基因工程综合实验操作 　 　 　 大肠杆菌常规培养 大肠杆菌在LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固体培养基中，置于37℃ 培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因质粒（如pUC18）的菌体，则需在培养 基中加入100 mg/ml的氨苄青霉素。在重组子克隆的鉴定培养中，LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal），浓度为40 mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为50 mg/ml。 大肠杆菌染色体DNA的抽提 1. 大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4℃，离心10分钟收获菌体沉淀。 2. 沉淀中加入3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。 3. 加入400 ml 10% SDS使最终浓度为1%，混匀，37℃保温30分钟或澄清即可。 4. 加入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60℃保温60分钟。 5. 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。 6. 4℃，15 000 rpm，离心30min。 7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4℃，15000 rpm，离心30分钟。 8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4℃，离心10分钟。 9. 取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后 -20℃放置30分钟以上，4℃，15000 rpm，离心30分钟。 10. 弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心5分钟。 11. 弃上清，沉淀于37℃凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。 12. 取5 ml电泳。 Buffer A Tris-HCl (pH8.0) 10 mM EDTA (pH8.0) 20 mM 　 DNA酶切 在Eppendorf管中建立如下酶切反应体系：置于37℃保温1.5小时，然后电泳检查 质粒DNA 5 ml 限制性内切酶 1 ml 10×酶切缓冲液 1.5 ml 无菌重蒸水 8.5 ml 总体积 15 ml DNA琼脂糖凝胶电泳 1. 用1×TAE–buffer配制0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2. 待溶液冷却至60℃左右，加入溴化乙锭（用水配1 mg/ml贮存液）至最终浓度为0.5 mg/ml，充分混匀。 3. 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度 在3-5 mm之间。 4. 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE-buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使 缓冲液没过胶面约1 mm。 5. DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。 6. 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动。采用100V电压进行电泳。 7. 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。 50×TAE-buffer Tris 242 g/l 冰醋酸 57.1 ml/l EDTA 0.4 g/l 　 DIG分子杂交 I．DNA转移和固定 1. 大肠杆菌染色体DNA（各1-2 mg）分别用BamHI、EcoRI、PstI、HindIII酶切，电泳。 2. 电泳拍照（胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位），搭建转移台，在盛有0.4N NaOH的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜（剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块）、凝胶、尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物，放置 过夜。