，目 性 的可 性。体细胞突变的 率 然 高，但对于某' 体–讲，变 异的性 是 别的， 此 性 良好的 物品?材料，通过 变 变 别不良 性 ，是体细胞突变 的目的。 其?，必? 分考 ? 物的细胞培养技术 ，只有对起始材料有良好的培 养技术，才有可能制定 满的 变及 方案。如—起始细胞的培养技术不成 ，不能 再生?株，则不能 续的各 作。 其 ，适当的细胞类 亦是提高体细胞突变 筛 率的重要条件。 ?、培养细胞的自发变异 离体培养的 物细胞会?现 高 率的自发变异， 离体培养中体细胞自发突变所产生的变异‰‰ ?定，没有?工 变的 续干 ，有 于分离和 。 ?家? 用自发突变的这些 点， ?'些 品?，如 美国RNA 物技术 从番茄体细胞 性 变异中 ? 品?，currency1 的 ?家也 从 体细胞 性 再生 株变异中 ? 品?。 、培养细胞的 变 1．物理 变 物理 变主要是通过o?、?? 及 度 对培养物 '定处理，然 对处理 的培养物 培养筛 。常用的o?处理 Xo?、γo?、快中”、￥ ? 。 2．化学 变 化学 变是通过在培养基中 ?'些化学物 ，细胞对这些化学物 吸收 接 间接引起 基突变。常用的化学 变fl主要有： ?化fl˙ 酸? o DES， 基 酸 o EES， 基?酸 o EMS，`? ? 28 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 EO， 亚 EI ¨，此类 变fl有' 活化?基，可与DNA分”中的 基 酸基 ， 变DNA的 而引起突变； 基类似物˙5 ?是 腺 ?类似物，2 ?基 是腺 类似物 ¨， 在细胞￠核酸复制时，这些类似物可 到 成的DNA分”中引起 ； 移? 变fl，如ICR化 物和 ?类似物 ； 其它如亚 酸、? 某些 亦可引起突变产生。 3．复 ” 变 变处理可 是单 ”处理，亦可 是复 ” 变。'般–说，复 变的 — 单 ” 变好。 4． ”? 变 ” 可 接将 ‰基 ? 细胞￠ 得 性 ， 可 独立? 通过其 能 导变异。 目?， 用 的 ”体 主要是 ?的Ac/Ds 统，其主要 作过程是， 采用基 化的方法将Ac/Ds导 受体细胞，再通过体细胞培养 再生 株的自 ? Ac ”切除，由于 ”? 的随机性，即可在切除Ac的 株中筛 ?不 同变异。 用这' 在 、 薯、番茄、 ? 物 得可 用的体细胞变异 株。 –、体细胞突变体的筛 1． 接筛 法 接筛 法是在? 的 条件下，能 培养细胞 再生 体 得 接感官 的 差异， 此能将突变 体和 突变 体分离。 ? 接的 法是用'? 有特定物 的 培养基，在此培养基 只有突变细胞 能够生长，而 突变细胞不能生长，从而 接筛 ?突变体。如 除草fl、 ? 突变 体的筛 ，‰可 接在培养基中? '定§度的除草fl ???˙ 的物 。 目?采用这' ， 从 ? 物中筛 ?可 用的体细胞变异体。 2．间接筛 法 间接 法是'???于与突变?现 有关的性 作为 指 的筛 方法。当? 乏 接 ? 指 接 条件对细胞生长不 时，可考 采用间接筛 法。如脯 ?酸˙Pro¨作为'??˙调?物 ，在维 细胞膜?定性、细胞 分 衡 方面具有重 要的生物学意义。 物在 生物胁迫如干旱、? 条件下，体￠Pro常常有不同程度的 ?高，而且耐干旱和耐寒 物的体￠Pro‰‰ 高。 29 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 病突变体的筛 也常常用间接筛 的策略。由于在离体培养中 接接?病原物会 严重障碍细胞生长， 此可 在培养基中? '定fl 的病原物类' –?? 。??病是 ?严重的真 性病害?'，同时由?? 产生的?? ' ˙DON¨ 不仅影… 正常生长，还可 ?在籽?中，严重时可 成?畜中'。陆维忠 ˙2003¨ 幼穗为 体 导 组织，然 将 组织 ?DON的培养基 中，?过两?连续 导筛 ， 得了 DON的 组织。再将 DON的 组织 分化培养基再生 株， 得的再生 株?过连续田间 病性鉴定筛 ， 培养? ? ?病 品?“宁962390”。 ?、体细胞变异的 用 1．创 ?中间材料 接筛 品? 据统 ， 导突变 被用– 良诸如 、 、大 、棉花、花生和菜豆这些?” ˉ”的重要作物。在全? 50 国家中， 培 ?1000 由 接突变 得的 由 这些突变体 而衍生的品?。这些品?的主要特性 品 良、? 病性和 逆 性 。 2．遗传研究 突变体作为基 克隆和 记筛 具有独特的 点。 为突变'旦发生，即可在?现 与供体 著不同，通过差异 示 分” 筛 ，即可快速 得突变—点的DNA 序列，?过?序与 能鉴定，就可能 得与突变性 相关的基 。即 通过分析不能 得 能基 ，这些DNA序列也可作为与突变性 相关的分” 记，用于相关遗传研究。 突变体用于基 克隆和 能鉴定 成为 式 物如 南芥 的常o方法， 年 –也 开始广泛用于其它作物中。特别是与 ” 签? 突变技术相 ，更 现? 这' 的高 性。目?， 用突变体策略 分离?'些 能基 和 病基 ，如 ? 脱? 基 ADH，?? 成相关基 GA1、GA4，生长 敏感性基 AUX1、 AUX2、番茄 病基 Df9 。 3．发 生物学研究 物的 体发 是' 渐 过程，每' 器官和组织的分化都是' 复 的调控 过程。 用体细胞突变策略对 物发 的基 调控研究取得了突破性 。特别是 用 南芥和 草 式 物， 分离?'大 不同发 ?˙和组织类 的突变体， 顶端分生组织、根、开花 变、花序、花分生组织、 胎发 的' 列突变体。通过对 这些突变体的研究，不仅建立了器官发 式，而且分离鉴定了'大 与发 有关的 基 ， 维 正常发 fl的基 、 发 程的基 ， 及相关修饰基 ˙fi智 宏和刘′明，1998¨。 30 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 4．生化代· 研究 生物的各?代·活?涉及到' 列 相关基 的?“。如—某'代·过程的关? 基 突变，则会影…到下游代·链的正常 。 此，突变体作为代·活?调控研究的 工具，具有?分便 和高 的 。 体细胞突变技术的不?成 ， 细胞生物大群体突变的建立成为可能。??可 根据?要建立某'代· 中每' 调?点的突变体，也可 根据?要与基 工程相 ，对'些关?调控过程 修饰和 ， 代·过程按??类?要 ， 此而 发 起–的 学科领域称?为代·工程。 物突变体用于代·研究， ??典的 ”是通过 草突变体对 酸还原 的 研究。 酸还原 ?失突变体有两?类 ：cnx和nia。两?突变体具有同'?现 ，即 在 fl 为唯' ‰的培养基 不能生′。但将这两?突变体的原生 体融 ，融 细胞即可在只有 fl ‰的培养基 生长。由此说明，两?突变体′在独立的基 — 点，而不同—点的基 可能通过不同的 控制 酸还原 的活性。研究 示。cnx和 nia突变体分别通过影…钼 ”和 ??–影… 酸还原 的活性。 年–，通过体细胞 突变研究激 、?生代·产物 代· 的研究 有fi ??。 离体培养中遗传的?定性是相对的，而体细胞变异发生是普遍的，但变异的程度 可 通过培养类 和条件 控制，从而 ??能够更好ˇ 用离体培养技术。 用适 当的 体和培养方式， 体细胞变异发生， 培养群体维 遗传?定，可 分 用离体培养的快速ˉ” ˉ”?康?苗。将离体培养技术与 变技术相 ，可 提高变异 率，??变异 的基础材料，丰富遗传…‰。特别是随着 变 的不? 善和分”生物学技术的 用，必将 体细胞变异的研究和 用 得 更 分的发 挥。 思考题 1．体培养物的遗传变异有何特点？ 2．哪些 会影…培养物的遗传变异？ 3．从细胞学和分”生物学机制 理解体细胞 性 变异的机制。 4．体细胞 性 变异的 导和 方法。 5．体细胞 性 变异的 用 。 31 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1–￥ 物主要组织培养技术˙5学时¨ 教学目的与要求： 掌握 物组织培养的主要技术，特别是茎尖脱'原理，花药培养 得单倍体 及幼 培养技术的 用。 currency1'?、 物脱'及快速ˉ”技术 '、 ˉ?与意义 意义：能够有 ˇ` 良品?的特性； 生产 病'?苗，防止品?退化； 快速ˉ” 品?， 良品?迅速 用； ? 耕ˇ，提高农产品的 品率； 便于 输。 目?受病'危害严重影…生产的有： ? 大田作物： 薯、 薯、 、 草。 ? 蔬 菜：?菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 ? — 树：柑橘、苹—、草莓、 蕉。 ? 花 卉： 石竹、各?”花、天竹葵、￥罗兰 块根、块茎、鳞茎为ˉ”器官的作物，每年相当'部分产品要用?作?。如： 大 蒜：?? 占产 的?到?分?'。 薯：?? 占产 的?分?'。 贝 母：?? 占产 的 分?'。 ?、 物的脱'技术 1．基本原理 病'在 物体￠的分布具有不‰ 性 理论假说： (1)、能 竞争 病'核酸和 物细胞分 时DNA 成‰?要 耗大 的能 ，而 32 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 分生组织细胞本 活跃，其DNA 成是自?提供能 自?复制，而病'核酸的 成 要靠 物提供能 –自?复制， 而就得不到足够的能 ，从而就 制了病'核酸的复 制。 (2)、传导 制 病'在 物体￠的传播主要是通过维管束 现的，但在分生组织中， 维管组织还不?全，从而 制了病' 分生组织的传导。 (3)、激 制 在分生组织中，生长 和细胞分 ‰ 高， 而阻滞了病' 的侵 者 制病'的 成。 (4)、 ?乏 1969年，Stace-Smith提?，可能病'的 成?要的 统在分生组 织中?乏 还没建立， 而病' 法在分生组织中复制。 (5)、 制 ” 1976年，Martin-Tanguy 提?了 制 ”假说，认为在分生组织 中′在有某? 制 ”。 茎尖脱'是控制 物病'的有 (1)、药物防治病'病 率?， (2)、 病' ??履艰难 (3)、组织培养的高 隔离防治了病'的再侵染 2． 物脱'的技术o程 * 母体 株的 和 处理 母体的 ：欲脱'材料的品?典 性； 体?康程度 。 处理： A B C 损 脱'区 致死区 33 生长区 处理区生长 温 度 高 温 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 石竹在38～40°C条件下?两 ?处理可除去全部病'。 ? ”花在35～38°C的条件下处理60天可 病'失活。 ? 薯在37°C条件下处理10～20天能除去卷?病'。 ? 柑橘 速衰病'、?化病'?在40°C/30°C条件下处理7～12周。 鳞 病'?要在40°C/30°C条件下处理8周。 啐?病'?要在50°C条件下处理3～22 时。 亚? —病'在50°C条件下处理30～40分钟。 * 茎尖分生组织培养再生 株 茎尖分生组织培养有两 ˉ?：shoot tip shoot apex； apical meristem apical dome. * 脱' —检? ? 指示 物鉴定(test plants) 所谓指示 物是指具有能够辨别某?病'的专化性症 的寄主 物。 ? 血清鉴定(serologic test) ?管?fi ；‰ 双扩散； ?‰ 吸??定 (ELISA)。 * 脱'苗的`′与ˉ” ? 脱'苗的离体`′与ˉ” ? 建立脱'?苗生产ˉ”网络体 ? 木本 物建立隔离的脱'苗母本园 3．影…脱' —的 * 母体材料病'侵染的程度 * 起始培养的茎尖大 34 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 离体茎尖大 的 薯脱' —的影… 茎尖长(mm) ?原基? 株? 脱' 株? 脱'率˙ ¨ 0.12 1 50 24 48 0.27 2 42 18 42.9 0.6 4 64 0 0 * 体的生理 fl 、离体 性ˉ”(propagation in vitro) 1．离体ˉ”的'般技术 ? 培养物的建立 ? 培养物的?”: ￠ ?”；不定 ?”； 体?”; 组织?” ? 生根培养 ? 生产用苗的培 2．离体ˉ”的 用 ˉ ? 用于?速某些难ˉ” ˉ”速度 ?的 物， 某些?要?要?速ˉ”的特殊 基 ，如名贵花卉、 良…‰、—树 变分离、工程 株 。 ? 用于自然ˉ”极–感染病'的 物，如 薯、 薯、 、 蕉、石竹、fi 。 ? 用于有性ˉ”变异 ˉ过大而自然条件下 不– 性ˉ”的 物，如 ?”、 花竹、￥罗兰 。 3．离体ˉ”的有关a题： ? ‰生长调?fl对品?典 性的影… ? 继代??与变异 ? ?”方式的 理 35 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1??、花药及花 培养 '、 ˉ?及意义 1．ˉ? 花药培养其 体是 物 性生”器官的'部分，就培养方法和技术–讲， 于 器官培养的 ?。 花 培养的精确定义是：将处于'定发 ?˙的花 从花药中分离?–，再? 离 体培养。有时花 培养也称为 孢”培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面– 讲，它 于细胞培养的 ?。 2．单倍体 物的特点 所谓单倍体(haploid)是指具有 ”体染色体?的孢”体( 物 体)。 diploid 物其haploid即为monoploid ? 2n = 2x = 20 n = x = 10 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid 物其haploid为dihaploid 薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆ˇ棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid 物其haploid为triploid 普通 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid 物其haploid为tetraploid 草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28 单倍体 物与它?的?倍体相 ，有 明 的特点： ? 体细胞染色体? ； ? 生长发 ，体fi 、各器官明 ； ? ”严重败 ，有的甚至不能 有性?代。 3．单倍体的 用 36 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 迅速 得纯 材料，缩短 ?年 ? 得 ?中间材料 ? 与 变 ?相 可 提高 变 率 ? 与细胞融 相 ， 这' ? 更具有 际 用意义 ? 作为遗传工程受体更为有 ? 用作基础遗传研究的各 领域 Utilization of haploid cell line ?、花药培养 ??通过花药培养 得单倍体 株成 的是印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。目? 有250 ? 物花药培养成 。 目?，花药培养 得单倍体的技术 在禾本科作物、茄科作物、?字花科作物 的 ?中广泛 用。 37 Haploid cell line Mutation induction and selection of cells Cell habridization Genetic engineering Regeneration of plants Utilization of new forms in breeding and crop improvement 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 花药培养的基本程序是： 体 体(花蕾) 处理— 体 '—剥取花药—接?— 导培养—分 化培养 1． 体的 ：供?材料的遗传背景 供?材料的生理 fl 花 的发 时 –分体 — 孢” — 单核花 — 双核花 ?适 Sunderland (1971)对 草不同花 发 时 的培养 了观察： 花 发 时 体 导 率( ) ?分 0 单核 14 单核晚 40 双核 55 2、花药 处理 大 ? —?明，花药培养? 予'定的? 处理是?分必要的。 草、茄” 3～5°C 72 时 10°C 10～14天 柑橘 3°C 5～10天 薯 4°C 48 时 ? 处理的作用： ? 可 激发花 母细胞产生两 相 核，?不是' ¨养核' 生”核； ? ` 高 的 生活 花 ，同时延￥体细胞组织的衰老； ? 激发花 产生原 ； ? 细胞同?分 。 3．培养基及培养条件 38 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 培养基 ? 花药培养常用的基本培养基：MS˙Murashigc & Skoog，1962¨； Nitsch (Nitsch，1969)；N6(?至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。 ? ??成分： ；激 。 番茄花药培养对 §度的 导 §度 2 3 4 6 10 13 17 导 率 5 10 12 18 25 45 8 花药培养常用的激 有： 细胞分 类： BA— 6-benzyladenine KT— kinetin Zeatin 生长 类： NAA— naphthalene acetic acid I A A— indole-3-acetic acid 2,4-D— 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4 高秀云 对茄”的研究?明： MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT 1mgl-1 n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2mgl-1 ＋ KT 1mgl-1 n 64,1% 2n 35.9% 高§度的2,4-D主要 导花药fi成 组织，而不能fi成 体，从而??了?倍 体细胞发 的机会。 培养条件 度和光? 度：不同 物对 度的要求不同，如： 柑橘在20°C 下， 全不能fi成 体，且 组织fi成亦 ，当将 度提高 到21～25°C时便会有 体fi成，而当 度提高到26°C 时 全不能fi成 体。 菜若将接? 的花药在30°C条件下培养2～3天，可 著提高花 的fi成率， 在33°C条件下培养3～5天，可提高成 率和 苗率。 