分子克隆技术
系列一
利用质粒载体克隆水稻 DNA片段
CIAP去除 5‘磷酸
外源 DNA
限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH
5’P 3‘OH 5’P
5’P
3‘OH
3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
5’OH
3’OH
转化 E.Coli
限制性内切酶酶切
多克隆位点
3’OH
载体必备条件,
1,是一个复制子；
2,载体在受体细胞中能大量繁殖, 其携带的外
源基因才能在受体细胞中得到大量扩增；
3,有 1到几个限制内切酶的单一识别与切割位
点, 便于外源基因的插入；
4,具有选择性的遗传标记 (如抗生素抗性标记
等 )以此知道它是否已进入受体细胞, 并据
此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来 。
基因克隆相关载体,
? Plasmid
? Cosmid,Fosmid
? P1
? YAC (Yeast Artificial Chromosome)
? BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
? MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
? PAC (P1-derived Artificial Chromosome)
? BIBAC (Binary-BAC)
? TAC (Transformation-competent Artificial Chromosome)
质粒的基本特点
质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子,
大小在 1－ 20kb之间, 是双链闭合环状 DNA分子,
具有自主复制和转录能力, 能使子代细胞保持它
们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息 。 它
可独立游离于细胞质中, 也可整合到细菌染色体
上 。 质粒在细胞内的复制可分为严谨型 （ 只在细
胞周期的一定阶段进行复制, 一个细胞内只有 1
至几个拷贝 ） 和松弛型 （ 细胞周期中随时可以复
制, 拷贝数较多, 一般在细胞内有 20个以上 ）
E.coli 的 pSC101是第一个用来作为克隆
载体的质粒，其包含一个 EcoR I 酶切位点
及四环素抗性基因（ tetr )
pBR322是最早被广泛应用的克隆载体
之一，它包含 ampicillin和 tetracycline抗性
基因和多种限制性内切酶的单一切点。许多
第二代、第三代的克隆载体都是从 pBR322
衍生而来。
实验一、质粒的抽提
实验目的,掌握减法抽提质粒的原理, 步骤及
各试剂的作用
实验材料,含有 pUC18载体的大肠杆菌
实验步骤,
1,细菌培养物的生长
2,细菌的收集及裂解
3,质粒的沉淀
细菌培养物的生长
从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素
的培养基中，培养至对数生长后期即可
（松驰型质粒 〕 。严谨型质粒（拷贝数较
低）可采用绿霉素扩增的办法来扩增质粒；
细菌的收集及裂解,
通过离心收集菌体；细菌的裂解可采用
离子型或非离子型去污剂, 有机溶剂, 碱处
理或加热处理等方法 。 （ 具体采用何种方法
取决于质粒的大小, 大肠杆菌菌株及裂解后
纯化质粒的方法 ）
质粒的沉淀,加 2/3体积的异丙醇, 室温
下放置 5分钟或两倍体积 95％
乙醇混匀, 冰上放置 10分钟；
质粒的纯化,一般采用苯酚 /氯仿纯化质
粒 ; 为满足较高要求, 可采用
氯化铯密度梯度离心
操作步骤 （ 一 ）,
1,接 种 于 含有 相 应 抗生 素 的 LB 培 养基 （ 含
AMP）, 过夜培养；
2,吸取 1.5ml菌液, 12000rpm离心 2分钟；
3,加入 100?l solution Ⅰ 振荡打匀, 重新悬浮细胞；
（ 注意：应彻底打匀使无沉淀或碎块 ）
4,加入 200?l solution Ⅱ 轻柔颠倒混匀, 放置冰上
至清亮, 一般不超过 5分钟；
5,加入 150?l solution Ⅲ 颠倒混匀, 放置于冰上 10
分钟, 使杂质充分沉淀；
操作步骤 （ 二 ）
6,12000rpm离心 10分钟；
7,吸取 400?l上清 （ 注意：不要汲取到飘浮的杂
质 ）, 加 2/3体积的异丙醇, 室温下放置 5分钟
或两倍体积 95％ 乙醇混匀, 冰上放置 10分钟；
8,12000rpm4oC冷冻离心 15分钟；
9,倒尽上清, 加 75％ 乙醇浸洗洗盐, （ 放置片刻
后倒去上清；或离心 5分钟 ）
10.加 50 ?l灭菌超纯水或 TE溶解 。
质粒 DNA质量检测
1,DNA纯度, 吸光值检测：检测 260nm,280nm
吸光值, 紫外分光光度计 A260/A280=1.8－ 2.0；
1.8最佳, 低于 1.8说明有蛋白质, 大于 1.8说明有
RNA。
2,质量检测, 琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带
（ 超螺旋, 开环, 线型三种构型 ）, 点样孔附
近无 DNA带 （ 无染色体 DNA污染 ） 。
3,DNA浓度,
1 0D＝ 50ug/ml DS-DNA 或
1 0D＝ 40ug/ml RNA or SS－ DNA
琼脂糖凝胶电泳
? 制胶：先封好制胶板, 调好梳子的高度；再
称取 0.21g琼脂糖于 30ml 0.5× TBE电泳液中,
融化, 冷至 50 oC左右加 2?l EB,混匀, 倒胶；
? 制样,10μl溶解后的质粒加入 1－ 2μl溴酚兰 ;
? 点样电泳；
? 结果观察：一般有三条带 （ 超螺旋, 开环,
线型三种构型 ）
SolutionI,葡萄糖 50Mm
Tris.HCl 25Mm
EDTA 10Mm
RNase A 100μg/ml
SolutionII,
NaOH 0.2N
SDS 1%
SolutionIII,
5M KAC 60ml
冰乙酸 11.5ml
H2O 28.5ml
For sequence,
Solution I,
1 M Tris-HCl(pH7.6) 2.5ml
0.25 M EDTA 2.0ml
ddH2O 45ml
sterile by autoclave
add 10mg/ml RNaseA 0.5ml
Solution III,
5 M KAC 13.2ml
ddH2O 27ml
Adjust pH to 4.8
add H2O to 50ml
Sterile by autoclave
?RNaseA,C 或 U的 3’－ P与相临的 5’－
OH处切开 。 〔 配制：一般以 10mg/ml
溶于 TE中, 然后在沸水中煮 10－ 30分
钟之后分成小份储存于－ 20oC〕
?EB：溴化乙锭, 可嵌入 DNA分子中,
受紫外光激发而发出荧光, 利用它可
检测 DNA。 是诱变剂, 可引起插入突
变, 并有中度毒性, 操作时应注意防
护 。
氨苄青霉素 （ ampicillin）, 能够杀死正在生长
的大肠杆菌, 其主要通过肽聚糖交联而抑制
细胞壁的合成 。
氨苄青霉素抗性基因 （ ampr）,合成 β-内酰胺
酶, 在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解 。
氯仿, 对眼睛, 皮肤, 粘膜及呼吸道都
有刺激作用, 它是致癌剂并可损
伤肝脏和肾脏, 操作时需戴手套,
安全镜并在通风橱中进行 。
苯酚,是强腐蚀剂, 能引起严重烧伤 。
操作时应戴手套, 安全镜, 穿防
护服, 并在通风橱中进行 。
感受态细胞的制备
将外源 DNA导入大肠杆菌去主要有两种方法,
1,电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔 。 因而需用
冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞,
以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子 。 109
－ 1010转化子 /?g DNA；
2,CaCl2 法：利用冰冷的 CaCl2处理对数生长期的细
胞, 可以诱导其产生短暂的, 感受态,, 易于摄取
外源 DNA。 106－ 107/?g DNA。
实际操作过程中应注意的事项,
1,密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数
生长期的细胞 （ 一般通过检测 OD600 来控制 。
DH5?菌株 OD600为 0.5时细胞密度是 5× 107/ml） ；
2,所有操作均应在 无菌条件和冰上 进行；
3,所使用的器皿必须干净 。 因为痕量的去污剂或其
它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率
另外, 转化时还应注意质粒的质量和浓度,（ 1） 用
于转化的应主要是超螺旋的 DNA； （ 2） 一定范围
内, 转化效率与外源 DNA的浓度呈正比 )
操作步骤 （ 一 ）,
1,前夜接种受体菌 （ DH5?或 DH10B）, 挑取单菌落
于 LB 培养基中 37oC 培养过夜 （ 约 16小时 ） ；
2,转接 1ml过夜培养物于 100ml 添加有 20mM MgCl2 在
37oC摇床剧烈振荡培养约 2.5-3 小时 （ 300rpm） ；
3,将 0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷； ( 注：后继步骤
需在无菌和 0-4oC下操作 )
4,吸取 1.5ml培养好的菌液至 1.5ml离心管中, 在冰上
冷却 10分钟；
操作步骤 （ 二 ）
5,4oC下 4000rpm冷冻离心 10分钟；
6,弃去上清, 加入 100?l预冷 0.1M CaCl2溶液, 用
移液枪轻轻上下吸动打匀, 使细胞重新悬浮,
在冰上放置 20分钟；
7,重复 6,7,6步骤；
8,细胞悬浮液可立即用于转化实验 或添加冷冻保
护剂后超低温冷冻贮存备用 （ － 70oC） 。
利用质粒载体克隆水稻 DNA片段
外源 DNA 克隆的要求 说明
所带的末端
平端 要求较高的 DNA及连接酶
不同的突出端 用两种限制酶消化后
需纯化质粒以提高连接效率
相同的突出端
1,酶切位点可保留
2,非重组克隆背景低
3,不需 CIP处理
4,外源 DNA只以一个方
向插入重组质粒中
1,非重组克隆的背景高
2,不同酶切的平头可连接
3,质粒及外源 DNA连接处
的酶切位点消失
4,重组质粒会带有 外源
DNA的串联拷贝
线状质粒 DNA常需用磷
酸酶 （ CIP） 处理
1,酶切位点常可保留
2,外源 DNA会以两个方向
插入
3,重组 质粒可带 有外源
DNA的串联拷贝
CIAP去除 5‘磷酸
外源 DNA
限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH
5’P 3‘OH 5’P
5’P
3‘OH
3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
5’OH
3’OH
转化 E.Coli
限制性内切酶酶切
多克隆位点
蓝色菌落：载体自连
白色菌落：外源片段插入
在质粒中克隆外源片段的主要步骤 （ 一 ）,
1,载体及外源片段的限制酶消化, 限制性内切酶
切出相互匹配的粘性末端 〔 一种酶 〕 或不相匹
配的粘性末端 （ 不同酶消化 ） 或平端；
2,载体的去磷酸化, 碱性磷酸酶去除载体的 5’－ P
基团, 以防载体自连；
3,线状载体与外源片段的连接, 连接酶使双链
DNA 5’－ P与相邻的 3’－ OH之间形成新的共价