注：在摆放过程中要防止气泡的产生 3. 次日取出尼龙膜，在槽口处用圆珠笔标记后，在6×SSC中洗涤30s，放于牛皮纸上，于80℃烘2h，放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。 II．oligonucleotide tailing 1. 用无菌水溶解oligonucleotide至适当浓度。 2. 在插入冰中的管中混合： oligonucleotide 100pmol 反应缓冲液（vial 1） 4 ml CoCl2溶液（vial 2） 4 ml DIG-dUTP溶液（vial 3） 1 ml dATP溶液（vial 4） 1 ml TdT（50units）（vial 5） 1 ml 加无菌水至终体积20 ml。 3. 37℃保温15min，然后置于冰中，加入2 ml糖原溶液（1 ml vial 9 + 200 ml 0.2M EDTA，pH8.0）。 4. 终止标记反应后，加入2.5 ml 4M LiCl，75 ml 乙醇（-20℃预冷），沉淀oligonucleotide。 5. 至少在-70℃放置30分钟或-20℃放置2h，15000转/分离心20min。 6. 沉淀用50 ml 70%乙醇洗涤、晾干，用适当体积的无菌水溶解，保存于-20℃。 III．预杂交和杂交 1. 把尼龙膜放入杂交管中，按20 ml/100 cm2 加入预杂交液，于杂交炉中68℃保温至少1 h。 2. 将DIG标记的DNA探针（5~25ng/ml）煮沸10 min，迅速插入盐冰中变性。 3. 弃此预杂交液，按2.5 ml/100 cm2膜加入含5-25 ng/ml标记探针的杂交液。 4. 膜在杂交温度保温6-16 hr。 5. 在杂交温度洗涤： a 至少50 ml/100 cm2 2×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2次 b 0.1×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2次 6. 膜可立即检测或晾干后保存。 IV. 免疫检测 1. 杂交后严格洗涤，把膜直接浸入Washing buffer中1-5 min。 2. 在100 ml Blocking solution（1×conc）放置30 min。 3. 用Blocking Solution（1×Conc把anti-DIG-AP conjugate稀释至150 mU/ml，50 ml中有10ml anti-DIG-AP conjugate）。 4. 膜在50 ml抗体溶液中放置30 min。 5. 100ml Washing buffer洗膜15 min×2次。 6. 膜在20 ml Detection buffer中平衡2-5 min。 7. 膜在新配的10 ml Color-substrate solution中放置5 min（置于黑暗中），注意在显色过程中不要摇动。 8. 几分钟后有色物质开始生成，反应一般在16 h后达到完全。 9. 颜色达到一定强度后，可用50 ml H2O洗膜5 min来终止反应。 10. 结果拍照保留。 20×SSC NaCl 3 mol/l Na-citrate 0.3 mol/l pH 7.0 Buffer 1 Maleic acid 0.1 mol/l NaCl 0.15 mol/l pH 7.5 用固体NaOH调节 10×Blocking Blocking reagent 10% 溶于Buffer 1，灭菌后存于4℃ 杂交Buffer 用于寡核苷酸探针的杂交 5×SSC Blocking reagent 1% 使用前加入polyA（vial 11） N-lauroylsarkosine 0.1% 终浓度为0.1mg/ml SDS 0.02% 2×预杂交液 用于DNA片段探针的杂交 12×SSC 使用时加入SDS，终浓度为0.5% 10×Denhardts 试剂 鲑鱼精子DNA碎片 200 mg/ml Washing Buffer Tween 20 0.3% 加入Buffer 1中 Detection buffer Tris-HCl 0.1 mol/l 显色中每10ml加入200μl NaCl 0.1 mol/l NBT/BCIP stock solution MgCl2 50 mmol/l pH 9.5 　 PCR法体外扩增phoA（碱性磷酸单脂酶基因） 1. 按如下体积加入各反应物： 　 总体积 50 ml ddH2O 20.5 ml 10×buffer 5 ml Mg2+（2.5mM） 5 ml dNTP（2.5mM） 4 ml Primer1（10 pmol/ml） 10 ml Primer2（10 pmol/ml） 10 ml 染色体DNA（约100 ng/ml） 5 ml Taq酶（5 U/ml） 0.5 ml 2. 