高级生物化学
Advanced biochemistry
内容
核酸专题（李正文）
蛋白质专题（何冰）
代谢调控专题（韦海华）
核酸 (Nucleic Acid)
核酸的结构
核酸的性质与研究方法
核酸研究的新进展核酸参考书
王琳芳，蛋白质与核酸，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998
韦弗，分子生物学，科学出版社,麦格劳 -希尔国际公司,
2000
郜金荣,分子生物学，武汉大学出版社,1999
阎隆飞,分子生物学,北京农业大学出版社,1997
Dienbach,C.W.PCR 技术实验指南，科学出版社,1998
苏慧慈,原位 PCR，科学出版社,1995
第一章 核酸的结构
Structure of Nucleic Acid
第一节 核酸的一级 结构
(primary structure of nucleic Acid)
一、概述核酸是重要的生物大分子。
脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid，
DNA）：存在于细胞核和线粒体内，是贮存和携带遗传信息的物质。
核糖核酸（ ribonucleic acid,RNA）：存在于胞浆中，参与遗传信息的表达。
mRNA,信使核糖核酸
tRNA，转运核糖核酸
rRNA，核糖体核糖核酸其中 RNA 又分为三类：
脱氧核糖核酸（ DNA）
人 6,0 × 10-9 mg
牛 6,5 × 10-9 mg
鼠 6,6 × 10-9 mg
鸡 2,6 × 10-9 mg
鸭 2,1 × 10-9 mg
蟾蜍 7,3 × 10-9 mg
鲤鱼 3,3 × 10-9 mg
几种不同生物的细胞内 DNA的含量五碳糖磷酸碱基核苷核苷酸核糖核糖核苷酸脱氧核糖脱氧核苷酸核酸的基本单位－核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸－ DNA的基本单位腺嘌呤碱基脱氧核糖磷酸
AGCT
鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶核糖核苷酸－ RNA的基本单位腺嘌呤胞嘧啶碱基核糖磷酸鸟嘌呤AGCU
尿嘧啶鸟嘌呤核糖核苷酸腺嘌呤核糖核苷酸胞嘧啶核糖核苷酸尿嘧啶核糖核苷酸
核酸的一级结构,是指核酸中核苷酸的排列顺序。是其高级结构和功能的基础。
核苷酸之间通过 3?,5? -磷酸二酯键 连接二、一级结构序列测定
（一） 限制性内切酶 (Restriction endonuclease )
1 定义：在原核生物中存在的能识别外源
DNA双链中 4～ 6个碱基对组成的特异序列，并在此序列某位点水解外源 DNA，这类酶称 限制性内切酶。
作用的位点称 靶位点。
核酸的一级结构限制性内切酶
限制性内切酶主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制 -修饰体系，限制外源 DNA、保护内源
DNA。
1970年 Smith等分离到第一种限制性核酸内切酶，
为 DNA分子体外剪切奠定了技术基础。
限制性核酸内切酶的命名,一般是以微生物属名的第一个字母 （大写） 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株 (品系 )。字母后面的罗马字则是简单地表明该种生物中不同限制酶分离的先后顺序。例如，分离自产色链霉菌 (Streptomyces achromogenes )的两种限制酶被分别命名为
SacI和 SacII。 比如限制酶 HincⅡ 和 HindⅢ 则是分别来自流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae)的 c和 d血清型菌株。
2 限制性核酸内切酶的命名和种类迄今为止，已有上千种限制酶被分离纯化，从目前已商品化的 100多种限制酶的识别序列可以看出，限制酶所识别的 DNA序列大多数都富含 胞嘧啶 (C)和鸟嘌呤 (G)。
限制性内切酶
I型限制性内切酶限制性内切酶限制性核酸内切酶的种类：
最早从大肠杆菌中发现的 EcoK,EcoB就属于 I类酶。
其分子量较大；反应过程中除需 Mg2+外，还需要 S-
腺苷 -L甲硫氨酸,ATP；在 DNA分子上没有特异性的酶解片断,
I型限制性内切酶能识别 DNA分子内非甲基化的特定序列，但切割是随机的，且切割位点远离识别位点，不能生成特定片段，因此,I类酶作为 DNA
的分析工具价值不大 。
II型限制性内切酶限制性内切酶
II类酶有 EcoR I,BamH I,Hind II,Hind III等。
其分子量小于 105道尔顿；反应只需 Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，
因而 DNA分子经过 II类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。酶切后可形成粘性末端或平整末端 。
II型限制性内切酶能识别 DNA分子中的特定序列，大部分具有回文结构。 II型限制性内切酶识别的 DNA序列一般长度是 4,5和 6个碱基对。
3 限制性内切酶的识别序列与酶切特点
(1)限制酶识别的 DNA特异序列具有回纹结构的序列。
(2)限制酶识别序列 4-6个碱基对。
现在已从各种微生物中发现上千种限制酶，
它们识别序列的长度最短的是 4个核苷酸，最长的为 8个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高的是识别 6个碱基对的限制酶。
限制性内切酶
EcoR I的识别位点
G A A T T C5’ 3’
C T T A A G3’ 5’ A A T T CG
5’-粘性末端
Hind III的识别位点
T T C G A A
A A G C T T 5’ 3’
3’ 5’
A G C T T
A
5’-粘性末端限制性内切酶
Hae III的识别位点
Pst I的识别位点
G G C C5’ 3’
C C G G3’ 5’
C T G C A G5’ 3’
G A C G T C3’ 5’
G G C C
C C G G
平整末端
C T G C A
G
3’-粘性末端限制性内切酶在已发现的限制性内切酶中，近百种酶的识别顺序已被确定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序，
这种酶称为“异源同功酶” (isochizomer)。应该注意的是
，这些酶虽然有相同的识别顺序，但它们的 切点并不完全一样。 例如 Xma I和 Sma I都识别六核苷酸 CCCGGG，但
Xma I的切点在 cCCGGG，而 Ema I的切点则在
CCCGgGG，前者切割 DNA分子，形成带有 CCGG粘性末端的 DNA片段，而后者并不形成粘性末端。
当然，也有识别顺序和切点都相同的酶，如 Hap II
,Hpa II,Mno I，都在识别顺序 CCGG内有一相同的切点,Hal III和 BsuR I同样在识别顺序 GGCC内有一相同的切点。
限制性内切酶用限制性内切酶把 DNA切割成一定大小的片断，这些酶解片断的排列顺序就叫 DNA
的限制酶图谱。
图谱制作简单，将纯化的 DNA用不同的限制性内切酶切割，进行凝胶电泳分析，确立了 DNA限制酶图谱后，就可以测定每个
DNA片断的碱基顺序，最后排列出完整的
DNA分子碱基顺序。
(二） DNA的限制酶图谱核酸的一级结构
（三） DNA序列测定
DNA序列测定技术从 60年代最早提出设想至今,已经日臻完善,测定序列的技术也越来越简化,在各项研究工作中的地位也日趋重要 。
核酸的一级结构
DNA序列分析战略
DNA序列测定
对于较小片断（ ≤500bp)的 DNA,可直接利用质粒系统（如 PUC18,PUC19等）测序。
DNA序列分析战略
DNA序列测定对于大片段 DNA，可采用：
限制性片断亚克隆法对 DNA进行酶切分析，确定酶谱后，以合适的限制性内切酶降解以制备各种长度的限制酶片断，并亚克隆到测序载体上建立亚克隆库，然后测亚克隆 DNA序列，通过排列分析，确定
DNA片断的全序列
随机法（鸟枪测序法）
利用一定的方法将目的 DNA随机打断成大小不同的片断并获得亚克隆，收集这些亚克隆的 DNA资料，通过计算机处理而获得目的 DNA的全部序列。
DNA序列测定
DNA序列测定方法
传统的序列测定技术有两种,Sanger 等
(1977)提出的酶法及 Maxam和 Gibert(1977)提出的化学降解法。
双脱氧链终止法
Sanger双脱氧链终止法使用特异引物 在 DNA
聚合酶作用下进行延伸反应，在 DNA合成反应混合物的 4种普通 dNTP中，加入少量的一种双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)作为链终止剂，由于
ddNTP在脱氧核糖的 3’位置缺少一个羟基，不能与后续的 dNTP形成磷酸二酯键，从而使
DNA链中断。
DNA序列测定双脱氧链终止法双脱氧链终止法
反应产物是一系列的核苷酸链，它们将分别终止模板链的每一个 A，每一个 C，每一个 G
或每一个 T的位置上。
Reaction Requirements for
Dideoxy Sequencing of DNA
DNA序列测定化学降解法
化学降解法原理是用某些专用的化学试剂修饰各种碱基，使相应的糖苷键变得不稳定，在哌啶的作用下，
糖苷键断裂，从而得到以特定碱基结尾的一系列 DNA
片段，经电泳分离，推断出碱基的序列。
DNA序列测定化学降解法经过大量的筛选，发现以下几种试剂与哌啶一起作用，可以在特定的碱基部位断键：
1 硫酸二甲酯＋哌啶 在 G处断键
2 HCl+哌啶 在 A和 G处断键
3 水合肼＋哌啶 在 C和 T处断键
4 水合肼＋ 2MNaCl+哌啶 在 C处断键化学裂解法测定 DNA序列示意图
DNA序列测定
近年来随着 PCR技术和 M13噬菌体及噬菌体载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法得到广泛应用，市场上多数厂家生产的测序试剂盒，测序仪器均按此原理设计，
DNA序列测定
标记物的种类也日益增多，除了放射性标记外，还有多种荧光标记，除了标记在特异的引物上，还可标记在 ddNTP上，还可同时将四种不同的荧光分别标记在 A,C，
