华东理工大学,酶工程》讲义
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第一章 概论
第一节 研究内容
一、概念
酶工程（ Enzyme Engineering）是随着酶学迅速发展，特别是应用通广，使酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学。从应用目的出发研究酶，就是在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。50年代，这一方面文章不超过10篇，60年代起迅速发展，当时日本研究就很活跃，现在仍是世界上领先国家之一。
二、应用领域
1969年，日本田边制药公司的一位科学家采用固定化氨基酰化酶，成功地将化学法合成的氨基酸转化成人体可以直接利用的氨基酸，成本只有传统工艺的60%，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。现在酶工程已深入各个领域。
⑴ 为工业生产锦上添花。
⑵ 环境卫士：利用聚丙乙烯，海藻酸钙包埋热带假丝酵母或者将假单孢菌固定在无烟煤颗粒上，形成一个固定化的薄膜，这种固定化反应器可以分解废水中的酚，几分钟内0.01%
降道0.0001%。
⑶ 生物传感器。
⑷ 医药上：尿激酶（有效溶血物质）。
⑸ 生物芯片。
三、研究内容
⒈ 酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶开发。
⒉ 酶生产中基因工程技术的应用。
⒊ 酶与细胞固定化。☆
⒋ 酶分子改造与化学修饰，以及酶结构与功能的研究。
⒌ 酶的应用性开发。
⒍ 酶反应器的研究（包括反应检测）
⒎ 酶抑制剂、激活剂开发及应用研究。☆
⒏ 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究☆
⒐ 非水相介质中酶的催化。☆
第二节 国内外酶制剂工业概况
一、国内外酶制剂生产及销售状况
二、我国酶制剂生产的不足点
⒈ 科研经费和技术力量投入不够，酶制剂的菌种产酶水平与国外有较大差距。
⒉ 酶的品种和品级系列存在差距。
⒊ 生产装备落后，提炼工艺研究重视不够。
三、我国酶制剂生产努力方向。
⒈ 增加科研投入
⒉ 开发活性专一菌株。
⒊ 研究新的分离技术，降低分离纯化成本。
第三节 生物芯片
一、生物芯片简介
（一）生物芯片的来源
（二）生物芯片的概念
生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流华东理工大学,酶工程》讲义
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体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。
（三）生物芯片技术主要包括四个基本要点
⒈ 芯片方阵的构建：芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上。
⒉ 样品的制备：生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。
⒊ 生物分子反应：生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率。
⒋ 信号的检测：芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，
通过扫描以获得有关生物信息。
（四）生物芯片的主要类型
生物芯片技术是一种高通量检测技术，它包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。
⒈ 基因芯片(Genechip)又称DNA芯片（DNAChip）。它是在基因探针的基础上研制出的，
所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，
然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。
基因芯片是生物芯片研究中，最先实现商品化的产品。目前，比较成熟的产品有检测基因突变的芯片，检测细胞基因表达水平的表达基因芯片。
⒉ 蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。如果加入与之特异性反应的带有特殊标记的蛋白质分子（抗体或抗原），两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。此种方法构建的模型所需蛋白质的量极少，
反应相对较快，蛋白质芯片稳定性较好，灵敏度较高，在临床检测方面大有发展。
⒊ 芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统，它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成，从而使现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化，属未来生物芯片的发展方向。
二、生物芯片的应用前景展望
生物芯片的成熟和应用一方面将为下个世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、
航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命；另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段，故必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台。
（一）基因芯片
它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。
这些应用主要包括基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图以及等方面。
⒈ 表达检测。人类基因组编码大约10万个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mRNA（信使RNA，可简单理解为基因表达的中介物）的实验工具很重要。有关对芯片技术检测基因表达及其敏感性、特异性进行的研究实验表明芯片技术易于监测非常大量的mRNAs并能敏感地反映基因表达中的微小变化。
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利用基因芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共157,112个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。
⒉ 寻找新基因。有关实验表明在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可用于基因发现，如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现的。
⒊ DNA测序。人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展，芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。如使用美国Affymetrix公司1998年生产出的带有13.5万个基因探针的芯片就可以使人类DNA解码速度提高了25倍。
核酸突变的检测及基因组多态性的分析。有关实验结果已经表明DNA芯片技术可快速、
准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析必将越来越重要。
（二）蛋白质芯片
蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。
人类基因组大规模测序工作接近尾声，以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临。蛋白质芯片作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具，必将发挥越来越大的作用。
美国Ciphergen公司的芯片能够从人体体液或组织中获取大量的微量蛋白质，以绘制捕获的蛋白质图谱。其第一代系统已经使用了两年，功效显著。蛋白质芯片可以准确而迅速地提供多标记蛋白质的“显性指纹”---一种比任何单个标记更有效的疾病阶段指示剂。在以往的实验中，Ciphergen公司的科学家们利用蛋白质芯片系统对来自健康个体和不同癌症阶段的患者的血清样本进行了研究。仅在三天内他们找到了6种前列腺癌的潜在标记，而利用以往的标准技术，发现和确定同样数量的潜在标记可能需要数月至数年的时间才能得到证明。
印度普度大学的科学家们宣布，他们已经率先研制成功一种蛋白质生物芯片，通过这种生物芯片，医生可以利用含有生物芯片的医疗设备迅速而准确地对一般疾病进行诊断并对某些化学治疗方法进行评估；它还可以帮助士兵在战场上探测到来自敌方的生化攻击；对农作物的病虫害进行探测并发出警告；同时它还能帮助科学家们对人们常用来治病的植物进行分析，看它们是否确实含有具治疗效果的化学成份，从而在此基础上研制并生产出新的药品。
（三）芯片实验室
美国普杜大学已开发出一种芯片实验室技术，将化学实验室的专用仪器缩微在芯片上，
芯片上的仪器缩小到常规仪器的千分之一甚至百万分之一。这项成果使科学家能在一块硅片上堆积几十个或几百“芯片实验室”，每个“实验室”都能进行复杂的化学分析，从而可减少很多化学和医学分析的费用，并提高效率。
三、生物芯片的研发和生产现状
（一）国际
美国Affymetrix公司是世界上最有影响的基因芯片开发制造商，该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，
拥有多项专例。
目前，国际上已经有许多从事生物芯片研究的公司，每家公司的芯片技术都各具特色，
应用目的也不尽相同，如加利福尼亚州森尼维尔的Hyseq公司,声称拥有最快的基因分析器,
它们由机器人制造,机器人把DNA探针滴到过滤纸上,其DNA阵具有优势,破译DNA的速度最华东理工大学,酶工程》讲义
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快。帕洛阿尔托的Syntenl公司声称它的芯片衡量细胞中基因活动最有效，公司正在利用基因芯片研究前列腺癌等疾病。圣迭戈的Nanogen公司计划进入诊断艾滋病毒和其它传染病的市场。Incyte制药公司与Affymetrix公司合作生产针对各种疾病的基因分析芯片供药品研究使用。
但是，基因芯片要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有一些关键问题亟待解决如(1)基因芯片的特异性的提高；(2)样品制备和标记操作的简化；(3)增加信号检测的灵敏度；(4)高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发。
（二）国内
⒈ 上海细胞所与陕西超群公司；⒉ 第四军医大与陕西高科集团；⒊ 联合基因科技公司与第一军医大；⒋ 清华大学生物芯片研发中心。
四、我国生物芯片产业化的前景
（一）市场
⒈ 药物筛选和新药开发。
⒉ 中药基因组学研究和我国的中药现代化。
中药基因组学的含义是通过现代科学技术手段结合传统中药理论和现代科学理论，将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达调控的影响关联起来，在分子水平上用现代基因组学，特别是功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中药理论及作用机理。
⒊ 疾病诊断
基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
人类所有疾病都直接、间接与基因有关，根据基因概念，人类疾病可分为三大类。第一类为单基因病。这类疾病已发现6000余种，其主要病因是某一特定基因的结构发生改变，
属于单基因病的如多指症、白化病、早老症等。第二类为多基因病。这类疾病的发生涉及两个以上基因的结构或表达调控的改变，如高血压、冠心病、糖尿病、哮喘病、骨质疏松症、
神经性疾病、原发性癫痫、肿瘤等。第三类为获得性基因病。这类疾病由病原微生物通过感染将其基因入侵到宿主基因引起。
⒋ 环境保护及其他
在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。基因芯片还可用于司法。另外芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，
也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场尚待开发。
（二）生产
⒈ 制造技术
基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、
准确的检测和分析。
⒉ 基因、蛋白质等前沿研究
对生物芯片工业来讲，除去制作技术外，关键就是芯片上放置的基因和蛋白质等物质了。
如果制作用于检测某人核苷酸多态性以诊断某种遗传病，或者用于基因测序，那么芯片探针上一般放置的是有8个碱基的寡聚核苷酸片段，基因芯片和蛋白质芯片则相应放置的是基因标志性片段EST（可表达的基因标志性cDNA序列片段，可以通过对mRNA的双端尾侧的几百个碱基进行测序得到）、全长基因或蛋白质。因此制作生物芯片首先要解决的是DNA探针、
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基因以及蛋白质的尽可能全面和快速的收集问题。
世界三大基因库分别是：人类基因克隆库；人类基因探针库；小鼠基因克隆及探针库。
目前基因芯片上面使用最多的是基因标志性片段EST，可以从公共数据库中查找获得。
DBEST是目前最大的一个公共数据库。
五、有关生物芯片的上市公司
目前为止，尚未有一家上市公司真正进入生物芯片领域并实现产业化生产，有关的上市公司都只是计划涉足、有重组进入的可能或处于前期科研阶段。这些公司分别是：张江高科、
上海医药、复星实业、哈高科、河池化工、友好集团、上实联合、星湖科技等公司。
第二章 酶学与酶工程
第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制
一、酶的分类
⒈ 氧化还原酶：脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等
⒉ 转移酶：酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等
⒊ 水解酶：脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶
⒋ 裂合酶：这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。
⒌ 异构酶：此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移、分子内裂解等
⒍ 接酶（合成酶）：这 类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、
C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。
二、酶的组成和结构特点
⒈ 单体酶
⒉ 寡聚酶
⒊ 多酶复合体
辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。
辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。
辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基。
三、酶的作用机制
⒈ 酶的作用过程
酶的活性部位：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
⒉ 酶与底物的结合模型
锁和钥匙模型；诱导锲合模型。
⒊ 酶的催化作用
⑴ 研究方法,
① 从非酶系统模式获得催化作用规律，其优点是反应简单，易于探究，其缺点是非酶系统与酶系统不同，其实验结果不一定完全适合于阐明酶的催化作用。
② 从酶的结构与功能研究中得到催化作用机理的证据。
⑵ 酶的催化作用
① 广义的酸碱催化：能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱
例：HA=A
-
+H
+
HA为酸，A
-
为碱
HA（酸）+A=AXH（酸催化） AXH+B
-
（碱）=Y+BH+A
-
（碱催化）
在酶蛋白中可以作为广义酸碱的功能基团见表。
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共价催化：底物与酶以共价方式形成中间物。这种中间物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提高催化反应速度。
共价催化的常见形式是酶的催化基团中亲核原子对底物的亲电子原子的攻击类似亲核试剂与亲电子试剂。
亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和电子的原子中心。带正电离子如Mg
2+
,NH3
4+
是亲电子的，含有-C=O及-C=N-基团的化合物也是亲电子的，其中的O 及N都有吸引电子的倾向，因而使得邻近的C原子缺乏电子。它发挥催化作用的步骤是从底物移去电子。
亲核试剂就是一种试剂具有强烈供给电子的原子中心。它发挥催化作用是由于它能供给底物一对电子。
③ 邻近效应及定向效应
所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。
④ 变形或张力
⑤ 酶的活性中心为疏水区域
第二节 酶作为催化剂的显著特点
一、催化能力
二、专一性
⒈ 对所作用的底物和催化的反应都是高度专一性
⒉ 催化反应的立体专一性
⒊ 调节性：① 酶浓度的调节；② 激素调节；③ 共价修饰调节；④ 限制性蛋白水解作用与酶活力调控；⑥ 反馈调节；⑦ 金属离子和其他小分子化合物的调节。
第三节 酶作用动力学
一、单底物酶促反应动力学（Michaelis-Menten学说）
酶和底物的作用是通过酶和底物生成复合物而进行的。底物浓度较低时，酶的活性中心未被饱和，反应速度随底物浓度上升而呈正相关。当底物浓度较高，酶的活性中心被饱和或趋于饱和时，反应速度增加率较小或不再增加。因为酶-底物复合物的生成速度相应较快，
而分解速度相对较慢，成为整个反应的限速步骤。
二、恒态假设
在初速度范围内，酶浓度远远低于底物浓度，则酶-底物络合物浓度也很低。除了反应和初期的瞬间，ES的变化速率相对于[P]而言可以忽略。形成的ES络合物维持恒态，即浓度保持不变，解离的速度与形成的速度相同。
三、King-Altman法
中间络合物超过两个以上时用此图解法，简便可靠。
要求将反应写成循环形式，使所有的含酶种类（包括E在内）互相转变展示出来，每步都用К表示，К是这步速度常数和有关游离底物浓度的乘积，如不涉及底物，那么只有速度常数，所以上式最后推导成,
一般来讲，这个方法大体包含下列几步,