充分混匀后按下列条件进行反应： 　 　 　 　 　 　 　 　 97℃ 　 5 min 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 95℃ 　 30 s 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 57℃ 　 1 min 30个循环 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 72℃ 　 2 min 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 72℃ 　 10 min 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 4℃ 　 ∞ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 3. 取50％采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况，扩增产物集中于1.5 kb片段的位置附近，割下该位置的凝胶进行 外源DNA的回收。 　 4. 回收的PCR扩增产物直接与pMD18-T载体连接，连接反应如下： Solution I PMD18-T PCR产物 ∑ 5 ml 1 ml 4 ml 10 ml 5. 16℃连接1h以上，用于转化。 DNA的琼脂糖凝胶回收 1. 用手术刀在DNA紫外检测仪下切割下含有所要DNA片段的凝胶块置于Eppendorf管中，加入100 ml重蒸水。 2. 用牙签将凝胶块尽量捣碎，剪去管的上部，用烧红的针头在管底扎几个微孔，孔径越细越好。 3. 将管套入另一个Eppendorf管中，常温下，15000 rpm离心10分钟。 4. 将上清液吸到收集管中，向沉淀中加入100 ml重蒸水。 5. 重复步骤(2)、(3)、(4)各一次，见图。 6. 收集的上清液加入0.1V 的KAc（PH5.5，3M）和2.0-2.5 V的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置30 min，取 出15000 rpm，4℃离心30 min。 7. 弃上清，加入400 ml 70％的乙醇，15000rpm，4℃离心5 min。 8. 弃上清，沉淀凉干后用20 ml ddH2O溶解待用。 大肠杆菌感受态细胞的制备 1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃下隔夜培养。 2. 挑取单菌落接种于30 ml LB液体培养基中，37℃下隔夜培养。 3. 按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30 ml LB培养基中。 4. 在37℃的水浴摇床中培养1.5小时，OD600接近0.5。 5. 4℃，6000 rpm 离心10分钟收获菌体。 6. 上述得到的菌体沉淀用10 ml的10 mmol/L CaCl2（冰冻）悬浮，4℃，6000 rpm离心10分钟。 7. 弃上清，将沉淀用1 ml的75 mmol/l CaCl2（冰冻）重新悬浮并转入无菌Eppendorf管中。 8. 冰水浴中放置8 h即可使用。 　 大肠杆菌的转化 1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。 2. 吸取90 ml感受态细胞悬浮液至无菌Eppendorf管中，加入10 ml DNA溶液，轻轻混匀，在冰水浴中放置30分钟。 3. 42℃水浴中脉冲2分钟，快速转移至冰水浴中，加入900 ml LB培养基，37℃水浴摇床培养1-1.5小时。 4. 吸取100 ml已转化的感受态细胞涂布于100 mg/ml Ap和40 mg/ml X-gal的LB平板上。 5. 37℃下倒置培养12-16小时，挑选单菌落划线扩增培养。 　 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA 1. 在Eppendorf管中加入110 ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5 mg/ml）溶液，挑入米粒大小的菌团，充 分悬浮并混匀。 2. 上述菌体悬浮液沸水煮30秒。 3. 迅速放置于常温下15000 rpm离心15分钟。 4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100 ml的异丙醇，充分混匀后4℃，15000 rpm离心20分钟。 5. 弃上清液，加入70%冰乙醇400 ml，4℃，15000 rpm离心5分钟。 6. 沉淀凉干后用50 ml无菌重蒸水溶解。 7. 取5 ml电泳检测。 STET： 蔗糖 8％ TritonX-100 5％ Tris-HCl (PH8.0) 50 mM EDTA (PH8.0) 50 mM 　 碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA 1. 