G,T上，在一个反应中完成测序，各种核酸混合物在通过荧光检测系统时，可根据四种不同的荧光一次性将测序阅读完毕。
质粒测序方法
一,材料：
1,测序 DNA聚合酶 33U/μl
2,酶稀释缓冲液
3,反应缓冲液
4,ddATP混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各
150μM,ddATP3μM
ddCTP混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各 150μM，
ddCTP 3μM
ddGTP 混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP 各
150μM,ddGTP3μM
ddTTP混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各 150μM，
ddTTP 3μM
质粒测序方法
5,甲酰胺上样缓冲液
6,标记引物 2pmol/μl
7,1.5ml薄壁离心管
8,PCR自动热循环仪质粒测序方法二、操作过程
1,取 4个 0.2μl薄壁管,分别标记 A,C，
G,T,置于冰上 。
质粒测序方法
2、分别加入 3μlddATP混合物,ddCTP混合物,ddGTP混合物,ddTTP混合物至标好的 A,C,G,T管内，盖好盖子，以防蒸发。
3,用酶稀释液稀释测序 DNA聚合酶,4个反应需用 7μl稀释缓冲液加 3μl测序 DNA聚合酶,
从而得到 10μl浓度为 10U/μl的测序 DNA聚合酶 。
质粒测序方法
4,配制反应混合液：
反应缓冲液 3μl
2pmol/μl标记引物 1μl
待测质粒 DNA0.2μg/μl 1μl
水 14μl
稀释好的酶 2μl
总体积 20μl
质粒测序方法
5,混匀后在标好的 A,C,G,T管内分别加入 5μl
反应混合液,混匀加 10～ 20μl石蜡油 。
6,进行 PCR循环：
注意：退火温度主要依赖于引物的特异序列,以及模板纯度,下面仅介绍一般程序：
95℃ 预变性 1分钟
50℃ 30”
70℃ 60”
95℃ 30”
共 30个循环 。
质粒测序方法
7,加 8μl甲酰胺上样缓冲液,混匀
8,取 2μl电泳
9,如果是荧光标记,可由测序仪自动分析测序结果；如果标记物为放射性,则凝胶电泳结束后用胶片放射自显影,然后以胶片上读结果 。
质粒测序方法
MegaBACE instrument
质粒测序方法
Sequence Analyzer
质粒测序方法第二节 核酸的高级结构一,DNA的二级结构
（ 1）二级结构的含义,
DNA的二级结构是指 DNA的双螺旋结构。
绝大多数 DNA是由两条多脱氧核苷酸链构成的双链分子或双链环状分子，只有少数病毒为 DNA单链环状分子（如 M13,?X174)
（ 2） DNA碱基组成的特点 —Chargaff定律碱基当量定律 A+G=T+C
不对称比率 A+T/G+C
（ 3）二级结构的典型结构
B-DNA(Watson & Crick模型,1953年）
DNA的二级结构
DNA的二级结构
DNA的二级结构
DNA的二级结构
DNA
的双螺旋结构
DNA的二级结构
B-DNA结构要点
1,右手螺旋，有大沟和小沟
2,直径 20?,10个碱基组成一个螺旋，沿中心轴上升 3.4?
3,磷酸和戊糖组成的链位于外侧，碱基位于内侧
4,A和 T配对,G和 C配对
5.维持双螺旋结构的主要力：氢键和碱基堆积力
DNA的二级结构
（ 4） DNA双螺旋结构的多态性类型 旋转方向螺旋直径
nm
螺距
nm
每转碱基对数目碱基对垂直距离 nm
碱基对与水平面倾角
A-DNA 右 2.3 2.8 11 0.255 20
B-DNA 右 2.0 3.4 10 0.340 0
C-DNA 右 3.1 9.3 0.310 6
Z-DNA 左 1.8 4.5 12 0.370 -9
DNA的二级结构
A-DNA B-DNA & H-DNA
DNA的二级结构
B-DNA & Z-DNA
DNA的二级结构
(5) DNA的其它螺旋结构回文结构镜像重复三股螺旋（ H-DNA）
DNA的其它结构回文结构 — DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的 双螺旋结构 。即对称轴一侧的片段旋转 180° 后，
与另一侧片段对称重复。
回文结构能形成十字结构和发夹结构
DNA的其它结构
AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATC
TTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG
存在于 同一股上 的某些 DNA区段的反向重复序列。此序列各单股中没有互补序列，不能形成十字型或发夹结构。
镜像重复
DNA的其它结构
DNA三股螺旋（ H-DNA,ts-DNA）
多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的 DNA螺旋区段，
其序列中有较长的镜像重复时，形成局部三股配对，并互相盘绕的三股螺旋，
其中两股的碱基按 Watson-Crick方式配对，
第三股多聚嘧啶（镜像重复）通过 TAT和
CGC+配对，而处于双螺旋的大沟中。
DNA的其它结构
DNA的三股螺旋
DNA的三股螺旋
DNA三螺旋的碱基配对二,DNA的三级结构双螺旋进一步扭曲形成的超螺旋。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。
包括,线状 DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状 DNA形成的结、超螺旋和连环等线状 DNA形成的超螺旋
DNA的三级结构环状 DNA形成的超螺旋
DNA的三级结构三,RNA的结构
RNA的一级结构是由数量极其庞大的四种核糖核酸（ AMP,GMP,CMP,UMP）按一定顺序，通过 3′,5′磷酸二酯键连成的线形分子。
RNA的二级结构是短的，不完全螺旋的多核苷酸链。
RNA的三级结构是在茎环结构基础上进一步扭曲折叠而成的复杂结构。
（一） tRNA的结构
1,tRNA的一级结构由 74~93个（多为 76个）核苷酸组成单链 ；
具有不变的（恒定的）核苷酸,U8,G18,G19 ；
含较多的修饰核苷酸；
5ˊ 端多为 PG,3ˊ 端多为 CCAOH 。
2.tRNA的二级结构 ——三叶草结构具有四臂四环，
3ˊ 端为 CCAOH 序列,5ˊ 端为 PG
3,tRNA的三级结构 ——倒 L形结构
RNA的结构
tRNA的三叶草结构
RNA的结构
tRNA的三级和二级结构
RNA的结构
（二） mRNA的结构
RNA的结构
(三） rRNA的结构
rRNA是核糖体的组成成分,其种类和大小用 S表示。
30S 16S
原核生物 70S 23S
50S
5S
40S 18S
真核生物 80S 28S
60S 5.8S
5S
RNA的结构
rRNA的二级结构
RNA的结构第二章 核酸的性质和研究方法
Properties and research method
of Nucleic Acid
第一节 核酸的理化性质一,一般理化性质
1.晶形
DNA为白色纤维状固体； RNA为白色粉末状固体
2.溶解性均溶于水；不溶于一般有机溶剂，在 70%乙醇中形成沉淀；
在 0.14MNaCl 和 1~2MNaCl中
DNA-蛋白 溶解度低 溶解度高
RNA-蛋白 溶解度高 溶解度低
3.粘度 DNA粘度很大 RNA粘度小得多
4.旋光性 均很强
5密度及沉降性密度,RNA>双链 DNA；环状 DNA >开环、线状 DNA
二,核酸的紫外吸收纯 DNA OD260/OD280=1.8
纯 RNA OD260/OD280=2.0
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使 DNA和
RNA在 240～ 290nm处有强烈紫外吸收，最大吸收
260nm
核酸的性质三,密度及沉降特性密度：
RNA>双链 DNA；
环状 DNA >开环、线状 DNA
单链 DNA >双链 DNA
沉降速度：
RNA >环状 DNA >开环、线状 DNA
核酸的性质四,核酸的变性、复性变性：指双螺旋区氢键断裂变成单链，不涉及一级结构破坏的过程。
复性：变性 DNA在适当条件下，又可使两条分开的链重新缔合成双螺旋的过程。
核酸的性质
DNA 的变性和复性核酸的性质第二节 核酸研究方法一、核酸电泳最常用：凝胶电泳优点：简单，快速，灵敏，成本低。
常用有：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）琼脂糖凝胶电泳常用于分析 DNA，用于分析 RNA时，由于其常含有 RNA酶，必须先加蛋白质变性剂
（如甲醛等）处理后才能用于分析核酸的研究方法与电泳迁移有关的因素
1 核酸分子大小：与分子量大小对数成反比。
2 胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，常用 1％凝胶。
3 DNA构象：超螺旋最快，线形 DNA其次，开环形最慢。
4 电流：一般不大于 5v/cm。
5 碱基组成：有影响，但不大。
6 温度,4～ 30℃,常在室温下进行核酸的研究方法电泳完毕，将凝胶在溴乙锭溶液中染色
（ 0.5ug/ml)。
溴乙锭为一扁平分子，很容易插入 DNA碱基对之间。
DNA与溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发射出红橙色的可见荧光。 0.1ugDNA即可检出。
核酸的研究方法
（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳加入交连剂其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于 1000bp的
DNA片断。另外，一般不含 RNA酶，所以可以用于 RNA分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品，经溴乙锭染色后，在紫外光下，发出的荧光很弱，所以，浓度很低的样品不能用此法检测。
核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法
