第 9章
微生物基因表达的调控
生物工程学院
车振明
自学
第 9章
微生物基因表达的调控
第 10章
微生物与基因工程
生物工程学院
车振明
是指对遗传信息的分子操作和施工,即把
分离到的或合成的基因经过改造,插入载体
中,导入宿主细胞内,使其扩增和表达,从而获
得大量基因产物,或者令生物表现出新的性状,
基因工程 （ genetic engineering） 或
重组 DNA技术 (recombinant DNA technology)
二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大
事件,推动了生物科学的迅猛发展,并带动了生
物技术产业的兴起,
（参见 P255）
微生物在基因工程的兴起和发展过
程中起着不可替代的作用！
（参见 P255）
“微生物与基因工程”
克隆技术是所向披靡的, 六脉神剑,
还是危机四伏的, 潘多拉盒,
99药学 --------99生物基地班
一、基因工程的基本过程
1,基因分离,
（参见 P256）
a）分别提取供体 DNA和载体 DNA
2,体外重组,
b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分
别切割供体和载体 DNA
在 DNA连接酶的作用下使具有相同粘性
末端的供体 DNA片段和载体连接,成为重组
载体。
第一节 基因工程概述
4,在特定的宿主中表达,得到基因工程产品
一、基因工程的基本过程
第一节 基因工程概述
3,重组载体的传递与筛选
用人工转化的方法将重组载体导入受体
细胞中,并通过一定的筛选标记筛选得到含
有目的外源片段的重组子,
二、基因工程的发展历史
对基因工程的建立与发展具有重要意义
的几项关键技术,
*DNA的特异切割
*DNA的分子克隆 (人工转化方法的建立 )
*DNA的快速测序
*聚合酶链式反应 (PCR) (DNA的体外扩增 )
*DNA合成技术
*DNA的定位诱变技术
（参见 P255）
三、微生物学与基因工程的关系
1)基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬
菌体改造而成 ；
2)基因工程所用工具酶绝大多数是从微生物中分离
纯化得到的；
3)将外源 DNA导入宿主细胞的人工转化方法,是在微
生物自然转化现象的基础上发展起来的；
4)微生物细胞是基因克隆的重要宿主，
5)微生物是基因产物的重要表达载体；
6)基因工程得以建立与发展的理论基础主要来自对
微生物的研究；
7)微生物的多样性,为基因工程提供了极其丰富而独
特的基因资源；
微生物学不仅为基因工程提供了
理论基础,
同时也提供了操作技术
（参见 P256）
第二节 微生物与基因工程工具酶
基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不
同微生物中分离和纯化而获得的,
一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
能识别双链 DNA分子的特定序列,并在识别位
点或其附近切割 DNA的一类内切酶,简称为限制
性酶 (restrition enzyme)。
在细菌细胞内限制性酶与 DNA甲基化酶共同
构成细菌的 限制 –修饰系统,利用限制酶降解进
入细胞内的外源 DNA,同时用甲基化酶修饰细菌
本身 DNA，以避免被酶降解。
（参见 P264）
1,命名与分类
取微生物属名的第一个字母和种名的头
两个字母组成三个斜体字母加以表示,遇有
株名,再加在后面,如果同一菌株先后发现几
个不同的酶,则用罗马数字加以表示,
EcoRI
表示大肠杆菌属名第一个字母E:
表示种名头两个字母Co:
表示株名R：
表示该菌中第一个被分离出来的酶。I：
根据限制酶识别和切割 DNA的特点,可将限
制酶分为,I,II,III三种类型
I型和 III型限制酶无切割特异性或特异性不强,
II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附
近，特异性最强,
2,限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列通常由 4～ 8个碱基对组成,具有二重
旋转对称轴,序列呈回文结构
(palindromic structure).