键, 若质粒载体的两条链都带有 5‘磷酸基团,
则可形成 4个新的磷酸二酯键, 但如质粒已去
磷酸化, 则只能形成 2个新的磷酸二酯键, 且
产生的两个杂交分子带有 2个单链切口, 当杂
合体导入到感受态细胞后可被修复 。
在质粒中克隆外源片段的主要步骤 （ 二 ）
4,连接产物转化感受态细胞,
注意：利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时,
用转化细胞 铺平板的密度要低 （ 90mm
平板上不得超过 105个菌落 ）, 同时
37?C培养不应超过 20小时, 具氨苄青
霉素抗性的转化体可将 ?－内酰胺酶分
泌到培养基中, 迅速灭活菌落周围的
抗生素, 从而导致对氨苄青霉素敏感
的卫星菌落的出现 。
5,转化子的鉴定 （ ?互补 ）
转化子的鉴定 （ ?互补 ）,
许多常用载体 （ pUC系列 ） 都带有一个大肠杆菌 DNA的短片段,
其中含有 ?-半乳糖苷酶 （ LacZ） 的调控序列和头 146个氨基酸的
编码序列, 该编码区中插入了一个多克隆位点, 它并不破坏阅读
框, 但可使少数几个氨基酸插入到 ?-半乳糖苷酶的氨基端而不影
响功能 。 这种载体适用于可编码 ?-半乳糖苷酶 C端部分序列的宿
主细胞 。 虽然宿主和质粒编码的片段都没有活性, 但它们可以融
为一体, 形成具有酶学活性的蛋白质 。 这样, LacZ基因缺失 近
操纵基因区段 的突变体与带有完整的 近操纵基因区段 的 ?-半乳糖
苷酶阴性的突变体之间实现互补, 这种现象叫 ?互补 。 由 ?互补
而产生的 LacZ＋ 细菌易于识别, 因为它们在生色底物 x-gal (5-溴 -
4-氯 -3-吲哚 -?-D-半乳糖苷 )存在下, 形成蓝色菌落, 而外源片段
插入到质粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无 ?互补
能力的氨基端片段, 因此, 带重组质粒的细菌形成白色菌落 。 这
一颜色反应大大简化了质粒重组体的鉴定 。
IPTG（ 异丙基硫代 -?-半乳糖苷 ）,是 ?-半乳糖苷酶活性的诱导物, 也可作为
具有 Lac或 Tac启动子的表达载体的表达诱导物来使用 。
蓝色菌落：载体自连
白色菌落：含外源片段
克隆中用到的几种工具酶,
?限制酶
?碱性磷酸酶
?连接酶
限制性内切酶,
1,About 400 different restriction enzymes,
2,RE were discovered in 1970s by Hamilton
Smith and Daniel Nathans,They shared the
1986 Nobel prize in physiology or Medicine
with Werner Arber,
II类限制性内切酶的特点
1,有特定的识别序列, 通常为 4－ 6个碱基的回
文对称序列 。
2,切割位点位于识别序列内的固定位置上, 切
割后在 5’末端有磷酸基团, 3’末端有羟基 。
3,切割后形成粘性末端或平末端, 前者又分为 3'
突出端 （ 如 PstI） 和 5’突出端 (如 EcoRI)两种
4,其活性发挥只需 Mg2＋ 作辅酶 。
限制酶的一个活性单位 （ 1U）,原则上指在
50ul反应体系中, 37?C下, 经过 1小时的反应将
1μg的 DNA完全分解所需要的酶量 。
限制酶的 star活性：限制酶在某些条件下使
用时对底物 DNA的特异性可能降低, 即可将与原
来识别的特定 DNA序列不同的碱基序列切断, 这
种现象叫限制酶的 star活性 。 它的出现的频率与酶,
底物及反应条件有关 。
碱性磷酸酶
细菌碱性磷酸酶 〔 BAP〕 和牛小肠碱性
磷酸酶 （ CIAP） 都能催化水解 DNA,RNA、
dNTP和 NTP上的 5‘－磷酸残基 。 比较而言,
CIP更常用, 因其可在 70?C 10’内加热灭活或
通过酚抽提而变性失活, 同时 CIP的活性比
BAP的高 10－ 20倍 。
牛小肠碱性磷酸酶 （ CIAP） 是一个二
聚体蛋白, 每个 CIP单体带有两个对酶的活
性至关重要的 Zn原子, 去磷酸化的缓冲液中
应含有终浓度为 1m mol/L 的 ZnCl2 。
连接酶
体外催化磷酸二酯键的形成可使用两
种酶：大肠杆菌连接酶和 T4噬菌体连接酶,
但几乎在所有的克隆中 T4噬菌体连接酶都
是首选的酶, 因其能在正常的反应条件下
能有效的将平端连接起来 。
各种连接酶特性的比较,
T4DNA
Ligase
E.coli DNA
Ligase
T4 RNA
Ligase
Ligases of
thermophilic
bacteria
最适 pH
辅酶
7.2-7.8
ATP
7.5-8.0
NAD
7.2-8.4
ATP
NAD
平滑末端 可能 * 不能 NO
DNA 5’P末端和
RNA 3’OH末端
可能 可能 不能 NO
RNA 5’P末端和
DNA3 ’OH末端
可能 不能 不能 NO
RNA和 RNA 少数 可能 不能 可能 NO
外源片段,
5’GATCCN － －－－－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－－－－ NCTTAA 5’
载体,
5’GATCCN － －－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－ － NCTTAA 5’
连接后
EcoR I,
5’---NGAATTCN---3’
3’---NCTTAAGN---5’
5’NG 3’ 5’ AATTCN 3’
3’NCTTAA 5’ 3’ GN 5’
BamH I,
5’--NGGATCCN--3’
3’--NCCTAGGN--5’
5’-NG 3’ 5’GATCCN 3’
3’-NCCTAG 5’ 3’ GN 5’
Hind III
5’NAAGCTTN3’
3’NTTCGAAN5’
5’NA 3’ 5’ AGCTTN3’
3’NTTCGA 5’ 3’ AN5’
EcoR I,
5’---NGAATTCN---3’
3’---NCTTAAGN---5’
5’NG 3’ 5’ AATTCN 3’
3’NCTTAA 5’ 3’ GN 5’
BamH I,
5’--NGGATCCN--3’
3’--NCCTAGGN--5’
5’-NG 3’ 5’GATCCN 3’
3’-NCCTAG 5’ 3’ GN 5’
EcoR I/ BamH I 双酶切,
5’AATTCN －－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－ NCCTAG 5’
载体,
5’GATCCN －－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－ NCTTAA 5’
外源片段,
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 一 ）
1,外源 DNA和质粒载体的酶切及检测,
? 外源 DNA获取及酶切：某 BAC克隆 DNA 300ng,用
5 U限制性内切酶 EcoRI完全酶切, 1.2％ 凝胶检测
酶切是否完全；
? 取 40?l质粒载体 pUC18 DNA用 5U内切酶 EcoRI完全
酶切 (1hr),吸取 5?l用 1.2％ 凝胶检测酶切是否完全
? 造成 DNA酶切不完全的主要原因有,
1,DNA不干净, 反应体系中存在酶的抑制剂；
2,操作不当, 酶或 DNA加至管壁上, 反应体系没完全混合；
3,反应条件不合适, 用错了缓冲液或温度不合适；
4,酶的活力不够
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 二 ）
2,酶切产物的纯化,
a) 加等体积酚 /氯仿 （ 1:1）, 振荡混合后离心,
b) 吸出上层水相, 加入等体积氯仿 /异戊醇 （ 24,1）, 混合
后离心；
c) 吸出上清, 加 1/10体积 3M NaAC和两倍体积乙醇, -20oC
放置 15分钟以上；
d) 12000rpm 4oC冷冻离心 15分钟；倒去上清, 用 70％ 乙醇
浸洗沉淀, 风干加入 40?l d2H2O溶解；
DNA样品
加等体积的
苯酚,氯仿,异戊醇 (25:24:1) 混匀
8000rpm
离心 5’
上清转至一
新离心管
加 2倍体积的乙醇
1/10体积 3M的 NaAc
混匀 8000rpm
离心 5’
上清转至一
新离心管
加等体积的
氯仿,异戊醇 (24:1)
混匀,-20℃, 15’
12000rpm
离心 15’
弃上清，加 100μl
75%乙醇洗沉淀 吹干 TE溶解
注意,
氯仿 对眼睛, 皮肤, 粘膜及呼吸道都有刺激
作用, 它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏, 操
作时需戴手套, 安全镜并在通风橱中进行 。
苯酚 是强腐蚀剂, 能引起严重烧伤 。 操作时
应戴手套, 安全镜, 穿防护服, 并在通风橱
中进行 。
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 三 ）
3,按以下反应进行载体去磷酸化,
DNA 40?l
CIAP 5U
10 ? buffer 6.0?l
add d2H2O to 60?l
4,按第 2步纯化载体, 溶于 20 ?l d2H2O；
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 四 ）
5,连接反应,
DNA 5?l（ approx,150ng）
pUC18 1?l（ 40ng）
5 ? buffer 2?l
T4 ligase 2U
add d2H2O to 10?l 16oC水浴过夜
6,热激转化感受态细胞, 37?C培养过夜；
7,转化子鉴定,
质粒的转化 （ 热激法 ） 及转化子的鉴定
操作步骤 （ 一 ）,
1,取出 3管制备好的感受态细胞, 放在冰上融化；
2,每 100?l感受态细胞加入约 20ng 质粒 DNA,3管分别加连接
产物, 标准超螺旋质粒 DNA（ 阳性对照 ） 及不加入
任何 DNA（ 阴性对照 ）, 用移液枪轻轻吸打均匀,
在冰上放置 30分钟；
3,热击：将离心管放置 42oC水浴, 热击 90秒, 注意：勿摇动
离心管；
4,冰镇：快速将离心管转移至冰浴, 放置 1－ 2分钟；
操作步骤 （ 二 ）
5,复苏：每管加 400?l SOC培养基, 在 37oC摇床温和摇动
温育 45分钟, 使细菌复苏；
6,布皿：取适当体积均匀涂布于含有 IPTG,X-gal,抗生
素 （ AMP） 的 LB平板；
7,培养：倒置培养皿, 于 37oC培养 12－ 16小时 即可观察
到蓝白相间的菌落 （ 其中白色菌落为含有外源插
入片段的转化子, 蓝色菌落是载体自连的转化子 ）
转化时还应注意质粒的质量和浓度, （ 1）, 用于转化的
应主要是超螺旋的 DNA； （ 2）, 一定范围内,
转化效率与外源 DNA的浓度呈正比 。
转化子的鉴定：鉴定转化子中是否含有外源 DNA片
段常用的方法有,
1,?互补
2,杂交筛选
3,插入失活 （ 一些老质粒如 pBR322等 ）
4,小量提取质粒酶切检测
PCR
原 理,
PCR（多聚酶链式反应 〕 是一种体外扩增特异
DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技
术之一，是在模板 DNA、引物和 dNTPs的存在下
依赖于 DNA聚合酶的酶促反应。 PCR技术的特异
性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为 变
性 （ denaturation，） 退火 （ annealing）,延伸
（ extension）三步，经过一定的循环，介于两个
引物之间的特异 DNA片段得到大量扩增。