39 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 光?： 4．花药培养中单倍体fi成的 花药的 ：花药壁(2n)、药隔(2n)、花 ?(n) 培养 花 发 的 根据Sunderland,、Wicks和Norreel的研究，可 把 的花 发 分为 类： (1)、单核—正常分 成' 生”核、' ¨养核。 ' 生”核发 ， ' ¨ 养核发 ， ?者‰ 发 。 (2)、单核—‰ 分 为两 ”细胞， 不?发 。 (3)、异常 核花 ?发 Nitsch(1970)在南洋 花中观察到4核花 发 成 体 Nemec在风 ”中发现，有些 孢”核连续分 3?，fi成类似8核 囊的现象，称为 花 囊。 单倍体 株fi成 ? 通过 体fi成单倍体 株 NAA§度对品?“? 咀”花药 导 体的影… NAA(mgl-1) 0.25 1.0 2.0 embryoid(%) 6.45 1.9 1.11 callus 6.7 9.2 12.9 ? 通过 组织fi成 株 株–‰ 倍性 细胞类 embryoid n 单 花 ? callus n / 2n / 2n+ 单 花 ?、花 细胞与花药壁细胞 40 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 、花 及 孢”培养 1．取材时 的确定 –分体—单核 —单核晚 —双核 —双核晚 — 核 ------------------- --------------------------------------- 孢 ” 花 ? ---------------- ------------------ 花 培养 花药培养 2．花 孢”的分离 3．培养方法 花药§护培养 花 悬浮培养 双层培养 –、单倍体 株的鉴定与?倍化 1．鉴定方法：fifl学鉴定 染色体分析 41 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2．单倍体 株的?倍化：继代?倍 创 法?倍 秋 § 处理?倍 currency1 ?、 物 胎培养 物 胎培养 培养、 珠培养、”房培养、 乳培养。 '、 物 培养(embryo culture of plants) 1． 培养的意义和类 培养在 中的 用意义 ? 克服 ?中 ? 的 夭折 ? 克服珠 干 ，提高 ? 率 ? 理论研究领域的 用 培养的类 成 (mature embryo)培养；幼 (immature embryo)培养 2．幼 培养 Hanning 在1904年就培养了萝卜和辣根菜的 ，发现离体 可 分发 ，并 且提?萌发fi成 苗，这是? 培养? 得成 的' 。 Laibach在1925～1929年间，通过培养亚麻?间 ?幼 ，成 ˇ 得了?间 ?， ? 了这?方法在 际 用中的价?。 李继侗，1933年在银杏培养中发现了 乳提取物能够 银杏离体 的生长。这' 发现为 ? 用 物 乳汁液、幼嫩?”及— 提取液 天然物 培养物生长具有 启示作用。 幼 培养的关?技术：取材时 幼 剥离 培养条件的控制˙是否?要特殊处理¨ 42 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 幼 离体培养的生长发 方式 幼 培养中，常?的生长方式有 ?： (1)、 性发 (embryonal development) 幼 接?到培养基 ，?然按?在活 体￠的发 方式发 ，? fi成成 (有时甚至可能类似?”)，然 再按?”萌发 ?苗fi成 ? 株，这? 发 的幼 '般' 幼 将–就是' 株。 (2)、 萌发(early mature sprouting) 幼 接? ，离体 不继续 性生长，而是 在培养基 迅速萌发成幼苗，通常称?为 萌发。在大 ?情况下，' 幼 萌发成 ' 株，但有时会由于细胞分 产生大 的 性细胞， fi成fi 体，从而可 fi成fi 株，这?现象就是所谓的丛生 现象。 (3)、 组织(callus) 在fi 情况下，幼 在离体培养中 发生细胞?”，fi成 组织。'般–讲由 fi成的 组织大 为 性 组织，这? 性 组织 ￡ –分化fi成 株。 ?、”房培养 ”房培养 授 ?和授 的”房培养。 1942年，La Rue 对番茄、 ˇ生根 (Kalanchoe)、连翅 (Forsythia)和驴蹄草 (Caltha)授 的花连?'˙花梗 了培养，在 机?培养基 得到了正常的— 。 1949年和1951年Nitsch建立了 ?的”房培养技术，他培养了 ?瓜、番茄、菜 豆、草莓和 草 物授 ?和授 的”房，在 的 机?培养基 ，授 的 ?瓜和番茄 得了成 — 及具有生活 的?”。 1969年Nitsch 在 了 授 ”房培养的尝?，并得到了 株，但这些 株是 于?倍体和–倍体的。 1971年Uchimiya 从 授 ?”房培养中 得了 组织和分化的不定根，但 也不是单倍体的。 1976年San Noeum在 授 的大 ”房培养中 ? 得了单倍体 株。 ，相继 在大 、 草、 、 日葵、 、 ?、fi 、 稞、荞 、?魔?、?树 ??? 物 43 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 得了单倍体 株(孔凡 ，1990)。 1．材料的 品?间的差异 囊发 时 大 囊发 时 与花 发 时 的相关性 花 发 时 囊发 时 单核中 大孢”–分体 单核靠 单核至–核 囊 ?核花 ?核 囊 核花 成 囊 2．培养基 物激 的影… fi 授 ”房培养 2,4 - D单独 用 导 率为18.87% 2,4 - D＋6-BA 导 率为33.73% 2,4 - D＋KT 导 率为47.76% 荞 授 ”房培养 2,4 - D单独 用 导 率为7.6% 2,4 - D＋KT 导 率为1.8% §度 §度 在3～10 ?间， 不同 物材料而异，'般是 导培养?˙ §度 要高'些，分化培养时 §度要?'些。 3．接?方式 主要考 两 方面的a题：极性；¨养吸收 4．单倍体的–‰和发 44 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 由?细胞 囊的 ”生”产生单倍体 ?细胞、?细胞、 ?细胞‰可发 产生单倍体 正常发 的大孢”–分体产生单倍体 、被” 物 乳培养 1．ˉ况 乳培养的? 研究始于1933年，Lampe和Mills 了 ? 乳培养。 乳 培养的研究主要 中在 下'些a题的探 ： ? 乳细胞的全能性。在离体培养条件下， 乳细胞是否与其它体细胞和花 ' 样，具有全能性而再生 株。 ? 大 ?被” 物的 乳是 倍体，能否通过 乳培养 得 倍体 株而得到 籽 ；通过 乳培养技术，探索 良农、林及园 物 倍体 ?技术的可 能性。 ? 研究离体培养条件下 和 乳的关 。 到目?为止， 有40 ? 物的 乳 了培养。其中苹—、 、 、 、 、 、 ?、大 、 ˙ 、 、 薯、 、核 的 乳培养得到了再生 株。其它有的 分化除 、根、? 得到 组织。 2． 物 乳的发 特性 物 乳可 分为两大类：被” 物 乳和 ” 物 乳。 被” 物 乳是双受精的产物，它由? 极核和' ”融 fi成，所 ，在染 色体倍性 它 于 倍体组织。 ” 物 特殊，它的 乳在受精?就 fi成。 ” 物的 乳为 ”体的'部分， 由大孢” 接分 发 而成， 此它是单倍体组织。 乳按发 是否fi成细胞壁可分为 ?类 ： 45 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 核 乳 乳? 发 ?过'˙游离核?˙， 大 ?被” 物的 乳 于核 乳。游离 核?˙时间长短 物不同而异。 ? 物游离核时间 物类 fi成细胞壁时的游离核? 4核 还阳? 8核～16核 100核 ?′花、 —、苹—、柑橘 fi核 ? 细胞 乳 和核 乳不同，细胞 乳的发 不?过游离核?˙而按正常的细胞分 方式 。 乳 生核currency1'?分 即fi成两 ”细胞， 每?分 都fi成细胞壁。某些 花 物，如 草、 麻、 及番茄 是 于?类。 ? 生目 乳 生目 乳是核 与细胞 ?间的中间 。 生 乳核currency1'?分 为细胞 ， 两 细胞中的核 游离核分 。 3．影… 乳培养的 乳是'?独特的组织，在被” 物中它是双受精的产物，在倍性 于 倍体， 事 ??培养 乳的 要目的也是为了 接 得 倍体 株。 ? 乳的发 时 ? 物 乳培养的? 时间(授 天?) 大 10～12天 ? 瓜 7～16天 ˙ 7～14天 46 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 基 ? 培养条件：高§度的生长 、 高的pH ? ” 4． 乳培养的fifl发生 ? 组织fi成 ? 器官发生 思考题 1． 用茎尖分生组织培养脱除去 物病'的原理。 2．哪些 会影…茎尖培养的脱' —？ 3．对于生根 难的 物脱'在培养方式采用哪些 ？ 4．微ˉ”中 的?”方式有哪些？各有何特点？ 5．为什么用于ˉ”的组培技术要 ‰ 用 ‰激 ？ 6．通过离体培养 得单倍体的 有哪些？ 7．花药培养中如何 体？ 8．花药培养与花 培养有什么不同？ 9．花药培养过程中花药为什么要?过? 处理？ 10．花药培养时为什么要用 高§度 和 ?§度激 ？ 11．花培中再生 株的fi成 与再生 株倍性有何关 ？ 12．