所有限制酶切割 DNA后,均产生含 5?磷酸基和
3?羟基的末端
Hind III的识别序列,5`-A A G C T T-3`3`-T T C G A A-5`
5`-A A G C T T-3`
3`-T T C G A A-5`
切割后形成具有粘性末端 （ cohesive end）
的 DNA片段
限制性酶不在识别序列的对称轴上切割,而
是交错切割结果形成 5?或 3?单链突出的粘性末
端的 DNA限制片段 。
二个具有互相匹配的粘性末端的 DNA片段可
以通过碱基的互补及 DNA连接酶的作用而重新
连接起来。
HpaI的识别序列, 5` - G T T A A C - 3`
3` - C A A T T G - 5`
5` - G T T A A C - 3`
3` - C A A T T G - 5`
切割后形成具有平末端 (blunt end)的 DNA片段,
限制酶在识别序列的对称轴上切割,形成的
DNA片段没有突出的单链,
具有平末端的 DNA片段 也可以在 DNA连接酶 的
作用 连接 起来
不同的限制性核酸内切酶识别 DNA中的碱
基对序列长短不同,在随机排列的 DNA序列中,
识别位点序列长的限制酶,在酶切后所得到的
DNA片段长,相反识别位点序列短的限制酶,酶
切后所得到 DNA片段短。
3,同裂酶 （ Isoschizomers）
有些来源不同的限制酶却识别和切割相
同的序列,这类限制酶称为同裂酶,同裂酶产
生同样切割,形成同样的末端,酶切后所得到
的 DNA片段经连接后所形成重组序列,仍可能
被原来的限制酶所切割,同裂酶的反应条件可
能存在差异。
4,同尾酶 (Isocaudomers)
有些来源不同的限制酶,识别及切割序列各不相同,
但却能产生出相同的粘性末端,这类限制酶称为同尾
酶,但两种同尾酶切割形成的 DNA片段经连接后所形
成的重组序列,不能被原来的限制酶所识别和切割,
MunI：
5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
EcoRI：
5` - G A A T T C - 3`
3` - C T T A A G - 5`
5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
5` - G A A T T C - 3`
3` - C T T A A G - 5`
重新连接后的序列, 5` - C A A T T C - 3`3` - G T T A A G - 5`
二,DNA连接酶 （ DNA ligase）
T4 DNA连接酶
大肠杆菌 DNA连接酶
在体外将目的基因和载体共价
连接构成
重组 DNA分子
（参见 P266）
三、其它
DNA聚合酶, 从大肠杆菌中提取,用于体外合
成 DNA.
碱性磷酸脂酶,用于 DNA连接时对载体的某段
末端进行修饰,以减少载体的
自身环化,
核酸外切酶, 用于 DNA的缺失分析,
单链核酸内切酶, 用于修饰粘性末端及进行
DNA结构分析,
第三节 微生物与克隆载体
以扩增外源 DNA为目的载体 ----克隆载体
（ cloning vector）
作为克隆载体的基本：
1)载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制
2)载体应具有若干限制酶的单一切割位点,便
于外源 DNA的插入
3)载体必须具有可供选择的遗传标记
4)载体 DNA须易于生长和操作
（参见 P257）
基因工程的常用载体：
质粒载体
λ噬菌体载体
柯斯质粒载体
M13噬菌体载体
真核细胞的克隆载体
人工染色体
噬菌粒载体
一、质粒克隆载体
a）低分子量有利于 DNA的分离和操作；
特点,
b）具有较高拷贝数；
c）易于导入细胞；
d）具有安全性；
质粒载体克隆外源 DNA片段的大小一般
不超过 15Kb
二,λ噬菌体克隆载体
将野生型 λ 噬菌体 DNA进行改造后建成,主要是去
掉噬菌体 DNA上过多的常用限制酶的酶切位点,及对
非必要基因区域进行改造,
特点：
1) 它的分子遗传学背景十分清楚,
2)λ 噬菌体载体的容量较大,一般质粒载体只能容纳
10多个 kb.而 λ 噬菌体载体却能容纳大约 23kb的外
源 DNA片段,
3) 具有较高的感染效率,其感染宿主细胞的效率几乎
可达 100％,而质粒 DNA的转化率却只有 0.1％,
4) 和质粒相比,λ 噬菌体具有更为狭窄的寄主范围,
因此更加安全,
（参见 P260）
与溶原性相关的基因可以被外源 DNA取代而