PCR反应体系中的主要成分及其作用,
1,模板 DNA：一般 102－ 105个拷贝
2,Mg2＋, Mg2＋ 能影响反应的特异性和扩增片段的产率 。 一
般反应体系中 1.5-2.5 mmol/L
3,反应缓冲液,使 Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 。
4,dNTPS：在 PCR反应体系中其浓度一般为 20－ 200umol/L，
浓度过高, 过低都不利 。
5,Taq DNA聚合酶：在 70－ 75?C具最高活性 。 具有 5‘－ 3’的
聚合酶活性和 5‘－ 3’的外切酶活性, 无校正功能 。 是镁依
赖性酶 。
6,引物,PCR反应中引物浓度一般为 0.1－ 0.5umol/L。
循环条件的设定,
1,变性：模板 DNA由双链变成单链, 使有利于与引物
结合 。 可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间,
一般情况下 94?C 30秒可使各种复杂的 DNA分子完全
变性 （ 过高的温度或高温持续时间过长, 可对 Taq DNA聚合
酶活性和 dNTP分子造成损害 ） 。
2,退火：变性的 DNA快速冷却至 40－ 60?C可使引物和
模板 DNA发生结合 。 可根据引物的长度和 G＋ C的含
量选择复性温度 。 退火时间 30秒 。
3,延伸：一般是 70－ 75?C,此时 Taq DNA聚合酶活性
最高 。 <1kb,1分钟； >1kb的可适当延长时间 。
4,循环次数：理论上 20－ 25个循环 PCR产物的累计即
可达到最大值, 实际操作中 25－ 30较合理 。 循环次
数越多, 非特异性产物的量也会增加 。
PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性
扩增带的可能原因,
1,Taq酶过多；
2,变性时间过短；
3,变性温度过低；
4,延伸时间过长；
5,循环次数过多；
6,模板量过多；
7,引物浓度过高或设计不合理； Mg2+浓度不合适等。
导致 PCR产物很少或无扩增产物的原因
凝胶电泳检测 PCR产物时, 目的扩增带很弱或看不到目的扩增带,
应从以下几个方面寻找原因,
1,点样或染胶问题
2,反应体系中忘记加入某种成分 (无扩增产物 ） 或分装
mixture时出了问题；
3,目的片段太大, 使用的 DNA Polymerase 无法扩增出目的
片段；
4,DNA溶液中或反应体系中含有 Taq 酶抑制剂, 抑制了 Taq
DNA聚合酶的活性 。
5,退火温度太高；
6,Taq 酶活力不够或其他试剂有问题；
7,引物设计不合理, 与模板不配对等 。
探针准备及标记
洗膜 /压 X-光片
DNA酶切
DNA抽提
酶切产物电泳
转膜
烘膜
预杂交
杂交
冲洗 X-光片
结果分析
FRFLP流程
实验一：植物总 DNA的快速少量抽提
（ CTAB法）
分离纯化核酸总的原则,
1,保证核酸一级结构的完整性 。 （ 30－
50KB）
2,排除其它分子的污染
抽提方法及过程应满足下列要求,
1,尽量简化操作步骤, 缩短抽提过程 。 （ 快, 防融
化 ）
2,减少化学因素对核酸的降解 （ 过碱过酸 ）
3,减少物理因素对核酸的降解 （ 高温, 机械剪切 ）
4,防止核酸的生物降解 （ 内源 DNase,试剂灭菌,
手套 ）
DNA纯化的要求,
1,不存在对工具酶有抑制作用的有机
溶剂和过高浓度的金属离子 。
2,其它生物大分子的污染应降到最低
程度 。
植物 DNA的抽提常采用下列两种方法,
1,SDS法, 离子去污剂, 过程长, 纯度高 。
2,CTAB法,该方法简便, 快速, DNA产量高 (纯度
稍次, 适用于一般生物学操作 ),不需要 CsCl 密度
梯度离心 。
原 理,
CTAB是一种非离子去污剂。 CTAB与核酸形
成复合物，此复合物在高盐（ >0.7mM）浓度
下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（ 0.1-
0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸复合物就因溶解
度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等
仍溶解于溶液中。经离心弃上清后,CTAB-
核酸复合物再用 70－ 75%酒精浸泡可洗脱掉
CTAB。
本实验注意事项,
1,尽量取材幼嫩叶片, 如太老, 酚类物质多, 必须用
10mM的 β-ME处理
2,研钵预冻, 粉末转管前加 CTAB前不要融化
3,24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔, 转移用的枪头最
好是剪宽了的
4,所用试剂必需灭菌, 手套
思考,
（ 1） 试分析 DNA降解的可能原因
（ 2） 提高 DNA产量的措施
所用到的试剂及作用（一）,
? 氯仿 /异戊醇（ 24:1）：氯仿加速有机相与液相分
层，去除植物色素，蛋白质和多糖等。异戊醇可
减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两
有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。
? 95%EtOH 沉淀 DNA。
? 10M NH4AC 诱导乙醇沉淀较大 DNA。
? 70%EtOH 去除微量 Na+,K+,M2+等阳离子及小
分子量的有机分子，洗脱 CTAB
所用到的试剂及作用（二）,
? TE（ 1mMEDTA,10mM Tris.HCl pH8.0） 溶解并长
期保存 DNA。 EDTA螯合 Mg2+,Ca2+等二价阳离子,
从而抑制 DNase等的活性 。
外环境条件,
? pH8.0防止脱氨作用；
? 65℃ CTAB中 DNase变性, 促进内溶物释放；
? 离心时 >15℃ 以防 CTAB沉淀而降低 DNA量 。
DNA质量检测
一, DNA检测常规项目
? DNA纯度：紫外分光光度计 A260/A280=1.8－ 2.0,质
量好
? 分子量大小：琼脂糖凝胶电泳, 50Kb左右与 λDNA仿
（ 清晰主带 ）, 质量好
? DNA浓度,1 0D＝ 50ug/ml DS-DNA（ 浓度 ） 数
量 40ug/ml RNA or SS－ DNA
限制性内切酶操作
准备
1,调整 DNA浓度, 大致相当浓度 300-400ng/ul, 每样品
取等体积的量, 质量好的 DNA。
2,仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书, 熟悉分析
条件及酶切的贮存浓度 <10u-50u/ul>厂家配套试剂 。
3,限制性内切酶贮存 buffer一般含 50%甘油, 若甘油在
反应体系中超过 5%即影响特异性, 因此酶的体积
<1/10V总 。
酶切体系,
DNA(3-5ug,3ug) 8ul
10*buffer reaction 1.5ul
Enzyme (8u) 0.8ul（ 冰上 ）
Add H2O to 15ul
酶切终止及检测,
1、加上样缓冲液终止酶切，也可 65℃ 加热 10min 使酶变性
失活。
2,电泳检测酶切效率：每样品 1/10量上样, 电泳检测 。
? 若呈现均匀连续分布的一片, 则酶切效果好, 否则重做 。
? 出现切烂,DNA降解, 重新提 DNA；
? 切不动：杂质多 （ 多糖, 蛋白质, 酚类, 有机溶剂等 ）,
重新纯化 。
A1优总 DNA A2劣总 DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动
点样孔
酶星活性 (star activity),
在非最适条件下 （ 高 PH,低离子强度 ）, 有些
酶识别特异性会降低, 表现出松弛的专一性
(relaxed specificity),这种酶切特异性降低现象即
为该限制性内切酶的星活性 (star activity)。 如识
别六碱基变成识别四或五个碱基的 。
思考,
（ 1） 什么是酶星活性？ 如何避免？
（ 2） 影响酶切效率的因素？
（ 3） EB指示剂原理？
电泳
1,胶浓度 0.7-0.8%。
2,胶厚度 <5mm (<250ml胶 )。
3,胶的均一性 (不同样品的迁移率一致 )。
4,样品数及样品 DNA量 (经济, 高效 )。 (42孔梳子,亲
本, 统一量 )
5,指示剂量稍大, 长时间指示 。
6,电泳电压：大电泳槽 40V,12小时, 1-1.5V/cm。
7,电泳结束, 指示剂约移动 10-11cm。
Southern blotting onto Hybond-N+ Membrane
一, 转膜目的意义
二, 转膜的方式,
1,Upward Capillary Transfer (Figure 1)
2,Downward Capillary Transfer (Figure 2)
3.Simultaneous Transfer to Two Membranes (Figure 3)
4,Electrophoretic Transfer
5.Vacuum Transfer
固相支持物的种类及选择,
? 尼龙膜：高强度, 不易破损, 与 DNA共价
结合, 反复使用 10次以上不破损, 不丢失
DNA,吸附 DNA每 cm2比硝酸膜多 5倍,
50bp有效杂交 。
? 硝酸纤维素膜：非共价结合, 易脆, 易丢
失 DNA,<500bp的 DNA无效, 不适用于
RFLP。
硝酸纤维素膜 ）
支撑型 硝酸
纤维素膜
不带电荷的尼
龙膜
带正电荷的尼
龙膜
活化纸
应 用 ssDNA,RNA,
蛋白质
ssDNA,RNA,
蛋白质
ssDNA,dsDNA,
RNA,蛋白质
ssDNA,
dsDNA,RNA,
蛋白质
ssDNA,RNA
结合能力
（ μg/cm2 )
80-100 80-100 400-600 400-600 2-40
抗张强度
差 好
好 好 好
核酸结合的形
式
非共价键 非共价键 共价 共价 共价
有效结合核酸
的下限
500核苷酸 500核苷酸 50核苷酸或碱
基对
50核苷酸或碱
基对
5核苷酸
重复探测的可
行性
差（易脆） 差（信号易丢
失）
好 好 好
用于固定核酸的各种材料的性质（ Brown,1991）
原理
尼龙膜 （ 带正电荷的 ） 具有较大的 DNA结合容量,
它能够吸附变性 DNA,核酸能够不可逆结合在尼
龙膜上 。 尼龙膜两边均有同样吸附 DNA功能, 无
论用哪边均可以经久耐用, 可反复利用 10次以上
（ 10-20次 ）, 经毛细管 （ 毛细吸附 ） 作用, 把
DNA从凝胶上转到膜上 。 DNA转到膜上是复制胶
上的带型, 再在 80-100℃ 真空干燥 2-4hrs,即可固
定 DNA。
转移缓冲液（ transfer buffer）
?带 正 电 荷 的 尼 龙 膜, 可 用 高 盐 离 子 强 度
（ SSC）, 但不能充分发挥膜潜能； 0.4N
NaOH,共价结合 DNA是最大优点 。
?硝酸纤维膜：高盐离子强度促进ＤＮＡ与膜结
合 （ ２０ × ＳＳＣ ）, 低盐离子强度导致小片
段ＤＮＡ在转移过程中丢失,pＨ >９, ＤＮＡ
不能与膜结合 。
转膜时间 （ duration of transfer,12hrs）
取决于毛细管系统, ＤＮＡ大小, 胶厚度
(<5mm)及浓度 (<1%)。
ＤＮＡ分子量大小决定时间长短, 部分去嘌呤
减小ＤＮＡ, 碱转２ hrs大部分结合到膜 。
DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过
EB染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补
救措施，因此，每一步应严格操作
Southern hybridization
试验目的
对于大的基因组, DNA酶切图谱凭肉眼是分辨不开