幼 培养的关?技术是什么？ 13．幼 培养时 的发 方式有哪 ?？各有何特点？ 14． 授 珠”房培养与授 珠”房培养有何不同？ 15．在 际 作中如何确定 囊的发 时 ？ 16． 物 乳有哪些类 ？ 47 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency15￥ 物细胞培养与?生产物生产 ˙5学时¨ 教学目的与要求： 深 了解 物细胞在离体条件下的生长特性，掌握 物细胞悬浮 的建立 及?细 胞的筛 方法。 currency1'?、悬浮培养(suspension culture) '、悬浮培养 悬浮培养是指将单 游离细胞 细胞团在液体培养基中 培养?”的技术。 1．起始培养物的建立 ? 适宜的 体：幼 、 轴、”?是?常 用的 体。 ? 适宜的培养基： 高§度激 §度；必要的??物 。 ? 组织的要求： 散性好、?”快、再生能 2．悬浮 的建立 3．悬浮细胞的生长与?” 悬浮培养与?体培养 有 点：'是??培养细胞与培养液的接?面， 善 ¨养供 ；?是在 条件下可 ‰细胞代·产生的有害物 在局部积累而对细胞自 48 Cell suspension Secondary products Isolation protoplasts Mutation select Artificial seedsPlants 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 产生'害； 是 培养可 适当 善气体的 。 影…悬浮细胞生长的 ： ? 起始 组织的 ? 接?细胞密度 ? 培养条件：方式、 度、 ? 继代周 ' 成 的悬浮细胞培养体 必须满足 条件： ? 悬浮培养物分散性良好，细胞团 ，'般在30～50 细胞 下，在 际培 养中 有 全由单细胞组成的 物细胞悬浮 。 ? ‰'性好，细胞fi 和细胞团大 大致相同。悬浮 观为大 ‰'的 ?， 培养基清 ˙亮，细胞色 的乳? ??色。 ? 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长 '般2～3天甚至更短时间便可??'倍。 currency1 ?、 物细胞大o 培养与?生代·产物生产 '、ˉ? 物?生代·产物是指 物中'大类并 物生长发 所必?的 分”有机化和物， 其产生和分布通常有? 、器官组织和生长发 的特异性。?生产物在 物中的 成与 49 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 分解过程称为?生代·。 1． 物产生代·产物的类 物?生产物?类ˉ ˙据`￠￡ 过2??¨，根据分” 不同大致分 为： ￥类化 物 ??类 单￥类 § 类˙ §、currency1§、'§¨ “类化 物 “?? ?体?? 单“、倍 “、?“ 化 物 生物 ˙真生物 、fi生物 、原生物 ¨ 类˙ 、fl、 、 ¨ ?? ?基酸 生–? ?类、有机酸 2． 物?生代·产物在医药、?品、轻化工业 领域具有重要意义。 李时·˙1593¨在 本草 目 中所开列的?????药物 大 ?是 物药物，目? ?有 ?? 的法定药品–自 物。其药物的有 成分‰为?生产物。 fi 物?生代·产物是 良的?品 ?fl和名贵化”品原料。有些是生物' 的 主要–‰，可 用于 虫、 ，而对`′和?畜 害，是理想的``产品。 ?．o 化细胞培养是生产 物?生产物的理想 ? `护生fl`′ ? 提高生产 率 ? 发 生物技术产业 50 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 –自于 物体和细胞培养的￥草宁 生产方式 生产周 ￥草宁 ˙ 干重¨ ? 株 2～3年 1～2 物细胞培养 3周 14 Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with parent plant material. (After Fowler, 1983) Chemical product plant Cell yield (% DW) Whole plant yield (% DW) Ratio cell yield / whole plant Glutathione N. tabacum 1.0 0.1 10 Nicotine N. tabacum 5.0 2.1 2 Anthraquinones M.citrifolia 18.0 2.2 8 Rosmarinic acid C. blumei 27.0 3.0 9 Ajmalicine C.roseus 2.2 0.3 7 SErpentine C. roseus 1.8 0.5 3 Diosgenin D.deltoidea 3.5 2.0 2 物?生代·产品的…? 能 产品成分 用 年‰ ?˙ 美 ¨ 长′花 治`?血病 18～20˙美国¨ ′? ?` 统障碍药 5～25˙全? ¨ 宁 治`ˉ? 5～10˙美国¨ 致 虫fl 20˙全? ¨ ˙ˇ? 病药 20～55˙美国¨ 51 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 Stages in the development and operation of a plant cell biotechnology process 物细胞大o 培养的技术要求： 从工程的¨度讲必须要 '?研究和开发适宜于 物细胞生长和生产的生物 器， 建立? 的控制和调? 统； 从培养技术方面讲必须满足 下 条件：培养的细胞在遗传 是?定的， 得 到产 定的产物；细胞生长及生物 成的速度快，在 短的时间￠能得到 高产 的 Source Plant 52 Single stage Upsteam Development Production Phase Downstream Processing Biomass and/or medium Product extraction Product purification Two-stage Immobi- lized reactor system Callus Or Suspension Culture established Bioactor For ‘seed’ culture 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 终产物；代·产物要在细胞中积累而不被迅速分解，?好能将其ˇ放到培养基中。 ?、培养 统 1、悬浮培养 统 液体悬浮培养 统基本原理与 ? “悬浮培养方法'致，但大o 培养所采用 的? 及控制技术 “ o 培养要复 的 。 ? 机? 式培养 统 机? 式生物 器通常是在微生物发 ?的基础 ? 的，根据 物细胞 的特性，其? 要求在微生物发 ?的基础 作如下 ： ?要 切，'般 ??式为?ˇ式； 为 物细胞生长周 长，?要随时— 分和¨养， 此必须? ?液 ?；由于 物细胞的生理活??要 气，且细胞代·也可能产生有害气体， 所 必须? 通气 ?； 为便于取样观察，'般还? 有取样口。 ? 气 式培养 统 考 到机? 式 器的 切作用难 ‰，同时 器 ?的中轴‰‰是￡– 培养物污染的部—， 此，发 ? 气提?式生物 器，但其?点是 不‰ 。 ? ˇ 式培养 统 '般用于产品中? 某些必? 解细胞才能 得目的产物的培养，其 点是控制精 确，处理?活，?点是培养体积 。 2、?定化培养 统 这'技术的 点在于： ? 可 ￡–ˇ控制培养 统的理化`′，从而可 研究特定的代· ，并便于调 ?； ? 细胞—?的?定 其所处的`′类似于在 物体中所处的 fl，相ˇ间接?密切， 可 fi成'定的理化梯度，有 于?生产物的 成； ? 由于细胞?定在 物 ，培养基可 不?更 ，可 从培养基中提取产物，‰除 了培养基中 有过 的 生产物对细胞代·的 制，也由于细胞?在 器 中， 的培养基可 再? 用这些细胞生产 生产物，从而? 了生产细胞所 ? 的时间和 用； ? 正是由于细胞?定在'定的 中，并可 从培养基中不?提取产物， 此，它可 连续生产。 细胞?定化培养技术按?其 物不同可 分为两大类： 53 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 式?定化培养 统： 物 采用琼脂、琼脂 、 酸?、 ； ? ?着式?定化培养 统： 物采用 网、 ?o泡 、中 纤维 材料。 、 物细胞o 培养技术要点 1、细胞 的建立和 2、 良细胞 的?”培养 3、大o 培养体 的建立 培养方式的 ： ? 间 培养 ?间 培养 两 间 培养 ? 连续培养 单 连续培养 连续培养 回 式连续培养 ? ?定化细胞培养 –、影… 物细胞培养及?生产物 成的 1． 物细胞生长与产物 成的关 ? 生长?? 产物 成与细胞生长成正 。 ? 中间 产物仅在细胞生长下 时 成，细胞处于指?生长 止生长产 物都不 成。 ? 生长?? 产物 成在细胞生长 止 。 2．影… ? ￠ 细胞的遗传特性 母细胞 体的生理 fl ? 度 pH ¨养 况 通气 况 生长调? ”：激 、?体物 54 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1 ?、单细胞培养技术 '、细胞 a培养 主要技术要点是： ? 