不影响 λ 噬菌体 的感染、复制和裂解宿主
细胞的能力。
经过体外基因操作和包装后形
成重组噬菌体,可以通过正常的
感染途径进入宿主细胞；
重组噬菌体 DNA也可不经过体
外包装而直接通过转染 (转化 )方
式进入宿细胞；
质粒和噬菌体载体
都可用于构建基因
文库 ;
但后者更有优势：
容纳的外源 DNA片
段较大；以感染途
径进入宿主细胞的
效率比转化高 ;
三、柯斯质粒载体 柯斯质粒载体
(cosmid vector)，
又称粘粒，是由 λ
噬菌体的粘性末端
和质粒构建而成。
Cosmid
(cos site-carrying
plasmid)
带有粘性末端位点
( cos)的质粒
（参见 P260）
特点：
1)具有 λ噬菌体的特性,在克隆了外源片段后
可在体外被包装成噬菌体颗粒,高效地感染对
λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞,进入寄主的柯
斯质粒 DNA分子,按照 λ噬菌体 DNA的方式环
化 m但无法按噬菌体的方式生活,更无法形成子
代噬菌体颗粒。
2)具有质粒载体的特性,在寄主细胞内如质粒
一样进行复制,携带有抗性基因和克隆位点,并
具氯霉素扩增效应。
（参见 P260）
柯斯质粒用于克隆大片段的 DNA分子特
别有效,而这种特性对于研究高等生物的
基因组十分重要。
3)具有高容量的克隆能力,柯斯质粒本身一般
只有 5～ 7kb左右,而它克隆外源 DNA片段的极
限值竟高达 45kb,远远超过质粒载体及 λ噬菌
体载体的克隆能力,同时,由于包装限制,柯斯质
粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值,例
如,5 kb大小的柯斯质粒载体,插入的外源片段
至少不能小于 30 kb.
（参见 P260）四,M13噬菌体载体
M13是大肠杆菌丝状噬菌体,其基因组为环
状 ssDNA,大小为 6407bp
2) 进入细胞后,转变成复制型 (RF) dsDNA,然后
以滚环方式复制出 ssDNA.每当复制出单位长度
正链,即被切出和环化,并被立即组装成子代噬
菌体和以出芽方式 （ 即宿主细胞不被裂解 )被
释放至胞外,
1) 通过性毛感染雄性 （ F+或 Hfr） 大肠杆菌
或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞
生活史：
M13克隆载体是对野生
型 M13进行改造后建成,其
特点是虽然克隆外源 DNA
的能力较小,一般只适于克
隆 300～ 400bp的外源 DNA片
段,但特别适合用于制备克
隆基因的单链 DNA。
主要被用于制备测序用
单链 DNA模板、特异的单
链 DNA探针,进行定位诱变
等,也可用于噬菌体展示
（ phage display）,(见 P286)
（参见
P260）
五、噬菌粒载体 （参见 P261）
丝状噬菌体和质粒
载体 DNA融合而成,
兼有两者优点。
五
、
噬
菌
粒
载
体
（参见
P261）
六、真核生物的克隆载体
真核生物基因调控以及真核基因产物转录
及翻译后的加工等问题,单用原核生物载体所
很难解决,
现在常用的真核生物载体,主要有以下二大类,
1）酵母质粒载体
2）真核生物病毒载体
（参见 P262）
六,人工染色体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)
细菌人工染色体 (bacteria artificial chromosome,BAC)
人工染色体的最大特点是克隆外源 DNA能力
非常大,例如一个 YAC可插入长达 1000 kb以上
DNA片段,BAC的外源 DNA插入量为 300 kb,特别
适合于对结构复杂的高等生物的基因组进行分
析,在人类基因组研究中正被广泛应用。
（参见 P263）
第四节 微生物作为克隆载体的宿主
一、宿主的基本要求与性质
① 能够高效吸收外源 DNA；
② 具有使外源 DNA进行高效复制的酶系统；
③ 不具有限制修饰系统；
④ 不具有 DNA重组系统,常用重组缺陷型 (RecA-)；
⑤ 便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；
⑥ 具有安全性,宿主细胞应该对人、畜,农作
物 无害或无致病性等。
（参见 P266）
二、常用的基因工程宿主
1）大肠杆菌
3）酿酒酵母
2）枯草芽孢杆菌
特点,生长迅速、极易培养、能在廉价
培养基中生长，遗传学及分子生
物学背景十分清楚,
4）动物细胞