的 （ EB染色 ）, 因为大小不等的分子呈现弥散分
布, 只有借助灵敏的放射性同位素 （ 或其他化学发
光物质 ）, 将靶 DNA在凝胶上 （ 膜上 ） 的带型通过
特定的探针与之杂交, 转换成 X光片上直观的带型,
从而揭示基因组的规律 。
基本原理
依据碱基配对原则, 用放射性同位素标记的
DNA探针, 与固着在膜上的靶 DNA杂交,
经放射自显影, 确定靶 DNA的位置 。
预杂交
?膜上许多没有 DNA分子的地方, 存在 DNA结合点, 若不在
预杂交时用一些封闭剂结合在这些位点上, 加入探针后, 探
针 DNA分子将会结合在这些位点上, 导致杂交背景深 。 预杂
交的目的是用非特异性 DNA分子 （ 鲑精 DNA） 及其它高分子
化合物 （ 封闭剂 ） 将待杂交膜中的非特异性位点封闭, 从而
减少杂交背景 。 （ Denharts,鲑精 DNA含在杂交液中 ） 。
?将尼龙膜放入杂交袋或杂交管中, 加入杂交液, 赶气泡, 封
口, 放入 65℃ 的杂交箱中, >3hrs (bags),杂交液浸没膜 。 一
般地, 12hrs。
杂交液组成,
5× SSC (NaCl,柠檬酸钠 )
50mM PB (NaH2PO4,Na2HPO4)
5× Denhardt (多聚蔗糖, 聚乙烯比咯烷酮, BSA)
2.5mmEDTA （ 有 /无 ）
100ug/ml SS DNA (鲑精 DNA)
0.1%SDS （ 高浓度作封闭剂, 低浓度表面活性剂 ）
10%硫酸葡聚糖 （ dextran sulfate）
探针的标记方法,
体外标记 DNA或 RNA的方法有多种, 如：末端
标记, 随机引物标记, 切口平移 （ nick
translation）, 体外转录 （ in vitro transcription）
及各类 PCR等 。
这些方法有的是在特定位置标记核酸 （ 5‘或
3‘末端 ）, 有的标记核酸分子内部的多个位点 。
有的产物是标记单链, 有的产物是标记双链 。
有的方法产生一定长度的标记产物, 有的得到
的是长短不一的标记产物 。
方法一,labelin of DNA by nick Translation
特点：快, 易, 便宜, 高比活的标记 DNA,用于文库筛选 。
E.coli DNA polymerase I,5’?3’ polymerase;
5’?3’ exonuclease
The nicks in the DNA template produced by add trace amounts
of DNaseI
注意 DNasel量及反应时间。量少，时间短，标记低；量大，
时间长，片段过小。掌握酶量及反应时间，产生大小相等的标
记了的 DNA片段。
方法二, 随机引物标记,
在 DNA聚合酶的作用下, 寡核苷酸通过与单链的模
板配对可以启动 DNA的合成 。 如果寡核苷酸序列是
不同的 （ heterogeneous）, 引物中包含所有可能的
随机序列 (如 6碱基引物可有 46=4096种 ),则可以与
任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链, 四种
核苷酸底物中有一种是用同位素标记的, 因而可产
生均匀一致高比活放射性探针 。 同位素标记的探针
DNA 的平均长度与引物的浓度成反比,
随机引物标记体系包括,
? The klenow fragment 去除了 E,coli DNA polymerase I
的 5’→ 3’的外切酶活性，具有 5’→ 3’的聚合活性及 3’
→ 5’ 外切酶活性。
? Primer：可通过用 DNase I 消化牛胸腺 DNA,DNA合
成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针 DNA
的平均长度与引物的浓度成反比 [=k/(lnPc)1/2,Pc 是引
物的浓度，一般可产生 400-600 bp 的标记产物。
? 模板 DNA：线状双链 DNA。环状 DNA 用限制性内切
酶切成线状再标记。
? α-32P-d CTP,(放射性比活 >3000Ci/mmol)
探针标记反应体系,1-2blots(19.5× 9.5cm2)
DNA 100ng
dNTP 2.0ul
Random primer 5.0ul
Klenow (1u/ul) 1ul
?- dCTP* 1.0ul
add H2O to 17.0ul
探针标记步骤,
1,将探针 DNA变性 （ 100℃, 10min）
2,变性探针置于冰浴上
3.按反应体系加入反应混合液于变性 DNA中
4.再在同位素操作台上, 加入 32P标记的 dNTP
（ ?-32P dCTP*）
5,30℃ 温育 2小时以上
杂交
将标记好的探针, 补加 300ul 杂交液, 100℃ 变
性 （ or 0.4N NaOH变性 ）, 加入杂交袋 （ 盒 ）
中 （ 忌直接加于膜上 ）, 杂交前作标记效率测定,
>25%以上可以往下做杂交, 过夜杂交, 杂交效率
受杂交速率及杂交稳定性影响 。
1,杂交率的影响因素 （ 杂交时间长 —— 影响不大 ）
? 杂交温度：双链 DNA分子； T=Tm-20— 25℃ 可
达最大杂交率,DNA-RNA杂交分子则低于 Tm 值
10-15 ℃ 。
? 离子强度 (1.5M/L NaCl 杂交率最高 )
? 双链长度 (形成杂交物长度 ),杂交率与双链长
度成正比
? 探针的复杂程度 (重复性探针可以增加杂交率 )
? pH5.0-9.0 基本无影响 。
2,影响杂交稳定性 （ 影响解链温度 )的因素
? 离子强度 在 0.01-0.4M NaCl 之间,每 ?10× 单价
阳离子, Tm ?16.6℃
? 碱基组成 AT<CG（ 在 NaCl 溶液中 ） ；
? 去稳定剂 （ destabilizer） DNA-DNA杂交分子,
每 1%formamide,Tm ?0.6℃ ； 6M urea 可降低
Tm 30 ℃
? 碱基错配：每 1%的错配可使 Tm 降低 1℃
? 双链长度 （ 探针杂交物 ） >500bp 基本无影响 。
3,洗膜
从低严谨度到高严谨度冼膜液 （ 具体情况而定 ）
1× SSC/0.1%SDS洗膜两次 （ 冷 5min,热 65℃,
15min） ?检测信号强度 ?0.5× SSC/0.1%SDS
热冼 65℃,15min ? 依 情 况 可 有 改 动
0.2× SSC/0.1%SDS or 0.1× SSC/0.1%SDS 。
SSC调整 [Na+],缓冲容量大, 改变 Tm,从而洗
掉非特异性探针杂交体, [SSC],Tm SSC0.1%-
0.2%可以升高洗膜温度 17℃, 0.1%SDS可以洗
去膜上的封存剂 。
4,包膜
膜从洗膜液中捞出, 在滤纸上凉干, 膜表面
无可见水膜为止 （ 忌太干, 以防探针难以洗
脱, 影响再次使用 ） 用保鲜膜包膜, 压片, -
20℃ 或 -70℃, 依据信号强弱曝光 （ 3— 7天 ）
5,冲洗 X-光片
在暗室红灯下取出 X-光片, 置入显影液中至
杂交带显现出来 （ 显影时间依据信号强弱及
曝光时间长短可由几秒钟到 2分钟 ）, 转入清
水中漂洗, 然后放入定影液中定影至清亮
（ 约 10分钟 ） 。 自来水冲洗干净后, 晾干,
读片,
显影液配方,
成分 相纸 胶卷 X-光片
温水 （ 40℃ 左右 ） 750ml 750ml 750ml
米吐尔 3.1g 1g 4g
无水亚硫酸钠 45g 75g 60g
对苯二芬 12g 9g 10g
无水碳酸钠 67.5g 25g 40g
溴化钾 1.9g 5g 4g
加水定容至 1000ml 1000ml 1000ml
6,膜上探针洗脱
再次使用膜前, 必须洗去上次探针 ！
(1) 0.1%SDS,0.1× SSC 10min
(2) 0.1NaOH,0.2%SDS 2-3min
(3) 0.2M Tris.HCL,0.2%SDS,0.1× SSC 20min
只洗去探针, 而不影响膜上的靶 DNA（ 因为 DNA与膜是
共价键结合, 而 DNA与探针的结合是氢键结合 ） 。
杂交效果改良应考虑问题 (一）,
1,保证转膜质量；
2,操作规范；
3,提高灵敏度 （ 杂交 ） （ 信号强度 ） ；
?探针量及标记量 （ 探针变性 ） ；
?比活 （ 性 ） 度 ≥108dpm/u(<108弱 )；
?靶 DNA量 （ 绝对量, 酶切转膜决定；相对量, 靶 DNA相对于探针过
量时, 完全配对杂交, 探针过剩时, 完全配对和非严格的完全配对均有
发生 ） ；
?有惰性聚合物增加灵敏度； 10%(w/v)500,000(mw)dextran
sulfate或 8%(w/v)PEG6000,(对于单链探针, 可以增加 10-fold杂交
信号, dsDNA成 100-fold地增加杂交信号 )
杂交效果改良应考虑问题 （ 二 ）
4,提高特异性
?高盐溶液促进探针与靶序列的碱基配对 20× SSC 3M
NaCl/0.3M Na3Ci
?杂交后洗膜温度 T?Tm
?杂交后洗膜液浓度组成, 高严谨度洗膜液使不完全
配对的杂交失去稳定, 致使探针脱落
?杂交时间 8hrs 以后, DNA探针逐渐退火, 少量自由
与靶 DNA杂交,
? 探针长度 （ >1000bp） 过长, 高严谨度下难洗脱非
完全配对杂交探针 。
Troubles shooting guide for DNA Blotting and
Hybridization Analysis（ 一 ）
信号弱 (poor signal) 的可能原因,
? probe specific activity too low (<108dpm/ug)
? Inadequate depurination (transfer of DNA is poor)
? Not enough target DNA (DNA固定效果差 )
? Transfer time too short
? Probe concentration too low
? Incomplete denaturation of probe
? Incomplete denaturation of target DNA
? Final wash was too stringent
? Hybridization time too short
背景差 （ Spotty background or high background）
? Membranes adhered during hybridization or washing (not too many
membramesat once)
? Bubbles in a hybridization ba
? Not enough wash solution
? Agarose dried on the membrane（ 斑点 ）
? Hybridization temperature too low
? Labeled probe molecules are too short (nick-translation labeling,
reduce amount of DNasel)
? Probe concentration too high
? Inadequate prehybridization ≥3hrs
? Probe not denatured
? Not enough SDS in wash solution
? 封阻剂不足
制备感受态细胞
植物总 DNA的抽提
(RNase A) 外源 DNA的准备 质粒载体的抽提
限制酶 酶切 限制酶 酶切
CIP处理
T4连接酶 连接
热激法转化
转化子鉴定
挑白色菌落
抽提质粒
液体培养
做 PCR(Taq酶 )
PCR产物检测及纯化
经电泳检测质量好的
DNA用 限制内切酶 酶
切
酶切好的 DNA电泳
DNA由琼脂糖凝胶转
移至尼龙膜上
尼龙膜预杂交 探针标记 (Klenow酶 )
加入标记 好的探
针进行分子杂交