1.5 ml培养物6000 rpm，4℃离心10分钟，弃去上清液。 2. 加入100 ml溶液I悬浮菌体，室温放置5分钟。 3. 加入200 ml溶液II，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。 4. 加入150 ml溶液III，轻轻混匀，冰浴30分钟。 5. 4℃，15000 rpm离心20分钟，收集上清液。 6. 上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液（400 ml）氯仿，充分混匀，4℃，15000 rpm离心20分钟，将上清液转移 至另一离心管。 7. 在上清液中加入400 ml氯仿溶液，混匀，10000 rpm离心10分钟，将上清液转移至另一离心管。 8. 在上清液中加入400 ml异丙醇，–20℃放置30分钟，4℃，15000 rpm离心20分钟。 9. 用400 ml 75%的冰乙醇洗涤一次，凉干。 10. 加入50 ml无菌重蒸水溶解质粒DNA。 11. 取2 ml作酶切电泳检查。 　 溶液I D-Glucose 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0） 50 mmol/L EDTA（pH 8.0） 10 mmol/L 121℃消毒20分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为5 mg/ml 溶液II SDS 1% NaOH 0.2 mol/L 溶液III KAc（pH5.5） 3 mol/L 　 工程菌发酵 1. 挑取少量pET11a-phoA/BL21(DE3)菌体接种于含Ap（终浓度100 mg/ml）的30ml LB液体培养基中，于37℃培养过夜；以相同条件接种pET11a/BL21(DE3)为对照。 2. 以1%的接种量将上述一级培养物接种于含Ap（终浓度100 mg/ml）的100 ml LB液体培养基中，恒温培养2h后 （OD600约为0.5），加入诱导剂IPTG终浓度1 mM，继续37℃培养。 3. 诱导后培养3h后收集菌体，4℃，6000rpm离心10 min，弃上清液，菌体沉淀置于-20℃保存待用。 细胞裂解 1. 以5 ml 碳酸钠-碳酸氢钠重新悬浮菌体沉淀，冰浴超声裂解细胞。 2. 超声波裂解液于4℃，15000 rpm离心30 min，取上清液待用。 碳酸钠-碳酸氢钠溶液（0.1M，PH10.0） Na2CO3 1.06% NaHCO3 0.84％ 　 碱性磷酸单酯酶的活力测定 1. 以下列体系进行酶活测定的反应： 反应体系 NPP Buffer 酶液 NaOH（0.5M） 3.0 ml 0.6 ml 1.2-X X 1.2 2. 底物NPP加入Buffer（碳酸钠-碳酸氢钠溶液）后，底物与酶分别于37℃预热3-5 min，然后混合37℃保温30 min， 加入NaOH终止反应。 3. 参比管预热后先加入NaOH再加入酶保温。 4. 上述测活反应液与405 nm测定吸收值。 　 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 安装玻璃板并确定所需凝胶溶液体积。 2. 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液约4.5 ml，并于其上覆盖一层水。 3. 分离胶聚合完全后（约20 min），倾出覆盖液体。 4. 在分离胶上层直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入梳子，避免产生气泡。 5. 用Loading Buffer处理样品菌体，在100℃加热5 min左右，使蛋白质变性。 6. 浓缩胶聚合后小心移出梳子，用无菌水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胶后，按顺序加样。 7. 接通电泳装置，凝胶上所加电压为8 V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到15 V/cm，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。 8. 卸下玻璃板，标记凝胶加样方位，用考马斯亮蓝染色液（Staining Buffer）对凝胶进行染色，至少1 h以上。 9. 移出凝胶，回收染色液，用Destaining Buffer进行脱色1-2小时，其间应更换脱色液三四次。 10. 凝胶保存于水中，或把凝胶干燥成胶片保存。 　 