单细胞的分离； ? 单细胞悬浮液的制 ； ? a ? a率 ￡：这是 a培养中常用的' 术 ，用– a 率的高?。它 能长?细胞团的单细胞在接?单细胞中所占的 –?示。 a率( ) (fi成的细胞团?/接?的细胞?)×100 ?、§护培养 、微“培养 思考题 1．' 好的悬浮细胞 有哪些特?？用于建立悬浮细胞 的 组织有何要求？ 2．建立悬浮细胞 的关?技术有哪些？ 3．悬浮细胞 在继代培养中其群体生长o 。 4．细胞大o 培养有哪些培养 统？ 5． 物细胞o 培养与?生产物生产?景及?要研究解决的a题。 55 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1 ￥ 原生 体培养˙4学时¨ 教学目的与要求： 深 了解 物细胞 能与细胞全能性?“的关 ，掌握原生 体的分离 及培 养过程中?˙ 和激 的调控原理与技术。 currency1'?、原生 体研究ˉ况 '、原生 体的ˉ? ? 原生 体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞 是说' 被 膜所 ˉ的 细胞。 ? 亚原生 体(subprotoplast)：在原生 体分离过程中，有时会引起细胞￠ 物的? 而fi成'些 的原生 体就 亚原生 体。它可 具有细胞核 没有细胞核。 ? 核 体(nuclearplast)：由原生 膜和薄层细胞 ˉ细胞核fi成的 原生 体。也称 为微 原生 体(miniprotoplast)。 ? 胞 体˙cytoplast¨：不 细胞核而仅 有部分细胞 的原生 体。 ?、原生 体研究 物原生 体培养研究中 ?得提?重要成就： ? 1880年，Hanstein ?起用原生 体(protoplast)'?。 ? 1960年，Cocking ? 用 法制 番茄根原生 体 得成 。 ? 1971年，Takebe et al. ?得到 草?肉原生 体培养的再生 株。 ? 1985年，Fujimura et al.currency1' 禾?类作物 原生 体培养再生 株。 ? 1986年，Spangenberg et al.单 原生 体培养再生 株在 菜 得成 。 据统 ，目? 有49 科，146 的320 ? 物?原生 体培养得到了再生 株˙1993¨。其 ? 农作物和??作物为主，但从'年生 年生、草本 木本、高 物 ? 物扩 。 56 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 、原生 体研究的意义 57 Protoplast system Ontogenic processesCell differentiation Organogenesis Regenerative ability Somatic genetics Cell physioloy Cell fusion Organella, DNA uptake Cell cloning 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 A scheme of plant protoplast currency1??、原生 体的制 1、用于分离原生 体的材料准 ? ?管苗?片 ? 轴和”? ? 培养细胞 58 Tuber plants Suspension cells Epicoty Pre-treatment enzymolysis Purification Vigour test Cuture and regeneration 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2、 处理 原生 体分离常用的 品 – ‰ 生产?家 纤维 类 onozuka R–10 色木? Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 色木? Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan —胶 类 Macerozyme R-10 根? Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase ˙?? Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 ˙?? Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 纤维 Rhozyme HP-150 ˙? Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase ˙?? Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA ￠fl及其?˙ ￠fl：原生 体培养基 特殊 制。 ?˙ 调?fl： 、 、o 。 §度及 解时间 59 解 时 间 § 度 解 度 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 3、原生 体的收 和纯化 ? 浮法：常用的 浮fl有 、Percoll、Ficoll。 ? ?fi法：常用 作为?˙ 调?fl， 将 液洗?干 ，再用Percoll 浮'?。 4、原生 体活 检? ? 目?法：在 微 下观察，根据细胞fifl、 ?性确定原生 体活 。 ? FDA法：FDA˙? 酸 光 ¨是'? 极性物 ，能自由ˇ ?细胞 膜，在活 细胞￠，FDA被o 解即发 光˙ 光 ¨，由于 光 不能自由通过 膜， 而可 在 光 微 下通过具 光的细胞的观察确定细胞活性。 ? 凡 法： 凡 不能 过 膜，只有 膜受到严重损坏 ，细胞才能被染色， 而可 通过细胞被染色与否确定活性。 5、影…原生 体活 的 ? 分离材料的生理 fl ? 解条件： 、§度、 解 度、 解时间、 ￠液的?˙ ? 分离条件：离 ??、离 速度、纯化方法、分离 续时间 ? `′条件： 作`′的 度、分离用具的影… currency1 ?、原生 体培养 '、培养基 1．?˙ 常用的?˙ 调?fl： 、o 、 和 。 原生 体的?˙ 原则：培养基?˙ 与细胞?˙ ?。 60 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2． 机? ? 大 §度； ? NO3 和NH4+的 ； ? Ca2+§度 3．有机成分 维生 、?基酸、 及 ， 母提取物、 解o??。 4．激 常用的激 ：NAA、IAA、BA与2,4-D 5．pH? –、 原生 体培养方法 ? 液体 层培养 ? ?体培养 ? 液体 ?体双层培养 ? 琼脂 珠培养 ?、 组织fi成和 株再生 ? 细胞分 与细胞壁再生 ? 组织fi成 ? 组织分化 ? 株再生 currency1–?、影…原生 体培养的主要 '、基 ? 的? ￥ 明 ? ?肉原生 体的不同生长发 时 是受不同基 所控制的。 61 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 通过番茄与 番茄有性 对性 分离的遗传分析， 明其 组织的再生能 是2 性基 所决定的(Koornneef M et al.,1987).。Cheng和Veilleux(1991)对 薯 (S. Phureja)原生 体的培养能 也 过遗传分析，并 明从原生 体培养到fi成 组织是受2 独立—点的 性基 所控制(Cheng et al., 1991)。 ? Dudits ˙1991¨用 ?(Medicago sativa)不同基 了 深 的研究，认为有某 基 在离体培养时难 fi成细胞 。但是，如—将对激 调?有作用的发根农 的rolB和rolC基 引 并?“，就可能 其体细胞 fi成。 ?、原生 体的–‰ ? 供体材料体类 ? 供体细胞的分化程度 ? 供体细胞的生长同?性 、起始培养密度与培养基 ? 基本起始密度 ? 培养基激 ? 密度与培养基¨养成分 全性 –、原生 体培养中的'些生理a题 1．逆′ ? 细胞壁 解 是'?逆′ 导fl， 此可 产生活化?引起脂类过?化， 细胞 度同时 随着细胞膜的??(Ishii H.,1988)。 ? 细胞的逆′ '般是快速ˇ产生涉及 发不同代· ˙ 如 基 ? phenyl-propanoid route¨的 统， —fi成了 物 ' (phyto-alexins)和如木 '类的 物。 ? 有些逆′ 对原生 体制 和培养是不 的， 如在?菜原生 体制 时由于某 些 的活性? 得fi成类脂过?化物(lipid peroxides)， —引起原生 膜的?化 损 。而对 薯原生 体活 的损 ?是由于 产生所致(Perl Aet al.,1991)。 2．修复机理 62 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 原生 体分离时会ˉ失'些不同的细胞 。 原生 体中细胞骨 的组分、 、 方 发生变化，?常?的是引起细胞极性的 变(Simmond D H., 1991)，同时也会干 膜的?? 统。 ? 原生 体修复其 膜及其中的?? 组分的能 ，细胞壁再生的能 及细胞骨 的 修复修复和调?能 都对它?能否 '?发 有 大影…。 3．细胞脱分化与细胞分 ? 