洗膜
包膜及压 X光片
冲洗 X光片
分析结果
洗去膜上的探针以备后用
系列一
利用质粒载体克隆水稻 DNA片段
CIAP去除 5‘磷酸
外源 DNA
限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH
5’P 3‘OH 5’P
5’P
3‘OH
3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
5’OH
3’OH
转化 E.Coli
限制性内切酶酶切
多克隆位点
3’OH
载体必备条件,
1,是一个复制子；
2,载体在受体细胞中能大量繁殖, 其携带的外
源基因才能在受体细胞中得到大量扩增；
3,有 1到几个限制内切酶的单一识别与切割位
点, 便于外源基因的插入；
4,具有选择性的遗传标记 (如抗生素抗性标记
等 )以此知道它是否已进入受体细胞, 并据
此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来 。
基因克隆相关载体,
? Plasmid
? Cosmid,Fosmid
? P1
? YAC (Yeast Artificial Chromosome)
? BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
? MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
? PAC (P1-derived Artificial Chromosome)
? BIBAC (Binary-BAC)
? TAC (Transformation-competent Artificial Chromosome)
质粒的基本特点
质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子,
大小在 1－ 20kb之间, 是双链闭合环状 DNA分子,
具有自主复制和转录能力, 能使子代细胞保持它
们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息 。 它
可独立游离于细胞质中, 也可整合到细菌染色体
上 。 质粒在细胞内的复制可分为严谨型 （ 只在细
胞周期的一定阶段进行复制, 一个细胞内只有 1
至几个拷贝 ） 和松弛型 （ 细胞周期中随时可以复
制, 拷贝数较多, 一般在细胞内有 20个以上 ）
E.coli 的 pSC101是第一个用来作为克隆
载体的质粒，其包含一个 EcoR I 酶切位点
及四环素抗性基因（ tetr )
pBR322是最早被广泛应用的克隆载体
之一，它包含 ampicillin和 tetracycline抗性
基因和多种限制性内切酶的单一切点。许多
第二代、第三代的克隆载体都是从 pBR322
衍生而来。
实验一、质粒的抽提
实验目的,掌握减法抽提质粒的原理, 步骤及
各试剂的作用
实验材料,含有 pUC18载体的大肠杆菌
实验步骤,
1,细菌培养物的生长
2,细菌的收集及裂解
3,质粒的沉淀
细菌培养物的生长
从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素
的培养基中，培养至对数生长后期即可
（松驰型质粒 〕 。严谨型质粒（拷贝数较
低）可采用绿霉素扩增的办法来扩增质粒；
细菌的收集及裂解,
通过离心收集菌体；细菌的裂解可采用
离子型或非离子型去污剂, 有机溶剂, 碱处
理或加热处理等方法 。 （ 具体采用何种方法
取决于质粒的大小, 大肠杆菌菌株及裂解后
纯化质粒的方法 ）
质粒的沉淀,加 2/3体积的异丙醇, 室温
下放置 5分钟或两倍体积 95％
乙醇混匀, 冰上放置 10分钟；
质粒的纯化,一般采用苯酚 /氯仿纯化质
粒 ; 为满足较高要求, 可采用
氯化铯密度梯度离心
操作步骤 （ 一 ）,
1,接 种 于 含有 相 应 抗生 素 的 LB 培 养基 （ 含
AMP）, 过夜培养；
2,吸取 1.5ml菌液, 12000rpm离心 2分钟；
3,加入 100?l solution Ⅰ 振荡打匀, 重新悬浮细胞；
（ 注意：应彻底打匀使无沉淀或碎块 ）
4,加入 200?l solution Ⅱ 轻柔颠倒混匀, 放置冰上
至清亮, 一般不超过 5分钟；
5,加入 150?l solution Ⅲ 颠倒混匀, 放置于冰上 10
分钟, 使杂质充分沉淀；
操作步骤 （ 二 ）
6,12000rpm离心 10分钟；
7,吸取 400?l上清 （ 注意：不要汲取到飘浮的杂
质 ）, 加 2/3体积的异丙醇, 室温下放置 5分钟
或两倍体积 95％ 乙醇混匀, 冰上放置 10分钟；
8,12000rpm4oC冷冻离心 15分钟；
9,倒尽上清, 加 75％ 乙醇浸洗洗盐, （ 放置片刻
后倒去上清；或离心 5分钟 ）
10.加 50 ?l灭菌超纯水或 TE溶解 。
质粒 DNA质量检测
1,DNA纯度, 吸光值检测：检测 260nm,280nm
吸光值, 紫外分光光度计 A260/A280=1.8－ 2.0；
1.8最佳, 低于 1.8说明有蛋白质, 大于 1.8说明有
RNA。
2,质量检测, 琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带
（ 超螺旋, 开环, 线型三种构型 ）, 点样孔附
近无 DNA带 （ 无染色体 DNA污染 ） 。
3,DNA浓度,
1 0D＝ 50ug/ml DS-DNA 或
1 0D＝ 40ug/ml RNA or SS－ DNA
琼脂糖凝胶电泳
? 制胶：先封好制胶板, 调好梳子的高度；再
称取 0.21g琼脂糖于 30ml 0.5× TBE电泳液中,
融化, 冷至 50 oC左右加 2?l EB,混匀, 倒胶；
? 制样,10μl溶解后的质粒加入 1－ 2μl溴酚兰 ;
? 点样电泳；
? 结果观察：一般有三条带 （ 超螺旋, 开环,
线型三种构型 ）
SolutionI,葡萄糖 50Mm
Tris.HCl 25Mm
EDTA 10Mm
RNase A 100μg/ml
SolutionII,
NaOH 0.2N
SDS 1%
SolutionIII,
5M KAC 60ml
冰乙酸 11.5ml
H2O 28.5ml
For sequence,
Solution I,
1 M Tris-HCl(pH7.6) 2.5ml
0.25 M EDTA 2.0ml
ddH2O 45ml
sterile by autoclave
add 10mg/ml RNaseA 0.5ml
Solution III,
5 M KAC 13.2ml
ddH2O 27ml
Adjust pH to 4.8
add H2O to 50ml
Sterile by autoclave
?RNaseA,C 或 U的 3’－ P与相临的 5’－
OH处切开 。 〔 配制：一般以 10mg/ml
溶于 TE中, 然后在沸水中煮 10－ 30分
钟之后分成小份储存于－ 20oC〕
?EB：溴化乙锭, 可嵌入 DNA分子中,
受紫外光激发而发出荧光, 利用它可
检测 DNA。 是诱变剂, 可引起插入突
变, 并有中度毒性, 操作时应注意防
护 。
氨苄青霉素 （ ampicillin）, 能够杀死正在生长
的大肠杆菌, 其主要通过肽聚糖交联而抑制
细胞壁的合成 。
氨苄青霉素抗性基因 （ ampr）,合成 β-内酰胺
酶, 在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解 。
氯仿, 对眼睛, 皮肤, 粘膜及呼吸道都
有刺激作用, 它是致癌剂并可损
伤肝脏和肾脏, 操作时需戴手套,
安全镜并在通风橱中进行 。
苯酚,是强腐蚀剂, 能引起严重烧伤 。
操作时应戴手套, 安全镜, 穿防
护服, 并在通风橱中进行 。
感受态细胞的制备
将外源 DNA导入大肠杆菌去主要有两种方法,
1,电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔 。 因而需用
冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞,
以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子 。 109
－ 1010转化子 /?g DNA；
2,CaCl2 法：利用冰冷的 CaCl2处理对数生长期的细
胞, 可以诱导其产生短暂的, 感受态,, 易于摄取
外源 DNA。 106－ 107/?g DNA。
实际操作过程中应注意的事项,
1,密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数
生长期的细胞 （ 一般通过检测 OD600 来控制 。
DH5?菌株 OD600为 0.5时细胞密度是 5× 107/ml） ；
2,所有操作均应在 无菌条件和冰上 进行；
3,所使用的器皿必须干净 。 因为痕量的去污剂或其
它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率
另外, 转化时还应注意质粒的质量和浓度,（ 1） 用
于转化的应主要是超螺旋的 DNA； （ 2） 一定范围
内, 转化效率与外源 DNA的浓度呈正比 )
操作步骤 （ 一 ）,
1,前夜接种受体菌 （ DH5?或 DH10B）, 挑取单菌落
于 LB 培养基中 37oC 培养过夜 （ 约 16小时 ） ；
2,转接 1ml过夜培养物于 100ml 添加有 20mM MgCl2 在
37oC摇床剧烈振荡培养约 2.5-3 小时 （ 300rpm） ；
3,将 0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷； ( 注：后继步骤
需在无菌和 0-4oC下操作 )
4,吸取 1.5ml培养好的菌液至 1.5ml离心管中, 在冰上
冷却 10分钟；
操作步骤 （ 二 ）
5,4oC下 4000rpm冷冻离心 10分钟；
6,弃去上清, 加入 100?l预冷 0.1M CaCl2溶液, 用
移液枪轻轻上下吸动打匀, 使细胞重新悬浮,
在冰上放置 20分钟；
7,重复 6,7,6步骤；
8,细胞悬浮液可立即用于转化实验 或添加冷冻保
护剂后超低温冷冻贮存备用 （ － 70oC） 。
利用质粒载体克隆水稻 DNA片段
外源 DNA 克隆的要求 说明
所带的末端
平端 要求较高的 DNA及连接酶
不同的突出端 用两种限制酶消化后
需纯化质粒以提高连接效率
相同的突出端
1,酶切位点可保留
2,非重组克隆背景低
3,不需 CIP处理
4,外源 DNA只以一个方
向插入重组质粒中
1,非重组克隆的背景高
2,不同酶切的平头可连接
3,质粒及外源 DNA连接处
的酶切位点消失
4,重组质粒会带有 外源
DNA的串联拷贝
线状质粒 DNA常需用磷
酸酶 （ CIP） 处理
1,酶切位点常可保留
2,外源 DNA会以两个方向
插入
3,重组 质粒可带 有外源
DNA的串联拷贝
CIAP去除 5‘磷酸
外源 DNA
限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH
5’P 3‘OH 5’P
5’P
3‘OH
3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
5’OH
3’OH
转化 E.Coli
限制性内切酶酶切
多克隆位点
蓝色菌落：载体自连
白色菌落：外源片段插入
在质粒中克隆外源片段的主要步骤 （ 一 ）,
1,载体及外源片段的限制酶消化, 限制性内切酶
切出相互匹配的粘性末端 〔 一种酶 〕 或不相匹
配的粘性末端 （ 不同酶消化 ） 或平端；
2,载体的去磷酸化, 碱性磷酸酶去除载体的 5’－ P
基团, 以防载体自连；
3,线状载体与外源片段的连接, 连接酶使双链