5×SDS-PAGE Buffer SDS-PAGE电泳缓冲液，用时稀释5倍 Tris 15.1 g/l 甘氨酸 94 g/l SDS（10%） 50 ml/l SDS-PAGE 分离胶（10ml） 浓缩胶（5 ml） H2O 3.7 ml 3.3 ml Acryl-bis（3.3c） 3.6 ml 0.91 ml Tris-HCl 2.5 ml（1.5M，pH8.8） 0.63 ml（1.0M，pH6.8） SDS（10%） 0.1 ml 0.05 ml 过硫酸铵（10%） 0.1 ml 0.05 ml TEMED 4 ml 5 ml 2×Loading Buffer Tris-HCl 100 mM SDS 4% 溴酚蓝 0.2% 甘油 20% SDS-PAGE Staining Buffer Destaining Buffer 　 乙醇 30% 30% 乙酸 10% 10% 水 60% 60% 考马斯亮蓝 0.25-0.5% 碱性磷酸单酯酶提取 　 试剂： 50 mmol／L Tris-HCl (pH7.0) pH 7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 　 实验步骤： 　 1. 将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000 rpm离心15min，收集菌体； 2. 将收集的菌体以10 mL/g湿菌体的比例，用50 mmol/L Tris-HCl (pH7.0)悬浮，再用超声波破膜； 3. 菌裂解液于4℃，15000 rpm离心20 min，取上清液。 4. 上清液加入NaCl至终浓度为0.8 mol/L，70℃水浴30min，12000 rpm离心10 min，丢弃沉淀； 5. 上清液于0℃边搅拌边加入固体硫酸铵至60％饱和度，静置2-4 h ，12000 rpm离心20 min，弃上清液。 沉淀用1/10体积的pH 7.6 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，于4℃对相同缓冲液透折。直至透析袋内外平衡。 透析好的样品进行离子交换柱层析。 　 包涵体中碱性磷酸单酯酶提取 　 试剂： 50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 3 mol/L脲（0.1 mol/Tris-HCl pH8.0） TE缓冲液 0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽 4 mmol/L还原型谷胱甘肽溶液 　 实验步骤： 1. 将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000 rpm离心15 min，收集菌体； 2. 约每克湿菌加3 ml的量悬浮于50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，含1 mmol/L EDTA的缓冲液中进行超声破碎； 3. 超声破菌后1200 rpm，4℃离心30min进行固液分离，用TE缓冲液反复洗涤除去可溶性杂蛋白，核酸及外加溶质等； 4. 用9倍量的变性剂3 mol/L脲（0.1 mol/Tris-HCl pH8.0）和0.5%Trton X-100的TE缓冲液分别洗涤； 5. 将包涵体溶于变性液50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/LLEDTA，8 mmol/L 脲（pH 8.0），12000 rpm离心30min； 6. 取上清液，在0.25 mmol/L氧化型谷胱甘肽和2 mmol/L还原型谷胱甘肽溶液中，4℃透析过夜； 透析液浓缩备用。临用前加相应缓冲液至一定体积。 　 离子交换柱层析纯化碱性磷酸单酯酶 试剂 DEAE-纤维素32 0.02 mol/L对硝基酚磷酸二钠 pH 7.6 0.5M Tris-HCl缓冲液 pH7.6 0.5M Tris-HCl（内含0.3 N NaCl）缓冲液 pH10.0 0.1M Na2CO3-NaHCO3的底物缓冲液 　 实验步骤： 　 I．DEAE-纤维素预处理 1. 称取5克DE-32，于小烧杯中，加入75毫升0.5 mol/L HCl的烧杯中，于室温轻轻搅拌30分钟。 2. 将糊状物移入布氏漏斗中，用蒸馏水淋洗并浸泡5分钟，不时轻轻搅拌，抽滤。如此重复，每加一次去离子水， 浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4。 3. 将糊状物移入烧杯中，加入75毫升0.5 mol/L NaOH，于室温轻轻搅拌30分钟后，将交换剂移入布氏漏斗中，反 复用去离子水淋洗、抽滤，直至洗涤液pH为8，抽干。 4. 将DEAE-纤维素移入烧杯中，浸泡在150毫升去离子水中。用0.5 mol/L HCl把pH调至7.6左右（可在pH计上进行 或用pH试纸调试），须使悬液最终pH在10分钟内无变化，然后抽滤。 5. 