三、外源 DNA导如入宿主细胞
四,基因文库与 cDNA文库的构建
五,重组体的筛选与鉴定
自学！
第五节 基因工程的常用技术和方法
一,PCR的原理和应用
聚合酶链式反应
（ polymerase chain reaction,PCR）
1．原理
特点,在体外模拟细胞内进行的
DNA复制过程,
（ Mullis,1984）
（参见 P277）
1)变性 (denaturation):模板 DNA经热变性,双链
被解开,成为两条单链。
2)退火 (annealing):温度下降,变性 DNA复姓,使
寡核苷酸引物即与模板 DNA中所要扩增序
列两端的碱基配对。
3)延伸 (extension):在适宜条件下 (包括 DNA聚
合酶和核苷酸单体 ),引物 3? 端向前延伸,
合成与模板碱基序列完全互补的 DNA链。
4)重复变性、退火和延伸三步操作,DNA片
段呈 2的指数增长,在 1－ 2小时内重复 25－
30次循环,扩增的 DNA片段拷贝数可增加至
106～ 107倍。
2,PCR技术的关键酶 ------DNA聚合酶
1)Klenow聚合酶 (大肠杆菌 DNA聚合酶片段 )
2)Taq DNA聚合酶 (水生栖热菌（ Thermus
aquaticus)中分离,1988年萨奇 (R.K.SaiKi))
3)pfu DNA聚合酶 (火球菌 (Pyrococcus Furiosus)
中分离 )
4)Vent DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis)
（参见 P279）
本章其它有关内容
自学
思考题,
1）基因工程的基本步骤是怎样的？
其中哪些需涉及到微生物的参与？
2）为什么说微生物学不仅为基因工程
提供了理论基础，同时也提供了操
作技术？
微生物基因表达的调控
生物工程学院
车振明
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第 9章
微生物基因表达的调控
第 10章
微生物与基因工程
生物工程学院
车振明
是指对遗传信息的分子操作和施工,即把
分离到的或合成的基因经过改造,插入载体
中,导入宿主细胞内,使其扩增和表达,从而获
得大量基因产物,或者令生物表现出新的性状,
基因工程 （ genetic engineering） 或
重组 DNA技术 (recombinant DNA technology)
二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大
事件,推动了生物科学的迅猛发展,并带动了生
物技术产业的兴起,
（参见 P255）
微生物在基因工程的兴起和发展过
程中起着不可替代的作用！
（参见 P255）
“微生物与基因工程”
克隆技术是所向披靡的, 六脉神剑,
还是危机四伏的, 潘多拉盒,
99药学 --------99生物基地班
一、基因工程的基本过程
1,基因分离,
（参见 P256）
a）分别提取供体 DNA和载体 DNA
2,体外重组,
b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分
别切割供体和载体 DNA
在 DNA连接酶的作用下使具有相同粘性
末端的供体 DNA片段和载体连接,成为重组
载体。
第一节 基因工程概述
4,在特定的宿主中表达,得到基因工程产品
一、基因工程的基本过程
第一节 基因工程概述
3,重组载体的传递与筛选
用人工转化的方法将重组载体导入受体
细胞中,并通过一定的筛选标记筛选得到含
有目的外源片段的重组子,
二、基因工程的发展历史
对基因工程的建立与发展具有重要意义
的几项关键技术,
*DNA的特异切割
*DNA的分子克隆 (人工转化方法的建立 )
*DNA的快速测序
*聚合酶链式反应 (PCR) (DNA的体外扩增 )
*DNA合成技术
*DNA的定位诱变技术
（参见 P255）
三、微生物学与基因工程的关系
1)基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬
菌体改造而成 ；
2)基因工程所用工具酶绝大多数是从微生物中分离
纯化得到的；
3)将外源 DNA导入宿主细胞的人工转化方法,是在微
生物自然转化现象的基础上发展起来的；
4)微生物细胞是基因克隆的重要宿主，
5)微生物是基因产物的重要表达载体；
6)基因工程得以建立与发展的理论基础主要来自对
微生物的研究；
7)微生物的多样性,为基因工程提供了极其丰富而独
特的基因资源；