第一，写出其反应历程的方程式，将品种不同的酶存在形成（Enzyme Specles）安排成封闭的几何图形，每一种酶存在形式作为几何图形的一角。
第二，写出n-1线的所有可能的图形，n 为几何图形的角数（即酶存在形式的数目），
它的n-1线图形的总数应为：m!/(n-1)!/(m-n+1)!式中m为完整的几何图形的线段数目。注意当反应历程构成的基本图形包含有不止一个封闭圈时，在写出n-1线图形时，必须把这些含有各种各样的封闭圈的图形除去。
第三，按照King-Altman图形可以写出每种酶存在形式的浓度和总酶浓度的比例，它们华东理工大学,酶工程》讲义
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具有基本上相似的表达式,
Ex/Et=若干项的加和/相同的分母
分子的每一项都由一个King-Altman图形构成，对于某一种特定的酶的存在形式，它的分子的每一项可以由King-Altman图形中每一根线所表示的由其他酶形式转变为这种形式的速度常数，或速度常数与配基浓度彼此相乘而得到。
第四节 影响反应速度的因素
一、酶浓度对反应速度的影响
在酶反应中，如果底物浓度足以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。由米氏方程推导：v=V[S]/(Km+[S])又V=K2[E]所以v=K2[S]/(Km+[S])*[E]
当[S]维持不变时，v正比于[E]。这里使用的酶必须是纯酶制剂或不含抑制剂的粗酶制剂。
二、PH对酶反应速度的影响
大部分酶的活性受其环境pH 的影响，有最适pH。
用酶活对pH作图，可得到钟罩形的曲线。酶的最适pH目前还只能用实验方法测得，随底物的浓度，温度和其它条件的变化而变化。PH对酶活的影响主要表现在以下几个方面,
⒈ pH的改变可以破坏酶的空间构象，引起酶活的丧失。这种失活作用或者是可逆的，
或者是不可逆的。
⒉ PH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程受到影响。
⒊ PH的改变影响活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合。
⒋ PH的改变影响底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物。
PH可以对游离酶或酶-底物复合物产生一定的效应，从而导致对酶反应的速度产生显著的影响，其机理相当复杂。
三、温度对酶反应速度的影响
当温度升高时，与一般的化学反应一样，反应速度加快。随着温度升高而使酶蛋白逐步变性，反应速度随之下降。酶反应存在着一个最适温度，反应速度对温度作图，所得曲线为钟罩形，顶点为最适温度，它受到作用时间、酶的浓度、底物、激活剂或抑制剂等因素的影响。在变性温度以内，温度对酶催化反应速度的影响也服从Arrhenius方程。温度每增加
10℃，酶催化反应的速度增加1-2倍。
四、抑制剂对酶反应速度的影响
第五节 酶抑制作用的概念和分类
一、概念
能降低酶催化反应速度的因素很多，通常将其分为失活作用和抑制剂作用两类。
⒈ 失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。
⒉ 抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。
⒊ 去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。抑制剂分子的全部或一部分通过非共价见键或共价键和酶结合，直接影响酶的催化作用。去激活作用通过去除金属离子而间接地影响酶的活性。当金属离子去除后，底物与酶的结合减少，实际上是降低了底物的有效浓度。
⒋ 阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化，而抑制作用是指一定量酶分华东理工大学,酶工程》讲义
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子催化效力的减少，不涉及酶分子合成的问题。
二、抑制程度的表示
一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示方法,
⒈ 相对活力分数（残余活力分数）a=Vi/Vo
⒉ 相对活力百分数（残余活力百分数） a%==Vi/Vo*100%
⒊ 抑制分数，指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo
⒋ 抑制百分数 i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%
通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。
三、抑制作用的分类
不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不可逆抑制作用）
可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）
四、抑制作用的定义
⒈ 不可逆抑制作用
抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。由于被抑制的酶分子受到不同程度的修饰，故不可逆抑制也就是酶的修饰抑制。
⒉ 可逆抑制作用,
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。这种抑制剂又可通过两种不同的方式与酶结合而抑制酶的活性。
⑴ 抑制剂与酶的活性中心相结合，阻断酶分子的结合基团或催化基团，或与酶-底物中间复合体结合，从而阻止底物形成产物。这类抑制剂在酶分子上的结合部位基本上和底物相同或相近，故称为同位抑制剂，这种抑制作用也就叫做同位抑制作用。
⑵ 抑制剂和酶分子活性中心以外的部位相结合，通过酶分子空间构象的改变，从而影响底物与酶的结合与酶的结合或酶的催化效率。由于抑制剂与酶的结合部位不同于底物的结合部位，故这种抑制剂称为别位抑制剂。为了表示其可引起酶的变构，也可译作别构抑制剂。
这类抑制作用也就叫作别构抑制作用。可引起别构作用的酶称位别构酶，别构酶大多是有一个亚基的寡聚体酶，将在下章予以详细介绍。而本章主要介绍同位抑制作用。
五、可逆抑制和不可逆抑制作用的鉴别
除了根据上述透析，过滤等物理方法视其能否去除抑制剂来区别不可逆抑制和可逆抑制作用外，还可以利用下列两种动力学方法来加鉴别。
⒈ 将不同量的酶加入含有等量底物和抑制剂的试管中，使各管的体积相等，测定酶促反应的初速度，并用酶浓度[E]对初速度V作图。当反应系统中不加抑制剂时，可得到一条通过零点得直线（直线a）。当反应系统中有一定量的不可逆抑制剂时，后者可抑制一定量的酶，只有当加入酶的摩尔数超过抑制剂的摩尔数，即尚有剩余的酶分子时，才能表现活力。而一旦具有活力后，其反应的初速度随酶量的增高程度应和无抑制剂时一样，故[E]对V作图时得到一条原点向右移而与直线a平行的直线b。当反应系统中含有一定量的可逆性抑制剂时，因抑制剂的量是恒定的，对酶的抑制分数也是恒定的，因此可得一通过零点但斜率较低的直线C。
⒉ 一定量的抑制剂先与一定量的酶保温一定时间后，
取出不同量的混合液加至等量的底物中，各管的体积也保持华东理工大学,酶工程》讲义
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相等，测定反应的初速度，也用酶浓度[E]对反应初速度V作图（图）。如果保温混合物中不加抑制剂，也得到一条通过零点的直线a。而当保温混合物中含有不可逆抑制剂时，后者使一定比例的酶受抑制，相当于减少混合物中酶的浓度，即使测活的各管中加入混合物的量不等，但其中有活性和无活性酶的比例相同，且因抑制剂不可逆，已灭活的酶不会因抑制剂的稀释而复活，故其抑制分数不变，[E] 对V的作图仍为一直线，唯其斜率较低（直线b）。
但当保温混合物中含有可逆抑制剂时，抑制剂和酶在测活系统中受到同样程度的稀释，加入混合物的体积逾大，稀释的倍数逾小，则抑制剂的浓度逾大，抑制程度也逾大，故可得到一条下弯的曲线C。
第六节 可逆抑制作用
一、竞争性抑制作用
⒈ 含义：较常见而重要的可逆性抑制，指抑制剂I
和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥。已结合S的ES复合体不能再结合I，已结合I的EI复合体也不能再结合S，故不可能存在IES三联复合体。可用右上的反应式表示,
当反应体系中加入I时，可破坏E和ES的平衡，使ES→E→EI，此时再增加S的浓度，
又可逆转而使EI→E→ES，故再酶量恒定的条件下，反应速度与[S]和[I]的比值有关。
⒉ 竞争性抑制的机理
竞争性抑制剂之所以能和底物竞争与酶结合并与底物互相排斥，常常由于抑制剂与底物在结构上有类似之处。当它与酶结合时，很可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，
从而阻断了底物和酶的结合，降低酶和底物的亲和力，即Ks增大。同样，底物和酶结合后，
也可阻碍抑制剂与酶蛋白上相同的基团结合。这就是抑制剂和底物互相竞争的原因。例如丙二酸和琥珀酸竞争而抑制琥珀酸脱氢酶，赖氨酸和精氨酸酶，都是由于抑制剂与底物结构相似的缘故。
⒊ 举例
某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用,
药物（抑制剂） 被抑制的酶 竞争底物 临床应用及机理
抗菌作用
磺胺药 二氢叶酸合成酶（细菌） 苯甲酸
（抑制四氢叶酸）
氨基蝶呤 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸 抗白血病
5-氟尿嘧啶 尿嘧啶核苷磷酸化酶 尿嘧啶 抗癌作用
（5-FU） （胸腺嘧啶核苷磷酸化酶）（胸腺嘧啶） （抑制核苷酸合成）
抗通风
别嘌呤醇 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤，次黄嘌呤
（抑制尿酸生成）
止血，抗纤溶
6-氨基已酸 纤溶酶 -赖氨酸-氨基酰
（抑制纤溶酶）
肾上腺素
苯丙胺（麻黄素）单胺氧化酶
（去甲肾上腺素）
中枢兴奋，抗哮喘
⒋ 过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示，
由于其能障小，和酶结合就紧密得多。如抑制剂的化学结构能类似过渡态底物，则其对酶的亲和力就会远大于底物，从而引起酶的强烈抑制。过渡态底物的类似物，它们大多数是竞争性抑制剂，对相应酶的Ki要比底物的Km小2-5个数量级，故其抑制效率比基态底物类似物高得多。
华东理工大学,酶工程》讲义
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二、反竞争性抑制
⒈ 概念：这类抑制剂I不和游离酶结合，只能和
ES中间复合物结合成EIS，但EIS不能释出产物。S和
E的结合不但不排斥I，反而促进了I和E的结合，可表示如右,
⒉ 举例：单底物酶的反竞争性抑制作用非常罕见，如芳香基硫酸基的肼解。氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用也属于反竞争性抑制。而多底物中反竞争抑制现象非常重要，，如双底物乒乓机制中，
任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性抑制剂。
别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，可抑制次黄嘌呤转变成黄嘌呤及尿酸。但别嘌呤也是黄嘌呤氧化酶的底物，可受此酶催化而变成氧嘌呤醇又称别黄嘌呤，后者是黄嘌呤氧化酶的非竞争性抑制剂。这是别嘌呤醇用于治疗痛风症（血中尿酸过多，沉积于软骨、肌腱等组织而引起关节炎的一种疾病）的原理。
三、混合型抑制
⒈ 含义：基本上和非竞争性抑制剂相似，S或I和E的结合互不相关，ES可再接I，IE也可再接S，但Ks不等于K′s，Ki
也不等于K′i,
⒉ 反应速度公式及作图
1/v=Km/Vm（1+[I]/Ki）*1/[S]+1/Vm（1+[I]/ Ki） 如左图
⒊ 动力学特点
⑴ 当有I存在时，Vm
减小，Km可大可小，在Vm
和Km均减小的情况下，Vm
的减小甚于Km的减小，故
Km/Vm增大。
⑵ Km和Vm的改变程度均与[I]成正比。
⑶ 抑制分数与[I]成正比，与[S]成正比
（Ki>K′i）或反比（Ki<K′i）
四、其他可逆抑制
⒈ 部分抑制：以上讨论的都是形成死端络合物的抑制，而这些复合物不会释放产物。假如混合型抑制中ESI复合物也能释放产物即为部分抑制。
⒉ 底物抑制：高浓度的底物会抑制自身转化为产物。
如琥珀酸脱氢酶，该反应需要底物的两个羧基同时与酶分子结合,
当底物浓度很高时，可能会产生以下情形,
所以反应不能发生，除非有一个分子解离，
反应才能进行，底物抑制特征,
⒊ 产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时存华东理工大学,酶工程》讲义
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在的，因此，考虑产物对反应速度的影响，可能具有一定的意义。
第七节 不可逆抑制作用
不可逆作用可分为非专一性和专一性两大类。
不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制，最后达到完全抑制。抑制剂的效应，应以速度常数表示，而不能以平衡常数表示，它决定于给定时间内某一浓度抑制剂所抑制酶活性分数。
一、非专一性的不可逆抑制作用
⒈ 概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。但某些非专一性抑制剂因作用条件不同，作用对象不同，或由于位阻效应以及活性部位其它基团的存在，也能显示专一性抑制效应。
⒉ 非专一性抑制剂的类型,
⑴ 酰化剂；可用通式表示为RC=O
⑵ 烃基化剂：R-X表示。如卤烃衍生物，由于卤原子的强电负性，使烃基带部分正电荷，有利于酶上的一些亲核基团的攻击。
⑶ 含活泼双键的试剂：含活泼双键的试剂，如N-乙基顺丁烯二酰亚胺、丙烯氰等。它们可与酶分子上的-SH、-NH2等基团起加成反应。
⑷ 亲电试剂：常见的有四硝基甲烷，它可使酶分子上的酪氨酸侧链硝基化。产物具有特殊光谱性质，易于被检测。
⑸ 氧化剂：一些二硫化合物可使酶分子上的-SH氧化。如酶分子上的甲硫氨酸的硫醚基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基等，都可在光敏剂存在下发生温和的光氧化作用，使酶失活。
⑹ 还原剂：以二硫键为必需基团的酶，可被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。
⒊ 通过非专一性不可逆抑制作用判断酶分子中必需基团的性质和数目
必需测定酶活力降低的反应速度常数和侧链基团被破坏的反应速度常数，比较它们之间的关系，并加以分析才能作出判断。邹承鲁教授创立了一种方法。他在测定抑制作用过程中酶活力剩余分数a的同时，又测定酶分子上某必需基团的剩余分数Le。他假定同类基团中如有n个是必需基团，而且所有这类基团与抑制剂反应活性相等，并且又只有n个必需基团都未被破坏的酶分子才能保持活性；那么某必需基团的剩余分数Le将会和该类基团总的剩余分数L相同。根据这些假定他得出,a=Len或a1/n=Le，并且a1/n=L，取对数得：lga=nlgL。
把lga对lgL作图得一直线，其斜率为n，从而求得该必需基团得数目。该判断酶分子中心必需基团数目得作图法，已被广泛应用于酶化学修饰的研究。
二、专一性不可逆抑制剂的类型
⒈ Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂具有与底物相似的可与酶结合的基团，同时还具有一个能与酶其它基团反应的活泼基团。它之所以有专一性，是由于此抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和它与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。从两个解离常数的比值，可决定其专一性程度。如果比值在三个数量级以上，则这个不可逆抑制剂是一个专一性很强的抑制剂。判断抑制作用是否发生在酶的活性部位，常用的判断方法如下,
⑴如果抑制剂的作用是化学计量的，并且作用后酶活性全部丧失，说明它全部结合在酶的活性部位。
⑵ 如果底物和竞争性抑制剂能保护酶，使之抵抗不可逆抑制的作用，即可证实此不可逆抑制剂肯定结合在酶的活性部位。
⑶ 采用简单方法使酶失活，如失活酶不会再与抑制剂反应，则证明该不可逆抑制剂是华东理工大学,酶工程》讲义
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结合在酶的活性部位。
⒉ Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，即能与酶结合，也能被酶催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团(latent reactive group)，该潜伏反应基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合，使结合物停留在这种状态，
不能再分解生成产物，酶因而致死，使酶遭受抑制。这种抑制剂专一性很强，又是经酶催化后引起，所以被称为自杀性底物。
⑴ 天然酶的自杀底物
在西印度群岛中有一种称为Ackee Blighia sapida的植物，成熟的果实是牙买加岛居民的主要食品，但未成熟果实的假种皮却含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）其结构式如右,
此种降糖氨酸的降解产物却是人体中不少重要黄素酶的自杀底物。例如，此物可专一地抑制异戊酰-CoA脱氢酶，因而导致血中异戊酸的积聚。此种生理异常通过中枢神经系统可导致剧烈呕吐，称为牙买加呕吐病。通常认为这种致命性疾病的死亡是由于低血糖所引起。
患者血中葡萄糖水平只有0.5mmol/L，约为正常人的十分之一浓度。
⑵ 治疗用人工合成的酶自杀底物
治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。
第八节 酶抑制剂的应用
一、医学上的应用
⒈ 青霉素类药物：可以抑制革兰氏阳性细菌胞壁肽的合成所需要的转肽酶。抗菌素的问题就是一些菌株产生耐药性。如长期使用青霉素，细菌会诱导出一种适应酶β-内酰胺酶，
可水解青霉素中的内酰胺环，使之成为不杀菌的青霉酸酰。（不能形成D-丙氨酸-D-丙氨酸结构，丧失了杀菌能力）
对付办法：已合成了几个β-内酰胺酶的自杀底物，如：一种青霉素的亚砜衍生物，能和抗性细菌的β-内酰胺酶结合使酶自杀，就可再用青霉素。图如右所示。
两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。
⒉ 中药对酶活性的抑制是近年来又一吸引人的研究领域。
二、农业生产上的应用
农业应用面很广，仅杀虫剂农药方面讨论。农药三大类（有机磷，氨基甲酸酯类，除虫菊酯类）
农药杀虫的机理-抑制生物体中的靶酶。
例如：有机磷对生物体酶的抑制研究最清楚--靶酶：乙酰胆碱酯酶。