DNA 5’－ P与相邻的 3’－ OH之间形成新的共价
键, 若质粒载体的两条链都带有 5‘磷酸基团,
则可形成 4个新的磷酸二酯键, 但如质粒已去
磷酸化, 则只能形成 2个新的磷酸二酯键, 且
产生的两个杂交分子带有 2个单链切口, 当杂
合体导入到感受态细胞后可被修复 。
在质粒中克隆外源片段的主要步骤 （ 二 ）
4,连接产物转化感受态细胞,
注意：利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时,
用转化细胞 铺平板的密度要低 （ 90mm
平板上不得超过 105个菌落 ）, 同时
37?C培养不应超过 20小时, 具氨苄青
霉素抗性的转化体可将 ?－内酰胺酶分
泌到培养基中, 迅速灭活菌落周围的
抗生素, 从而导致对氨苄青霉素敏感
的卫星菌落的出现 。
5,转化子的鉴定 （ ?互补 ）
转化子的鉴定 （ ?互补 ）,
许多常用载体 （ pUC系列 ） 都带有一个大肠杆菌 DNA的短片段,
其中含有 ?-半乳糖苷酶 （ LacZ） 的调控序列和头 146个氨基酸的
编码序列, 该编码区中插入了一个多克隆位点, 它并不破坏阅读
框, 但可使少数几个氨基酸插入到 ?-半乳糖苷酶的氨基端而不影
响功能 。 这种载体适用于可编码 ?-半乳糖苷酶 C端部分序列的宿
主细胞 。 虽然宿主和质粒编码的片段都没有活性, 但它们可以融
为一体, 形成具有酶学活性的蛋白质 。 这样, LacZ基因缺失 近
操纵基因区段 的突变体与带有完整的 近操纵基因区段 的 ?-半乳糖
苷酶阴性的突变体之间实现互补, 这种现象叫 ?互补 。 由 ?互补
而产生的 LacZ＋ 细菌易于识别, 因为它们在生色底物 x-gal (5-溴 -
4-氯 -3-吲哚 -?-D-半乳糖苷 )存在下, 形成蓝色菌落, 而外源片段
插入到质粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无 ?互补
能力的氨基端片段, 因此, 带重组质粒的细菌形成白色菌落 。 这
一颜色反应大大简化了质粒重组体的鉴定 。
IPTG（ 异丙基硫代 -?-半乳糖苷 ）,是 ?-半乳糖苷酶活性的诱导物, 也可作为
具有 Lac或 Tac启动子的表达载体的表达诱导物来使用 。
蓝色菌落：载体自连
白色菌落：含外源片段
克隆中用到的几种工具酶,
?限制酶
?碱性磷酸酶
?连接酶
限制性内切酶,
1,About 400 different restriction enzymes,
2,RE were discovered in 1970s by Hamilton
Smith and Daniel Nathans,They shared the
1986 Nobel prize in physiology or Medicine
with Werner Arber,
II类限制性内切酶的特点
1,有特定的识别序列, 通常为 4－ 6个碱基的回
文对称序列 。
2,切割位点位于识别序列内的固定位置上, 切
割后在 5’末端有磷酸基团, 3’末端有羟基 。
3,切割后形成粘性末端或平末端, 前者又分为 3'
突出端 （ 如 PstI） 和 5’突出端 (如 EcoRI)两种
4,其活性发挥只需 Mg2＋ 作辅酶 。
限制酶的一个活性单位 （ 1U）,原则上指在
50ul反应体系中, 37?C下, 经过 1小时的反应将
1μg的 DNA完全分解所需要的酶量 。
限制酶的 star活性：限制酶在某些条件下使
用时对底物 DNA的特异性可能降低, 即可将与原
来识别的特定 DNA序列不同的碱基序列切断, 这
种现象叫限制酶的 star活性 。 它的出现的频率与酶,
底物及反应条件有关 。
碱性磷酸酶
细菌碱性磷酸酶 〔 BAP〕 和牛小肠碱性
磷酸酶 （ CIAP） 都能催化水解 DNA,RNA、
dNTP和 NTP上的 5‘－磷酸残基 。 比较而言,
CIP更常用, 因其可在 70?C 10’内加热灭活或
通过酚抽提而变性失活, 同时 CIP的活性比
BAP的高 10－ 20倍 。
牛小肠碱性磷酸酶 （ CIAP） 是一个二
聚体蛋白, 每个 CIP单体带有两个对酶的活
性至关重要的 Zn原子, 去磷酸化的缓冲液中
应含有终浓度为 1m mol/L 的 ZnCl2 。
连接酶
体外催化磷酸二酯键的形成可使用两
种酶：大肠杆菌连接酶和 T4噬菌体连接酶,
但几乎在所有的克隆中 T4噬菌体连接酶都
是首选的酶, 因其能在正常的反应条件下
能有效的将平端连接起来 。
各种连接酶特性的比较,
T4DNA
Ligase
E.coli DNA
Ligase
T4 RNA
Ligase
Ligases of
thermophilic
bacteria
最适 pH
辅酶
7.2-7.8
ATP
7.5-8.0
NAD
7.2-8.4
ATP
NAD
平滑末端 可能 * 不能 NO
DNA 5’P末端和
RNA 3’OH末端
可能 可能 不能 NO
RNA 5’P末端和
DNA3 ’OH末端
可能 不能 不能 NO
RNA和 RNA 少数 可能 不能 可能 NO
外源片段,
5’GATCCN － －－－－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－－－－ NCTTAA 5’
载体,
5’GATCCN － －－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－ － NCTTAA 5’
连接后
EcoR I,
5’---NGAATTCN---3’
3’---NCTTAAGN---5’
5’NG 3’ 5’ AATTCN 3’
3’NCTTAA 5’ 3’ GN 5’
BamH I,
5’--NGGATCCN--3’
3’--NCCTAGGN--5’
5’-NG 3’ 5’GATCCN 3’
3’-NCCTAG 5’ 3’ GN 5’
Hind III
5’NAAGCTTN3’
3’NTTCGAAN5’
5’NA 3’ 5’ AGCTTN3’
3’NTTCGA 5’ 3’ AN5’
EcoR I,
5’---NGAATTCN---3’
3’---NCTTAAGN---5’
5’NG 3’ 5’ AATTCN 3’
3’NCTTAA 5’ 3’ GN 5’
BamH I,
5’--NGGATCCN--3’
3’--NCCTAGGN--5’
5’-NG 3’ 5’GATCCN 3’
3’-NCCTAG 5’ 3’ GN 5’
EcoR I/ BamH I 双酶切,
5’AATTCN －－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－ NCCTAG 5’
载体,
5’GATCCN －－－－ NG 3’
3’ GN－ －－－ NCTTAA 5’
外源片段,
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 一 ）
1,外源 DNA和质粒载体的酶切及检测,
? 外源 DNA获取及酶切：某 BAC克隆 DNA 300ng,用
5 U限制性内切酶 EcoRI完全酶切, 1.2％ 凝胶检测
酶切是否完全；
? 取 40?l质粒载体 pUC18 DNA用 5U内切酶 EcoRI完全
酶切 (1hr),吸取 5?l用 1.2％ 凝胶检测酶切是否完全
? 造成 DNA酶切不完全的主要原因有,
1,DNA不干净, 反应体系中存在酶的抑制剂；
2,操作不当, 酶或 DNA加至管壁上, 反应体系没完全混合；
3,反应条件不合适, 用错了缓冲液或温度不合适；
4,酶的活力不够
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 二 ）
2,酶切产物的纯化,
a) 加等体积酚 /氯仿 （ 1:1）, 振荡混合后离心,
b) 吸出上层水相, 加入等体积氯仿 /异戊醇 （ 24,1）, 混合
后离心；
c) 吸出上清, 加 1/10体积 3M NaAC和两倍体积乙醇, -20oC
放置 15分钟以上；
d) 12000rpm 4oC冷冻离心 15分钟；倒去上清, 用 70％ 乙醇
浸洗沉淀, 风干加入 40?l d2H2O溶解；
DNA样品
加等体积的
苯酚,氯仿,异戊醇 (25:24:1) 混匀
8000rpm
离心 5’
上清转至一
新离心管
加 2倍体积的乙醇
1/10体积 3M的 NaAc
混匀 8000rpm
离心 5’
上清转至一
新离心管
加等体积的
氯仿,异戊醇 (24:1)
混匀,-20℃, 15’
12000rpm
离心 15’
弃上清，加 100μl
75%乙醇洗沉淀 吹干 TE溶解
注意,
氯仿 对眼睛, 皮肤, 粘膜及呼吸道都有刺激
作用, 它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏, 操
作时需戴手套, 安全镜并在通风橱中进行 。
苯酚 是强腐蚀剂, 能引起严重烧伤 。 操作时
应戴手套, 安全镜, 穿防护服, 并在通风橱
中进行 。
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 三 ）
3,按以下反应进行载体去磷酸化,
DNA 40?l
CIAP 5U
10 ? buffer 6.0?l
add d2H2O to 60?l
4,按第 2步纯化载体, 溶于 20 ?l d2H2O；
在质粒中克隆外源片段的具体操作步骤 （ 四 ）
5,连接反应,
DNA 5?l（ approx,150ng）
pUC18 1?l（ 40ng）
5 ? buffer 2?l
T4 ligase 2U
add d2H2O to 10?l 16oC水浴过夜
6,热激转化感受态细胞, 37?C培养过夜；
7,转化子鉴定,
质粒的转化 （ 热激法 ） 及转化子的鉴定
操作步骤 （ 一 ）,
1,取出 3管制备好的感受态细胞, 放在冰上融化；
2,每 100?l感受态细胞加入约 20ng 质粒 DNA,3管分别加连接
产物, 标准超螺旋质粒 DNA（ 阳性对照 ） 及不加入
任何 DNA（ 阴性对照 ）, 用移液枪轻轻吸打均匀,
在冰上放置 30分钟；
3,热击：将离心管放置 42oC水浴, 热击 90秒, 注意：勿摇动
离心管；
4,冰镇：快速将离心管转移至冰浴, 放置 1－ 2分钟；
操作步骤 （ 二 ）
5,复苏：每管加 400?l SOC培养基, 在 37oC摇床温和摇动
温育 45分钟, 使细菌复苏；
6,布皿：取适当体积均匀涂布于含有 IPTG,X-gal,抗生
素 （ AMP） 的 LB平板；
7,培养：倒置培养皿, 于 37oC培养 12－ 16小时 即可观察
到蓝白相间的菌落 （ 其中白色菌落为含有外源插
入片段的转化子, 蓝色菌落是载体自连的转化子 ）
转化时还应注意质粒的质量和浓度, （ 1）, 用于转化的
应主要是超螺旋的 DNA； （ 2）, 一定范围内,
转化效率与外源 DNA的浓度呈正比 。
转化子的鉴定：鉴定转化子中是否含有外源 DNA片
段常用的方法有,
1,?互补
2,杂交筛选
3,插入失活 （ 一些老质粒如 pBR322等 ）
4,小量提取质粒酶切检测
PCR
原 理,
PCR（多聚酶链式反应 〕 是一种体外扩增特异
DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技
术之一，是在模板 DNA、引物和 dNTPs的存在下
依赖于 DNA聚合酶的酶促反应。 PCR技术的特异
性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为 变
性 （ denaturation，） 退火 （ annealing）,延伸
（ extension）三步，经过一定的循环，介于两个
引物之间的特异 DNA片段得到大量扩增。
PCR反应体系中的主要成分及其作用,
1,模板 DNA：一般 102－ 105个拷贝