微生物学不仅为基因工程提供了
理论基础,
同时也提供了操作技术
（参见 P256）
第二节 微生物与基因工程工具酶
基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不
同微生物中分离和纯化而获得的,
一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
能识别双链 DNA分子的特定序列,并在识别位
点或其附近切割 DNA的一类内切酶,简称为限制
性酶 (restrition enzyme)。
在细菌细胞内限制性酶与 DNA甲基化酶共同
构成细菌的 限制 –修饰系统,利用限制酶降解进
入细胞内的外源 DNA,同时用甲基化酶修饰细菌
本身 DNA，以避免被酶降解。
（参见 P264）
1,命名与分类
取微生物属名的第一个字母和种名的头
两个字母组成三个斜体字母加以表示,遇有
株名,再加在后面,如果同一菌株先后发现几
个不同的酶,则用罗马数字加以表示,
EcoRI
表示大肠杆菌属名第一个字母E:
表示种名头两个字母Co:
表示株名R：
表示该菌中第一个被分离出来的酶。I：
根据限制酶识别和切割 DNA的特点,可将限
制酶分为,I,II,III三种类型
I型和 III型限制酶无切割特异性或特异性不强,
II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附
近，特异性最强,
2,限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列通常由 4～ 8个碱基对组成,具有二重
旋转对称轴,序列呈回文结构
(palindromic structure).
所有限制酶切割 DNA后,均产生含 5?磷酸基和
3?羟基的末端
Hind III的识别序列,5`-A A G C T T-3`3`-T T C G A A-5`
5`-A A G C T T-3`
3`-T T C G A A-5`
切割后形成具有粘性末端 （ cohesive end）
的 DNA片段
限制性酶不在识别序列的对称轴上切割,而
是交错切割结果形成 5?或 3?单链突出的粘性末
端的 DNA限制片段 。
二个具有互相匹配的粘性末端的 DNA片段可
以通过碱基的互补及 DNA连接酶的作用而重新
连接起来。
HpaI的识别序列, 5` - G T T A A C - 3`
3` - C A A T T G - 5`
5` - G T T A A C - 3`
3` - C A A T T G - 5`
切割后形成具有平末端 (blunt end)的 DNA片段,
限制酶在识别序列的对称轴上切割,形成的
DNA片段没有突出的单链,
具有平末端的 DNA片段 也可以在 DNA连接酶 的
作用 连接 起来
不同的限制性核酸内切酶识别 DNA中的碱
基对序列长短不同,在随机排列的 DNA序列中,
识别位点序列长的限制酶,在酶切后所得到的
DNA片段长,相反识别位点序列短的限制酶,酶
切后所得到 DNA片段短。
3,同裂酶 （ Isoschizomers）
有些来源不同的限制酶却识别和切割相
同的序列,这类限制酶称为同裂酶,同裂酶产
生同样切割,形成同样的末端,酶切后所得到
的 DNA片段经连接后所形成重组序列,仍可能
被原来的限制酶所切割,同裂酶的反应条件可
能存在差异。
4,同尾酶 (Isocaudomers)
有些来源不同的限制酶,识别及切割序列各不相同,
但却能产生出相同的粘性末端,这类限制酶称为同尾
酶,但两种同尾酶切割形成的 DNA片段经连接后所形
成的重组序列,不能被原来的限制酶所识别和切割,
MunI：
5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
EcoRI：
5` - G A A T T C - 3`
3` - C T T A A G - 5`
5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
5` - G A A T T C - 3`
3` - C T T A A G - 5`
重新连接后的序列, 5` - C A A T T C - 3`3` - G T T A A G - 5`
二,DNA连接酶 （ DNA ligase）
T4 DNA连接酶
大肠杆菌 DNA连接酶
在体外将目的基因和载体共价
连接构成
重组 DNA分子
（参见 P266）
三、其它
DNA聚合酶, 从大肠杆菌中提取,用于体外合
成 DNA.
