实 验 六
大蒜细胞 SOD酶的提取分
离与活性测定
在生命科学高度发展的今天，蛋白质、
酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题，而生
物大分子结构与功能的研究，必须首先
解决生物大分子的制备问题，有能够达
到足够纯度的生物大分子的制备工作为
前题，结构与功能的研究就无从谈起。
然而生物大分子的分离纯化与制备是一
件十分细致而困难的工作。
? 与化学产品的分离制备相比较, 生物大分子的制
备有以下主要特点,
? ⑴生物材料的组成极其 复杂,常常包含有数百种
乃至几千种化合物。
? ⑵许多生物大分子在生物材料中的 含量极微,分
离纯化的步骤繁多，流程长。
? ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时
就极 易失活,因此分离过程中如何防止其失活，就
是生物大分子提取制备最困难之处。
? ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，
温度,pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种
组成的综合影响，很难准确估计和判断。 (影响因
素多 )
? 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行,
? 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目
的产物的物理化学性质。
? 根据实验目的，建立相应的可靠的分析测定、及
制备方法，这是制备生物大分子的关键。
生物材料的破碎 和预处理。
分离 纯化方案 的选择和探索，这是最困难的过
程。
生物大分子 制备物 的均一性（即纯度）的 鉴定 。
产物的浓缩，干燥和 保存 。
大蒜 SOD的提取及活性测定
? 试验目的,
（ 1）掌握 SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（ 2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯
化倍数。
（ 3）掌握离心机的使用。
? 实验原理,P64,
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出 O2-,生
成带色的中间产物,在 420nm有最大吸收峰。邻苯
三酚自氧化产生的中间产物在 40s-3min这段时间，
生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深 → SOD逐渐增多 → 颜色浅，即酶活力越大，
颜色越浅。
? 试验试剂,
大蒜
磷酸缓冲液（ PH7.8,0.05mol/l)(PH8.3)
氯仿 —乙 醇混合液
冷丙酮
邻苯三酚
浓盐酸
? 操作步骤,
1,SOD提取：称取 5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，
加入 15ml的 PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌 20分
钟，使 SOD充分溶解,6000rpm离心，弃去沉淀，得上清
液。 (留出 1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录 )
大蒜 SOD的提取及活性测定
? 2、除杂蛋白,提取液加入 1/4体积的氯仿－乙
醇混合液搅拌 10分钟,6000rpm离心 15min去沉
淀，得粗酶液。（取 1ml粗酶液备用,精确测量
剩余粗酶液体积）
? 3,SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入
等体积的冷丙酮，搅拌 15min,6000rpm离心
15min,得到 SOD酶沉淀。将沉淀 每管先加 2ml
磷酸缓冲液，溶解后在加 3ml混匀。 6000rpm离
心 15min,取上清得到 SOD酶液。取 1ml备用，
其余量取体积。
? 4,粗酶液活性测定 （ 邻苯三酚法 ）
提取液, 粗酶液, 酶液中 SOD活力检测, 具体步骤
如下 。
试剂 /ml 空白管 对照管 OD1 提取液 粗酶液 酶液
PH8.3缓
冲液 3 3 3 3 3
SOD提
取液 0 0 0.1 0.1 0.1
蒸馏水 2 1.8 1.7 1.7 1.7
室温放置 20min
邻苯三酚 0 0.2 0.2 0.2 0.2
加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时 4min,加一滴浓盐酸
停止反应,420nm测吸光值,
OD2
? 5、溶液中可溶性蛋白含量测定,
分别从 1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取 0.3ml
按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公
式计算蛋白质浓度,
提取液稀释,50 ×
粗酶液稀释,20 ×
酶液稀释,10 ×
蛋白质浓度 (mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) × 稀释倍数
? 6、计算,
酶活力单位 U/ml=2（ OD1-OD2）× 5/0.1
(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达
到 80%时的酶量 )
总活力 U=活力单位 × 总体积
比活力 U/mg=活力单位 /蛋白质浓度
纯化倍数 =粗酶液 (酶液 )比活力 /提取液比活力
回收率 =粗酶液 (酶液 )总活力 /提取液总活力
7,试验结果讨论,