有机磷进入人体后在胆碱酯酶的作用下，酶促水解后与E-Ser-OH作用--O-CHE有机磷的急性毒性，主要归功于对胆碱对神经突触后膜上的乙酰胆碱酶（ACHE）的抑制，造成突触华东理工大学,酶工程》讲义
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间隙乙酰胆碱的积蓄，而持续地作用于受体，引起一系列胆碱能神经过度兴奋而死亡。
三、工业生产上应用
蛋白酶：细菌蛋白酶（洗涤剂）；木瓜蛋白酶（啤酒）。食品加工过程中由于多酚氧化酶的作用，发生酶促褐变，使果蔬类加工食品货架寿期缩短。多酚氧化酶是含铜金属蛋白，因而许多金属螯合剂是其抑制剂。真正对食品加工和保藏有实际价值的抑制剂主要是抗坏血酸和柠檬酸，或二氧化硫亚硫酸盐。葡萄酒的氧化变褐，也可用抗坏血酸或二氧化硫防止，即把葡萄糖和葡萄糖氧化酶-过氧化酶体系封装于高速透氧、低速透水的塑料袋中，作成氧清除剂加于罐头食品，使罐头顶空中氧被除去。这种体系也用于虾肉变色，除去啤酒中的氧。
第三章 固定化酶
第一节 概述
一、固定化酶的发展史
二、固定化酶的优缺点
优点：多次使用，稳定性高；纯化简单，底物与产物容易分开；反应条件易控制，可以装塔连续反应；较水溶性酶更适合于多酶反应；辅因子的再生和固定化，使固定化酶与能量再生体系，氧化还原体系偶联，扩大应用范围；增加产物的收得率，提高产物质量。
缺点：载体与试剂较贵，酶固定化回收率低；胞内酶固定化还要增加分离成本；适用于水溶性小分子底物，大分子由于载体阻拦，不易触及酶；固定单酶反应为多，多酶反应，尤其是辅因子固定化需进一步开发。
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一、影响固定化酶性质的因素
⒈ 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
⒉ 载体的影响：⑴ 分配效应；⑵ 空间障碍效应；⑶ 扩散限制效应。
二、固定化酶的性质
⒈ 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降
⒉ 固定化对酶稳定性的影响
⑴ 操作稳定性提高，在操作中可以长时间保留活力，半衰期在一个月以上。
转化酶最长，30℃，530天残余活力50%。葡萄糖异构酶最少，60℃，14天残余活力50%。
⑵ 贮存稳定性比游离酶大多数提高。
固定化的胰蛋白酶在2℃下，置于0.0025N Hcl中贮存数月活性不下降。
⑶ 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。研究50种，30种升高，12种不变，8
种下降。
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%；用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存活50%。用DEAE -纤维素通过离子结合的固定化转化酶在40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一条件下存在100%。
⑷ 对分解酶的稳定性提高。
⑸ 对有机溶剂的耐受力升高
固定化后酶稳定性提高的原因,
⑴ 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活性是靠其分子的三维结构来维持的，所以其分子伸展变形会破坏活性中心，是引起失活的原因之一。
⑵ 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。
⑶ 抑制自降解，提高了酶稳定性。可能固定化酶载体不允许酶蛋白自透过。
⒊ 最适pH的变化
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⑴ 载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。
⑵ 载体带正电荷，最适pH向酸性方向移动。
⒋ 最适温度变化，热稳定性升高，最适温度升高。因为最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。
⒌ 对底物专一变化-对大分子底物作用力下降。
⒍ 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化
由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境
对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程,
Km'=Km/ρ(表观米氏常数)
⑴ 载体与底物带相同电荷，[Si]<[S],则ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。
⑵ 载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，ρ>1,Km’<Km
三、评价固定化酶的指标
⒈ 酶活定义（游离）：在25℃,具有最适底物浓度，最适缓冲液离子强度和pH系统内一分钟转化一个微摩尔底物所需的酶量。
固定化的单位定义为：转化底物的量/固定化酶的单位重量（单位面积）/单位时间,单位是：μmol/mg(cm
2
)/min。
⒉ 活力回收=固定化酶总活力/被固定化游离酶总活力*100%，或称偶联效率、活力保留百分数。
⒊ 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）
第三节 固定化酶的制备
一、一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。
⒈ 四大类方法：吸附法（包括电吸附法）；共价法（无机多孔材料）；交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）。
各类固定化方法的特点比较,
吸附法
比较项目
物理吸附 离子交换吸附共价法 包埋法 交联法
制备难易 易 易 难 较难 较难
固定化程度 弱 中等 强 强 强
活力回收率 较高 高 低 高 中等
载体再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能
费用 低 低 高 低 中等
底物专一性 不变 不变 可变 不变 可变
适用性 酶源多 广泛 较广 小分子底物、药用酶 较广
⒉ 选择方法依据：⑴ 酶的性质；⑵ 载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等；⑶ 制备方法简便易行。
⒊ 衡量依据：⑴ 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率；⑵ 研究它的最适反应条件（底物浓度、pH值、温度、离子强度等）；⑶ 稳定性和不稳定原因的探究；
⑷ 对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。
二、酶的固定化方法
（一） 吸附法
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⒈ 物理吸附
选择载体的原则：⑴ 要有巨大的比表面积；⑵ 要有活泼的表面；⑶ 表面自由能有自发降低的趋势；⑷ 要控制颗粒形状、大小，便于装柱进行连续反应。
常用载体,
无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、多孔玻璃、硅胶。
一般吸附量<1mg蛋白/克吸附剂。
有机载体：火棉胶膜、胶质膜、微孔玻璃载体。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂
举例：10ml 2%(W/V)的葡萄糖淀粉酶溶液，在pH4.8，30℃下，以活性碳为吸附剂，搅拌15min，过滤，得固定化酶。
⒉ 离子交换吸附法
多糖作骨架：离子交换剂结合蛋白质能力较高：50-150mg蛋白/克吸附剂。
吸附剂的选择原则：对酶有高亲和力，不会引起酶失活；吸附容量大，不吸附反应产物和酶抑制剂。
影响吸附操作因素,
pH：pH变化会引起酶、载体、电荷的变化，一般在等电点时的吸附量最大。
离子强度：一般盐阻止吸附。
温度：温度升高，蛋白质吸附降低。
第一个有工业应用价值的固定化酶：氨基酰化酶：DEAE-Sephdex A-25吸附。
举例：将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4含 0.5M NaCl,1mM CaCl2
和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc
pH4.5（1mMCaCl2和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS
中备用。
(二)共价法(载体偶联法)
⒈ 概念
所谓共价法就是使酶蛋白的非必需基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）
通过共价键和不溶性载体形成不可逆的联接。要使载体与酶形成共价键，必需首先使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反应。
⒉ 一般认为共价法的特点如下,
① 酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的半衰期较长。
② 制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构发生变化。
③ 制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。
④ 载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pH，浓度的改变。
⒊ 常用载体
⑴ 天然高分子。如纤维素，葡聚糖凝胶（Aephadex），琼脂糖（Agarose，Sepharose），
卡那胶，淀粉以及它们的衍生物。（利用-OH）
⑵ 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用
-NH2）
⑶ 无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。（要加上一个基团）
⒋ 技术要点
⑴ 将所选用的载体上的有关基团活化，然后和酶蛋白上有关基团发生偶联反应。（直接活化或另接一反应基团）
⑵ 在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。（接手臂）
⒌ 酶蛋白上可供联接的基团：⑴ 游离氨基；⑵ 游离羧基；⑶ 巯基；⑷ 咪唑基；⑸
酚基；⑹ 羟基；⑺ 甲硫基；⑻ 吲哚基；⑼ 二硫键。
华东理工大学,酶工程》讲义
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⒍ 分类：⑴重氮法；⑵ 叠氮法；⑶ 缩合法；⑷ 烷化反应法；⑸ 硅烷化反应法；⑹
溴化氰法。
⑴ 重氮法 反应示意式如下,
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，
用这些载体制备了不少固定化酶。
方法原理如下,
① 用双功能试剂β-硫酸酯乙砜基苯胺
（SESA），连接于被活化（-OH）的纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。
② 在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。
③ 把酶偶联于ABSE-纤维素上。
反应式及原理如右所示,
例：5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）。
方法如下：⑴纤维素- OH的活化，即用0.6%NaOH,加热至85℃，维持时间30min。 ⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在40℃时用1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣，以SESA：
纤维素=1：1（干重）在pH13（0.5N NaOH调），85℃，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。
⑶ 去除多余的苯胺基，依次用0.05N NaOH和水洗涤。 ⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及
1N HCl在10℃以下反应15min，然后用预先冷却的0.05N HCl及H2O洗涤抽干即成。 ⑸ 偶联，先在酶液中加入硫酸铵（1：0.007）,然后用1M Na2CO3调pH值6.5，加入经重氮化的
ABSE-纤维素，再调PH值7.0，在冰浴中反应两小时，过滤，洗涤抽干即为固定化酶，活力回收为25%，硫酸铵加入与否对活力回收影响很大，否则只有6%。
异氰酸衍生物（异硫氰酸法）：对含有苯胺基的载体除采用重氮法外，（还采用氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺衍生物和苯乙烯树脂等）还可采用异氰酸或异硫氰酸法制备固定化酶。
重氮法所用的载体除上述外，还采用氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺衍生物和苯乙烯树脂等。
下面再介绍我们最近的实验成果，固定化多核苷酸磷酸化酶。
方法：⑴ 琼脂糖OH得活化，即用1N NaOH调pH值13，室温放置片刻。⑵ 醚化，称取1.25倍于琼脂糖干重的SESA，加两倍水，用1.7M Na2CO3调PH值6.0去渣，然后将SESA
边搅拌边加入到琼脂糖凝胶中，当温度达60℃，即加入固定Na2CO3，维持PH=10，约45min
后，取出抽滤，用0.5N NaOH洗三次，再用水洗数次至无色，即得到ABSE琼脂糖（洗是去除多余苯胺基）。⑶ 重氮化制备。加入5%NaNO2及1N HCl在冰浴中反应20min，然后用预先冷却的0.05N HCl及冷蒸馏水洗，抽干即成ABSE琼脂糖重氮盐。⑷ 偶联。以1.5u/g的比例加入PNP液酶，立即用1M Na2CO3调pH值8.0，（大多数酶在中性偏碱的条件下反应）在冰浴中偶联1.5 小时后，抽滤，以少许1M NaCl溶液洗涤后，水洗数次，抽干即得。（游离氨基、咪唑基、酚基起反应）
⑵ 叠氮法
是在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。
主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。
肽键：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基失去一分子水相结合的键，又称酰华东理工大学,酶工程》讲义
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胺键。
例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⑴ 酯化：CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥。⑵ 肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，
再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，甲醇洗涤干燥。⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素
（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶，防止戊二醛的另一醛再与载体上另一个-NH2反应。(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）
⑶ 缩合法（对含-NH2,-COOH载体的另一种方法）主要利用具有羧基或氨基的载体，加入到酶液中，在缩合剂碳化二亚胺（双环己基碳酰胺）作用下，使载体的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或 COOH 形成肽链而被固定。
含羧基的载体有羧甲基纤维素，羧甲基交联葡聚糖等。
含氨基的载体有氨乙基纤维素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。
⑷ 烷基化反应法。将含有卤素官能团试剂与非水溶性的纤维素载体进行烷化反应，然后和酶进行偶联制得固定化酶。
一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。
⑸ 硅烷化法：多孔玻璃特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。
载体可以再生，寿命长等。
一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
这些多孔玻璃的孔径在250～1000埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1克所拥有的表面积达100平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热处理原子重组而成，是优良载体，但必须加以改造）。
本法进行酶的固定化可分三个步骤：① 将本体接上一个结合剂（也即硅烷化）；② 接上功能基团；③ 把酶共价结合于载体。
⑹ 溴化氰法-异脲键合法
本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。
华东理工大学,酶工程》讲义
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上述这些载体在高pH条件下（pH11左右），溴化氰和多糖一类物质形成一种环化的活泼的亚氨碳酸盐，该化合物对蛋白质上的NH2反应十分敏感，生成N-取代异脲，N-取代亚氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要产物为N-取代异脲，反应式如右,
例：胰蛋白酶的固定--均在4℃时进行。
⑴ 活化。称取琼脂糖凝胶100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl和H2O洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按1ml沉淀凝胶加入50～300mg CNBr。立即用2N NaOH调pH值10～11，
维持pH值11，pH值不再下降，直到反应终止。反应在25℃通风橱内进行，反应仅需10分钟，这样CNBr将载体全部活化，生成活泼的亚氨碳酸盐。反应完毕后，用冰水和冷0.1M
pH9.5 NaHCO3洗涤（注意：切忌用带有-NH2基的缓冲液来洗涤，因为亚氨碳酸盐对NH2
-
敏感，
在酶偶联时，活性部位被NH2占领，酶偶联不上），去除多余CNBr和杂蛋白。
⑵ 偶联。用偶联缓冲液（0.025M pH 10.2硼酸缓冲液-0.02M CaCl2或NaHCO3平衡洗涤，
抽干，加入5ml缓冲液（内含16mg酶）温度降至4℃，搅拌反应4小时，最后分别用0.1M pH