DNA样品回收方法紫外照射下切下所需 DNA,切下的胶条放于透析袋中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳,3
～ 4小时后,DNA将电泳出来并粘在透析袋内壁上
，将电极倒转，通电 30～ 60秒，粘在内壁上的
DNA会释放到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提 1
～ 2次，水相用乙醇沉淀 DNA。这样回收的 DNA纯度很高 。
核酸的研究方法聚合酶链反应 (Polymerase Chain
Reaction,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术
PCR技术简史
PCR的最早设想,本世纪 60年代末、
70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于 1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA变性，与合适的引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA基因”。
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’解旋酶 解链酶
DNA
解旋解链合成引物子链延长
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
DNA
解旋解链合成引物子链延长
GGAUCG 5‘
AUCGCG5‘
引物酶引物酶
RNA引物
RNA引物
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
DNA
解旋解链合成引物子链延长
GGAUCG 5‘
AUCGCG5‘
TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’
ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 3’
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
DNA
的变性与复性变性复性加热退火
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
PCR技术
PCR的实现,1985年,美国 PE-Cetus公司的 Mullis等人发明了聚合酶链反应 （ PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA复制最初采用 E-coli DNA聚合酶进行 PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热 DNA聚合酶的应用使得 PCR能高效率的进行,随后 PE-Cetus公司推出了第一台 PCR
自动化热循环仪
1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
PCR技术简史PCR技术
PCR技术简史
PCR的改进与完善,Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的一个片段，其缺点是：
①此酶不耐高温,90℃ 会变性失活，每次循环都要重新加。
PCR技术
② 其 PCR产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。
引物链延伸反应在 37℃ 下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，此种酶催化的 PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于酶不耐热，在 DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，
给 PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR
技术在一段时间内没能引生物医学界的足够重视。
PCR技术 PCR技术简史
PCR技术简史
1988年初,Keohanog改用 T4 DNA聚合酶进行 PCR，
其扩增的 DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
PCR技术
1988年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌
(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA聚合酶。为与大肠杆菌多聚酶 I Klenow片段区别，将此酶命名为 Taq
DNA多聚酶 (Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使 PCR广泛的被应用。
PCR技术
PCR技术简史
Taq DNA聚合酶的特点：
①耐高温，在 70℃ 下反应 2h后其残留活性大于原来的 90%，
在 93℃ 下反应 2h后其残留活性是原来的 60%，在 95℃ 下反应 2h后其残留活性是原来的 40%。
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
PCR技术 PCR技术简史
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点标准的 PCR反应体系
4种 dNTP混合物 各 200umol/L
引物 各 10～ 100pmol
模板 DNA 0.1～ 2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
1 2 3 4 5
22
55
72
94
时间（ min）
温度
（ ℃ ）
适温延伸 3高温变性 1 低温退火 2 重复 1~3步
25~30轮目的 DNA片段扩增 100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链与引物复性
DNA
变性形成2
条单链子链延伸
DNA加倍
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
1 2 3 4 5
22
55
72
94
时间（ min）
温度
（ ℃ ）
适温延伸 3高温变性 1 低温退火 2 重复 1~3步
25~30轮目的 DNA片段扩增 100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链与引物复性子链延伸
DNA加倍
DNA
变性形成2
条单链模板 DNA
95℃
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃ 50℃
引物 1
引物 2
DNA引物
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
50℃
引物 1
引物 2
DNA引物
72℃
Taq酶
Taq酶
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第 1轮结束
95℃
第 2轮开始
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃ 50℃72℃Taq
Taq
Taq
Taq
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第 2轮结束
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点 重复 30轮后
230=1,073,741,824
模板 DNA第 1轮扩增第 2轮扩增第 3轮扩增第 4轮扩增 第 5轮扩增 第 6轮扩增
PCR技术理想拷贝数 =2n
n 循环次数实际拷贝数 =(1+x)n
X 平均效率,约为 0.85
n 循环次数
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点电泳分析
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点电泳分析
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点灵敏度高皮克 (pg=10-12)量级扩增到微克 (ug=10-6)水平能从 100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达 3个 RFU
细菌检测的最小检出率为 3个细菌简便、快速一次性加好反应液,2～ 4 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提 DNA
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国内外生产的几种 DNA扩增仪
2400型 PCR扩增仪
2700型 PCR扩增仪
9600型 PCR扩增仪
9700型 PCR扩增仪
PCR的步骤一,概 述
（一） PCR反应中的主要成份
1,引物,引物的好坏往往是 PCR成败的关键。
2,PCR反应系统的组成：
⑴耐热 DNA聚合酶（ Taq酶）
⑵模板 DNA：即待分析的目的 DNA，其长度不宜大于 10kb。
⑶引物：为了保证 DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，
需要两种引物，分别位于两条互补模板 DNA链的 3`-端。
⑷四种 dNTP。
⑸缓冲溶液：保证 DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液 pH值。
1.引物设计遵循的原则：
(1) 引物长度约为 16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。
(2) 引物中 G+C含量通常为 40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝
4(G+C)+2(A+T).