分离的原生 体原–的细胞 fl常常会影…脱分化的 。 ? 细胞在培养 的'些变化，如液泡 失、细胞体积??、细胞 变§，核??体? ? ，与此同时DNA开始复制，随 染色 变§，原生 体脱分化成为类似分生 组织 fl的细胞。 ? 原生 体培养 的细胞分 至 涉及到 下 ”：细胞壁的再生、细胞骨 的修复与调?、原生 体分离时细胞所处的周 ˙G2 细胞具有 高的分 率¨。 ，细胞壁的再生与DNA的 成—调与否也会影…细胞分 。 ?、原生 体研究的 ? ?密度和单 原生 体培养； ? 原生 体衍生 统如微 原生 体、胞 体、核 体的 用； ? 单倍 ”体如花 原生 体培养； ? ?机控制 统、 式细胞光度 技术的 用。 思考题 1．原生 体、亚原生 体、微 原生 体和原生 球的ˉ?。 2．为什么原生 体要培养在 ?培养基中？ 3．影…原生 体培养的主要 。 4．原生 体的培养方法有哪些？各有何 ?点。 5．性细胞原生 体的?类、分化 及 用领域。 6．为什么说原生 体培养 统是现代生物技术的 体？ 63 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1?￥ 体细胞 ˙4学时¨ 教学目的与要求： 在 '?认识原生 膜性 的基础 ，深 了解细胞融 的基本原理，掌握 融 和 融 的基本方法。 currency1'?、体细胞 的ˉ? 体细胞 ，即原生 体融 。 物细胞 的 重要 1960年，Kocking用 法制 高 物原生 体 ? 得成 ； 1970年，Power ?用 酸· 为 导fl 了 大o 的原生 体 导融 ； 1971年，Takebe ?从离体 草原生 体培养中 得再生 ? 株； 1972年，Carlson ? 得 草和郎? 草的细胞 ?，这也是currency1' 物细胞 ?； 1974年，Kao将 ? 导融 法 用于 物细胞融 并建立了相 的融 技术； 1978年，Melchers 得了currency1' 间细胞 ?˙番茄＋ 薯¨； 1981年，Zimmerman发明了 融 仪，并 ?提?了 融 ˉ?； 1987年，Schweiger建立了单对原生 体 融 技术程序。 根据融 时细胞的 ?程度，原生 体融 可分为两大类： ? 对称融 ˙asymmetric fusion¨ 即两 ?的细胞原生 体融 。 ? 对称融 ˙symmetric fusion¨ 用物理 化学方法 某?本的核 细胞 失活 再 融 ，它可 分为 ?： 用于细胞核 细胞 失活的方法分为物理和化学两大类： ? 物理方法常采用o?处理，如Xo?、o? ，它?能 细胞核失活； ? 化学处理目?常用的?fl有，核失活 碘 ˙IOA¨、碘 酸(Iodoacetate)； 失 活 罗丹明˙R 6 G，它是'??脂染料，能够 制??体的?化 酸化过程而 “到失活作用。 64 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1??、原生 体的融 '、融 方法 1．PEG 导融 法 ? PEG 导融 的特点：其 点是融 成本?，勿?特殊? ；融 ”产生的异核率 高；融 过程不受物? 制。其?点是融 过程ˉ琐，PEG可能对细胞有'害。 ? PEG的作用机理： Kao 认为，由于PEG分”具有轻微的负极性，故可 与具有 正极性基团的 、?? 和碳 化 物 fi成H?，从而在在原生 体?间fi成分 ”…，其 —是 原生 体发生粘连 而 原生 体的融 ； ，PEG能?? 类脂膜的 ?性，也 原生 体的核、细胞器发生融 成为可能。 ? 融 技术要点： 融 液：CaCl2·2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol o 0.5~1.0mol pH 5.6 65 P1 P2 P1 P2 ? 静止1min. 融 融 液 ? PEG 稀 ˇ 洗 涤 ? 稀ˇ液 ? 培养基 培 养 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 导液：融 液＋PEG 20～45 稀ˇ液：A液˙g/100ml¨pH6.0 B液˙g/100ml¨pH10.5 7.21 ?酸 0.375 CaCl2·2H2O 0.79 NaOH 0.169 DMSO 10ml 2． 融 法 ? 与PEG融 起–， 融 有 大 点：'是不′在对细胞的'害a题；?是融 率高； 是融 技术 作简便。 ? 融 仪的 特点：'是 变 ?部分；'是高 击部分。 ? 融 的基本过程： 细胞膜的接?：当原生 体?于 导率 ?的￠液中时， ?通 ， 即通过 原生 体而不是通过￠液，其 —是原生 体在 ?作用下极化而产生?极”，从而 原生 体紧密接?排列成串； 膜的击 ：原生 体成串排列 ，立即 予高 脉冲就可 原生 膜击 ， 从而导致两 紧密接?的细胞融 在'起。 ? 关于融 ??： 融 中的主要?? 、 变 ?的 幅 率、 变 ? 的处理时间； 高 、脉冲宽度、脉冲?? 。 ?、原生 体的融 过程 66 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 、影…原生 体融 的 ，原生 体 对细胞的融 起着至关重要的作用，高 的原生 体是细胞 融 的 要条件。 其?，融 方法 其 是融 ??， 各?融 液都 适当。 currency1 ?、 ?细胞的发 ?fl及体细胞 ?鉴定 '、 ?细胞的发 ?fl 核 重组 细胞器重组 部分核物 细胞器ˉ失 核分 的 同?性 ?、体细胞 ?的特点 fifl 的 中性 变异幅度大 ?倍性 双?性 的共 性 偏?现象 、 ?细胞的 统与 ? 株的鉴定 1． ?细胞的 统 ? 观 ? ˇ— ? 光 记 67 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2．体细胞 ?的鉴定 ? fifl鉴定：根据双?的fifl学性 观察 鉴定。 ? 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 ? 生化鉴定：同 鉴定。 ? 分”鉴定：RFLP鉴定、RAPD 记鉴定。 ?、体细胞 ?的遗传特性 1．细胞分 与染色体ˉ失 如—细胞分 而核不发生融 ，在 的发 过程中就会有两? —，'是细胞 分 ? 即 止生长从而导致死?；?是在发 过程中某'?本的细胞核部分 全 部ˉ失。如—这样就会产生 ?情况：A细胞＋B细胞 ；A细胞＋B细胞 和部分染色 体 基 。 2．基 移与性 ?“ 由于染色体的部分ˉ失，常常 某 ?本的部分 别基 与 '?本的染色体 发生? ，其 —是 现了?本间的基 移。基 移通常是在 代中某些性 得 ?“，有时由于基 的重组也可能产生双?‰没有的 性 。 3．体细胞 ?遗传 的不?定性 体细胞 ? 代在遗传 常常不?定，这可能涉及到 方面的 ，如?缘关 的远 、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞 遗传物 的重组 。 currency1–?、体细胞 ?的 用 '、体细胞 ?的 用 1、 物 ?中的核 2、 细胞 ?的 得 3、 远缘 创 物? 4、 细胞器的ˇ作研究 68 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ?、体细胞 面临的 难 1、 融 特性的高 性 2、 ?细胞的培养和 3、 ?的遗传?定性控制 、体细胞 研究的发 1、 导融 及 ?细胞的各?生理、生化、遗传机理的研 究 2、 融 的程序化控制研究 3、 各?类 原生 体˙胞 体、核 体、细胞器¨的制 技术研究 4、 ?细胞培养技术的程序化研究 思考题 1． 物体细胞 的ˉ?和类 。 2．对称融 和 对称融 的ˉ?及 对称融 的作用。 3．PEG融 与 融 的原理及影… 。 4． ?细胞的 方法。 5．如何用分”生物学方法鉴定 ? 株？ 6．通过哪些 可 原生 体的遗传饰变？ 7．体细胞 技术的 用及还?要 '?研究解决的a题。 69 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1?￥ ?工?”˙2学时¨ 教学目的与要求： 了解 物?工?”的ˉ?与发 ˉ况；掌握 物?工?”ˉ”体的培养技术；了解 不同ˉ”体的?工?”特点与制 方法。 currency1'? ?工?”的ˉ? ?工?”˙artificial seeds¨ 称 成?”˙synthetic seeds¨ 体细胞?” ˙somatic seeds¨。 何'?ˉ”体， 论是在涂膜胶囊中 裹的、 的 ?过干燥的， 只要能够发 成 ?的 株，‰可称?为?工?”。 根据 被的?要程度可分为 类： currency1'类是 的 休眠的ˉ”体，如可 适当干燥的体细胞 ˙如鸭˙草的体细胞 ¨、休眠的微鳞茎和微块茎 ，它?在不? 被的情况下也具有 高的成株率； currency1?类为?工? 被的ˉ”体，'些体细胞 、原球茎 不能过度干燥，但只 ??工? 被即可维 良好的发 fl，如胡萝卜体细胞 ； currency1 类是 凝胶 再 被?工? 的ˉ”体，大 ?体细胞 、不定 、茎尖 ‰ ?要 在 液fl凝胶中，再??工? 裹才能 ‰失 ，从而维 良好的发 能 。 与?管苗技术和自然有性ˉ”?”相 ，?工?”具有 下突?