将上述滤块置于100毫升烧杯中，加入75毫升pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液轻轻搅拌之后，静置20分钟，用倾 斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH值与缓冲液几乎一致。 6. 将含有1倍体积pH 7.6 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液的DEAE-纤维素浆液含放在抽滤瓶中减压除尽气泡。备用。 II. 装柱 1. 层析柱（1.0×20cm）清洗后，用去离子水洗涤一遍。柱的下端联接好流出液引导塑料管，塑料管末端接上小乳 胶管，在乳胶管上装上螺旋夹。 2. 关紧螺旋夹。柱内装入适量的pH7.6 0.5M Tris-HCl缓冲液，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走层析柱的流 出液引导塑料管内的气泡，柱中仍保留少量缓冲液，关紧螺旋夹。 3. 将减压除尽气泡的DEAE-纤维素浆液沿层析柱管壁倒人柱中，使凝胶树脂在柱中保留的缓冲液中自然沉降，待 凝胶树脂沉降至离层析柱柱床高约1 cm高度时，部分旋松螺旋夹，让柱内溶液缓慢流出，注意此时的流速要极 其慢。再继续加入DEAE-纤维素浆液，直至凝胶树脂自然沉降后高达10 cm以上的柱床体积。缓冲液液面比凝胶 树脂层面高1 cm左右。 III. 平衡 当装柱完毕后，用pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液上柱继续进行平衡，流速维持在1毫升/5分钟（大约4-5滴/分）, 直至流出液的pH值与上柱缓冲液完全相同。 IV. 层析 1. 关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶树脂层面上的缓冲液至凝胶树脂层面与缓冲液液面齐平。 2. 用吸管吸取实验一或实验二中提取的碱性磷酸单酯酶的粗酶溶液，小心沿柱壁缓缓加入柱内。轻开螺旋夹，使 柱中缓冲液缓缓流出，让粗酶溶液进入纤维素凝胶树脂内，至与凝胶树脂层面齐平时。 3. 柱壁用少量pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液小心洗涤2-3次，重复至使缓冲液液面与凝胶树脂层面齐平。 4. 然后加入pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，使缓冲液液面比凝胶树脂层面高1-2 cm左右，保持流速1毫升/5分钟 （大约4-5滴/分）。 V. 洗脱 1. 将梯度洗脱仪和层析柱连接好。 2. 在梯度洗脱仪中的A（混合器）中加入100 ml pH7.6 0.5M Tris-HCl缓冲液，在梯度洗脱仪中的B（贮存器）内 加入100 ml pH7.6 0.5M Tris-HCl（内含0.3N NaCl）缓冲液。注意使A（混合器）和B（贮存器）内的液面应处 于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡。 3. 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以A混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。 4. 打开梯度洗脱仪与层析柱的连接管道，依序打开A（混合器）和B（贮存器），开始对层析柱进行梯度洗脱。保持流速2毫升/15分钟（大约3滴/分），收集洗脱流出液，收集管速为：管/15分钟，收集各管依次测定OD280值并定性测酶活。 VI. 酶活的定性测定 1. 取白瓷板一块，每个孔穴内加入一滴底物溶液，3滴底物缓冲液，一滴洗脱液，定性检测酶活性在各收集管中的分布。 2. 将含有酶活性的各管合并，测酶活性和酶蛋白量。 3. 以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37°C、pH10.4条件下，每分钟转化产生1 mmol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位。具体测定步骤如下：取0.5毫升0.02 mol/L对硝基酚磷酸二钠, 1.5毫升底物缓冲液, 于试管中混合后, 在37°C预热5分钟，再加入0.5毫升酶液，立即混匀，记时，37°C 保温20分钟，立即加入1毫升0.5 mol/L NaOH后再加酶液。已知对硝基酚的摩尔消化系数E： E4051cm =18.8 x 103, 求出每毫升活力单位数。 4. 酶蛋白含量测定：取上述选择的碱性磷酸单酯酶洗脱含量较为集中的峰段收集管编号，直接在紫外分光光度计中测定OD280值。同时用1 mM HCl作稀释溶液，调整溶液的合适稀释浓度，使测定溶液在紫外分光光度计中的 OD280测定值控制在0.15-0.30之间，最后读取OD280测定值。 　 VII. 结果与分析 1. 