(3) 四种碱基应随机分布，在 3‘端不存在连续 3个 G或 C,因这样易导致错误引发。
(4) 引物 3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5) 在引物内,尤其在 3‘端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在 3‘端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。
(7) 引物 5‘端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等,
通常应在 5’端限制酶位点外再加 1-2个保护碱基。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,
以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的 Met,3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般 PCR反应中的引物终浓度为 0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。
利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在 1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X,引物摩尔浓度,A,C,G,T,引物中 4种不同碱基个数。
2,4种三磷酸脱氧核苷酸
(dNTP)：
dNTP应用 NaOH 将 pH调至 7.0,并用分光光度计测定其准确浓度,dNTP原液可配成 5-10mmol/L并分装,-20℃ 贮存。一般反应中每种 dNTP的终浓度为 20-200μmol/L。理论上 4 种 dNTP各 20μmol/L,足以在 100μl反应中合成 2.6μg的
DNA。当 dNTP终浓度大于 50mmol/L时可抑制 Taq DNA聚合酶的活性,4种 dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种 dNTP的不足出现的错误掺入。
Mg2+浓度对 Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常 Mg2+ 浓度范围为 0.5-2mmol/L.对于一种新的 PCR反应,可以用 0.1-5mmol/L的递增浓度的 Mg2+ 进行预备实验,选出最适的 Mg2+浓度。在 PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或 EDTA
等可能影响 Mg2+离子浓度的物质,以保证最适 Mg2+浓度。
3,Mg2+：
4,模板：
PCR反应必须以 DNA为模板进行扩增，模板 DNA可以是单链分子，也可以是双链分子,可以是线状分子，也可以是环状分子 (线状分子比环状分子的扩增效果稍好 )。就模板
DNA而言，影响 PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为 102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要 0.1μg的人基因组 DNA,10ng的酵母 DNA,1ng的大肠杆菌 DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的 PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的 DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。 DNA中的杂质也会影响 PCR的效率。
5,Taq DNA聚合酶：
一般 Taq DNA聚合酶活性半衰期为 92.5℃ 130min,95℃
40min,97℃ 5min。现在人们又发现许多新的耐热的 DNA聚合酶
，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为 74℃ 下,30min，掺入 10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，
一般 PCR中出错率为 2× 10-4 核苷酸 /每轮循环，在利用 PCR克隆和进行序列分析时尤应注意,在 100μl PCR反应中,1.5-2单位的 Taq
DNA聚合酶就足以进行 30轮循环。所用的酶量可根据 DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活 Taq DNA聚合酶，灭活 Taq
DNA聚合酶的方法有：
(1) PCR产物经酚,氯仿抽提,乙醇沉淀 。
(2) 加入 10mmol/L的 EDTA螯合 Mg2+ 。
(3) 99-100℃ 加热 10min。
6,反应缓冲液：
反应缓冲液一般含 10-50mmol/L Tris·Cl (20℃ 下
pH8.3-8.8),50mmol/L KCl和适当浓度的 Mg2+。
Tris·Cl在 20℃ 时 pH为 8.3-8.8，但在实际 PCR反应中
,pH为 6.8-7.8。 50mmol/L的 KCl有利于引物的退火
。另外，反应液可加入 5mmol/L的二硫苏糖醇 (DDT)
或 100μg/ml的牛血清白蛋白 (BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入 T4噬菌体的基因 32蛋白则对扩增较长的 DNA片段有利。各种 Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
二,PCR反应参数
1,变性,在第一轮循环前,在 94℃ 下变性 5-10min非常重要,它可使模板 DNA完全解链,然后加入 Taq DNA聚合酶 (hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使 PCR失败,因为未变性完全的 DNA双链会很快复性,减少 DNA产量,一般变性温度与时间为 94℃ 1min。在变性温度下,双链 DNA解链只需几秒钟即可完全,
所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含 GC
的序列,可适当提高变性温度,但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2,退火,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度,
实际使用的退火温度比扩增引物的 Tm值约低 5℃ 。一般当引物中
GC含量高,长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度 (例如用 60℃ 和 94℃ )完成整个扩增循环
,既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为 37℃ -55℃,1-2min。
3,延伸,延伸反应通常为 72℃,接近于 Taq DNA聚合酶的最适反应温度 75℃,实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为
Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从 20℃ -85℃,延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度,在一般反应体系中
,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成 2kb长的 DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加,但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间 (10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,
这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4,循环次数,当其它参数确定之后,循环次数主要取决于 DNA浓度。一般而言 25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使 PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经 25-30轮循环扩增后,反应中 Taq
DNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的 DNA样品稀释 103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经 60轮循环后,扩增水平可达 109-1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示,C＝ C0 (1+P)n 。其中,C为扩增产物量,C0 为起始 DNA量,P
为增效率,n为循环次数。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，
减少非特异性产物。
二,材料、设备及试剂一、材料不同来源的模板 DNA。
二、设备移液器及吸头，硅烷化的 PCR小管,DNA扩增仪 (PE公司 )，琼脂糖凝胶电泳所需设备 (电泳槽及电泳仪 )，台式高速离心机。
三、试剂：
1,10× PCR反应缓冲液,500mmol/L KCl,100mmol/L Tris·Cl,在
25℃ 下,pH9.0,1.0％ Triton X-100。
2,MgCl2,25mmol/L。
3,4种 dNTP混合物,每种 2.5mmol/L。
4,Taq DNA聚合酶 5U/μl。
5,T4 DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。
6、经 SmaⅠ 酶切和加 dT的 pUC质粒。
7、其它试剂：矿物油（石蜡油）,1% 琼脂糖,5× TBE，酚,氯仿,
异戊醇 (25:24:1)，无水乙醇和 70％ 乙醇。
三、操作步骤一,PCR反应
1,依次混匀下列试剂
35μl H2 O
5μl 10× PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种 dNTP
0.5μl 上游引物（引物１）
0.5μl 下游引物（引物２）
0.5μl 模板 DNA(约 1ng)
混匀后离心 5秒。
2,将混合物在 94℃ 下加热 5分钟后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底,加入 Taq DNA聚合酶（
0.5μl约 2.5U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3,用 94℃ 变性 1分钟,45℃ 退火 1分钟,72℃ 延伸 2分钟,循环 35轮,进行 PCR。最后一轮循环结束后,于 72℃
下保温 10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳取 10μl扩增产物用 1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三,PCR产物的纯化扩增的 PCR产物如利用 T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
（一）酚 /氯仿法
1.取反应产物加 100μl TE.。
2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机 10000rpm离心 15秒
，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次，可除去覆盖在表面的矿物油。
3.再用酚,氯仿,异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
4.在水相中加 300μl 95％乙醇，置 -20℃ 下 30min沉淀。