8.5硼酸缓冲液-1M NaCl洗涤即成10.2M pH 4.0醋酸缓冲也去除各种杂质。
(三) 交联法。
交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成席夫碱（基）
Shiff碱将酶固定化。含氨基的载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，还有乙撑二异氰酸酯OCN（CH2）6NCO。
交联剂的特点：①带有二个以上的功能基团。②反应比较剧烈条件比较严格。③操作方便，活力回收不高。
固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。
交联法有4种形式,
①酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺乏选择性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高。
②酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，
使酶与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，
经-30℃低温处理，再预热至4℃而得泡沫状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。
③吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。此法用于胞外酶的固定化较好，尤其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选择性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间的共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶装柱流动性能好，缺点是必须保证酶吸附在载体上。
④载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合物的单体反应，反应后再与酶一起共聚。
⑤交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
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（四）包埋法（entrapping method）：将酶物理包埋在高聚物内
包埋法分为格子型和微胶囊型两种。
将酶包裹在凝胶的微小格子中称为格子型；用半透性聚合物膜将酶包裹起来称为微胶囊型。包埋法有如下几个特点：① 不需要化学修饰氨基酸残基。② 反应条件温和，很少显著改变酶的结构。③ 包埋时只适用于小分子的底物和产物。④ 对酶、粗酶制剂和微生物都能进行固定。⑤ 无E-载体之间的化学反应只有载体凝固过程。
⒈格子型。格子型使将酶包埋在聚合物的凝胶格子中,格子的结构可以防止蛋白质渗出于周围培养体中，但是底物仍能渗入这格子内与酶相接触，使之处在不脱离状态下，达到固定化酶的目的。本法所用的聚合物有合成高分子物质聚丙烯酰胺、海藻酸、角叉菜胶等。
⒉ 微囊化法：其原理是用各种类型的膜将酶封装起来。这类膜能使低分子底物和产物通过膜，而酶和其他高分子不能通过。
微囊化法制备固定化酶有两种方法,
① 界面沉淀法：这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低面形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。
② 界面聚合法：是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界石上发生聚合反应产生聚合体将酶包裹起来。半透性微囊的膜可用尼龙610组成。
第四节 固定化细胞
一、细胞固定化种类：吸附法、不用载体法、包埋法。
二、包埋固定法
包埋法是在微生物细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
包埋法可以细分为凝胶包埋法、纤维包埋法、微胶囊包埋法三种。下面主要介绍凝胶包埋法。
按照形成凝胶方式的不同，形成凝胶的方法有：通过基材的聚合作用；离子网络的形成；
改变pH值、温度和溶剂等。
1．通过离子网络键包埋细胞
这是一种通过多价离子使高分子电解质形成凝胶的包埋法，其中尤以海藻酸钙包埋法最为常用。该法由于所用的试剂没有毒性，包埋的细胞易于增殖，故常被优先选用于生长细胞，
以及某些敏感细胞（如植物细胞）和原生质体的包埋，也常用于食品用酶的固定化。
其基本原理是：先将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na
+
，部分被Ca
2+
、或Al
3+
等所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。因此，这种方法又称离子交换凝胶法。可以通过下列参数的改变来调节。
⑴ 藻酸钙凝胶的机械性质与甘露糖醛酸和古罗糖醛嵌段的分布以及海藻酸本身的分子量和分散性有关。因此选用不同分子量及链段结构的海藻酸，可以配制出不同浓度的海藻酸钠溶液。当古罗糖醛酸嵌段含量较高时，凝胶的强度较高。
⑵ 固浴中的CaCl2浓度，可在0.05%-2%之间选用。
⑶ 操作温度可以0-80℃内选取。
⑷ 凝胶珠粒的直径可由滴加器口径的改变而控制在0.15mm,所得粒子直径分布均匀。
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⑸ 直接包埋法的细胞包埋密度，每毫升凝胶可高达1kg温细胞，不过太高的包埋量会对底物和产物的扩散带来不利。
⑹ 海藻酸钙凝胶粒子，还可通过部分干燥法使粒子的直径减小。
⒉ 通过改变载体溶液参数包埋细胞
除了上述聚合法和离子网络法外，改变载体溶液和温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。胶原蛋白、明胶、琼脂、角叉菜聚糖等，
均可用作此种包埋法的载体。
三、吸附法
它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。影响吸附法的主要因素有以下方面,
⑴ Z-电位,Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小，显然，细胞易于被吸引在具有相反Z-电位载体表面上。
⑵ 细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的荷电性质，直接影响着细胞与载体之间的相互吸引力。
⑶ 载体的性质：玻璃、陶瓷等无机材料，系由不同含量的铝、镁、钛等氧化物所组成，
在水介质中，它们会形成相应的氢氧化物（水合氧化物），存在于细胞表面的某些氨基或羧基，可以通过螯合金属离子吸附。
第五节 固定化辅酶
辅酶及偶联酶系的固定化,
⒈ 辅酶固定化的意义
辅酶类物质是一些“全酶”的组成成分，参与催化反应。同时当其与某些高分子物质结合时，可以大大提高催化效率。因此，将其固定化，一方面是固定化酶的必需，另一方面，
固定化酶可以提供亲和色谱的吸附剂。此外，还可能为研制“人工酶”提供实验模型，甚至可以将某些酶的催化性质加以改变，例如改变其底物特异性和热稳定性。辅酶物质固定化一般采用共价偶联法，或将其进行适当的化学修饰后进行包埋。酶常用的固定化载体，有琼脂糖、纤维素、合成高分子材料及微孔玻璃等不溶性物质；也有用葡聚糖、聚氨基酸或聚乙烯胺等不溶性材料的，还有用海藻酸的。固定化反应常用重氮化反应，卤代烷基化反应和BrCN
反应等。
⒉ 按作用机理可将辅酶分成二大类
⑴ 辅基型辅酶（酶内传递）：它与酶结合牢固，难以解离，是酶活性中心的组成部分，
在反应终止时再生成原形。
⑵ 底物型辅酶（酶间载体）：它与酶结合不牢固，容易解离，在酶反应中它由酶Ⅰ从底物AX接受还原单位或化学基团X，转移到酶Ⅱ，然后将X传递给底物B后再生成原形。
因此，可将它看作是一种特殊的共同底物。
⒊ 需辅酶的酶的亲和固定化
需辅酶的酶，其酶蛋白和辅酶之间，有较强的亲和力，因此这类酶的固定化，可以用溴化氰活化法或重氮化法或烷基化法，直接将酶蛋白共价结合于载体。为维持正常的催化作用，
必需不断向反应系统补充辅酶，另一种方法是将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附上去。
⒋ 保留辅因子方法：⑴ 在系统中不断加入辅因子；⑵ 固定化增殖细胞加入法；⑶ 微量辅因子一底物保留法；⑷ 固定化酶辅因子方法；⑸ 加入辅因子共价结合法。
例：李永丰包埋大肠杆菌生产谷氨酸脱羧酶，发现辅因子（PLP流失严重）。加入底物和PLP混合物成功。
因为PLP通过底物带入酶活性中心，后PLP与酶亲和力>PLP与底物亲和力。
所以S-PLP断开，PLP进入大大提高了酶的活力。
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用含铁的聚丙烯酰胺凝胶珠固定化腺苷酸激酶（E1）和乙酸激酶（E2），使ATP再生，
乙酰磷酸由乙烯酮和磷酸化学合成供给。美国麻省理工学院用这种再生系统，以其相应的酶系，完成了酶法合成短杆菌肽S（一种环状十肽）的研究。
第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用。
一、酶反应器
⒈ 分批搅拌反应器；⒉ 连续流搅拌桶反应器；⒊ 连续搅拌桶-超滤反应器；
⒋ 填充床反应器；⒌ 循环反应器；⒍ 流化床反应器。
二、固定化酶（细胞）的应用
⒈ 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
⒉ 固定化酶在医药治疗上的应用
例1：固定化L-天冬酰胺酶用于治疗白血病。L-天冬酰胺酶能分解L-Asn为L-Asp和
NH3。当注射该酶后，人体正常细胞由于有L-天冬酰胺合成酶，可以合成L-Asn，因而细胞的蛋白质合成不受影响。癌细胞本身缺少或没有L-天冬酰胺合成酶，因而L-Asn被注射的
L-天冬酰胺酶分解后，就缺少了合成蛋白质的一种原料，蛋白质合成的受影响，最终癌细胞会“饿死”。
例2：制造人工肾。以往治疗肾脏疾病，常用血液透析装置，由体外循环达到滤除尿素和尿酸等代谢废物的目的，装置笨重，价格昂贵，效率不高。利用固定化尿酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化尿酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。
⒊ 固定化酶在分析化学中应用
酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。
它的原理是：当把这种酶电极插入待测溶液时，酶膜中发生的酶催化反应产生某种离子或气体等电极活性物质，再由基础电极对之响应，转换成电信号，尔后经过放大、处理即可测出反应物量的变化。
⒋ 固定化酶和亲和色谱
⒌ 固定化酶在环境保护
一是环境监测，二是污染物处理。例如造纸厂废水中，含有大量淀粉和白土混悬和胶态物，用固定化a-淀粉酶，可以连续处理这种废水中的胶态悬浮淀粉，使纤维沉淀分离除去。
利用固定化热带假丝酵母的复合酶系，能够分解酚，可以用于处理含酚废水。
⒍ 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。
⒎ 固定化酶在基础理论研究中应用
第四章 有机介质中的酶促反应
第一节 有机介质中的酶促反应概述
一、有机相酶反应的优点
⒈ 有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化。）
⒉ 可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。
⒊ 能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中）
⒋ 可改变反应平衡移动方向（使许多热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酶合成，酯交换等）主要朝着合成而不是水解的方向进行。
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⒌ 可控制底物专一性（不同底物反应所选最适溶剂不一定相同）。
⒍ 可防止由水引起的副反应。
⒎ 可扩大反应pH值的适应性。
⒏ 酶易于实现固定化。
⒐ 酶和产物易于回收。（酶不溶于有机溶剂，有利于产物分离和酶的回收利用，且从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。）
⒑ 可避免微生物污染。
二、有机相酶反应具备条件
⒈ 保证必需水含量；
⒉ 选择合适的酶及酶形式；
⒊ 选择合适的溶剂及反应体系；
⒋ 选择最佳pH值。
三、有机相酶反应的研究进展
⒈ 超临界流体中的酶反应
所谓超临界流体是指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力。然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。另外该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性，而且萃取后分离也很容易。
有关性质,
⑴ 超临界流体的P-V-T性质
超临界流体萃取中最常用的萃取剂是CO2。
⑵ 所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力7.28Mpa）时的状态。
该流体的密度和液体相近，粘度和气体相近，自扩散系数比液体大100倍左右。完成传质达到平衡要快，分离效果要好。
⑶ SC流体的选择性
提高溶剂选择性的基本原则是：第一，操作温度和超临界流体的临界温度接近；第二，
超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近。若两条原则基本符合，效果就较理想，
若符合程度降低，效果就会递减。
⑷ SC流体的溶解能力
超临界流体的溶解能力与其密度有很大关系，而密度又受到体系温度或压力的明显影响，所以压力或温度的变化，就会直接改变其溶解能力。
⑸ 超临界流体的选定
作为萃取剂的超临界流体必须具备以下条件,
① 萃取剂需具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性；
② 临界温度不能太低或太高，最好在室温附近或操作温度附近；
③ 操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度；
④ 临界压力不能太高，可节约压缩动力费；
⑤ 选择性要好，容易得到高纯度制品；
⑥ 溶解度要高，可以减少溶剂的循环量；
⑦ 萃取剂要容易获取，价格要便宜；
⑧ 萃取剂必须对人体没有任何毒性。（在医药、食品上使用）
某些萃取剂超临界特性如下表,
流体名称 乙烷 丙烷 丁烷 戊烷 乙烯 NH3 CO2 SO2 H2O
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临界温度（℃） 32.3 96.9 150 296.7 9.9 132.4 31.1 157.6 374.3
临界压力（Mpa） 4.26 3.8 3.38 5.12 11.28 7.38 7.88 22.11 4.88
临界密度（g/cm
3
） 0.22 0.228 0.232 0.227 0.236 0.46 0.525 0.326 0.203
⑹ 超临界流体萃取过程
① 依靠压力变化萃取分离法（等温法，绝热法）：在一定温度下，使超临界流体和溶质减压，经膨胀，分离，溶质经分离槽下部取出，气体经压缩机返回萃取槽循环使用。
② 依靠温度变化的萃取分离法（等压法）：经加热，升温使气体和溶质分离，从分离槽下部取出萃取物，气体经冷却，压缩后返回萃取槽循环使用。
③ 用吸附剂进行萃取分离法（吸附法）：在分离槽中，经萃取出的溶质被吸附剂吸附，气体经压缩后返回萃取槽循环使用。
如图所示，在超临界CO2中加入N2，使咖啡因在CO2中的溶解度显著下降。根据这一原理建立起来的超临界流体萃取过程叫做惰性气体的分离法流程。此流程的操作都在等温等压下进行，故能耗低。但关键是必须有使超临界流体与惰性气体分离的简便方法。
⑺ 超临界流体萃取的应用
超临界流体萃取与液体溶剂萃取比较
超临界流体萃取法 液体溶剂萃取法
1 可选择萃取挥发性小的物质，生成超临界相 在要分离的原料中加入溶剂形成二相
2 萃取能力由T，P控制。夹带剂研究不多 萃取能力由温度及混合溶剂浓度控制，压力无影响
3
在常温，高压（5-30Mpa）下操作,
可处理对热稳定的物质
都在常温，常压下进行
4 溶质溶剂易于分离，改变压力温度即可 溶质与溶剂分离常用蒸馏法，存在对热稳定性问题
5 粘度小，扩散系数大，易达到相平衡 扩散系数小，有时粘度相当高
6 超临界相溶质浓度小 萃取相为液相，溶质浓度一般较高
超临界流体萃取的应用实例：（从咖啡中脱除咖啡因，从啤酒花中提取有效成分已工业化）
医药工业,
⑴ 原料药的浓缩，精制和脱溶剂（抗生素等）；
⑵ 酵母，菌体生成物的萃取（r-亚麻酸，酒精等）；
⑶ 酶，维生素等的精制、回收；
⑷ 从动植物中萃取有效药物成分（生物碱，维生素E，芳相油等）；
⑸ 脂质混合物的分离精制（甘油酯，脂肪酸，卵磷酯）。
食品工业,
⑴ 植物油的萃取（大豆，棕榈，花生，咖啡）；
⑵ 动物油的萃取（鱼油，肝油）；
⑶ 食品的脱脂（马铃薯片，无脂淀粉，油炸食品）；
⑷ 从茶，咖啡中脱除咖啡因，啤酒花的萃取；
⑸ 香料的萃取；
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⑹ 植物色素的萃取；
⑺ 油脂的脱色脱臭。
化妆品香料工业,
⑴ 天然香料的萃取，合成香料的分离、精制；
⑵ 烟草脱烟碱；
⑶ 化妆品原料的萃取、精制（界面活性剂，单甘酯等）。
⒉ 仿水溶剂和印迹技术
⑴ 仿水溶剂体系
原理：酶在有机相中主要依靠必需水与酶分子间的氢键维持活性构象，因此可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。
极性添加剂对体系的影响有以下三个方面,
① 对反应体系内水的分配影响；② 与蛋白质的直接作用；③ 对产物分配的影响。
应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。
⑵ 分子印迹技术（酶在冻干前可用配体为酶作印迹）
① 当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，
再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。
② 用正丁醇沉淀-胰凝乳蛋白酶和N-乙酰D-色氨酸间的酶抑制剂复合物，经干燥后再放入环己烷中，它可催化合成N-乙酰D-色氨酸乙酯，在水中酶还能“记住”它最后存在过的水溶液的PH值，因该PH值决定了酶分子上有关基团的电离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持，即失去对D型氨基酸的专一性，因为在有机溶剂沉淀时，
该酶分子接受D型氨基酸的构象被冻结，并且在有机溶剂中仍能保持，但在水中则酶又变回到它的天然构象，只能催化L型氨基酸酯化。