计算各收集管洗脱液中的蛋白含量、碱性磷酸单酯酶酶活力单位、碱性磷酸单酯酶酶比活，以上述三组数据及 洗脱液NaCl的浓度为纵坐标，以洗脱液体积V洗为横坐标，作洗脱曲线图。 2. 针对实验过程中的每一实验步骤，分析影响在DEAE-纤维素的离子交换层析过程中洗脱液的蛋白含量、碱性磷 酸单酯酶酶活力单位、碱性磷酸单酯酶酶比活的可能因素；分析影响从原料中最终制取碱性磷酸单酯酶活力单位总收得率的各种可能因素。洗脱液盐浓度计算方法：对于线性梯度洗脱，在一定时间内梯度洗脱仪混合器A 中的盐浓度C洗与从层析柱流出的溶液的体积V洗的关系可用下式表示：位总收得率的各种可能因素。洗脱液盐 浓度计算方法：对于线性梯度洗脱，在一定时间内梯度洗脱仪混合器A中的盐浓度C洗与从层析柱流出的溶液的 体积V洗的关系可用下式表示： C洗=Cb－Ca V洗+Ca V梯总 式中：Ca表示梯度洗脱仪混合器A中溶液NaCl的浓度；Cb表示梯度洗脱仪贮液器B中溶液NaCl的浓度； V梯总表示梯度洗脱液(A+B)的总体积；V洗表示流过柱的柱流出洗脱液体积；则C洗即为对应流过柱洗脱液 体积V洗时梯度洗脱仪中的A（混合器）中溶液NaCl的浓度。 凝胶层析法测定蛋白质分子量 试剂： 蛋白质标准样品混合液：分别称取3.0毫克牛血清白蛋白（MW67000）、鸡卵清蛋白（MW43000）、 结晶牛胰岛素（pH2-6时为二聚体，MW12000）共同溶于1毫升0.25 mol/LKCL-0.2 mol/LHAC溶液中。 碱性磷酸单酯酶样品（自制） SephadexG-75 洗脱液：0.025 mol/L KCl-0.2 mol/L Hac 　 操作步骤： I. 凝胶预处理 1. 称取凝胶干粉12克，放入250毫升锥形瓶中，加入过量的水，室温浸泡24小时，或沸水浴（100）浸泡3小时。 2. 溶胀平衡后的凝胶用倾法除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分搅拌，以防止颗粒破碎）， 放置数分钟机，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止。 3. 将浸泡后凝胶抽干，用300毫升洗脱液平衡1小时，减压抽气10分钟以除去气泡。 II. 装柱 1. 将层析柱垂直装好，在柱内先注入1/4-1/5的水，底板以下全部充满水，不留气泡，关闭柱出口，出口处接上一根长约1.5米，直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约45 cm处。 2. 插入一根直径稍小的长玻棒，一直到柱的底部。轻轻搅动凝胶（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成 均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，一边灌凝胶，提升玻管，直至充满整个柱时将玻管抽出。待底 面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口。 3. 随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下降。（如果凝胶床面上不再有凝 胶颗粒下降，应该用搅拌均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，不利于以后的 工作。 4. 当凝胶沉积到柱的顶端约6 cm处，可停止装柱。 5. 用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否纹路或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。 III. 平衡 1. 柱装好后，使层析床稳定15-20分钟，然后连接恒压洗脱瓶出口和层析柱顶端。 2. 用3-5倍体积的洗脱液平衡层析柱，平衡过程中维持操作压在45 cm水柱。 IV. 上样与洗脱 1. 上样前先检查凝胶床面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻棒将床面搅浑，让凝胶自然下降，形成水平状态的床面。用毛细吸管小心吸去大部分清液，然后让液面自然下降，直至几乎露出床面。 2. 用吸管将样品非常小心地滴加到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。加完后，再打开底端出口，使样品 流至床表面。用少量洗脱液同样小心清洗表面1-2次，然后将洗脱液在柱内约加至4 cm高。 3. 如图连接恒压瓶、层析柱、部分收集器，让洗脱液恒压（50 cm水柱）、恒流（2 ml/min）过程洗脱，用部 分收集器按每管2 ml收集洗脱流出液。 V. 记录 1. 各收集管于280 nm处检测OD280值，以管号（或洗脱液体积）为横坐标，OD值为纵坐标，绘出洗脱曲线。 2. 