5.在小离心机上 10000rpm离心 10min，吸净上清液。加入 1ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液。重复洗涤沉淀 2次。
将沉淀溶于 7ml ddH2O 中，待用。
PCR产物纯化方法
0.05mol/1三羟甲基氨甲烷（ Tris）缓冲液，
PH=7.5内含 0.004mol/1EDTA。简称 TE缓冲液。
称约 1.21克 Tris和 0.298克 EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）溶于 150毫升蒸馏水中，先用稀盐酸调 PH近
7.5，加水至近 200毫升，再调 PH至 7.5并加水至刻度，存冰箱
（二） Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取 PCR扩增液中的 DNA，提纯后的 DNA可用于测序、标记
、克隆等。
该系统中含有的试剂和柱子可供 10,20,25,50,100
次 PCR产物的纯化，试剂包括：
Wizard PCR DNA纯化树脂直接提取缓冲液
Wizard微型柱分子生物学用试剂盒货号 品名 产地 规格 包装 价格
（元）
S06002 Wizard Plus微量 DNA纯化试剂盒 Promega A1330 50次 552
S06003 Wiazrd Plus微量 DNA纯化试剂盒 Promega A7100 50次 806
S06005 Wizard Plus中量 DNA纯化试剂盒 Promega A7640 25次 1381
S06006 Wizard Plus大量 DNA纯化试剂盒 Promega A7270 10次 1105
S06007 Wizard DNA-UP树脂纯化试剂盒 Promega A7280 100次 1049
S06008 Wizard PCR Preps DNA树脂纯化试剂盒 Promega A7170 50次 850
S06009 Wizard λDNA 树脂纯化试剂盒 Promega A7290 20次 729
S06010 Wizard 基因组 DNA纯化试剂盒 Promega A1120 100× 300μL 1296
1、吸取 PCR反应液水相放于 1.5ml eppendorf管中。
2、加 100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
3、加 1ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合 3次。
4、取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒与 Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
5、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入 2ml 80%
异丙 醇，对微型柱进行清洗。
6、取出微型柱置于 eppendorf管中,12000g离心 20秒，以除去微型柱中的洗液。
7、将微型柱放在一个新 eppendorf管中，加 50μl TE或水，静止 1分钟后,12000g
离心 20秒。
8、丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化 DNA，存放于 4℃ 或 -20℃ 。
[注意 ]
1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。
2,PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取 DNA的 产量。
Wizard PCR DNA纯化过程
研究
– 基因克隆,DNA测序,分析突变
诊断
– 细菌,病毒,寄生虫检测,诊断
人类基因组工程
– 遗传图谱的构建,DNA测序,表达图谱
法医
– 犯罪现场标本分析
肿瘤
– 各种肿瘤检测
其他 ……
PCR的应用
4,PCR的主要用途：
1、目的基因的克隆：是迅速获得一定量的目的基因的有效方法之一。
① 利用特异性引物以 cDNA或基因组 DNA为模板，获得已知的目的基因；
② 利用简并引物从 cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的 DNA片段；
③ 利用随机引物从 cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。
2、基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。
3,DNA的微量分析：由于 PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量 DNA的分析检测。
三核酸的分子杂交第三章 核酸的研究进展
Structure of Nucleic Acid
1990年
“人类基因组计划”正式启动。
1996年第一只体细胞克隆动物（绵羊）“多莉”在英国诞生。
1998年中、日、美、英、韩五国代表制定“国际水稻基因组测序计划”。
1999年国际人类基因组计划联合研究小组宣布完整破译出人体第 22对染色体的遗传密码。
2000年中、美、日、德、法、英 6国科学家联合宣布成功绘制出人类基因组草图。
“中国超级杂交水稻基因组计划”正式启动
2001年中、美、日、德、法、英 6国科学家联合公布了人类基因组图谱及初步分析结果。
2003年第一只体细胞克隆动物（绵羊）“多莉”死亡。
中国大陆、台湾、香港科学家宣布联手启动“中华人类基因组单体型图”计划。
中、美、日、德、法、英 6国科学家联合宣布完成人类基因序列图。
中、美科学家分别测定出非典型肺炎病毒的基因图谱。
1972，基因重组技术
1978，人类试管婴儿技术
1985,DNA扩增技术（ PCR）
1990，人类基因组计划（ HGP）
1997，哺乳动物克隆技术影响深远的生物学技术
Advanced biochemistry
内容
核酸专题（李正文）
蛋白质专题（何冰）
代谢调控专题（韦海华）
核酸 (Nucleic Acid)
核酸的结构
核酸的性质与研究方法
核酸研究的新进展核酸参考书
王琳芳，蛋白质与核酸，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998
韦弗，分子生物学，科学出版社,麦格劳 -希尔国际公司,
2000
郜金荣,分子生物学，武汉大学出版社,1999
阎隆飞,分子生物学,北京农业大学出版社,1997
Dienbach,C.W.PCR 技术实验指南，科学出版社,1998
苏慧慈,原位 PCR，科学出版社,1995
第一章 核酸的结构
Structure of Nucleic Acid
第一节 核酸的一级 结构
(primary structure of nucleic Acid)
一、概述核酸是重要的生物大分子。
脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid，
DNA）：存在于细胞核和线粒体内，是贮存和携带遗传信息的物质。
核糖核酸（ ribonucleic acid,RNA）：存在于胞浆中，参与遗传信息的表达。
mRNA,信使核糖核酸
tRNA，转运核糖核酸
rRNA，核糖体核糖核酸其中 RNA 又分为三类：
脱氧核糖核酸（ DNA）
人 6,0 × 10-9 mg
牛 6,5 × 10-9 mg
鼠 6,6 × 10-9 mg
鸡 2,6 × 10-9 mg
鸭 2,1 × 10-9 mg
蟾蜍 7,3 × 10-9 mg
鲤鱼 3,3 × 10-9 mg
几种不同生物的细胞内 DNA的含量五碳糖磷酸碱基核苷核苷酸核糖核糖核苷酸脱氧核糖脱氧核苷酸核酸的基本单位－核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸－ DNA的基本单位腺嘌呤碱基脱氧核糖磷酸
AGCT
鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶核糖核苷酸－ RNA的基本单位腺嘌呤胞嘧啶碱基核糖磷酸鸟嘌呤AGCU
尿嘧啶鸟嘌呤核糖核苷酸腺嘌呤核糖核苷酸胞嘧啶核糖核苷酸尿嘧啶核糖核苷酸
核酸的一级结构,是指核酸中核苷酸的排列顺序。是其高级结构和功能的基础。
核苷酸之间通过 3?,5? -磷酸二酯键 连接二、一级结构序列测定
（一） 限制性内切酶 (Restriction endonuclease )
1 定义：在原核生物中存在的能识别外源
DNA双链中 4～ 6个碱基对组成的特异序列，并在此序列某位点水解外源 DNA，这类酶称 限制性内切酶。
作用的位点称 靶位点。
核酸的一级结构限制性内切酶
限制性内切酶主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制 -修饰体系，限制外源 DNA、保护内源
DNA。
1970年 Smith等分离到第一种限制性核酸内切酶，
为 DNA分子体外剪切奠定了技术基础。
限制性核酸内切酶的命名,一般是以微生物属名的第一个字母 （大写） 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株 (品系 )。字母后面的罗马字则是简单地表明该种生物中不同限制酶分离的先后顺序。例如，分离自产色链霉菌 (Streptomyces achromogenes )的两种限制酶被分别命名为
SacI和 SacII。 比如限制酶 HincⅡ 和 HindⅢ 则是分别来自流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae)的 c和 d血清型菌株。
2 限制性核酸内切酶的命名和种类迄今为止，已有上千种限制酶被分离纯化，从目前已商品化的 100多种限制酶的识别序列可以看出，限制酶所识别的 DNA序列大多数都富含 胞嘧啶 (C)和鸟嘌呤 (G)。
限制性内切酶
I型限制性内切酶限制性内切酶限制性核酸内切酶的种类：
最早从大肠杆菌中发现的 EcoK,EcoB就属于 I类酶。
其分子量较大；反应过程中除需 Mg2+外，还需要 S-
腺苷 -L甲硫氨酸,ATP；在 DNA分子上没有特异性的酶解片断,
I型限制性内切酶能识别 DNA分子内非甲基化的特定序列，但切割是随机的，且切割位点远离识别位点，不能生成特定片段，因此,I类酶作为 DNA
的分析工具价值不大 。
II型限制性内切酶限制性内切酶
II类酶有 EcoR I,BamH I,Hind II,Hind III等。
其分子量小于 105道尔顿；反应只需 Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，
因而 DNA分子经过 II类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。酶切后可形成粘性末端或平整末端 。
II型限制性内切酶能识别 DNA分子中的特定序列，大部分具有回文结构。 II型限制性内切酶识别的 DNA序列一般长度是 4,5和 6个碱基对。
3 限制性内切酶的识别序列与酶切特点
(1)限制酶识别的 DNA特异序列具有回纹结构的序列。
(2)限制酶识别序列 4-6个碱基对。
现在已从各种微生物中发现上千种限制酶，
它们识别序列的长度最短的是 4个核苷酸，最长的为 8个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高的是识别 6个碱基对的限制酶。
限制性内切酶
EcoR I的识别位点
G A A T T C5’ 3’
C T T A A G3’ 5’ A A T T CG
5’-粘性末端
Hind III的识别位点
T T C G A A
A A G C T T 5’ 3’
3’ 5’
A G C T T
A
5’-粘性末端限制性内切酶
Hae III的识别位点
Pst I的识别位点
G G C C5’ 3’
C C G G3’ 5’
C T G C A G5’ 3’
G A C G T C3’ 5’
G G C C
C C G G
平整末端
C T G C A
G
3’-粘性末端限制性内切酶在已发现的限制性内切酶中，近百种酶的识别顺序已被确定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序，