原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
四、有机相酶反应的应用现状
第二节 有机介质中酶促反应的条件
一、必需水
⒈ 概念：这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关。只要这层必需水不丢，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍能保持其催化活性。
⒉ 干燥的酶水合过程,
⑴ 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）；
⑵ 与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)；
⑶ 凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25-0.38g/g）；
⑷ 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。
⒊ 影响酶必需水含量的因素（酶和溶剂）
⑴ 不同酶需水量不同
例：溶菌酶在含水量38%以上，即每个酶分子周围有300个以上水分子，整个酶被一层单分子水层所包围，酶活性才能发挥。
在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附50个水分子，而脂肪酶仅需几个水分子就可显示出活性。
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⑵ 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。
溶剂疏水性越强，需水量越少。
例：胰凝乳蛋白酶，在二氯乙烷或氯仿中，1%含水量最高在更疏水的乙酸乙酯中则要求更高。
⒋ 表征必需水作用的参数---热力学水活度
即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。
含义：即为水在体系中的固相（酶，载体），液相（含低物的溶剂）和气相（液面上部的空间）之间进行分配，达到平衡时各相水活度相等。
二、酶的选择
⒈ 酶种类的选择：应具有对有机介质变性的潜在能力，在有机介质中能保持其催化活性构象。
在酶蛋白分子中与底物结合并起催化作用的区域，称为酶的活性部位。活性部位通常由酶分子中的残基侧链活性基团及辅基构成，一般位于酶分子的凹槽或两结构域（或两瓣）的结合处。
生物大分子结构的精确性称刚性，构成蛋白质的二级结构单位，如α螺旋、β-折叠和转角等相对刚性的，它们是稳定蛋白质空间结构的基础。蛋白质（酶）分子具有刚柔相间的空间结构。
蛋白质（酶）分子并非完全刚性的观点，认为局部区域具有一定的可运动性或称为柔性。
蛋白质中还含有一定量的环结构和无规则卷曲。由环和无规卷曲构成的局部区域相对比较柔性。
酶的柔性和刚性是局部的，也是相对的。对于局部柔性部位的维持必须有刚性部分来支持。酶分子既要保持相对稳定的整体结构，又必须要有相对柔性的微环境状态。正是这种刚柔相济的独特酶分子结构，是酶的催化作用保持高效性和可调性的结构基础。
在有机相中，酶在大多数有机溶剂中的不溶性也消除了酶构象的可变性，使酶变得更坚固，具有一定刚性，而有机相中微水也能破坏分子内氢键，使之有一定的柔性。
⒉ 酶形式的选择
⑴ 酶粉：例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。
⑵ 化学修饰酶：例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。
⑶ 固定化酶：把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，
其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。
载体对酶的影响,
① 载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。
例：在水浴液中，底物肉桂酸浓度在0.1mmol/L以上可强烈抑制马肝酸脱氢酶，但在乙酸丁酯中使用亲水载体固定化酶，底物浓度高达50mmol/L也不会发生抑制作用。
② 载体影响酶分子上的结合水
③ 通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。
例：α-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。
④ 影响酶动力学，影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度。
注意：载体不一定是固体或在有机溶剂中不溶的，如果酶加到含临界比的水表面活性剂系统中，酶会进入到凝胶束中，凝胶束是包埋在表面活性剂离子网格中的水微滴，凝胶束中华东理工大学,酶工程》讲义
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的酶活很高，但凝胶束结构易遭破坏，而且可溶酶的量也有限。
三、溶剂及反应体系的选择
水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等。
水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等。
⒈ 酶促反应有机介质体系,
⑴ 单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）
⑵ 两相体系（水/水不溶性有机溶剂）
⑶ 低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）
⑷ 反胶束体系,
① 概念：是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。
表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。
临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系的特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。
正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成“水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质与其它亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”，由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。
② 制备：将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），
便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。
反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。
反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。
③ 基本原理：“水壳”模型
反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水；自由水即为存在于水相中的那部分水。大分子的蛋白质被封闭在“水池”中，表面存在一层水化层与胶束内表面分隔开来，从而使蛋白质不与有机溶剂直接接触。水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多，如：从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层；α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象；反胶束中酶所显示的动力学特性接近于在主体水中的特性等，这些事实都有力地支持了水壳模型。
④ 影响的主要因素,
水相pH值的影响；离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定；
表面活性剂浓度的影响；离子种类对萃取的影响。
⑤ 反胶束的应用
分离蛋白质混合物；
浓缩酶（例：浓缩α-淀粉酶，用TOMAC/异辛烷反胶束系统再加入表面活性试剂，活力回收可达85%，浓缩倍数可增加17倍。）；
华东理工大学,酶工程》讲义
27
从发酵液中提取胞外酶；
直接提取胞内酶；
蛋白质复性（有人用AOT/异辛烷反胶束溶液萃取变性的核糖核酸酶，将负载有机相连续与水接触除去变性剂盐酸胍，再用谷胱甘肽的混合物重新氧化二硫键，使酶的活性完全恢复，最后由反萃液回收复性的完全具有活性的核糖核酸酶，总收率达到了50%。）。
⒉ 有机溶剂影响酶催化的方式,
⑴ 有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活。
① 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度
② 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。
③ 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。
⑵ 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活
例如：氯仿显著减少过氧化物酶催化苯酚的氧化，原因在于氯仿是苯酚基的很好的猝灭剂。
⑶ 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。虽然这种相互作用可能不会直接影响酶，
但它对催化有重要影响。
① 强极性溶剂能溶解大量的水，倾向于夺取酶的必需水层而导制失活。
② 疏水性溶剂夺去水的能力较弱，引起酶失活可能性较小。
⒊ 选择有机溶剂必须考虑因素
⑴ 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。
例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）
又例：在己烷中聚苯酚氧化酶催化反应中，极性的苯醌产物不溶于己烷，导致在酶周围的水层发生不需要的聚合，该聚合物缠住酶，降低酶活，而在极性更强的氯仿中，苯醌分配到主体溶剂中不会使酶失活。
⑵ 溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。
例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。
⑶ 必须考虑溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）
最新报道溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。在加入等量水时：溶剂的lgP越高酶活性越大，所需最佳水量越少。
四、PH选择和离子强度的影响
⒈ pH选择：环境pH值决定酶表面的离子状态，而表面的离子状态又与酶的活性密切相关因酶分子活性中心的必需基团，需在特定的pH条件下，取得酶催化反应所需的最佳离子化状态。在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，从具有最适pH值的缓冲液中冻干出来。即使同一种酶不同来源，对pH
值敏感程度大不相同。
⒉ 离子强度影响：随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。
第三节 有机介质对酶性质的影响
一、稳定性
⑴ 热稳定性提高
例：丹麦Nove公司生产的脂肪酶Lipozyme TM，在水溶液中600C保温1小时后剩余的酶活只有10%，而在橄华东理工大学,酶工程》讲义
28
榄油中同样条件下脂肪酶的剩余酶活仍近100%。600C对乌桕脂和硬脂酸甲酯的转化反应24
小时后，酶活仍保持82%。
结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。
⑵ 储存稳定性提高
二、活性
⒈ 单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响
⑴ 有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象的氢键和疏水作用力，或破坏酶周围水化层，使酶失活或变性。
⑵ 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。
⒉ 低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化
例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化
⒊ 在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加
特点：酶活力依赖微团的水化程度，即取决于水与表面活性剂的摩尔比（R）
超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。
认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。
根据,
⑴ 微团水化程度（W）（W=[H2O]/[表面活性剂]）的最佳值和酶活性的最大值呈正相关；
⑵ W值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径。
三、专一性
某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。
例：醇脱氢酶催化烷醇氧化为醛，在水溶液中辛烷是最佳底物，再反向微团包裹后则丁醇更快被氧化。
有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。
四、反应平衡方向
有机介质能改变某些酶的反应平衡方向。
例：水解酶，水浓度高达55.5mol/L，水解酶在有机介质中，热力学平衡→催化合成反应。
有机溶剂在酶促合成多肽和蛋白质上的应用
酶 合成产物 有机溶剂 使用浓度（%）合成收率（%）
枯草杆菌蛋白酶核糖核酸酶 甘油 90 50
无色杆菌蛋白酶人胰岛素 DMF和乙醇30 80
羧肽酶 牛胰核糖核酸酶甘油 90 50
凝血酶 人生长激素 甘油 80 20
嗜热杆菌蛋白酶天冬甜味素 乙酸乙酯
胰凝乳蛋白酶 脑啡肽 乙醇或DMF
第四节 有机介质中酶促反应应用举例（外消旋体的拆分）
一、概念
⒈ 光学活性物质：能使平面偏振光旋转的化合物为光学活性物质。
⒉ 手性：一个具有光学活性的有机物不能与它的镜像重合
⒊ 对映异构体：两个互为镜像但不能重合的对映体称为对映异构体，它们旋光能力相华东理工大学,酶工程》讲义
29
同，但方向相反。
⒋ 外消旋体：等量对映异构体的混合物没有光学活性，成为外消旋体。
⒌ 外消旋体拆分：即利用拆分技术将外消旋体的两个对映体分开。通过外消旋体的拆分可得纯的光绪活性物质。
二、光学活性化合物的重要作用
⒈ 医药（Thalidomide;巴比妥药DMBB和MPPB；）；
⒉ 精细化学品（杀虫剂asana）；
⒊ 材料（100%光学活性的β-三氯甲基-β-丙内酯聚合物的熔点高达275度，而相应的外消旋体在相同条件下得到的聚合物在接近200度便分解。
三、光学活性物质的制备技术
⒈ 不对称合成法（以含有手性中心的天然化合物即手性源为原料，通过传统的化学合成方法，保留其活性中心，获得新的手性化合物；也可以用前手性底物与手性助剂或手性催化剂反应，生成光学活性产物。酶是一类具有催化活性的蛋白质，本身就是手性物质，因此可作为不对称合成的手性催化剂。脂肪酶、氧化还原酶、醛缩酶）
⒉ 外消旋体拆分（生物法，非生物法）即利用拆分技术将外消旋体的两个对映体分开。
可以不改变现有生产方法和工艺流程，减少投资同时获得一种消旋体的两种对映体，有可能申报对映体新药专利的机会。
非生物拆分法：⑴ 机械分离法；⑵ 形成和分离对映体异构法；⑶ 色谱分离法；⑷ 动力学拆分。
生物拆分法：利用一个酶或一系列酶。
⑴ 水相酶反应的应用研究热点是手性产品的合成和开发。脂肪酶和酯酶应用最多。
工业应用奥地利的Chemie-linz公司已从美国MIT购买了Klibanov教授的非水相酶催化法拆分a-卤代丙酸的专利许可，并建立了中试工厂，大批量生产光学活性除草剂中间体。
⑵ 生物拆分法原理：实质也为-动力学拆分过程即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。
快：E+A→E+P
慢：E+B→E+Q
C：表征参数
对映体选择率：底物中一对异构体（同一个酶的两种竞争性底物）的Vm/Km之比为酶的选择性。
E：反映某一拆分过程的效果，也表征酶选择性的大小，是酶反应的特征参数。
光学纯度o.p (%)=[a]/[a]纯品
对映体过量值，残余底物ees,
生成底物eep,
一般认为比旋光度与组成之间成直线关系，因此在实验无误差时，o.p与ee所表示的数值应是相同的。
第五章 核酶和抗体酶
第一节 Ribozyme
化学本质是RNA的生物催化剂一Ribozyme,
一、Ribozyme的发现
80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学的Sidnery
Altan各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。这个发现曾被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。为此，T.Cech和S.Altman共同华东理工大学,酶工程》讲义
30
获得了1989年度诺贝尔化学奖。
二、Ribozyme的种类
自然界存在催化分子内反应（incis）的Ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(in trans)的Ribozyme。
1．自我剪接Ribozyme可分为两类：Ⅰ型IVS和Ⅱ型IVS。Ⅰ型IVS均与四膜虫大核rRNA
前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。Ⅱ型IVS的结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟坩酸参与，但仍需Mg
2+
。
2．自我剪切Ribozyme,后者包含剪切与连接两个步骤。自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。
3．催化分子间反应的Ribozyme.如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。
三、Ribozyme研究进展与展望
对各种已知Ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的Ribozyme,
研究热点：从催化分子内反应的自我剪切Ribozyme设计出催化分子间反应的Ribozyme.