2,Mg2＋, Mg2＋ 能影响反应的特异性和扩增片段的产率 。 一
般反应体系中 1.5-2.5 mmol/L
3,反应缓冲液,使 Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 。
4,dNTPS：在 PCR反应体系中其浓度一般为 20－ 200umol/L，
浓度过高, 过低都不利 。
5,Taq DNA聚合酶：在 70－ 75?C具最高活性 。 具有 5‘－ 3’的
聚合酶活性和 5‘－ 3’的外切酶活性, 无校正功能 。 是镁依
赖性酶 。
6,引物,PCR反应中引物浓度一般为 0.1－ 0.5umol/L。
循环条件的设定,
1,变性：模板 DNA由双链变成单链, 使有利于与引物
结合 。 可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间,
一般情况下 94?C 30秒可使各种复杂的 DNA分子完全
变性 （ 过高的温度或高温持续时间过长, 可对 Taq DNA聚合
酶活性和 dNTP分子造成损害 ） 。
2,退火：变性的 DNA快速冷却至 40－ 60?C可使引物和
模板 DNA发生结合 。 可根据引物的长度和 G＋ C的含
量选择复性温度 。 退火时间 30秒 。
3,延伸：一般是 70－ 75?C,此时 Taq DNA聚合酶活性
最高 。 <1kb,1分钟； >1kb的可适当延长时间 。
4,循环次数：理论上 20－ 25个循环 PCR产物的累计即
可达到最大值, 实际操作中 25－ 30较合理 。 循环次
数越多, 非特异性产物的量也会增加 。
PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性
扩增带的可能原因,
1,Taq酶过多；
2,变性时间过短；
3,变性温度过低；
4,延伸时间过长；
5,循环次数过多；
6,模板量过多；
7,引物浓度过高或设计不合理； Mg2+浓度不合适等。
导致 PCR产物很少或无扩增产物的原因
凝胶电泳检测 PCR产物时, 目的扩增带很弱或看不到目的扩增带,
应从以下几个方面寻找原因,
1,点样或染胶问题
2,反应体系中忘记加入某种成分 (无扩增产物 ） 或分装
mixture时出了问题；
3,目的片段太大, 使用的 DNA Polymerase 无法扩增出目的
片段；
4,DNA溶液中或反应体系中含有 Taq 酶抑制剂, 抑制了 Taq
DNA聚合酶的活性 。
5,退火温度太高；
6,Taq 酶活力不够或其他试剂有问题；
7,引物设计不合理, 与模板不配对等 。
探针准备及标记
洗膜 /压 X-光片
DNA酶切
DNA抽提
酶切产物电泳
转膜
烘膜
预杂交
杂交
冲洗 X-光片
结果分析
FRFLP流程
实验一：植物总 DNA的快速少量抽提
（ CTAB法）
分离纯化核酸总的原则,
1,保证核酸一级结构的完整性 。 （ 30－
50KB）
2,排除其它分子的污染
抽提方法及过程应满足下列要求,
1,尽量简化操作步骤, 缩短抽提过程 。 （ 快, 防融
化 ）
2,减少化学因素对核酸的降解 （ 过碱过酸 ）
3,减少物理因素对核酸的降解 （ 高温, 机械剪切 ）
4,防止核酸的生物降解 （ 内源 DNase,试剂灭菌,
手套 ）
DNA纯化的要求,
1,不存在对工具酶有抑制作用的有机
溶剂和过高浓度的金属离子 。
2,其它生物大分子的污染应降到最低
程度 。
植物 DNA的抽提常采用下列两种方法,
1,SDS法, 离子去污剂, 过程长, 纯度高 。
2,CTAB法,该方法简便, 快速, DNA产量高 (纯度
稍次, 适用于一般生物学操作 ),不需要 CsCl 密度
梯度离心 。
原 理,
CTAB是一种非离子去污剂。 CTAB与核酸形
成复合物，此复合物在高盐（ >0.7mM）浓度
下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（ 0.1-
0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸复合物就因溶解
度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等
仍溶解于溶液中。经离心弃上清后,CTAB-
核酸复合物再用 70－ 75%酒精浸泡可洗脱掉
CTAB。
本实验注意事项,
1,尽量取材幼嫩叶片, 如太老, 酚类物质多, 必须用
10mM的 β-ME处理
2,研钵预冻, 粉末转管前加 CTAB前不要融化
3,24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔, 转移用的枪头最
好是剪宽了的
4,所用试剂必需灭菌, 手套
思考,
（ 1） 试分析 DNA降解的可能原因
（ 2） 提高 DNA产量的措施
所用到的试剂及作用（一）,
? 氯仿 /异戊醇（ 24:1）：氯仿加速有机相与液相分
层，去除植物色素，蛋白质和多糖等。异戊醇可
减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两
有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。
? 95%EtOH 沉淀 DNA。
? 10M NH4AC 诱导乙醇沉淀较大 DNA。
? 70%EtOH 去除微量 Na+,K+,M2+等阳离子及小
分子量的有机分子，洗脱 CTAB
所用到的试剂及作用（二）,
? TE（ 1mMEDTA,10mM Tris.HCl pH8.0） 溶解并长
期保存 DNA。 EDTA螯合 Mg2+,Ca2+等二价阳离子,
从而抑制 DNase等的活性 。
外环境条件,
? pH8.0防止脱氨作用；
? 65℃ CTAB中 DNase变性, 促进内溶物释放；
? 离心时 >15℃ 以防 CTAB沉淀而降低 DNA量 。
DNA质量检测
一, DNA检测常规项目
? DNA纯度：紫外分光光度计 A260/A280=1.8－ 2.0,质
量好
? 分子量大小：琼脂糖凝胶电泳, 50Kb左右与 λDNA仿
（ 清晰主带 ）, 质量好
? DNA浓度,1 0D＝ 50ug/ml DS-DNA（ 浓度 ） 数
量 40ug/ml RNA or SS－ DNA
限制性内切酶操作
准备
1,调整 DNA浓度, 大致相当浓度 300-400ng/ul, 每样品
取等体积的量, 质量好的 DNA。
2,仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书, 熟悉分析
条件及酶切的贮存浓度 <10u-50u/ul>厂家配套试剂 。
3,限制性内切酶贮存 buffer一般含 50%甘油, 若甘油在
反应体系中超过 5%即影响特异性, 因此酶的体积
<1/10V总 。
酶切体系,
DNA(3-5ug,3ug) 8ul
10*buffer reaction 1.5ul
Enzyme (8u) 0.8ul（ 冰上 ）
Add H2O to 15ul
酶切终止及检测,
1、加上样缓冲液终止酶切，也可 65℃ 加热 10min 使酶变性
失活。
2,电泳检测酶切效率：每样品 1/10量上样, 电泳检测 。
? 若呈现均匀连续分布的一片, 则酶切效果好, 否则重做 。
? 出现切烂,DNA降解, 重新提 DNA；
? 切不动：杂质多 （ 多糖, 蛋白质, 酚类, 有机溶剂等 ）,
重新纯化 。
A1优总 DNA A2劣总 DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动
点样孔
酶星活性 (star activity),
在非最适条件下 （ 高 PH,低离子强度 ）, 有些
酶识别特异性会降低, 表现出松弛的专一性
(relaxed specificity),这种酶切特异性降低现象即
为该限制性内切酶的星活性 (star activity)。 如识
别六碱基变成识别四或五个碱基的 。
思考,
（ 1） 什么是酶星活性？ 如何避免？
（ 2） 影响酶切效率的因素？
（ 3） EB指示剂原理？
电泳
1,胶浓度 0.7-0.8%。
2,胶厚度 <5mm (<250ml胶 )。
3,胶的均一性 (不同样品的迁移率一致 )。
4,样品数及样品 DNA量 (经济, 高效 )。 (42孔梳子,亲
本, 统一量 )
5,指示剂量稍大, 长时间指示 。
6,电泳电压：大电泳槽 40V,12小时, 1-1.5V/cm。
7,电泳结束, 指示剂约移动 10-11cm。
Southern blotting onto Hybond-N+ Membrane
一, 转膜目的意义
二, 转膜的方式,
1,Upward Capillary Transfer (Figure 1)
2,Downward Capillary Transfer (Figure 2)
3.Simultaneous Transfer to Two Membranes (Figure 3)
4,Electrophoretic Transfer
5.Vacuum Transfer
固相支持物的种类及选择,
? 尼龙膜：高强度, 不易破损, 与 DNA共价
结合, 反复使用 10次以上不破损, 不丢失
DNA,吸附 DNA每 cm2比硝酸膜多 5倍,
50bp有效杂交 。
? 硝酸纤维素膜：非共价结合, 易脆, 易丢
失 DNA,<500bp的 DNA无效, 不适用于
RFLP。
硝酸纤维素膜 ）
支撑型 硝酸
纤维素膜
不带电荷的尼
龙膜
带正电荷的尼
龙膜
活化纸
应 用 ssDNA,RNA,
蛋白质
ssDNA,RNA,
蛋白质
ssDNA,dsDNA,
RNA,蛋白质
ssDNA,
dsDNA,RNA,
蛋白质
ssDNA,RNA
结合能力
（ μg/cm2 )
80-100 80-100 400-600 400-600 2-40
抗张强度
差 好
好 好 好
核酸结合的形
式
非共价键 非共价键 共价 共价 共价
有效结合核酸
的下限
500核苷酸 500核苷酸 50核苷酸或碱
基对
50核苷酸或碱
基对
5核苷酸
重复探测的可
行性
差（易脆） 差（信号易丢
失）
好 好 好
用于固定核酸的各种材料的性质（ Brown,1991）
原理
尼龙膜 （ 带正电荷的 ） 具有较大的 DNA结合容量,
它能够吸附变性 DNA,核酸能够不可逆结合在尼
龙膜上 。 尼龙膜两边均有同样吸附 DNA功能, 无
论用哪边均可以经久耐用, 可反复利用 10次以上
（ 10-20次 ）, 经毛细管 （ 毛细吸附 ） 作用, 把
DNA从凝胶上转到膜上 。 DNA转到膜上是复制胶
上的带型, 再在 80-100℃ 真空干燥 2-4hrs,即可固
定 DNA。
转移缓冲液（ transfer buffer）
?带 正 电 荷 的 尼 龙 膜, 可 用 高 盐 离 子 强 度
（ SSC）, 但不能充分发挥膜潜能； 0.4N
NaOH,共价结合 DNA是最大优点 。
?硝酸纤维膜：高盐离子强度促进ＤＮＡ与膜结
合 （ ２０ × ＳＳＣ ）, 低盐离子强度导致小片
段ＤＮＡ在转移过程中丢失,pＨ >９, ＤＮＡ
不能与膜结合 。
转膜时间 （ duration of transfer,12hrs）
取决于毛细管系统, ＤＮＡ大小, 胶厚度
(<5mm)及浓度 (<1%)。
ＤＮＡ分子量大小决定时间长短, 部分去嘌呤
减小ＤＮＡ, 碱转２ hrs大部分结合到膜 。
DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过
EB染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补
救措施，因此，每一步应严格操作
Southern hybridization
试验目的
对于大的基因组, DNA酶切图谱凭肉眼是分辨不开
的 （ EB染色 ）, 因为大小不等的分子呈现弥散分