这种酶称为“异源同功酶” (isochizomer)。应该注意的是
，这些酶虽然有相同的识别顺序，但它们的 切点并不完全一样。 例如 Xma I和 Sma I都识别六核苷酸 CCCGGG，但
Xma I的切点在 cCCGGG，而 Ema I的切点则在
CCCGgGG，前者切割 DNA分子，形成带有 CCGG粘性末端的 DNA片段，而后者并不形成粘性末端。
当然，也有识别顺序和切点都相同的酶，如 Hap II
,Hpa II,Mno I，都在识别顺序 CCGG内有一相同的切点,Hal III和 BsuR I同样在识别顺序 GGCC内有一相同的切点。
限制性内切酶用限制性内切酶把 DNA切割成一定大小的片断，这些酶解片断的排列顺序就叫 DNA
的限制酶图谱。
图谱制作简单，将纯化的 DNA用不同的限制性内切酶切割，进行凝胶电泳分析，确立了 DNA限制酶图谱后，就可以测定每个
DNA片断的碱基顺序，最后排列出完整的
DNA分子碱基顺序。
(二） DNA的限制酶图谱核酸的一级结构
（三） DNA序列测定
DNA序列测定技术从 60年代最早提出设想至今,已经日臻完善,测定序列的技术也越来越简化,在各项研究工作中的地位也日趋重要 。
核酸的一级结构
DNA序列分析战略
DNA序列测定
对于较小片断（ ≤500bp)的 DNA,可直接利用质粒系统（如 PUC18,PUC19等）测序。
DNA序列分析战略
DNA序列测定对于大片段 DNA，可采用：
限制性片断亚克隆法对 DNA进行酶切分析，确定酶谱后，以合适的限制性内切酶降解以制备各种长度的限制酶片断，并亚克隆到测序载体上建立亚克隆库，然后测亚克隆 DNA序列，通过排列分析，确定
DNA片断的全序列
随机法（鸟枪测序法）
利用一定的方法将目的 DNA随机打断成大小不同的片断并获得亚克隆，收集这些亚克隆的 DNA资料，通过计算机处理而获得目的 DNA的全部序列。
DNA序列测定
DNA序列测定方法
传统的序列测定技术有两种,Sanger 等
(1977)提出的酶法及 Maxam和 Gibert(1977)提出的化学降解法。
双脱氧链终止法
Sanger双脱氧链终止法使用特异引物 在 DNA
聚合酶作用下进行延伸反应，在 DNA合成反应混合物的 4种普通 dNTP中，加入少量的一种双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)作为链终止剂，由于
ddNTP在脱氧核糖的 3’位置缺少一个羟基，不能与后续的 dNTP形成磷酸二酯键，从而使
DNA链中断。
DNA序列测定双脱氧链终止法双脱氧链终止法
反应产物是一系列的核苷酸链，它们将分别终止模板链的每一个 A，每一个 C，每一个 G
或每一个 T的位置上。
Reaction Requirements for
Dideoxy Sequencing of DNA
DNA序列测定化学降解法
化学降解法原理是用某些专用的化学试剂修饰各种碱基，使相应的糖苷键变得不稳定，在哌啶的作用下，
糖苷键断裂，从而得到以特定碱基结尾的一系列 DNA
片段，经电泳分离，推断出碱基的序列。
DNA序列测定化学降解法经过大量的筛选，发现以下几种试剂与哌啶一起作用，可以在特定的碱基部位断键：
1 硫酸二甲酯＋哌啶 在 G处断键
2 HCl+哌啶 在 A和 G处断键
3 水合肼＋哌啶 在 C和 T处断键
4 水合肼＋ 2MNaCl+哌啶 在 C处断键化学裂解法测定 DNA序列示意图
DNA序列测定
近年来随着 PCR技术和 M13噬菌体及噬菌体载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法得到广泛应用，市场上多数厂家生产的测序试剂盒，测序仪器均按此原理设计，
DNA序列测定
标记物的种类也日益增多，除了放射性标记外，还有多种荧光标记，除了标记在特异的引物上，还可标记在 ddNTP上，还可同时将四种不同的荧光分别标记在 A,C，
G,T上，在一个反应中完成测序，各种核酸混合物在通过荧光检测系统时，可根据四种不同的荧光一次性将测序阅读完毕。
质粒测序方法
一,材料：
1,测序 DNA聚合酶 33U/μl
2,酶稀释缓冲液
3,反应缓冲液
4,ddATP混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各
150μM,ddATP3μM
ddCTP混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各 150μM，
ddCTP 3μM
ddGTP 混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP 各
150μM,ddGTP3μM
ddTTP混合物,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各 150μM，
ddTTP 3μM
质粒测序方法
5,甲酰胺上样缓冲液
6,标记引物 2pmol/μl
7,1.5ml薄壁离心管
8,PCR自动热循环仪质粒测序方法二、操作过程
1,取 4个 0.2μl薄壁管,分别标记 A,C，
G,T,置于冰上 。
质粒测序方法
2、分别加入 3μlddATP混合物,ddCTP混合物,ddGTP混合物,ddTTP混合物至标好的 A,C,G,T管内，盖好盖子，以防蒸发。
3,用酶稀释液稀释测序 DNA聚合酶,4个反应需用 7μl稀释缓冲液加 3μl测序 DNA聚合酶,
从而得到 10μl浓度为 10U/μl的测序 DNA聚合酶 。
质粒测序方法
4,配制反应混合液：
反应缓冲液 3μl
2pmol/μl标记引物 1μl
待测质粒 DNA0.2μg/μl 1μl
水 14μl
稀释好的酶 2μl
总体积 20μl
质粒测序方法
5,混匀后在标好的 A,C,G,T管内分别加入 5μl
反应混合液,混匀加 10～ 20μl石蜡油 。
6,进行 PCR循环：
注意：退火温度主要依赖于引物的特异序列,以及模板纯度,下面仅介绍一般程序：
95℃ 预变性 1分钟
50℃ 30”
70℃ 60”
95℃ 30”
共 30个循环 。
质粒测序方法
7,加 8μl甲酰胺上样缓冲液,混匀
8,取 2μl电泳
9,如果是荧光标记,可由测序仪自动分析测序结果；如果标记物为放射性,则凝胶电泳结束后用胶片放射自显影,然后以胶片上读结果 。
质粒测序方法
MegaBACE instrument
质粒测序方法
Sequence Analyzer
质粒测序方法第二节 核酸的高级结构一,DNA的二级结构
（ 1）二级结构的含义,
DNA的二级结构是指 DNA的双螺旋结构。
绝大多数 DNA是由两条多脱氧核苷酸链构成的双链分子或双链环状分子，只有少数病毒为 DNA单链环状分子（如 M13,?X174)
（ 2） DNA碱基组成的特点 —Chargaff定律碱基当量定律 A+G=T+C
不对称比率 A+T/G+C
（ 3）二级结构的典型结构
B-DNA(Watson & Crick模型,1953年）
DNA的二级结构
DNA的二级结构
DNA的二级结构
DNA的二级结构
DNA
的双螺旋结构
DNA的二级结构
B-DNA结构要点
1,右手螺旋，有大沟和小沟
2,直径 20?,10个碱基组成一个螺旋，沿中心轴上升 3.4?
3,磷酸和戊糖组成的链位于外侧，碱基位于内侧
4,A和 T配对,G和 C配对
5.维持双螺旋结构的主要力：氢键和碱基堆积力
DNA的二级结构
（ 4） DNA双螺旋结构的多态性类型 旋转方向螺旋直径
nm
螺距
nm
每转碱基对数目碱基对垂直距离 nm
碱基对与水平面倾角
A-DNA 右 2.3 2.8 11 0.255 20
B-DNA 右 2.0 3.4 10 0.340 0
C-DNA 右 3.1 9.3 0.310 6
Z-DNA 左 1.8 4.5 12 0.370 -9
DNA的二级结构
A-DNA B-DNA & H-DNA
DNA的二级结构
B-DNA & Z-DNA
DNA的二级结构
(5) DNA的其它螺旋结构回文结构镜像重复三股螺旋（ H-DNA）
DNA的其它结构回文结构 — DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的 双螺旋结构 。即对称轴一侧的片段旋转 180° 后，
与另一侧片段对称重复。
回文结构能形成十字结构和发夹结构
DNA的其它结构
AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATC
TTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG
存在于 同一股上 的某些 DNA区段的反向重复序列。此序列各单股中没有互补序列，不能形成十字型或发夹结构。
镜像重复
DNA的其它结构
DNA三股螺旋（ H-DNA,ts-DNA）
多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的 DNA螺旋区段，
其序列中有较长的镜像重复时，形成局部三股配对，并互相盘绕的三股螺旋，
其中两股的碱基按 Watson-Crick方式配对，
第三股多聚嘧啶（镜像重复）通过 TAT和
CGC+配对，而处于双螺旋的大沟中。
DNA的其它结构
DNA的三股螺旋
DNA的三股螺旋
DNA三螺旋的碱基配对二,DNA的三级结构双螺旋进一步扭曲形成的超螺旋。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。
包括,线状 DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状 DNA形成的结、超螺旋和连环等线状 DNA形成的超螺旋
DNA的三级结构环状 DNA形成的超螺旋
DNA的三级结构三,RNA的结构
RNA的一级结构是由数量极其庞大的四种核糖核酸（ AMP,GMP,CMP,UMP）按一定顺序，通过 3′,5′磷酸二酯键连成的线形分子。
RNA的二级结构是短的，不完全螺旋的多核苷酸链。
RNA的三级结构是在茎环结构基础上进一步扭曲折叠而成的复杂结构。
（一） tRNA的结构
1,tRNA的一级结构由 74~93个（多为 76个）核苷酸组成单链 ；
具有不变的（恒定的）核苷酸,U8,G18,G19 ；
含较多的修饰核苷酸；
5ˊ 端多为 PG,3ˊ 端多为 CCAOH 。
2.tRNA的二级结构 ——三叶草结构具有四臂四环，
3ˊ 端为 CCAOH 序列,5ˊ 端为 PG
3,tRNA的三级结构 ——倒 L形结构
RNA的结构
tRNA的三叶草结构
RNA的结构
tRNA的三级和二级结构
RNA的结构
（二） mRNA的结构
RNA的结构
(三） rRNA的结构
rRNA是核糖体的组成成分,其种类和大小用 S表示。
30S 16S
原核生物 70S 23S
50S
5S
40S 18S
真核生物 80S 28S
60S 5.8S
5S
RNA的结构
rRNA的二级结构
RNA的结构第二章 核酸的性质和研究方法
Properties and research method
of Nucleic Acid
第一节 核酸的理化性质一,一般理化性质
1.晶形
DNA为白色纤维状固体； RNA为白色粉末状固体
2.溶解性均溶于水；不溶于一般有机溶剂，在 70%乙醇中形成沉淀；
在 0.14MNaCl 和 1~2MNaCl中
DNA-蛋白 溶解度低 溶解度高
RNA-蛋白 溶解度高 溶解度低
3.粘度 DNA粘度很大 RNA粘度小得多
4.旋光性 均很强
5密度及沉降性密度,RNA>双链 DNA；环状 DNA >开环、线状 DNA
二,核酸的紫外吸收纯 DNA OD260/OD280=1.8
纯 RNA OD260/OD280=2.0
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使 DNA和
RNA在 240～ 290nm处有强烈紫外吸收，最大吸收
260nm
核酸的性质三,密度及沉降特性密度：
RNA>双链 DNA；
环状 DNA >开环、线状 DNA
单链 DNA >双链 DNA
沉降速度：
RNA >环状 DNA >开环、线状 DNA
核酸的性质四,核酸的变性、复性变性：指双螺旋区氢键断裂变成单链，不涉及一级结构破坏的过程。
复性：变性 DNA在适当条件下，又可使两条分开的链重新缔合成双螺旋的过程。
核酸的性质
DNA 的变性和复性核酸的性质第二节 核酸研究方法一、核酸电泳最常用：凝胶电泳优点：简单，快速，灵敏，成本低。