例如：锤头结构，它由两部分组成，一部分是设计的Ribozyme,另一部分是其底物。根据它们在锤头结构中的相对位置，可分为四种类型。其中以（d）类型应用最广，即一个线状RNA
分子可被一个具有催化中心，同时两侧与底物RNA分别互补的ribozyme特异降解。
Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。将Ribozyme基因构建于特定载体上。在爪蟾卵母细胞、Hela细胞等已表达成功。产生的 Ribozyme能阻断特定基因（如氯霉素酰基转移酶基因等）的表达。根据锤头结构或发夹结构原理设计的Ribozyme基因导入已获得美国FDA批准，很快将在临床上使用。一种高效并准确释放Ribozyme的质粒已构建，它将推动Ribozyme的研究。
对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA
为底物的Ribozyme。通过对它们的结构与作用机制的研究，可设计出更多的高效、稳定的
Ribozyme。这些Ribozyme可能成为研究RNA结构的有用工具，可能成为体内阻断有害基因表达和抗病毒感染、抗肿瘤的有效药物。导入抗病Ribozyme基因的转基因生物的出现将为期不远。
第二节 脱氧核酶
一、概念
具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶。
二、结构
Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca
2+
的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子。
三、脱氧核酶的催化特性
1．效率高 以Kcat/Km表示，脱氧核酶的催化效率在109mol/min
左右，超过任何其他的核酶。脱氧核酶的催化效率决定于底物结合速率。
2．酶的作用具有高度专一性 这种专一性是酶-底物以Watson-Crick碱基配对形成二联体或三联体的识别方式所决定。结合部位或催化部位的个别碱基突变导致碱基不配对，酶活将会丧失；碱基位置互换，仍是配对，则活性恢复。酶底物的结合亲和力决定于识别部位的序列长度短，最佳序列长度在14-20核苷酸范围内。
3．酶活性依赖金属离子：Mg
2+
,Zn
2+
,Cu
2+
,Pb
2+
,Ca
2+
、Mn
2+
、三价的镧族离子最高能提高酶活力105倍。
华东理工大学,酶工程》讲义
31
4．其它辅助因子：氨基酸（组氨酸）、精胺，该酶的螺旋结构与酶活性的关系也与锤头状核酶相似。脱氧核酶、核酶、蛋白酶在某种程度上有相似的切割催化机制。
四、酶促反应动力学特征
1．PH值和温度对酶反应速率的影响：pH4-8范围内呈钟形，在pH6.2左右达最大值。
最适温度在40℃左右，但有趣的是Vcat/Vuncat比值在15℃达最大值。
2．激活剂有：K
+
,Na
+
,Mg
2+
,Mn
2+
,Pb
2+
等；阴离子如组氨酸，还有H
+
等。表明酶的折叠活性形式中可能有G-四联体存在。
3．酶浓度对酶反应速率的影响：在底物过量和其他参数不变的条件下，催化速率与酶浓度成比例关系，符合米氏方程。V与[E]成直线关系。
五、生物学意义
三种脱氧核酶的活性：连接酶活性、金属螯合酶活性、磷酸酯酶活性。
第三节 抗体酶
一、概念
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
二、抗体酶研究简史
三、抗体酶的催化反应
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
4．金属螯和合反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
7．光诱导反应
a．光聚合反应（二聚作用）
四、制备方法
1．诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
半抗原设计原则就是酶的催化作用机制。常用过渡态类似物半抗原。
2．引入法：将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术
例：美国使用可裂解亲和标记物将含巯基的柄状亲核基团引入到抗2，4-二硝基苯酚
（DNP）的单抗的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有(DNP)与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇高6*104倍。不仅是这个含巯基的亲核基团能加速反应，而且是它作为一个诱导物可引入各种催化基团和辅助因子。还将荧光素联结在这个柄上，当抗原插入到抗体结合部位时，荧光迅速减弱，可检测荧光强度来研究抗体抗原的结合反应。
3．拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。
缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。
五、研究展望
1．研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律。
2．获得一类新型的蛋白酶。
3．催化天然酶不能催化的反应。
第六章 酶的化学修饰
华东理工大学,酶工程》讲义
32
第一节 前言
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。
2．作用的最适条件不符。
3．酶的主要动力学性质的不适应。
4．临床应用的特殊要求。
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造或修饰，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合理的酶。
2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造，这包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象变得更为稳定。另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。
三、酶化学修饰的基本原理
1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂
3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
第二节 酶化学修饰的方法及修饰剂
一、修饰剂的要求
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性
2．修饰剂上反应基团的数目及位置
3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
二、酶性质的了解
1．酶活性部位情况
2．酶的稳定条件、酶反应最适条件
3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等
三、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例
2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件
3．反应温度及时间
四、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰
2．有机大分子对酶的化学修饰
3．蛋白质类及其他
第三节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1．酰化及其相关反应（乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和0-甲基异脲等）
2．烷基化反应（2，4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物和碘甲烷等）
3．氧化和还原反应，氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原剂（2-巯基乙醇、
巯基乙酸和二硫苏糖醇等）
4．芳香环取代反应
二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1．巯基的化学修饰（烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰华东理工大学,酶工程》讲义
33
胺；常用N－乙基马来酰亚胺、5,5′－二硫－2－硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ））。
2．氨基的化学修饰（常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６－三硝基苯酚、２，４
－二硝基氟苯、碘代乙酸、还原烷基、丹磺酰氯）。
非质子化的赖氨酸的ε－氨基是酶分子中亲核反应活性很高的基团。ε－氨基的pKa
值一般为10，由于微环境的影响，蛋白质分子中也可能存在低pKa值的赖氨酸残基，这些残基具有更强的可反应性，因而可以被选择性地修饰。
3,羧基的化学修饰；水溶性的碳化二亚胺、硼氟化三甲锌盐为修饰剂。
4．咪唑基的化学修饰：可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。
5．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修饰剂。
6．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行修饰。
第四节 有机大分子对酶的修饰
一、概念
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糠肽、Sephadex G-25）、聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、丙烯酸等的单聚或共聚物），具有生物活性的大分子物质（如肝素）蛋白质等。这些大分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合。修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
三、举例
利用水溶性大分子对酶进行修饰，是降低甚至消除酶的抗原性的有效方法之一。例如，
精氨酸酶经聚乙二醇（PEG）结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性；聚乙二醇结合修饰后的L-天门冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。
第五节 蛋白质类及其它
一、蛋白质类修饰
血浆蛋白质是血浆中的天然组分，它们和其它蛋白质（包括酶类）的复合物在血液中有可能被视为"自体蛋白"而被接受。同时由于血浆蛋白质具有较大的分子量，在改进酶性质上效果更明显，因此，已被认为是具有较大优越性和前途的一类修饰剂，其中人血清白蛋白是目前研究较多的一种酶修饰剂。常用有以下几种方法,
1．戊二醛法：此方法是利用戊二醛双功能基团的活泼性，使白蛋白和酶分子上氨基产生交联反应，生成修饰酶。
2．碳二亚胺法：白蛋白和酶以碳二亚胺作为交联剂的修饰反应
3．活性酯法
（1）原理：根据多肽合成原理发展起来
（2）特点：反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触所可能产生的酶失活，减少了副反应的产生。
（3）工艺：a.白蛋白琥珀酰化；b.活性酯形成反应；c.修饰反应。
二、金属离子置换修饰
1．概念：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。
2．常用离子
常用二价金属离子。例如：Ca
2+
,Mg
2+
,Mn
2+
,Zn
2+
,Co
2+
,Cu
2+
,Fe
2+
等。金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶
华东理工大学,酶工程》讲义
34
3．修饰方法
(1)加入一定量的乙二胺四乙酸（EDTA）等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。
(2)通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。
(3)用不同的金属离子加入到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。
(4)测活，选择适宜的金属离子作为修饰剂，去置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
例如：将锌型蛋白酶的Zn
2+
除去，然后用Ca
2+
置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。
若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。
第六节 修饰酶的性质及特点
一、热稳定性：增加
1．修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性。
2．增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。
二、抗原性：部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。
三、体内半衰期：延长
四、最适pH：有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化
五、酶学性质的改变：绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。
六、对组织的分布能力变化：对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。举例：辣根过氧化物酶。
第七节 酶化学修饰的应用
一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用
1,研究酶的空间结构
2,确定氨基酸残基的功能
3,测定酶分子中某种氨基酸的数量
二、化学修饰酶在医药和生物技术中的应用
三、蛋白质化学修饰的局限性
1
第一章 概论
第一节 研究内容
一、概念
酶工程（ Enzyme Engineering）是随着酶学迅速发展，特别是应用通广，使酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学。从应用目的出发研究酶，就是在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。50年代，这一方面文章不超过10篇，60年代起迅速发展，当时日本研究就很活跃，现在仍是世界上领先国家之一。
二、应用领域
1969年，日本田边制药公司的一位科学家采用固定化氨基酰化酶，成功地将化学法合成的氨基酸转化成人体可以直接利用的氨基酸，成本只有传统工艺的60%，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。现在酶工程已深入各个领域。
⑴ 为工业生产锦上添花。
⑵ 环境卫士：利用聚丙乙烯，海藻酸钙包埋热带假丝酵母或者将假单孢菌固定在无烟煤颗粒上，形成一个固定化的薄膜，这种固定化反应器可以分解废水中的酚，几分钟内0.01%
降道0.0001%。
⑶ 生物传感器。
⑷ 医药上：尿激酶（有效溶血物质）。
⑸ 生物芯片。
三、研究内容
⒈ 酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶开发。
⒉ 酶生产中基因工程技术的应用。
⒊ 酶与细胞固定化。☆
⒋ 酶分子改造与化学修饰，以及酶结构与功能的研究。
⒌ 酶的应用性开发。
⒍ 酶反应器的研究（包括反应检测）
⒎ 酶抑制剂、激活剂开发及应用研究。☆
⒏ 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究☆
⒐ 非水相介质中酶的催化。☆
第二节 国内外酶制剂工业概况
一、国内外酶制剂生产及销售状况
二、我国酶制剂生产的不足点
⒈ 科研经费和技术力量投入不够，酶制剂的菌种产酶水平与国外有较大差距。
⒉ 酶的品种和品级系列存在差距。
⒊ 生产装备落后，提炼工艺研究重视不够。
三、我国酶制剂生产努力方向。
⒈ 增加科研投入
⒉ 开发活性专一菌株。
⒊ 研究新的分离技术，降低分离纯化成本。
第三节 生物芯片
一、生物芯片简介
（一）生物芯片的来源
（二）生物芯片的概念
生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流华东理工大学,酶工程》讲义
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体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。
（三）生物芯片技术主要包括四个基本要点
⒈ 芯片方阵的构建：芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上。
⒉ 样品的制备：生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。
⒊ 生物分子反应：生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率。
⒋ 信号的检测：芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，
通过扫描以获得有关生物信息。
（四）生物芯片的主要类型