大蒜细胞 SOD酶的提取分
离与活性测定
在生命科学高度发展的今天，蛋白质、
酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题，而生
物大分子结构与功能的研究，必须首先
解决生物大分子的制备问题，有能够达
到足够纯度的生物大分子的制备工作为
前题，结构与功能的研究就无从谈起。
然而生物大分子的分离纯化与制备是一
件十分细致而困难的工作。
? 与化学产品的分离制备相比较, 生物大分子的制
备有以下主要特点,
? ⑴生物材料的组成极其 复杂,常常包含有数百种
乃至几千种化合物。
? ⑵许多生物大分子在生物材料中的 含量极微,分
离纯化的步骤繁多，流程长。
? ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时
就极 易失活,因此分离过程中如何防止其失活，就
是生物大分子提取制备最困难之处。
? ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，
温度,pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种
组成的综合影响，很难准确估计和判断。 (影响因
素多 )
? 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行,
? 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目
的产物的物理化学性质。
? 根据实验目的，建立相应的可靠的分析测定、及
制备方法，这是制备生物大分子的关键。
生物材料的破碎 和预处理。
分离 纯化方案 的选择和探索，这是最困难的过
程。
生物大分子 制备物 的均一性（即纯度）的 鉴定 。
产物的浓缩，干燥和 保存 。
大蒜 SOD的提取及活性测定
? 试验目的,
（ 1）掌握 SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（ 2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯
化倍数。
（ 3）掌握离心机的使用。
? 实验原理,P64,
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出 O2-,生
成带色的中间产物,在 420nm有最大吸收峰。邻苯
三酚自氧化产生的中间产物在 40s-3min这段时间，
生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深 → SOD逐渐增多 → 颜色浅，即酶活力越大，
颜色越浅。
? 试验试剂,
大蒜
磷酸缓冲液（ PH7.8,0.05mol/l)(PH8.3)
氯仿 —乙 醇混合液
冷丙酮
邻苯三酚
浓盐酸
? 操作步骤,
1,SOD提取：称取 5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，
加入 15ml的 PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌 20分
钟，使 SOD充分溶解,6000rpm离心，弃去沉淀，得上清
液。 (留出 1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录 )
大蒜 SOD的提取及活性测定
? 2、除杂蛋白,提取液加入 1/4体积的氯仿－乙
醇混合液搅拌 10分钟,6000rpm离心 15min去沉
淀，得粗酶液。（取 1ml粗酶液备用,精确测量
剩余粗酶液体积）
? 3,SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入
等体积的冷丙酮，搅拌 15min,6000rpm离心
15min,得到 SOD酶沉淀。将沉淀 每管先加 2ml
磷酸缓冲液，溶解后在加 3ml混匀。 6000rpm离
心 15min,取上清得到 SOD酶液。取 1ml备用，
其余量取体积。
? 4,粗酶液活性测定 （ 邻苯三酚法 ）
提取液, 粗酶液, 酶液中 SOD活力检测, 具体步骤
如下 。
试剂 /ml 空白管 对照管 OD1 提取液 粗酶液 酶液
PH8.3缓
冲液 3 3 3 3 3
SOD提
取液 0 0 0.1 0.1 0.1
蒸馏水 2 1.8 1.7 1.7 1.7
室温放置 20min
邻苯三酚 0 0.2 0.2 0.2 0.2
加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时 4min,加一滴浓盐酸
停止反应,420nm测吸光值,
OD2
? 5、溶液中可溶性蛋白含量测定,
分别从 1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取 0.3ml
按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公
式计算蛋白质浓度,
提取液稀释,50 ×
粗酶液稀释,20 ×
酶液稀释,10 ×
蛋白质浓度 (mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) × 稀释倍数
? 6、计算,
酶活力单位 U/ml=2（ OD1-OD2）× 5/0.1
(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达
到 80%时的酶量 )
总活力 U=活力单位 × 总体积
比活力 U/mg=活力单位 /蛋白质浓度
纯化倍数 =粗酶液 (酶液 )比活力 /提取液比活力
回收率 =粗酶液 (酶液 )总活力 /提取液总活力
7,试验结果讨论,