常用有：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）琼脂糖凝胶电泳常用于分析 DNA，用于分析 RNA时，由于其常含有 RNA酶，必须先加蛋白质变性剂
（如甲醛等）处理后才能用于分析核酸的研究方法与电泳迁移有关的因素
1 核酸分子大小：与分子量大小对数成反比。
2 胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，常用 1％凝胶。
3 DNA构象：超螺旋最快，线形 DNA其次，开环形最慢。
4 电流：一般不大于 5v/cm。
5 碱基组成：有影响，但不大。
6 温度,4～ 30℃,常在室温下进行核酸的研究方法电泳完毕，将凝胶在溴乙锭溶液中染色
（ 0.5ug/ml)。
溴乙锭为一扁平分子，很容易插入 DNA碱基对之间。
DNA与溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发射出红橙色的可见荧光。 0.1ugDNA即可检出。
核酸的研究方法
（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳加入交连剂其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于 1000bp的
DNA片断。另外，一般不含 RNA酶，所以可以用于 RNA分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品，经溴乙锭染色后，在紫外光下，发出的荧光很弱，所以，浓度很低的样品不能用此法检测。
核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法
DNA样品回收方法紫外照射下切下所需 DNA,切下的胶条放于透析袋中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳,3
～ 4小时后,DNA将电泳出来并粘在透析袋内壁上
，将电极倒转，通电 30～ 60秒，粘在内壁上的
DNA会释放到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提 1
～ 2次，水相用乙醇沉淀 DNA。这样回收的 DNA纯度很高 。
核酸的研究方法聚合酶链反应 (Polymerase Chain
Reaction,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术
PCR技术简史
PCR的最早设想,本世纪 60年代末、
70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于 1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA变性，与合适的引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA基因”。
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’解旋酶 解链酶
DNA
解旋解链合成引物子链延长
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
DNA
解旋解链合成引物子链延长
GGAUCG 5‘
AUCGCG5‘
引物酶引物酶
RNA引物
RNA引物
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
DNA
解旋解链合成引物子链延长
GGAUCG 5‘
AUCGCG5‘
TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’
ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 3’
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
PCR技术
PCR技术简史
DNA的复制
核酸体外扩增的设想
聚合酶链反应的发明
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
DNA
的变性与复性变性复性加热退火
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’ 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’
PCR技术
PCR的实现,1985年,美国 PE-Cetus公司的 Mullis等人发明了聚合酶链反应 （ PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA复制最初采用 E-coli DNA聚合酶进行 PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热 DNA聚合酶的应用使得 PCR能高效率的进行,随后 PE-Cetus公司推出了第一台 PCR
自动化热循环仪
1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
PCR技术简史PCR技术
PCR技术简史
PCR的改进与完善,Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的一个片段，其缺点是：
①此酶不耐高温,90℃ 会变性失活，每次循环都要重新加。
PCR技术
② 其 PCR产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。
引物链延伸反应在 37℃ 下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，此种酶催化的 PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于酶不耐热，在 DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，
给 PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR
技术在一段时间内没能引生物医学界的足够重视。
PCR技术 PCR技术简史
PCR技术简史
1988年初,Keohanog改用 T4 DNA聚合酶进行 PCR，
其扩增的 DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
PCR技术
1988年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌
(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA聚合酶。为与大肠杆菌多聚酶 I Klenow片段区别，将此酶命名为 Taq
DNA多聚酶 (Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使 PCR广泛的被应用。
PCR技术
PCR技术简史
Taq DNA聚合酶的特点：
①耐高温，在 70℃ 下反应 2h后其残留活性大于原来的 90%，
在 93℃ 下反应 2h后其残留活性是原来的 60%，在 95℃ 下反应 2h后其残留活性是原来的 40%。
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
PCR技术 PCR技术简史
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点标准的 PCR反应体系
4种 dNTP混合物 各 200umol/L
引物 各 10～ 100pmol
模板 DNA 0.1～ 2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
1 2 3 4 5
22
55
72
94
时间（ min）
温度
（ ℃ ）
适温延伸 3高温变性 1 低温退火 2 重复 1~3步
25~30轮目的 DNA片段扩增 100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链与引物复性
DNA
变性形成2
条单链子链延伸
DNA加倍
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
1 2 3 4 5
22
55
72
94
时间（ min）
温度
（ ℃ ）
适温延伸 3高温变性 1 低温退火 2 重复 1~3步
25~30轮目的 DNA片段扩增 100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链与引物复性子链延伸
DNA加倍
DNA
变性形成2
条单链模板 DNA
95℃
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃ 50℃
引物 1
引物 2
DNA引物
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
50℃
引物 1
引物 2
DNA引物
72℃
Taq酶
Taq酶
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第 1轮结束
95℃
第 2轮开始
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃ 50℃72℃Taq
Taq
Taq
Taq
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第 2轮结束
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点 重复 30轮后
230=1,073,741,824
模板 DNA第 1轮扩增第 2轮扩增第 3轮扩增第 4轮扩增 第 5轮扩增 第 6轮扩增
PCR技术理想拷贝数 =2n
n 循环次数实际拷贝数 =(1+x)n
X 平均效率,约为 0.85
n 循环次数
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点电泳分析
PCR技术
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点电泳分析
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点灵敏度高皮克 (pg=10-12)量级扩增到微克 (ug=10-6)水平能从 100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达 3个 RFU
细菌检测的最小检出率为 3个细菌简便、快速一次性加好反应液,2～ 4 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提 DNA
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国内外生产的几种 DNA扩增仪
2400型 PCR扩增仪
2700型 PCR扩增仪
9600型 PCR扩增仪
9700型 PCR扩增仪
PCR的步骤一,概 述
（一） PCR反应中的主要成份
1,引物,引物的好坏往往是 PCR成败的关键。
2,PCR反应系统的组成：
⑴耐热 DNA聚合酶（ Taq酶）
⑵模板 DNA：即待分析的目的 DNA，其长度不宜大于 10kb。
⑶引物：为了保证 DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，
需要两种引物，分别位于两条互补模板 DNA链的 3`-端。
⑷四种 dNTP。
⑸缓冲溶液：保证 DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液 pH值。
1.引物设计遵循的原则：
(1) 引物长度约为 16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。
(2) 引物中 G+C含量通常为 40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝
4(G+C)+2(A+T).