布, 只有借助灵敏的放射性同位素 （ 或其他化学发
光物质 ）, 将靶 DNA在凝胶上 （ 膜上 ） 的带型通过
特定的探针与之杂交, 转换成 X光片上直观的带型,
从而揭示基因组的规律 。
基本原理
依据碱基配对原则, 用放射性同位素标记的
DNA探针, 与固着在膜上的靶 DNA杂交,
经放射自显影, 确定靶 DNA的位置 。
预杂交
?膜上许多没有 DNA分子的地方, 存在 DNA结合点, 若不在
预杂交时用一些封闭剂结合在这些位点上, 加入探针后, 探
针 DNA分子将会结合在这些位点上, 导致杂交背景深 。 预杂
交的目的是用非特异性 DNA分子 （ 鲑精 DNA） 及其它高分子
化合物 （ 封闭剂 ） 将待杂交膜中的非特异性位点封闭, 从而
减少杂交背景 。 （ Denharts,鲑精 DNA含在杂交液中 ） 。
?将尼龙膜放入杂交袋或杂交管中, 加入杂交液, 赶气泡, 封
口, 放入 65℃ 的杂交箱中, >3hrs (bags),杂交液浸没膜 。 一
般地, 12hrs。
杂交液组成,
5× SSC (NaCl,柠檬酸钠 )
50mM PB (NaH2PO4,Na2HPO4)
5× Denhardt (多聚蔗糖, 聚乙烯比咯烷酮, BSA)
2.5mmEDTA （ 有 /无 ）
100ug/ml SS DNA (鲑精 DNA)
0.1%SDS （ 高浓度作封闭剂, 低浓度表面活性剂 ）
10%硫酸葡聚糖 （ dextran sulfate）
探针的标记方法,
体外标记 DNA或 RNA的方法有多种, 如：末端
标记, 随机引物标记, 切口平移 （ nick
translation）, 体外转录 （ in vitro transcription）
及各类 PCR等 。
这些方法有的是在特定位置标记核酸 （ 5‘或
3‘末端 ）, 有的标记核酸分子内部的多个位点 。
有的产物是标记单链, 有的产物是标记双链 。
有的方法产生一定长度的标记产物, 有的得到
的是长短不一的标记产物 。
方法一,labelin of DNA by nick Translation
特点：快, 易, 便宜, 高比活的标记 DNA,用于文库筛选 。
E.coli DNA polymerase I,5’?3’ polymerase;
5’?3’ exonuclease
The nicks in the DNA template produced by add trace amounts
of DNaseI
注意 DNasel量及反应时间。量少，时间短，标记低；量大，
时间长，片段过小。掌握酶量及反应时间，产生大小相等的标
记了的 DNA片段。
方法二, 随机引物标记,
在 DNA聚合酶的作用下, 寡核苷酸通过与单链的模
板配对可以启动 DNA的合成 。 如果寡核苷酸序列是
不同的 （ heterogeneous）, 引物中包含所有可能的
随机序列 (如 6碱基引物可有 46=4096种 ),则可以与
任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链, 四种
核苷酸底物中有一种是用同位素标记的, 因而可产
生均匀一致高比活放射性探针 。 同位素标记的探针
DNA 的平均长度与引物的浓度成反比,
随机引物标记体系包括,
? The klenow fragment 去除了 E,coli DNA polymerase I
的 5’→ 3’的外切酶活性，具有 5’→ 3’的聚合活性及 3’
→ 5’ 外切酶活性。
? Primer：可通过用 DNase I 消化牛胸腺 DNA,DNA合
成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针 DNA
的平均长度与引物的浓度成反比 [=k/(lnPc)1/2,Pc 是引
物的浓度，一般可产生 400-600 bp 的标记产物。
? 模板 DNA：线状双链 DNA。环状 DNA 用限制性内切
酶切成线状再标记。
? α-32P-d CTP,(放射性比活 >3000Ci/mmol)
探针标记反应体系,1-2blots(19.5× 9.5cm2)
DNA 100ng
dNTP 2.0ul
Random primer 5.0ul
Klenow (1u/ul) 1ul
?- dCTP* 1.0ul
add H2O to 17.0ul
探针标记步骤,
1,将探针 DNA变性 （ 100℃, 10min）
2,变性探针置于冰浴上
3.按反应体系加入反应混合液于变性 DNA中
4.再在同位素操作台上, 加入 32P标记的 dNTP
（ ?-32P dCTP*）
5,30℃ 温育 2小时以上
杂交
将标记好的探针, 补加 300ul 杂交液, 100℃ 变
性 （ or 0.4N NaOH变性 ）, 加入杂交袋 （ 盒 ）
中 （ 忌直接加于膜上 ）, 杂交前作标记效率测定,
>25%以上可以往下做杂交, 过夜杂交, 杂交效率
受杂交速率及杂交稳定性影响 。
1,杂交率的影响因素 （ 杂交时间长 —— 影响不大 ）
? 杂交温度：双链 DNA分子； T=Tm-20— 25℃ 可
达最大杂交率,DNA-RNA杂交分子则低于 Tm 值
10-15 ℃ 。
? 离子强度 (1.5M/L NaCl 杂交率最高 )
? 双链长度 (形成杂交物长度 ),杂交率与双链长
度成正比
? 探针的复杂程度 (重复性探针可以增加杂交率 )
? pH5.0-9.0 基本无影响 。
2,影响杂交稳定性 （ 影响解链温度 )的因素
? 离子强度 在 0.01-0.4M NaCl 之间,每 ?10× 单价
阳离子, Tm ?16.6℃
? 碱基组成 AT<CG（ 在 NaCl 溶液中 ） ；
? 去稳定剂 （ destabilizer） DNA-DNA杂交分子,
每 1%formamide,Tm ?0.6℃ ； 6M urea 可降低
Tm 30 ℃
? 碱基错配：每 1%的错配可使 Tm 降低 1℃
? 双链长度 （ 探针杂交物 ） >500bp 基本无影响 。
3,洗膜
从低严谨度到高严谨度冼膜液 （ 具体情况而定 ）
1× SSC/0.1%SDS洗膜两次 （ 冷 5min,热 65℃,
15min） ?检测信号强度 ?0.5× SSC/0.1%SDS
热冼 65℃,15min ? 依 情 况 可 有 改 动
0.2× SSC/0.1%SDS or 0.1× SSC/0.1%SDS 。
SSC调整 [Na+],缓冲容量大, 改变 Tm,从而洗
掉非特异性探针杂交体, [SSC],Tm SSC0.1%-
0.2%可以升高洗膜温度 17℃, 0.1%SDS可以洗
去膜上的封存剂 。
4,包膜
膜从洗膜液中捞出, 在滤纸上凉干, 膜表面
无可见水膜为止 （ 忌太干, 以防探针难以洗
脱, 影响再次使用 ） 用保鲜膜包膜, 压片, -
20℃ 或 -70℃, 依据信号强弱曝光 （ 3— 7天 ）
5,冲洗 X-光片
在暗室红灯下取出 X-光片, 置入显影液中至
杂交带显现出来 （ 显影时间依据信号强弱及
曝光时间长短可由几秒钟到 2分钟 ）, 转入清
水中漂洗, 然后放入定影液中定影至清亮
（ 约 10分钟 ） 。 自来水冲洗干净后, 晾干,
读片,
显影液配方,
成分 相纸 胶卷 X-光片
温水 （ 40℃ 左右 ） 750ml 750ml 750ml
米吐尔 3.1g 1g 4g
无水亚硫酸钠 45g 75g 60g
对苯二芬 12g 9g 10g
无水碳酸钠 67.5g 25g 40g
溴化钾 1.9g 5g 4g
加水定容至 1000ml 1000ml 1000ml
6,膜上探针洗脱
再次使用膜前, 必须洗去上次探针 ！
(1) 0.1%SDS,0.1× SSC 10min
(2) 0.1NaOH,0.2%SDS 2-3min
(3) 0.2M Tris.HCL,0.2%SDS,0.1× SSC 20min
只洗去探针, 而不影响膜上的靶 DNA（ 因为 DNA与膜是
共价键结合, 而 DNA与探针的结合是氢键结合 ） 。
杂交效果改良应考虑问题 (一）,
1,保证转膜质量；
2,操作规范；
3,提高灵敏度 （ 杂交 ） （ 信号强度 ） ；
?探针量及标记量 （ 探针变性 ） ；
?比活 （ 性 ） 度 ≥108dpm/u(<108弱 )；
?靶 DNA量 （ 绝对量, 酶切转膜决定；相对量, 靶 DNA相对于探针过
量时, 完全配对杂交, 探针过剩时, 完全配对和非严格的完全配对均有
发生 ） ；
?有惰性聚合物增加灵敏度； 10%(w/v)500,000(mw)dextran
sulfate或 8%(w/v)PEG6000,(对于单链探针, 可以增加 10-fold杂交
信号, dsDNA成 100-fold地增加杂交信号 )
杂交效果改良应考虑问题 （ 二 ）
4,提高特异性
?高盐溶液促进探针与靶序列的碱基配对 20× SSC 3M
NaCl/0.3M Na3Ci
?杂交后洗膜温度 T?Tm
?杂交后洗膜液浓度组成, 高严谨度洗膜液使不完全
配对的杂交失去稳定, 致使探针脱落
?杂交时间 8hrs 以后, DNA探针逐渐退火, 少量自由
与靶 DNA杂交,
? 探针长度 （ >1000bp） 过长, 高严谨度下难洗脱非
完全配对杂交探针 。
Troubles shooting guide for DNA Blotting and
Hybridization Analysis（ 一 ）
信号弱 (poor signal) 的可能原因,
? probe specific activity too low (<108dpm/ug)
? Inadequate depurination (transfer of DNA is poor)
? Not enough target DNA (DNA固定效果差 )
? Transfer time too short
? Probe concentration too low
? Incomplete denaturation of probe
? Incomplete denaturation of target DNA
? Final wash was too stringent
? Hybridization time too short
背景差 （ Spotty background or high background）
? Membranes adhered during hybridization or washing (not too many
membramesat once)
? Bubbles in a hybridization ba
? Not enough wash solution
? Agarose dried on the membrane（ 斑点 ）
? Hybridization temperature too low
? Labeled probe molecules are too short (nick-translation labeling,
reduce amount of DNasel)
? Probe concentration too high
? Inadequate prehybridization ≥3hrs
? Probe not denatured
? Not enough SDS in wash solution
? 封阻剂不足
制备感受态细胞
植物总 DNA的抽提
(RNase A) 外源 DNA的准备 质粒载体的抽提
限制酶 酶切 限制酶 酶切
CIP处理
T4连接酶 连接
热激法转化
转化子鉴定
挑白色菌落
抽提质粒
液体培养
做 PCR(Taq酶 )
PCR产物检测及纯化
经电泳检测质量好的
DNA用 限制内切酶 酶
切
酶切好的 DNA电泳
DNA由琼脂糖凝胶转
移至尼龙膜上
尼龙膜预杂交 探针标记 (Klenow酶 )
加入标记 好的探
针进行分子杂交
洗膜
包膜及压 X光片
冲洗 X光片
分析结果
洗去膜上的探针以备后用