生物芯片技术是一种高通量检测技术，它包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。
⒈ 基因芯片(Genechip)又称DNA芯片（DNAChip）。它是在基因探针的基础上研制出的，
所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，
然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。
基因芯片是生物芯片研究中，最先实现商品化的产品。目前，比较成熟的产品有检测基因突变的芯片，检测细胞基因表达水平的表达基因芯片。
⒉ 蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。如果加入与之特异性反应的带有特殊标记的蛋白质分子（抗体或抗原），两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。此种方法构建的模型所需蛋白质的量极少，
反应相对较快，蛋白质芯片稳定性较好，灵敏度较高，在临床检测方面大有发展。
⒊ 芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统，它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成，从而使现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化，属未来生物芯片的发展方向。
二、生物芯片的应用前景展望
生物芯片的成熟和应用一方面将为下个世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、
航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命；另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段，故必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台。
（一）基因芯片
它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。
这些应用主要包括基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图以及等方面。
⒈ 表达检测。人类基因组编码大约10万个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mRNA（信使RNA，可简单理解为基因表达的中介物）的实验工具很重要。有关对芯片技术检测基因表达及其敏感性、特异性进行的研究实验表明芯片技术易于监测非常大量的mRNAs并能敏感地反映基因表达中的微小变化。
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利用基因芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共157,112个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。
⒉ 寻找新基因。有关实验表明在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可用于基因发现，如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现的。
⒊ DNA测序。人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展，芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。如使用美国Affymetrix公司1998年生产出的带有13.5万个基因探针的芯片就可以使人类DNA解码速度提高了25倍。
核酸突变的检测及基因组多态性的分析。有关实验结果已经表明DNA芯片技术可快速、
准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析必将越来越重要。
（二）蛋白质芯片
蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。
人类基因组大规模测序工作接近尾声，以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临。蛋白质芯片作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具，必将发挥越来越大的作用。
美国Ciphergen公司的芯片能够从人体体液或组织中获取大量的微量蛋白质，以绘制捕获的蛋白质图谱。其第一代系统已经使用了两年，功效显著。蛋白质芯片可以准确而迅速地提供多标记蛋白质的“显性指纹”---一种比任何单个标记更有效的疾病阶段指示剂。在以往的实验中，Ciphergen公司的科学家们利用蛋白质芯片系统对来自健康个体和不同癌症阶段的患者的血清样本进行了研究。仅在三天内他们找到了6种前列腺癌的潜在标记，而利用以往的标准技术，发现和确定同样数量的潜在标记可能需要数月至数年的时间才能得到证明。
印度普度大学的科学家们宣布，他们已经率先研制成功一种蛋白质生物芯片，通过这种生物芯片，医生可以利用含有生物芯片的医疗设备迅速而准确地对一般疾病进行诊断并对某些化学治疗方法进行评估；它还可以帮助士兵在战场上探测到来自敌方的生化攻击；对农作物的病虫害进行探测并发出警告；同时它还能帮助科学家们对人们常用来治病的植物进行分析，看它们是否确实含有具治疗效果的化学成份，从而在此基础上研制并生产出新的药品。
（三）芯片实验室
美国普杜大学已开发出一种芯片实验室技术，将化学实验室的专用仪器缩微在芯片上，
芯片上的仪器缩小到常规仪器的千分之一甚至百万分之一。这项成果使科学家能在一块硅片上堆积几十个或几百“芯片实验室”，每个“实验室”都能进行复杂的化学分析，从而可减少很多化学和医学分析的费用，并提高效率。
三、生物芯片的研发和生产现状
（一）国际
美国Affymetrix公司是世界上最有影响的基因芯片开发制造商，该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，
拥有多项专例。
目前，国际上已经有许多从事生物芯片研究的公司，每家公司的芯片技术都各具特色，
应用目的也不尽相同，如加利福尼亚州森尼维尔的Hyseq公司,声称拥有最快的基因分析器,
它们由机器人制造,机器人把DNA探针滴到过滤纸上,其DNA阵具有优势,破译DNA的速度最华东理工大学,酶工程》讲义
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快。帕洛阿尔托的Syntenl公司声称它的芯片衡量细胞中基因活动最有效，公司正在利用基因芯片研究前列腺癌等疾病。圣迭戈的Nanogen公司计划进入诊断艾滋病毒和其它传染病的市场。Incyte制药公司与Affymetrix公司合作生产针对各种疾病的基因分析芯片供药品研究使用。
但是，基因芯片要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有一些关键问题亟待解决如(1)基因芯片的特异性的提高；(2)样品制备和标记操作的简化；(3)增加信号检测的灵敏度；(4)高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发。
（二）国内
⒈ 上海细胞所与陕西超群公司；⒉ 第四军医大与陕西高科集团；⒊ 联合基因科技公司与第一军医大；⒋ 清华大学生物芯片研发中心。
四、我国生物芯片产业化的前景
（一）市场
⒈ 药物筛选和新药开发。
⒉ 中药基因组学研究和我国的中药现代化。
中药基因组学的含义是通过现代科学技术手段结合传统中药理论和现代科学理论，将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达调控的影响关联起来，在分子水平上用现代基因组学，特别是功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中药理论及作用机理。
⒊ 疾病诊断
基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
人类所有疾病都直接、间接与基因有关，根据基因概念，人类疾病可分为三大类。第一类为单基因病。这类疾病已发现6000余种，其主要病因是某一特定基因的结构发生改变，
属于单基因病的如多指症、白化病、早老症等。第二类为多基因病。这类疾病的发生涉及两个以上基因的结构或表达调控的改变，如高血压、冠心病、糖尿病、哮喘病、骨质疏松症、
神经性疾病、原发性癫痫、肿瘤等。第三类为获得性基因病。这类疾病由病原微生物通过感染将其基因入侵到宿主基因引起。
⒋ 环境保护及其他
在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。基因芯片还可用于司法。另外芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，
也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场尚待开发。
（二）生产
⒈ 制造技术
基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、
准确的检测和分析。
⒉ 基因、蛋白质等前沿研究
对生物芯片工业来讲，除去制作技术外，关键就是芯片上放置的基因和蛋白质等物质了。
如果制作用于检测某人核苷酸多态性以诊断某种遗传病，或者用于基因测序，那么芯片探针上一般放置的是有8个碱基的寡聚核苷酸片段，基因芯片和蛋白质芯片则相应放置的是基因标志性片段EST（可表达的基因标志性cDNA序列片段，可以通过对mRNA的双端尾侧的几百个碱基进行测序得到）、全长基因或蛋白质。因此制作生物芯片首先要解决的是DNA探针、
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基因以及蛋白质的尽可能全面和快速的收集问题。
世界三大基因库分别是：人类基因克隆库；人类基因探针库；小鼠基因克隆及探针库。
目前基因芯片上面使用最多的是基因标志性片段EST，可以从公共数据库中查找获得。
DBEST是目前最大的一个公共数据库。
五、有关生物芯片的上市公司
目前为止，尚未有一家上市公司真正进入生物芯片领域并实现产业化生产，有关的上市公司都只是计划涉足、有重组进入的可能或处于前期科研阶段。这些公司分别是：张江高科、
上海医药、复星实业、哈高科、河池化工、友好集团、上实联合、星湖科技等公司。
第二章 酶学与酶工程
第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制
一、酶的分类
⒈ 氧化还原酶：脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等
⒉ 转移酶：酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等
⒊ 水解酶：脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶
⒋ 裂合酶：这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。
⒌ 异构酶：此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移、分子内裂解等
⒍ 接酶（合成酶）：这 类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、
C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。
二、酶的组成和结构特点
⒈ 单体酶
⒉ 寡聚酶
⒊ 多酶复合体
辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。
辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。
辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基。
三、酶的作用机制
⒈ 酶的作用过程
酶的活性部位：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
⒉ 酶与底物的结合模型
锁和钥匙模型；诱导锲合模型。
⒊ 酶的催化作用
⑴ 研究方法,
① 从非酶系统模式获得催化作用规律，其优点是反应简单，易于探究，其缺点是非酶系统与酶系统不同，其实验结果不一定完全适合于阐明酶的催化作用。
② 从酶的结构与功能研究中得到催化作用机理的证据。
⑵ 酶的催化作用
① 广义的酸碱催化：能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱
例：HA=A
-
+H
+
HA为酸，A
-
为碱
HA（酸）+A=AXH（酸催化） AXH+B
-
（碱）=Y+BH+A
-
（碱催化）
在酶蛋白中可以作为广义酸碱的功能基团见表。
华东理工大学,酶工程》讲义
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共价催化：底物与酶以共价方式形成中间物。这种中间物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提高催化反应速度。
共价催化的常见形式是酶的催化基团中亲核原子对底物的亲电子原子的攻击类似亲核试剂与亲电子试剂。
亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和电子的原子中心。带正电离子如Mg
2+
,NH3
4+
是亲电子的，含有-C=O及-C=N-基团的化合物也是亲电子的，其中的O 及N都有吸引电子的倾向，因而使得邻近的C原子缺乏电子。它发挥催化作用的步骤是从底物移去电子。
亲核试剂就是一种试剂具有强烈供给电子的原子中心。它发挥催化作用是由于它能供给底物一对电子。
③ 邻近效应及定向效应
所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。
④ 变形或张力
⑤ 酶的活性中心为疏水区域
第二节 酶作为催化剂的显著特点
一、催化能力
二、专一性
⒈ 对所作用的底物和催化的反应都是高度专一性
⒉ 催化反应的立体专一性
⒊ 调节性：① 酶浓度的调节；② 激素调节；③ 共价修饰调节；④ 限制性蛋白水解作用与酶活力调控；⑥ 反馈调节；⑦ 金属离子和其他小分子化合物的调节。
第三节 酶作用动力学
一、单底物酶促反应动力学（Michaelis-Menten学说）
酶和底物的作用是通过酶和底物生成复合物而进行的。底物浓度较低时，酶的活性中心未被饱和，反应速度随底物浓度上升而呈正相关。当底物浓度较高，酶的活性中心被饱和或趋于饱和时，反应速度增加率较小或不再增加。因为酶-底物复合物的生成速度相应较快，
而分解速度相对较慢，成为整个反应的限速步骤。
二、恒态假设
在初速度范围内，酶浓度远远低于底物浓度，则酶-底物络合物浓度也很低。除了反应和初期的瞬间，ES的变化速率相对于[P]而言可以忽略。形成的ES络合物维持恒态，即浓度保持不变，解离的速度与形成的速度相同。
三、King-Altman法
中间络合物超过两个以上时用此图解法，简便可靠。
要求将反应写成循环形式，使所有的含酶种类（包括E在内）互相转变展示出来，每步都用К表示，К是这步速度常数和有关游离底物浓度的乘积，如不涉及底物，那么只有速度常数，所以上式最后推导成,
一般来讲，这个方法大体包含下列几步,
第一，写出其反应历程的方程式，将品种不同的酶存在形成（Enzyme Specles）安排成封闭的几何图形，每一种酶存在形式作为几何图形的一角。
第二，写出n-1线的所有可能的图形，n 为几何图形的角数（即酶存在形式的数目），
它的n-1线图形的总数应为：m!/(n-1)!/(m-n+1)!式中m为完整的几何图形的线段数目。注意当反应历程构成的基本图形包含有不止一个封闭圈时，在写出n-1线图形时，必须把这些含有各种各样的封闭圈的图形除去。
第三，按照King-Altman图形可以写出每种酶存在形式的浓度和总酶浓度的比例，它们华东理工大学,酶工程》讲义
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具有基本上相似的表达式,
Ex/Et=若干项的加和/相同的分母
分子的每一项都由一个King-Altman图形构成，对于某一种特定的酶的存在形式，它的分子的每一项可以由King-Altman图形中每一根线所表示的由其他酶形式转变为这种形式的速度常数，或速度常数与配基浓度彼此相乘而得到。
第四节 影响反应速度的因素
一、酶浓度对反应速度的影响
在酶反应中，如果底物浓度足以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。由米氏方程推导：v=V[S]/(Km+[S])又V=K2[E]所以v=K2[S]/(Km+[S])*[E]
当[S]维持不变时，v正比于[E]。这里使用的酶必须是纯酶制剂或不含抑制剂的粗酶制剂。
二、PH对酶反应速度的影响
大部分酶的活性受其环境pH 的影响，有最适pH。
用酶活对pH作图，可得到钟罩形的曲线。酶的最适pH目前还只能用实验方法测得，随底物的浓度，温度和其它条件的变化而变化。PH对酶活的影响主要表现在以下几个方面,
⒈ pH的改变可以破坏酶的空间构象，引起酶活的丧失。这种失活作用或者是可逆的，
或者是不可逆的。
⒉ PH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程受到影响。