(3) 四种碱基应随机分布，在 3‘端不存在连续 3个 G或 C,因这样易导致错误引发。
(4) 引物 3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5) 在引物内,尤其在 3‘端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在 3‘端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。
(7) 引物 5‘端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等,
通常应在 5’端限制酶位点外再加 1-2个保护碱基。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,
以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的 Met,3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般 PCR反应中的引物终浓度为 0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。
利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在 1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X,引物摩尔浓度,A,C,G,T,引物中 4种不同碱基个数。
2,4种三磷酸脱氧核苷酸
(dNTP)：
dNTP应用 NaOH 将 pH调至 7.0,并用分光光度计测定其准确浓度,dNTP原液可配成 5-10mmol/L并分装,-20℃ 贮存。一般反应中每种 dNTP的终浓度为 20-200μmol/L。理论上 4 种 dNTP各 20μmol/L,足以在 100μl反应中合成 2.6μg的
DNA。当 dNTP终浓度大于 50mmol/L时可抑制 Taq DNA聚合酶的活性,4种 dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种 dNTP的不足出现的错误掺入。
Mg2+浓度对 Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常 Mg2+ 浓度范围为 0.5-2mmol/L.对于一种新的 PCR反应,可以用 0.1-5mmol/L的递增浓度的 Mg2+ 进行预备实验,选出最适的 Mg2+浓度。在 PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或 EDTA
等可能影响 Mg2+离子浓度的物质,以保证最适 Mg2+浓度。
3,Mg2+：
4,模板：
PCR反应必须以 DNA为模板进行扩增，模板 DNA可以是单链分子，也可以是双链分子,可以是线状分子，也可以是环状分子 (线状分子比环状分子的扩增效果稍好 )。就模板
DNA而言，影响 PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为 102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要 0.1μg的人基因组 DNA,10ng的酵母 DNA,1ng的大肠杆菌 DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的 PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的 DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。 DNA中的杂质也会影响 PCR的效率。
5,Taq DNA聚合酶：
一般 Taq DNA聚合酶活性半衰期为 92.5℃ 130min,95℃
40min,97℃ 5min。现在人们又发现许多新的耐热的 DNA聚合酶
，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为 74℃ 下,30min，掺入 10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，
一般 PCR中出错率为 2× 10-4 核苷酸 /每轮循环，在利用 PCR克隆和进行序列分析时尤应注意,在 100μl PCR反应中,1.5-2单位的 Taq
DNA聚合酶就足以进行 30轮循环。所用的酶量可根据 DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活 Taq DNA聚合酶，灭活 Taq
DNA聚合酶的方法有：
(1) PCR产物经酚,氯仿抽提,乙醇沉淀 。
(2) 加入 10mmol/L的 EDTA螯合 Mg2+ 。
(3) 99-100℃ 加热 10min。
6,反应缓冲液：
反应缓冲液一般含 10-50mmol/L Tris·Cl (20℃ 下
pH8.3-8.8),50mmol/L KCl和适当浓度的 Mg2+。
Tris·Cl在 20℃ 时 pH为 8.3-8.8，但在实际 PCR反应中
,pH为 6.8-7.8。 50mmol/L的 KCl有利于引物的退火
。另外，反应液可加入 5mmol/L的二硫苏糖醇 (DDT)
或 100μg/ml的牛血清白蛋白 (BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入 T4噬菌体的基因 32蛋白则对扩增较长的 DNA片段有利。各种 Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
二,PCR反应参数
1,变性,在第一轮循环前,在 94℃ 下变性 5-10min非常重要,它可使模板 DNA完全解链,然后加入 Taq DNA聚合酶 (hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使 PCR失败,因为未变性完全的 DNA双链会很快复性,减少 DNA产量,一般变性温度与时间为 94℃ 1min。在变性温度下,双链 DNA解链只需几秒钟即可完全,
所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含 GC
的序列,可适当提高变性温度,但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2,退火,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度,
实际使用的退火温度比扩增引物的 Tm值约低 5℃ 。一般当引物中
GC含量高,长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度 (例如用 60℃ 和 94℃ )完成整个扩增循环
,既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为 37℃ -55℃,1-2min。
3,延伸,延伸反应通常为 72℃,接近于 Taq DNA聚合酶的最适反应温度 75℃,实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为
Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从 20℃ -85℃,延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度,在一般反应体系中
,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成 2kb长的 DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加,但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间 (10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,
这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4,循环次数,当其它参数确定之后,循环次数主要取决于 DNA浓度。一般而言 25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使 PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经 25-30轮循环扩增后,反应中 Taq
DNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的 DNA样品稀释 103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经 60轮循环后,扩增水平可达 109-1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示,C＝ C0 (1+P)n 。其中,C为扩增产物量,C0 为起始 DNA量,P
为增效率,n为循环次数。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，
减少非特异性产物。
二,材料、设备及试剂一、材料不同来源的模板 DNA。
二、设备移液器及吸头，硅烷化的 PCR小管,DNA扩增仪 (PE公司 )，琼脂糖凝胶电泳所需设备 (电泳槽及电泳仪 )，台式高速离心机。
三、试剂：
1,10× PCR反应缓冲液,500mmol/L KCl,100mmol/L Tris·Cl,在
25℃ 下,pH9.0,1.0％ Triton X-100。
2,MgCl2,25mmol/L。
3,4种 dNTP混合物,每种 2.5mmol/L。
4,Taq DNA聚合酶 5U/μl。
5,T4 DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。
6、经 SmaⅠ 酶切和加 dT的 pUC质粒。
7、其它试剂：矿物油（石蜡油）,1% 琼脂糖,5× TBE，酚,氯仿,
异戊醇 (25:24:1)，无水乙醇和 70％ 乙醇。
三、操作步骤一,PCR反应
1,依次混匀下列试剂
35μl H2 O
5μl 10× PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种 dNTP
0.5μl 上游引物（引物１）
0.5μl 下游引物（引物２）
0.5μl 模板 DNA(约 1ng)
混匀后离心 5秒。
2,将混合物在 94℃ 下加热 5分钟后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底,加入 Taq DNA聚合酶（
0.5μl约 2.5U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3,用 94℃ 变性 1分钟,45℃ 退火 1分钟,72℃ 延伸 2分钟,循环 35轮,进行 PCR。最后一轮循环结束后,于 72℃
下保温 10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳取 10μl扩增产物用 1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三,PCR产物的纯化扩增的 PCR产物如利用 T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
（一）酚 /氯仿法
1.取反应产物加 100μl TE.。
2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机 10000rpm离心 15秒
，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次，可除去覆盖在表面的矿物油。
3.再用酚,氯仿,异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
4.在水相中加 300μl 95％乙醇，置 -20℃ 下 30min沉淀。
5.在小离心机上 10000rpm离心 10min，吸净上清液。加入 1ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液。重复洗涤沉淀 2次。
将沉淀溶于 7ml ddH2O 中，待用。
PCR产物纯化方法
0.05mol/1三羟甲基氨甲烷（ Tris）缓冲液，
PH=7.5内含 0.004mol/1EDTA。简称 TE缓冲液。
称约 1.21克 Tris和 0.298克 EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）溶于 150毫升蒸馏水中，先用稀盐酸调 PH近
7.5，加水至近 200毫升，再调 PH至 7.5并加水至刻度，存冰箱
（二） Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取 PCR扩增液中的 DNA，提纯后的 DNA可用于测序、标记
、克隆等。
该系统中含有的试剂和柱子可供 10,20,25,50,100
次 PCR产物的纯化，试剂包括：
Wizard PCR DNA纯化树脂直接提取缓冲液
Wizard微型柱分子生物学用试剂盒货号 品名 产地 规格 包装 价格
（元）
S06002 Wizard Plus微量 DNA纯化试剂盒 Promega A1330 50次 552
S06003 Wiazrd Plus微量 DNA纯化试剂盒 Promega A7100 50次 806
S06005 Wizard Plus中量 DNA纯化试剂盒 Promega A7640 25次 1381
S06006 Wizard Plus大量 DNA纯化试剂盒 Promega A7270 10次 1105
S06007 Wizard DNA-UP树脂纯化试剂盒 Promega A7280 100次 1049
S06008 Wizard PCR Preps DNA树脂纯化试剂盒 Promega A7170 50次 850
S06009 Wizard λDNA 树脂纯化试剂盒 Promega A7290 20次 729
S06010 Wizard 基因组 DNA纯化试剂盒 Promega A1120 100× 300μL 1296
1、吸取 PCR反应液水相放于 1.5ml eppendorf管中。
2、加 100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
3、加 1ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合 3次。
4、取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒与 Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
5、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入 2ml 80%
异丙 醇，对微型柱进行清洗。
6、取出微型柱置于 eppendorf管中,12000g离心 20秒，以除去微型柱中的洗液。
7、将微型柱放在一个新 eppendorf管中，加 50μl TE或水，静止 1分钟后,12000g
离心 20秒。
8、丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化 DNA，存放于 4℃ 或 -20℃ 。
[注意 ]
1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。
2,PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取 DNA的 产量。
Wizard PCR DNA纯化过程
研究
– 基因克隆,DNA测序,分析突变
诊断
– 细菌,病毒,寄生虫检测,诊断
人类基因组工程
– 遗传图谱的构建,DNA测序,表达图谱
法医
– 犯罪现场标本分析
肿瘤
– 各种肿瘤检测
其他 ……
PCR的应用
4,PCR的主要用途：
1、目的基因的克隆：是迅速获得一定量的目的基因的有效方法之一。
① 利用特异性引物以 cDNA或基因组 DNA为模板，获得已知的目的基因；
② 利用简并引物从 cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的 DNA片段；
③ 利用随机引物从 cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。
2、基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。
3,DNA的微量分析：由于 PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量 DNA的分析检测。
三核酸的分子杂交第三章 核酸的研究进展
Structure of Nucleic Acid
1990年
“人类基因组计划”正式启动。
1996年第一只体细胞克隆动物（绵羊）“多莉”在英国诞生。
1998年中、日、美、英、韩五国代表制定“国际水稻基因组测序计划”。
1999年国际人类基因组计划联合研究小组宣布完整破译出人体第 22对染色体的遗传密码。
2000年中、美、日、德、法、英 6国科学家联合宣布成功绘制出人类基因组草图。
“中国超级杂交水稻基因组计划”正式启动
2001年中、美、日、德、法、英 6国科学家联合公布了人类基因组图谱及初步分析结果。
2003年第一只体细胞克隆动物（绵羊）“多莉”死亡。
中国大陆、台湾、香港科学家宣布联手启动“中华人类基因组单体型图”计划。
中、美、日、德、法、英 6国科学家联合宣布完成人类基因序列图。
中、美科学家分别测定出非典型肺炎病毒的基因图谱。
1972，基因重组技术
1978，人类试管婴儿技术
1985,DNA扩增技术（ PCR）
1990，人类基因组计划（ HGP）
1997，哺乳动物克隆技术影响深远的生物学技术