碱性磷酸脂酶,用于 DNA连接时对载体的某段
末端进行修饰,以减少载体的
自身环化,
核酸外切酶, 用于 DNA的缺失分析,
单链核酸内切酶, 用于修饰粘性末端及进行
DNA结构分析,
第三节 微生物与克隆载体
以扩增外源 DNA为目的载体 ----克隆载体
（ cloning vector）
作为克隆载体的基本：
1)载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制
2)载体应具有若干限制酶的单一切割位点,便
于外源 DNA的插入
3)载体必须具有可供选择的遗传标记
4)载体 DNA须易于生长和操作
（参见 P257）
基因工程的常用载体：
质粒载体
λ噬菌体载体
柯斯质粒载体
M13噬菌体载体
真核细胞的克隆载体
人工染色体
噬菌粒载体
一、质粒克隆载体
a）低分子量有利于 DNA的分离和操作；
特点,
b）具有较高拷贝数；
c）易于导入细胞；
d）具有安全性；
质粒载体克隆外源 DNA片段的大小一般
不超过 15Kb
二,λ噬菌体克隆载体
将野生型 λ 噬菌体 DNA进行改造后建成,主要是去
掉噬菌体 DNA上过多的常用限制酶的酶切位点,及对
非必要基因区域进行改造,
特点：
1) 它的分子遗传学背景十分清楚,
2)λ 噬菌体载体的容量较大,一般质粒载体只能容纳
10多个 kb.而 λ 噬菌体载体却能容纳大约 23kb的外
源 DNA片段,
3) 具有较高的感染效率,其感染宿主细胞的效率几乎
可达 100％,而质粒 DNA的转化率却只有 0.1％,
4) 和质粒相比,λ 噬菌体具有更为狭窄的寄主范围,
因此更加安全,
（参见 P260）
与溶原性相关的基因可以被外源 DNA取代而
不影响 λ 噬菌体 的感染、复制和裂解宿主
细胞的能力。
经过体外基因操作和包装后形
成重组噬菌体,可以通过正常的
感染途径进入宿主细胞；
重组噬菌体 DNA也可不经过体
外包装而直接通过转染 (转化 )方
式进入宿细胞；
质粒和噬菌体载体
都可用于构建基因
文库 ;
但后者更有优势：
容纳的外源 DNA片
段较大；以感染途
径进入宿主细胞的
效率比转化高 ;
三、柯斯质粒载体 柯斯质粒载体
(cosmid vector)，
又称粘粒，是由 λ
噬菌体的粘性末端
和质粒构建而成。
Cosmid
(cos site-carrying
plasmid)
带有粘性末端位点
( cos)的质粒
（参见 P260）
特点：
1)具有 λ噬菌体的特性,在克隆了外源片段后
可在体外被包装成噬菌体颗粒,高效地感染对
λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞,进入寄主的柯
斯质粒 DNA分子,按照 λ噬菌体 DNA的方式环
化 m但无法按噬菌体的方式生活,更无法形成子
代噬菌体颗粒。
2)具有质粒载体的特性,在寄主细胞内如质粒
一样进行复制,携带有抗性基因和克隆位点,并
具氯霉素扩增效应。
（参见 P260）
柯斯质粒用于克隆大片段的 DNA分子特
别有效,而这种特性对于研究高等生物的
基因组十分重要。
3)具有高容量的克隆能力,柯斯质粒本身一般
只有 5～ 7kb左右,而它克隆外源 DNA片段的极
限值竟高达 45kb,远远超过质粒载体及 λ噬菌
体载体的克隆能力,同时,由于包装限制,柯斯质
粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值,例
如,5 kb大小的柯斯质粒载体,插入的外源片段
至少不能小于 30 kb.