的、甚至是不可取 代的 点： 其'，在 性ˉ” 物中，有可能建立'?高 快速的ˉ”方法，它 能` 原有 品?的?性， 可 ?具有 生苗的复 ； 其?，可 对 异 ??”不通过有性制?而快速 得大 ?”，特别是对于那些 制? 难的 物更具有重要的 用意义； 其 ，对于'些不能正常产生?”的特殊 物材料如 倍体、 ?倍体、基 工程 物 ，有可能通过?工?”在短 ￠?大ˉ” 用； 其–，与田间制?相 ，可 ? 制?用ˇ，且不受 ? 制，可 现工?化生 产，同时还 ‰了?”携?病原 的危险； 其?，与 用?管苗相 ，可 ‰移栽 难，且可 现机?化 作，同时还便 于储藏和 输。 currency1?? ˉ”体的类 及其生产 70 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 '、不同类 ˉ”体 1． 导培养方式 体细胞 ： 体细胞 的 导和fi成?要?过至 两 ?˙：currency1'?˙，在 高生长 §度的培 养基中， 导培养 性细胞；currency1??˙，在 ?生长 生长 的培养基中fi成体细 胞 。 微 ：'般只?' 培养程序，但有时为了??ˉ”体的? ，也? '定?? 的继代。 微 变fl器官：?要?过不同的 导程序。 2．不同ˉ”体成苗率 ?8.1 不同ˉ”体成苗所?时间及成株率* 物 ˉ”体类 正常株? fi分 正常株? fi分 成苗所?天? 茶树 体细胞 17 17 83 83 10～60 不定 77 77 13 13 20～25 华腺萼木 体细胞 47 53 42 47 40～60 不定 466 93 34 7 20～25 * 引自陈正华 ˙1998¨。 ?、ˉ”体的生产 作为?” 用的ˉ”体， 必须要有 高程度的'致性。这?'致性除了遗传学 的'致性 ，还 生理 的'致性。 1．体细胞 的o 化生产 2．微 ¨养变fl器官ˉ”体的培养 3． ˉ”体的培养 currency1 ? ?工?” 被 71 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 '、ˉ”体的 处理 体细胞 适度脱 干燥和 制休眠； 微 变fl器官ˉ”体?面 '处理； 为ˉ”体的老化处理。 ?、ˉ”体的 ?8.2 ? 物?工?”的??成分及成苗率 物及ˉ”体 海 酸·§度˙ ¨培养基及 §度 激 及??成分§度˙mgL-1¨ 成苗率˙ ¨ –会 柑体细胞 3 MT，4% GA(1), IBA(0.25) 30-70˙ ¨ 唐菖蒲 球茎 4-5 MS，1.5% IBA(0.5), GA (0.1) 93˙ ¨ ?兰花球茎 4 良MS NAA(1.0), BA (0.2) 95˙ ¨ ?桉微 4 良SH NAA(0.2-0.5) 80-90˙ ¨ 体细胞 6 1/4MS GA (1), 防腐fl (200), IAA (0.2), 活性炭 45˙有 ¨ 海 酸·作 的 作程序是： 在 制好的海 酸·￠液中，按'定 ? ˉ”体并? ，然 将其逐滴滴 2.0% ～2.5%的CaCl2￠液中，?20～30 min的离” 作用，即能fi成 有ˉ”体并具有' 定刚性的 球珠˙bead¨，再用 漂洗20 min 终止 。此时的?工?”是'?胶囊 ，将其晾干 可贮′ 播?。 、?工? 的研制 72 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 理想的?工? ?是：具有'定的封闭性 ` ?工 乳的各?成分不– 失； 同时 具有良好的˙气性， ` ˉ”体维 生理活性的?要；此 ，还 有'定的坚 ”度， ? ?工?”的耐储 性和适于机?化 作；但同时 要求其 ' 害，能` ˉ”体顺 ˙发 。 currency1–? ?工?”的发 和 用?景 ?工?”从根本 –说是 物离体快速ˉ”技术的延伸和发 。 与常o离体ˉ”技术相 ，除了有离体ˉ”所具 的所有 ，在 用 还有更 在的 点： ，?工?”可 贮藏， 而可 周年生产， ‰了?管苗 用中由于 ?性生 产而?–的诸 矛盾。 其?，?工?”可 接播?， 了?管苗移栽在 作和管理 的 难，可 现机?化 作和常o的田间管理。 其 ，由于可 长距离 输， 此，?工?”可 建立相对 中的大 生产企业， 现…‰和技术 化。 '、微器官?工?”可能? 用于 性ˉ” 物 ?、?工?”可用于天然?”ˉ” 代群体变异大的 物 、 体细胞 为ˉ”体 用的可能性及?要注意的a题 思考题 1．?工?”的ˉ?和类 。 2．?工?”对ˉ”体有什么特殊要求？ 3．目??工?”生产中?要研究解决的主要技术a题。 4．目??工?”?适于在哪些方面 用？ 73 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1?￥ 物? …‰离体 ? `′ ˙?学时¨ 教学目的与要求： 了解 物? 离体`′的类 与特点；了解 ? `′的特点与方法； 物 物? ? `′的基本 作技术。 currency1'? ˉ ? '、 物? …‰? `′意义 防止…‰? ? ? 物 便于 ?、 ? `′的ˉ? ? …‰? `′˙cryopreservation¨是由cryo和preservation组成，在 中cryo 为'?缀，被解ˇ为? 、￡、冰、霜?意。从?义§，? 所涉及的 度 ˉ是不确定的。 习惯 ，??将 80°C 下的? 称为 ? ，干冰 度˙ 70°C¨称为极? ，? 则从4°C‰下¨˙李广武 ，1998¨。对 物而 ，? 常常是指那些 常 稍?' 些的 度。如—? 过细胞原生 所能忍受的临 度，就会致 物细胞遭受冻害 而死?。如? 树发生冻害的临 度通常在 6.5°C，枳壳通常在 20°C ˙沈德§ ，1986¨。 目?常用的 ? `′方法可分为两类，即￡冻 导`护性脱 的 ? `′和 化处理的 ? `′。在 ? 条件下，生物的代·和衰老过程大大 ?，甚至 全 止， 此可 长 `′ 物材料。 、 ? `′的研究ˉ况 1． ? `′技术的发 2．用于离体 ? `′的 物材料 3． ? `′的 物?类 74 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? `′ 涉及到不同的 物?类，如野生及?工创 的?类、豆类、薯类、 类、 类、纤维类、蔬菜类、—树、树木、药用 物和 类 。 currency1?? 物材料 ? 冻′的细胞学基础 '、细胞￠ 的冻 fl是细胞冻′技术的关? 物细胞中 有大 的 分， 占细胞 重 的60～90 。细胞中的 是由游离 和束缚 组成，其中游离 占90 ， ￡–冻 。由于细胞￠ 有复 的化 物，细 胞￠的￠液并不象纯 那样在0°C 冰。 理论 讲，细胞 的冻 度为 5～ 15 °C，细胞￠游离 的冻 在 25°C。 30 °C时，细胞 ?没有 冻 fl的游离 ′在，而 在 100°C 度下也不 冻 。根据Luyet的冻 理论˙Luyet 1937¨，细胞游离 的冻 度˙ 30°C¨可被认 为是细胞冻′的 全 度， 而细胞冻′的两?冻 法是 30°C为基础的。 控制细胞￠ 的冻 fl是细胞冻′技术的关?。 ?、 物细胞 ? `′过程中的致死损 细胞 ? `′有 重要 作?骤：'是细胞 冻；?是细胞在 196°C下长 贮′； 是细胞解冻。 物 ? `′技术建立在生物细胞冻害和 冻机理的基础? 。? ? `′ 成 的关?，在于 冰冻过程中 ‰细胞￠ 冰。为此，?对不同?类的 物材料， 筛 适 的冰冻`护fl，采用适当的 冰冻速度和化冻方式，可能 细胞不受损 损 到??程度。 currency1 ? ? `′的方法 ? `′ 物? …‰的程序 培养材料的准 、 处理、冰冻及`′、化冻处 理、细胞活 和变异的 价、 株再生 ? 。 '、传统的 冰冻方法 1．快速冰冻法 75 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2．?速冰冻法 3．两?法 4．逐 冰冻法 ?、 化`′方法 化˙vitrification¨是指液体 变为 晶体˙ fl¨的?化过程。 ￠液 化有两条 ：'是大幅度提高￡?速率；?是??￠液§度。 1． 化法 化法是将生物材料?极高§度的 化￠液快速脱 ， 接投 液 ， 生 物材料连同 化￠液发生 化 变， fl。此间 分”没有发生重排，不fi 成冰晶，也不产生 和体积的 变， 而不会对材料 成 害。`′终止 ，复 时 要快速化冻，防止去 化的发生。材料能 全度过￡?和化冻两 关口，就可` 冻 ′的成 。 2． 化法 化法是 脱 法和 化法的 。 `′材料 用 酸? ，然 ? §度梯度脱 和 化￠液处理 接 液 `′，其材料′活率 用 —脱 法要高，可能是 酸? 轻了 化￠液的 '性。 、其它 ? 冻′方法 1．干燥法˙desiccation¨ 2． 培养法˙pregrowth¨ 3． 培养-干燥法(pregrowth-desiccation) 4． 脱 法˙encapsulation-dehydration¨ currency1–? 影… ? `′ —的主要 76 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 '、材料的基本特性 材料的基本特性 物的基 、 冻性及器官、组织和细胞的年龄 及生理 fl。 不同基 的 物离体材料对 ? 冻′的 各不相同。 ?、 培养和? 