基因操作主要技术原理
basic principles of gene
manipulation
目的基因的表达
? 制备大量目的基因片段
? 重组 DNA
? 宿主细胞
? 重组子的筛选
? 表达蛋白的收集,纯化
鉴定目的基因 (凝胶电泳, 测序, 核酸杂交 )
转化
抗生素筛选,或蓝白斑筛选
PCR
1.基因扩增 gene amplification
? 基因扩增的定义
? PCR技术的基本原理和特点
? 影响因素
? PCR技术的研究应用
? PCR扩增效率的指标,
有效性、特异性、忠实性
Th e Nobe l Priz e in Che m is tr y 1 9 9 3
" fo r c o n tr i b u ti o n s t o th e d e v e l o p m e n ts o f m e th o d s
w i th i n DN A - b a s e d c h e m i s try "
" fo r h i s i n v e n t i o n o f t h e p o l y m e ra s e c h a i n r e a c ti o n (PCR ) m e t h o d "
Kar y B,M ul lis
La J ol l a,CA,USA
B:1 9 4 4
2.核酸凝胶电泳
gel electrophoresis
? 基本原理
电泳迁移率
凝胶的分辨能力
溴化乙锭 (ethidium bromide,EtBr)
? 用途, 可用于分离、鉴定、纯化 DNA
? 脉冲电场凝胶电泳 (pulsed-field gel
electrophoresis,PFGE)
3.DNA核苷酸序列分析
?Sanger双脱氧链终止法
基本原理
Sanger双脱氧 -M13体系 DNA序列分析法
? Maxam-Gilbert化学修饰法
基本原理
?两种测序方法的比较
? DNA序列分析的自动化
4.核酸分子杂交
? 基本原理
? 用途,
DNA/DNA的杂交,可用于检测特定生物之
间是否存在着亲缘关系 ;
DNA/RNA的杂交,可揭示核酸片段中某一
特定基因的位置
? 实验步骤,
核酸印迹转移
电泳凝胶核酸印迹法
斑点和狭线印迹法 (dot and slot blotting)
菌落和噬菌斑印迹法 (colony and plaque
blotting)
印记杂交
Southern blotting
Northern blotting
diagram
5.细菌转化 (transformation)
? 基本原理 diagram
感受态 (competence)出现的 机制
? 过程
? 用途, 是获得新的遗传性状的一种手段,是微
生物遗传、分子遗传、基因工程等领域的基
本实验技术
? 人工诱导感受态的方法,
? ① 利用 Ca2+和改变温度的方法,这在大肠杆菌中常用到。
? ② PEG介导的转化,利用聚乙二醇( PEG)改变原生质体
表面的电荷特性,使得细胞容易吸收 DNA/质粒,在等渗溶
液中使转化子再生。
? ③ 电转化 ( 电穿孔法 ),其原理是用高压脉冲电流击破细胞
膜或形成小孔, 使得 DNA大分子进入细胞 。 当电场强度, 脉
冲强度以一定的组合造成细胞 50-75%的死亡率时, 转化水
平最高, 转化率是人工制备感受态细胞转化率的 10-20倍 。
? ④ Biolistic(基因枪 )转化, 将包裹有 DNA的钨粒象子弹一样
高压射入细胞或细胞器。
Thank you for your attention
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目的基因的表达
? 制备大量目的基因片段
? 重组 DNA
? 宿主细胞
? 重组子的筛选
? 表达蛋白的收集,纯化
鉴定目的基因 (凝胶电泳, 测序, 核酸杂交 )
转化
抗生素筛选,或蓝白斑筛选
PCR
1.基因扩增 gene amplification
? 基因扩增的定义
? PCR技术的基本原理和特点
? 影响因素
? PCR技术的研究应用
? PCR扩增效率的指标,
有效性、特异性、忠实性
Th e Nobe l Priz e in Che m is tr y 1 9 9 3
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2.核酸凝胶电泳
gel electrophoresis
? 基本原理
电泳迁移率
凝胶的分辨能力
溴化乙锭 (ethidium bromide,EtBr)
? 用途, 可用于分离、鉴定、纯化 DNA
? 脉冲电场凝胶电泳 (pulsed-field gel
electrophoresis,PFGE)
3.DNA核苷酸序列分析
?Sanger双脱氧链终止法
基本原理
Sanger双脱氧 -M13体系 DNA序列分析法
? Maxam-Gilbert化学修饰法
基本原理
?两种测序方法的比较
? DNA序列分析的自动化
4.核酸分子杂交
? 基本原理
? 用途,
DNA/DNA的杂交,可用于检测特定生物之
间是否存在着亲缘关系 ;
DNA/RNA的杂交,可揭示核酸片段中某一
特定基因的位置
? 实验步骤,
核酸印迹转移
电泳凝胶核酸印迹法
斑点和狭线印迹法 (dot and slot blotting)
菌落和噬菌斑印迹法 (colony and plaque
blotting)
印记杂交
Southern blotting
Northern blotting
diagram
5.细菌转化 (transformation)
? 基本原理 diagram
感受态 (competence)出现的 机制
? 过程
? 用途, 是获得新的遗传性状的一种手段,是微
生物遗传、分子遗传、基因工程等领域的基
本实验技术
? 人工诱导感受态的方法,
? ① 利用 Ca2+和改变温度的方法,这在大肠杆菌中常用到。
? ② PEG介导的转化,利用聚乙二醇( PEG)改变原生质体
表面的电荷特性,使得细胞容易吸收 DNA/质粒,在等渗溶
液中使转化子再生。
? ③ 电转化 ( 电穿孔法 ),其原理是用高压脉冲电流击破细胞
膜或形成小孔, 使得 DNA大分子进入细胞 。 当电场强度, 脉
冲强度以一定的组合造成细胞 50-75%的死亡率时, 转化水
平最高, 转化率是人工制备感受态细胞转化率的 10-20倍 。
? ④ Biolistic(基因枪 )转化, 将包裹有 DNA的钨粒象子弹一样
高压射入细胞或细胞器。
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