（参见 P260）四,M13噬菌体载体
M13是大肠杆菌丝状噬菌体,其基因组为环
状 ssDNA,大小为 6407bp
2) 进入细胞后,转变成复制型 (RF) dsDNA,然后
以滚环方式复制出 ssDNA.每当复制出单位长度
正链,即被切出和环化,并被立即组装成子代噬
菌体和以出芽方式 （ 即宿主细胞不被裂解 )被
释放至胞外,
1) 通过性毛感染雄性 （ F+或 Hfr） 大肠杆菌
或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞
生活史：
M13克隆载体是对野生
型 M13进行改造后建成,其
特点是虽然克隆外源 DNA
的能力较小,一般只适于克
隆 300～ 400bp的外源 DNA片
段,但特别适合用于制备克
隆基因的单链 DNA。
主要被用于制备测序用
单链 DNA模板、特异的单
链 DNA探针,进行定位诱变
等,也可用于噬菌体展示
（ phage display）,(见 P286)
（参见
P260）
五、噬菌粒载体 （参见 P261）
丝状噬菌体和质粒
载体 DNA融合而成,
兼有两者优点。
五
、
噬
菌
粒
载
体
（参见
P261）
六、真核生物的克隆载体
真核生物基因调控以及真核基因产物转录
及翻译后的加工等问题,单用原核生物载体所
很难解决,
现在常用的真核生物载体,主要有以下二大类,
1）酵母质粒载体
2）真核生物病毒载体
（参见 P262）
六,人工染色体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)
细菌人工染色体 (bacteria artificial chromosome,BAC)
人工染色体的最大特点是克隆外源 DNA能力
非常大,例如一个 YAC可插入长达 1000 kb以上
DNA片段,BAC的外源 DNA插入量为 300 kb,特别
适合于对结构复杂的高等生物的基因组进行分
析,在人类基因组研究中正被广泛应用。
（参见 P263）
第四节 微生物作为克隆载体的宿主
一、宿主的基本要求与性质
① 能够高效吸收外源 DNA；
② 具有使外源 DNA进行高效复制的酶系统；
③ 不具有限制修饰系统；
④ 不具有 DNA重组系统,常用重组缺陷型 (RecA-)；
⑤ 便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；
⑥ 具有安全性,宿主细胞应该对人、畜,农作
物 无害或无致病性等。
（参见 P266）
二、常用的基因工程宿主
1）大肠杆菌
3）酿酒酵母
2）枯草芽孢杆菌
特点,生长迅速、极易培养、能在廉价
培养基中生长，遗传学及分子生
物学背景十分清楚,
4）动物细胞
三、外源 DNA导如入宿主细胞
四,基因文库与 cDNA文库的构建
五,重组体的筛选与鉴定
自学！
第五节 基因工程的常用技术和方法
一,PCR的原理和应用
聚合酶链式反应
（ polymerase chain reaction,PCR）
1．原理
特点,在体外模拟细胞内进行的
DNA复制过程,
（ Mullis,1984）
（参见 P277）
1)变性 (denaturation):模板 DNA经热变性,双链
被解开,成为两条单链。
2)退火 (annealing):温度下降,变性 DNA复姓,使
寡核苷酸引物即与模板 DNA中所要扩增序
列两端的碱基配对。
3)延伸 (extension):在适宜条件下 (包括 DNA聚
合酶和核苷酸单体 ),引物 3? 端向前延伸,
合成与模板碱基序列完全互补的 DNA链。
4)重复变性、退火和延伸三步操作,DNA片
段呈 2的指数增长,在 1－ 2小时内重复 25－
30次循环,扩增的 DNA片段拷贝数可增加至
106～ 107倍。
2,PCR技术的关键酶 ------DNA聚合酶
1)Klenow聚合酶 (大肠杆菌 DNA聚合酶片段 )
2)Taq DNA聚合酶 (水生栖热菌（ Thermus
aquaticus)中分离,1988年萨奇 (R.K.SaiKi))
3)pfu DNA聚合酶 (火球菌 (Pyrococcus Furiosus)
中分离 )
4)Vent DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis)
（参见 P279）
本章其它有关内容
自学
思考题,
1）基因工程的基本步骤是怎样的？
其中哪些需涉及到微生物的参与？
2）为什么说微生物学不仅为基因工程
提供了理论基础，同时也提供了操
作技术？