锻炼 处理对于调? 物离体材料的生理 fl 常有 。通过 处理的 物材料， 了细胞￠自由 的 ， 细胞能?受? 胁迫， ‰了￡冻 害，可大大提高 材料的 冻 。 、冰冻`护fl的 用 　　'般的生物体在没有 ?冰冻`护fl的情况下?历? 是 难′活下–的。所 ， 生物体的? `′离不开冰冻`护fl˙cryoprotective agent，CPA¨。冰冻`护fl也称作 冻fl， 理ˇ 冰冻`护fl，对? `′至关重要。 冰冻`护fl 具有 下特点：–￠于 ，对细胞 '，￡–从组织细胞中清除。冰 冻`护fl的作用主要?现在??膜˙性，?速细胞￠的 到细胞 冰，?定细胞膜 ，阻止? 害， ?冰点，提高￠液的粘滞性，阻止冰晶生长。 　　 ?˙ 冰冻`护fl： ?分”中性物 ，在￠液中– 分”，发生 作用， ￠液的粘性??，从而 化了 的 晶过程，“到`护的目的。常用的?˙ 冰冻` 护fl有 、? 亚砜˙DMSO¨、 ? ˙EG¨、 、 ? ˙PG¨ 。但?˙ 冰 冻`护fl 用§度、? 细胞的能 、对 分”活性的影… 各不相同，如 适宜于? 速￡?，而DMSO?–于? 细胞，并在常 下稍有'性。 　　 ?˙ 冰冻`护fl：能￠于 ，但不能 细胞，它 ￠液 过￡ fl，可在特 定 度下 ?￠ ˙ 解 ¨§度，从而起到`护作用。 ?˙ 冰冻`护fl主要有 咯??˙polyvingyl pyrollidone，PVP¨、 ˙sucrose¨、 ˙ ˇ 酐， dextrane¨、 ? ˙polyethylene glycol，PEG¨、???˙albumin¨、? 基fi ˙hydroxyethyl starch，HES¨ 。此类冰冻`护fl对快速、?速￡?‰有`护 —。 –、化冻方法 液泡 、 的细胞˙如茎尖分生组织¨，可采用快速化冻的方法。液泡大、 高的细胞则'般?要采用?速化冻法。 生长 ?中的材料，'般在37～40°C 浴中快速化冻 在“ 下?速化冻要好。 77 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 木本 物的? ，在 ? `′ ，必须在0°C? 下 ?速化冻才能“到良好 的 —。 化冻′的材料在`′终止 ，要求快速化冻， 防止由于?生 冰对组织细胞 成的 害。 ?、再培养 　　 ?冻′的材料会不可 ‰ˇ受到不同程度的 害。为了 再培养中的光 制， 于离体材料?复生长，冻′的材料'般在˙暗 光下培养1～2周，再 正常光下 培养。再培养所用的培养基'般是与`′?的相同，但有时?将大 琼脂 ，有时则在培养基中??'定 的PVP、 解o?? 成分 于生长的?复。 currency1?? ? `′过程中的遗传变异及其检?技术 论哪?? …‰的`′方法都是 ` 物?原有的遗传特性为?发点。在 ? `′过程中， 物材料是否发生变异是 ?工作者?分关 的a题。在 ? `′??， 体材料、培养继代时间、培养基成分 及自然突变 都可能影…到`′材料的遗 传?定性。 为了掌握 ? `′材料的遗传变异情况，有必要在`′材料的?复和再生?˙建 立有 的检?体 。目?，fifl学观察、细胞学方法、同 、分” 记如RFLP和RAPD 检?方法常常单独 起–用于遗传变异分析。 思考题 1． 物离体 ? `′的ˉ?及常用的 ? 方法。 2． 物材料 ? `′的细胞学基础。 3． ? `′的方法及其技术要点。 4．影… ? `′ —的主要 及调控 。 78 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 currency1?￥ ?物细胞工程ˉ?˙4学时¨ 本￥重点和难点： 了解?物细胞特性及其培养特点， 分认识?物细胞工程在?病诊?和治`中的 用?景。 currency1'?、?物细胞特性 '、?物细胞与 物细胞 ?、?物细胞在活体￠的特性 ? ?物细胞在 胎 即 高度分化，而且这?分化是不可逆 的， ? 活体￠的?物细胞按?分 能 可 分为 大类：currency1'类是能` 继续分 能 的 细胞；currency1?类细胞群是永久失去分 能 的细胞；currency1 类是静止细胞群，即所谓的 G0细胞。 79 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 、培养条件下?物细胞的生长特性 离体培养的?物细胞可分为两类：贴壁依赖 (anchorage-dependent)、贴壁 依赖 (anchorage-independent)和间性贴壁细胞。 –、培养条件下?物细胞的生理特点 1、?物细胞的分 周 长 各类细胞分 周 时间? 细 胞 类 别 细胞周 时间˙h¨ G1 S G2 M ? 肺成纤维细胞˙WI 38¨ 8 8.0 4.0 0.8 20.8 ?T细胞 10.5 7.6 3.2 0.8 21.1 ? ￠细胞 5.7 8.5 3.8 1 19 中国仓 ?巢细胞˙CHO¨ 4.7 4.1 2.8 0.8 12.4 急性淋巴性?血病细胞 1～10d 20 2~3d 1.0 2~20d 2、有 细胞 和永久细胞 ? ?物细胞离体培养起始物，??称?为原代培养˙primary culture¨。?继代培养 即成为有 细胞 (finite cell line)。 ? 大 ?细胞 在有 的代?￠ 不变的fi式?”，当 过有 ?代 ，它?可能有 两?情况，'是衰老死?，?是发 成永久细胞 称连续细胞 。 ? 有 细胞 成永久细胞 的过度 称为 (crisis)，其 过程在?物细胞 培养中称为体 化(in vitro transformation)。 ? 永久细胞 有如下特?：细胞fifl变化，如细胞变 ，黏?性 ，具有 高的核 ；生长速率??，倍?时间缩短；对血清的依赖性 ；贴壁依赖性 ?；细 胞异倍体和 ?倍体??，细胞接?到体￠ ，生￠率 ?。 3、?物细胞的`′敏感性 currency1??、?物细胞培养的`′与¨养要求 80 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 '、?物细胞培养的`′要求 1、 度 2、pH 3、￠?及气体`′ 4、?˙ ?、?物细胞的¨养?求 1、天然培养基 ? 其 点是¨养成分丰富、培养 —好；?点是成分复 、 体差异大、–‰有 。 ? 天然培养基的?类主要 生物性体液˙如血清¨、组织 ?液˙如 胎 ?液¨、 凝?fl˙如血浆¨、 解乳?? 。 2、 成培养基 ? 成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物 对细胞体￠生′`′中 知物 在体 ?工条件的 ，?过 复? 筛 、 化和重 组 fi成的培养基。 ? 成培养基的 点： 能 细胞提供' 似于体￠的生′`′， 便于控制和提 供 准化体 生′`′。 ? 成培养基的主要成分：?基酸、维生 、 类、 机离”和其它辅?成分。 §3、?物细胞工程的主要技术及其 意义 '、单克隆 体技术在现代医学中的 用 单克隆 体技术的核 是用骨髓￡细胞(myeloma cell)与?特定 ‰‰ 刺激的B淋 巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融 得到 ￡细胞(hybridoma cell)， ￡细 胞 能象骨髓￡细胞那样在体 ?”， 具有B淋巴细胞产生特异性 体的能 。 此，单克隆 体技术 称为 ￡技术(hybridoma technology)。 ? 单克隆 体具有高度的特异性与?敏性，可 广泛ˇ由于临 医学的?病诊?， 提高?病诊?的准确性。 ? 用单克隆 体技术可 生产各?‰ 苗，这不仅能大大 ?生产成本，同时也 ??了 苗的 全性。 81 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 ? 单克隆 体还有可能用于某些肿￡的治`，是?类战胜￠症?分有望的 在技术。 ? 单克隆 体技术还可广泛用于各?基础医学研究，从而¨?现代医学的不?发 。 ?、 胎移 和核移 技术在畜牧业中的 用 ? 用 胎技术可 工?fi式大 生产 胎，从而可 ? 胎成本，扩大 移 的–‰， 农畜?物 胎移 的¨广 用成为可能。 ? 体 受精可 准确ˇ确定受精的时间和 胎发 ?˙， 此， 用体 受精技术 核移 、性别控制和基 导 ，可望工?化生产遗传性?定、生产性能 良的家畜， ?快农畜良?化。 、?物细胞大 培养生产?生产物 ?物细胞培养的产物 苗：? — 儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、 肝?面 ‰、疱症、某些￠症 ?物 — 口蹄 、 痘病、 霍乱、 脑炎、 痢?、犬瘟、草 ?血病 ： 激 、细胞色 P450、胃?? 、胰?? 、纤维??￠ 原激活fl 激 ： `细胞生成 、 间 细胞激 、绒膜 性腺激 、 ?体激 ‰ 调? ”：干 、?细胞活化 ”、 移 制 ”、 腺 、?细胞 –、?物克隆技术的 用 ?物克隆技术至 在 下 方面具有广阔的 用?景： ? `′ 良的?物品?； ? 拯救濒临? 的·惜?物； ? 用克隆?物工?生产?? 药物，发 的医药工业； ? 用克隆技术生产?体器官，扩大器官移 所?的器官–‰。 思考题： 1．培养下的?物细胞特点与¨养?求 2．?物细胞培养在生物技术中的 用 3．?物细胞工程技术 用的两面性 82