根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve，然后以蛋白质分子量的对数值（logM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出分子量标准曲线。 3. 样品完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测的洗脱，从分子量标准曲线查出相应的分子量。 聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳 　 试剂： 　 标准蛋白（电泳纯） 细胞色素c (马心) 分子量：12500 胰凝乳蛋白酶原（猪） 分子量：23800 胃蛋白酶（猪胃） 分子量：35000 过氧化氢酶（牛肝） 分子量：60000 牛血清白蛋白 分子量：67000 未知蛋白（自制） 　 30％丙烯酰胺溶液：取29.2 g内烯酰胺，0.8 g甲叉双丙烯酰胺，加水至I00 ml，过滤，棕色 饼内避光，于4度保存。 1.5 M Tris-HCl分离胶缓冲液（pH8.8）：取18.15 g Tris，用l M HCl调pH至8.8，加水至 100 ml，于4度保存。 1.0 M Tris-HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8）：取12 g Tris，用l M HCl调pH至6.8，加水至100 ml，于4度保存。 电极缓冲液（PH8.3）：取28.8 g甘氨酸，6.04 g Tris，加I0 ml 10％SDS，加水至l L，室温保存。 　 10％SDS溶液：取10 g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。 10％过硫酸铵溶液：取0.l g过硫酸铵，加水至l ml，每次用前新鲜配制。 样品处理液： 水 4.0 ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 1.0 ml 甘油 0.8 ml 10％SDS 1.6 ml 2 -巯基乙醇 0.4 ml 025％（W/V）溴酚蓝 0.2 ml 上述溶液混匀后即可。 实验操作： I. 分离胶和浓缩胶配制 　 组 分 分离胶（ml） 浓缩胶（ml） 双蒸水 3.05 1.22 30％丙烯酰胺 2.5 0.26 分离胶缓冲液（pH8.8） 1.9 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 0.5 TEMED 0.026 0.02 10％SDS 0.075 0.02 10％过硫酸铵 0.013 0.02 总体积 7.6 2 上表所列是用于制成1块胶板所需组份的量（分离胶与浓缩胶配制应随用随配）。 　 II. 样品处理 　 1. 标准样品：用0.5 ml离心管，取2 mg/ml标准蛋白2.5 ml与等量50%蔗糖溶液混合，再与5 ml样品缓冲液混合。 2. 测定溶液：用0.5 ml，取样品2.5 ml与2.5 ml 50%蔗糖溶液混合，再与5 ml样品缓冲液混合。 3. 变性：于100℃沸水浴中煮5分钟。 　 III.电泳操作 　 1. 安装夹板：制胶前需要将白塑料框下沿的窄缝用密封胶带贴好，确保密封。将塑料框与凹型陶瓷板 的边缘对齐，安好六个铁夹子。 2. 制分离胶：将制胶板垂直放好，将配好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间，直至液面达到距梳子下 缘线1 cm处。用吸管将0.5 ml双蒸水加入制胶板中的分离胶液上，以防止液蒸发并保证胶面平整。 3. 制浓缩胶：分离胶聚合后，用滤纸吸去水液。用滴管在双蒸水中加满浓缩胶溶液后，插入与制胶板 相应的梳子。 4. 安装电泳槽：浓缩胶聚合后，除去梳子、密封胶带以及六个铁夹。将制胶扳、电泳糟内芯、另一对 制胶板依次放入槽内。两制胶板的凹型陶瓷板均应与电泳槽内芯接触。然后插入楔型板以固定两套制胶板。如果每次电泳只用一块胶板，必须用提供的有机玻璃板代替另一套制胶板。 5. 加样：在内外水槽加注缓冲液，使内外槽的水位均超过凹形板的缺口但低于塑料板的上沿。用微量 加样器在梳井内加样。 6. 电泳：盖好上盖，在100-150V的电压下电泳4小时左右，直到样品指示剂指示的电泳前沿到达制胶 板的下缘，关掉电源。然后拔掉楔形板，取下制胶扳。 7. 染色：用刀片或薄板将白塑料板与陶瓷板轻轻撬开，用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶 切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。然后手戴橡胶手套将分离胶小心移入染 色器皿中。在染色器皿中加入100 ml考马氏亮蓝染液（含0.25％考马氏亮蓝R-250，50％甲醇， 7％乙酸的水溶液），加盖，在摇床上染色2小时。 8. 脱色：将染液倒回贮存瓶（可反复使用）。在染色皿中加入100 ml脱色液（7％乙酸，30％甲醇）， 振荡脱色3小时。