⒊ PH的改变影响活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合。
⒋ PH的改变影响底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物。
PH可以对游离酶或酶-底物复合物产生一定的效应，从而导致对酶反应的速度产生显著的影响，其机理相当复杂。
三、温度对酶反应速度的影响
当温度升高时，与一般的化学反应一样，反应速度加快。随着温度升高而使酶蛋白逐步变性，反应速度随之下降。酶反应存在着一个最适温度，反应速度对温度作图，所得曲线为钟罩形，顶点为最适温度，它受到作用时间、酶的浓度、底物、激活剂或抑制剂等因素的影响。在变性温度以内，温度对酶催化反应速度的影响也服从Arrhenius方程。温度每增加
10℃，酶催化反应的速度增加1-2倍。
四、抑制剂对酶反应速度的影响
第五节 酶抑制作用的概念和分类
一、概念
能降低酶催化反应速度的因素很多，通常将其分为失活作用和抑制剂作用两类。
⒈ 失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。
⒉ 抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。
⒊ 去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。抑制剂分子的全部或一部分通过非共价见键或共价键和酶结合，直接影响酶的催化作用。去激活作用通过去除金属离子而间接地影响酶的活性。当金属离子去除后，底物与酶的结合减少，实际上是降低了底物的有效浓度。
⒋ 阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化，而抑制作用是指一定量酶分华东理工大学,酶工程》讲义
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子催化效力的减少，不涉及酶分子合成的问题。
二、抑制程度的表示
一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示方法,
⒈ 相对活力分数（残余活力分数）a=Vi/Vo
⒉ 相对活力百分数（残余活力百分数） a%==Vi/Vo*100%
⒊ 抑制分数，指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo
⒋ 抑制百分数 i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%
通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。
三、抑制作用的分类
不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不可逆抑制作用）
可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）
四、抑制作用的定义
⒈ 不可逆抑制作用
抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。由于被抑制的酶分子受到不同程度的修饰，故不可逆抑制也就是酶的修饰抑制。
⒉ 可逆抑制作用,
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。这种抑制剂又可通过两种不同的方式与酶结合而抑制酶的活性。
⑴ 抑制剂与酶的活性中心相结合，阻断酶分子的结合基团或催化基团，或与酶-底物中间复合体结合，从而阻止底物形成产物。这类抑制剂在酶分子上的结合部位基本上和底物相同或相近，故称为同位抑制剂，这种抑制作用也就叫做同位抑制作用。
⑵ 抑制剂和酶分子活性中心以外的部位相结合，通过酶分子空间构象的改变，从而影响底物与酶的结合与酶的结合或酶的催化效率。由于抑制剂与酶的结合部位不同于底物的结合部位，故这种抑制剂称为别位抑制剂。为了表示其可引起酶的变构，也可译作别构抑制剂。
这类抑制作用也就叫作别构抑制作用。可引起别构作用的酶称位别构酶，别构酶大多是有一个亚基的寡聚体酶，将在下章予以详细介绍。而本章主要介绍同位抑制作用。
五、可逆抑制和不可逆抑制作用的鉴别
除了根据上述透析，过滤等物理方法视其能否去除抑制剂来区别不可逆抑制和可逆抑制作用外，还可以利用下列两种动力学方法来加鉴别。
⒈ 将不同量的酶加入含有等量底物和抑制剂的试管中，使各管的体积相等，测定酶促反应的初速度，并用酶浓度[E]对初速度V作图。当反应系统中不加抑制剂时，可得到一条通过零点得直线（直线a）。当反应系统中有一定量的不可逆抑制剂时，后者可抑制一定量的酶，只有当加入酶的摩尔数超过抑制剂的摩尔数，即尚有剩余的酶分子时，才能表现活力。而一旦具有活力后，其反应的初速度随酶量的增高程度应和无抑制剂时一样，故[E]对V作图时得到一条原点向右移而与直线a平行的直线b。当反应系统中含有一定量的可逆性抑制剂时，因抑制剂的量是恒定的，对酶的抑制分数也是恒定的，因此可得一通过零点但斜率较低的直线C。
⒉ 一定量的抑制剂先与一定量的酶保温一定时间后，
取出不同量的混合液加至等量的底物中，各管的体积也保持华东理工大学,酶工程》讲义
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相等，测定反应的初速度，也用酶浓度[E]对反应初速度V作图（图）。如果保温混合物中不加抑制剂，也得到一条通过零点的直线a。而当保温混合物中含有不可逆抑制剂时，后者使一定比例的酶受抑制，相当于减少混合物中酶的浓度，即使测活的各管中加入混合物的量不等，但其中有活性和无活性酶的比例相同，且因抑制剂不可逆，已灭活的酶不会因抑制剂的稀释而复活，故其抑制分数不变，[E] 对V的作图仍为一直线，唯其斜率较低（直线b）。
但当保温混合物中含有可逆抑制剂时，抑制剂和酶在测活系统中受到同样程度的稀释，加入混合物的体积逾大，稀释的倍数逾小，则抑制剂的浓度逾大，抑制程度也逾大，故可得到一条下弯的曲线C。
第六节 可逆抑制作用
一、竞争性抑制作用
⒈ 含义：较常见而重要的可逆性抑制，指抑制剂I
和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥。已结合S的ES复合体不能再结合I，已结合I的EI复合体也不能再结合S，故不可能存在IES三联复合体。可用右上的反应式表示,
当反应体系中加入I时，可破坏E和ES的平衡，使ES→E→EI，此时再增加S的浓度，
又可逆转而使EI→E→ES，故再酶量恒定的条件下，反应速度与[S]和[I]的比值有关。
⒉ 竞争性抑制的机理
竞争性抑制剂之所以能和底物竞争与酶结合并与底物互相排斥，常常由于抑制剂与底物在结构上有类似之处。当它与酶结合时，很可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，
从而阻断了底物和酶的结合，降低酶和底物的亲和力，即Ks增大。同样，底物和酶结合后，
也可阻碍抑制剂与酶蛋白上相同的基团结合。这就是抑制剂和底物互相竞争的原因。例如丙二酸和琥珀酸竞争而抑制琥珀酸脱氢酶，赖氨酸和精氨酸酶，都是由于抑制剂与底物结构相似的缘故。
⒊ 举例
某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用,
药物（抑制剂） 被抑制的酶 竞争底物 临床应用及机理
抗菌作用
磺胺药 二氢叶酸合成酶（细菌） 苯甲酸
（抑制四氢叶酸）
氨基蝶呤 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸 抗白血病
5-氟尿嘧啶 尿嘧啶核苷磷酸化酶 尿嘧啶 抗癌作用
（5-FU） （胸腺嘧啶核苷磷酸化酶）（胸腺嘧啶） （抑制核苷酸合成）
抗通风
别嘌呤醇 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤，次黄嘌呤
（抑制尿酸生成）
止血，抗纤溶
6-氨基已酸 纤溶酶 -赖氨酸-氨基酰
（抑制纤溶酶）
肾上腺素
苯丙胺（麻黄素）单胺氧化酶
（去甲肾上腺素）
中枢兴奋，抗哮喘
⒋ 过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复合体后被活化的过渡形式，一般用S*表示，
由于其能障小，和酶结合就紧密得多。如抑制剂的化学结构能类似过渡态底物，则其对酶的亲和力就会远大于底物，从而引起酶的强烈抑制。过渡态底物的类似物，它们大多数是竞争性抑制剂，对相应酶的Ki要比底物的Km小2-5个数量级，故其抑制效率比基态底物类似物高得多。
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二、反竞争性抑制
⒈ 概念：这类抑制剂I不和游离酶结合，只能和
ES中间复合物结合成EIS，但EIS不能释出产物。S和
E的结合不但不排斥I，反而促进了I和E的结合，可表示如右,
⒉ 举例：单底物酶的反竞争性抑制作用非常罕见，如芳香基硫酸基的肼解。氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用也属于反竞争性抑制。而多底物中反竞争抑制现象非常重要，，如双底物乒乓机制中，
任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性抑制剂。
别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，可抑制次黄嘌呤转变成黄嘌呤及尿酸。但别嘌呤也是黄嘌呤氧化酶的底物，可受此酶催化而变成氧嘌呤醇又称别黄嘌呤，后者是黄嘌呤氧化酶的非竞争性抑制剂。这是别嘌呤醇用于治疗痛风症（血中尿酸过多，沉积于软骨、肌腱等组织而引起关节炎的一种疾病）的原理。
三、混合型抑制
⒈ 含义：基本上和非竞争性抑制剂相似，S或I和E的结合互不相关，ES可再接I，IE也可再接S，但Ks不等于K′s，Ki
也不等于K′i,
⒉ 反应速度公式及作图
1/v=Km/Vm（1+[I]/Ki）*1/[S]+1/Vm（1+[I]/ Ki） 如左图
⒊ 动力学特点
⑴ 当有I存在时，Vm
减小，Km可大可小，在Vm
和Km均减小的情况下，Vm
的减小甚于Km的减小，故
Km/Vm增大。
⑵ Km和Vm的改变程度均与[I]成正比。
⑶ 抑制分数与[I]成正比，与[S]成正比
（Ki>K′i）或反比（Ki<K′i）
四、其他可逆抑制
⒈ 部分抑制：以上讨论的都是形成死端络合物的抑制，而这些复合物不会释放产物。假如混合型抑制中ESI复合物也能释放产物即为部分抑制。
⒉ 底物抑制：高浓度的底物会抑制自身转化为产物。
如琥珀酸脱氢酶，该反应需要底物的两个羧基同时与酶分子结合,
当底物浓度很高时，可能会产生以下情形,
所以反应不能发生，除非有一个分子解离，
反应才能进行，底物抑制特征,
⒊ 产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时存华东理工大学,酶工程》讲义
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在的，因此，考虑产物对反应速度的影响，可能具有一定的意义。
第七节 不可逆抑制作用
不可逆作用可分为非专一性和专一性两大类。
不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制，最后达到完全抑制。抑制剂的效应，应以速度常数表示，而不能以平衡常数表示，它决定于给定时间内某一浓度抑制剂所抑制酶活性分数。
一、非专一性的不可逆抑制作用
⒈ 概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。但某些非专一性抑制剂因作用条件不同，作用对象不同，或由于位阻效应以及活性部位其它基团的存在，也能显示专一性抑制效应。
⒉ 非专一性抑制剂的类型,
⑴ 酰化剂；可用通式表示为RC=O
⑵ 烃基化剂：R-X表示。如卤烃衍生物，由于卤原子的强电负性，使烃基带部分正电荷，有利于酶上的一些亲核基团的攻击。
⑶ 含活泼双键的试剂：含活泼双键的试剂，如N-乙基顺丁烯二酰亚胺、丙烯氰等。它们可与酶分子上的-SH、-NH2等基团起加成反应。
⑷ 亲电试剂：常见的有四硝基甲烷，它可使酶分子上的酪氨酸侧链硝基化。产物具有特殊光谱性质，易于被检测。
⑸ 氧化剂：一些二硫化合物可使酶分子上的-SH氧化。如酶分子上的甲硫氨酸的硫醚基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基等，都可在光敏剂存在下发生温和的光氧化作用，使酶失活。
⑹ 还原剂：以二硫键为必需基团的酶，可被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。
⒊ 通过非专一性不可逆抑制作用判断酶分子中必需基团的性质和数目
必需测定酶活力降低的反应速度常数和侧链基团被破坏的反应速度常数，比较它们之间的关系，并加以分析才能作出判断。邹承鲁教授创立了一种方法。他在测定抑制作用过程中酶活力剩余分数a的同时，又测定酶分子上某必需基团的剩余分数Le。他假定同类基团中如有n个是必需基团，而且所有这类基团与抑制剂反应活性相等，并且又只有n个必需基团都未被破坏的酶分子才能保持活性；那么某必需基团的剩余分数Le将会和该类基团总的剩余分数L相同。根据这些假定他得出,a=Len或a1/n=Le，并且a1/n=L，取对数得：lga=nlgL。
把lga对lgL作图得一直线，其斜率为n，从而求得该必需基团得数目。该判断酶分子中心必需基团数目得作图法，已被广泛应用于酶化学修饰的研究。
二、专一性不可逆抑制剂的类型
⒈ Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂具有与底物相似的可与酶结合的基团，同时还具有一个能与酶其它基团反应的活泼基团。它之所以有专一性，是由于此抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和它与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。从两个解离常数的比值，可决定其专一性程度。如果比值在三个数量级以上，则这个不可逆抑制剂是一个专一性很强的抑制剂。判断抑制作用是否发生在酶的活性部位，常用的判断方法如下,
⑴如果抑制剂的作用是化学计量的，并且作用后酶活性全部丧失，说明它全部结合在酶的活性部位。
⑵ 如果底物和竞争性抑制剂能保护酶，使之抵抗不可逆抑制的作用，即可证实此不可逆抑制剂肯定结合在酶的活性部位。
⑶ 采用简单方法使酶失活，如失活酶不会再与抑制剂反应，则证明该不可逆抑制剂是华东理工大学,酶工程》讲义
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结合在酶的活性部位。
⒉ Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，即能与酶结合，也能被酶催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团(latent reactive group)，该潜伏反应基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合，使结合物停留在这种状态，
不能再分解生成产物，酶因而致死，使酶遭受抑制。这种抑制剂专一性很强，又是经酶催化后引起，所以被称为自杀性底物。
⑴ 天然酶的自杀底物
在西印度群岛中有一种称为Ackee Blighia sapida的植物，成熟的果实是牙买加岛居民的主要食品，但未成熟果实的假种皮却含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）其结构式如右,
此种降糖氨酸的降解产物却是人体中不少重要黄素酶的自杀底物。例如，此物可专一地抑制异戊酰-CoA脱氢酶，因而导致血中异戊酸的积聚。此种生理异常通过中枢神经系统可导致剧烈呕吐，称为牙买加呕吐病。通常认为这种致命性疾病的死亡是由于低血糖所引起。
患者血中葡萄糖水平只有0.5mmol/L，约为正常人的十分之一浓度。
⑵ 治疗用人工合成的酶自杀底物
治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。
第八节 酶抑制剂的应用
一、医学上的应用
⒈ 青霉素类药物：可以抑制革兰氏阳性细菌胞壁肽的合成所需要的转肽酶。抗菌素的问题就是一些菌株产生耐药性。如长期使用青霉素，细菌会诱导出一种适应酶β-内酰胺酶，
可水解青霉素中的内酰胺环，使之成为不杀菌的青霉酸酰。（不能形成D-丙氨酸-D-丙氨酸结构，丧失了杀菌能力）
对付办法：已合成了几个β-内酰胺酶的自杀底物，如：一种青霉素的亚砜衍生物，能和抗性细菌的β-内酰胺酶结合使酶自杀，就可再用青霉素。图如右所示。
两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽酶，导致胞壁合成障碍。
⒉ 中药对酶活性的抑制是近年来又一吸引人的研究领域。
二、农业生产上的应用
农业应用面很广，仅杀虫剂农药方面讨论。农药三大类（有机磷，氨基甲酸酯类，除虫菊酯类）
农药杀虫的机理-抑制生物体中的靶酶。
例如：有机磷对生物体酶的抑制研究最清楚--靶酶：乙酰胆碱酯酶。
有机磷进入人体后在胆碱酯酶的作用下，酶促水解后与E-Ser-OH作用--O-CHE有机磷的急性毒性，主要归功于对胆碱对神经突触后膜上的乙酰胆碱酶（ACHE）的抑制，造成突触华东理工大学,酶工程》讲义
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间隙乙酰胆碱的积蓄，而持续地作用于受体，引起一系列胆碱能神经过度兴奋而死亡。
三、工业生产上应用
蛋白酶：细菌蛋白酶（洗涤剂）；木瓜蛋白酶（啤酒）。食品加工过程中由于多酚氧化酶的作用，发生酶促褐变，使果蔬类加工食品货架寿期缩短。多酚氧化酶是含铜金属蛋白，因而许多金属螯合剂是其抑制剂。真正对食品加工和保藏有实际价值的抑制剂主要是抗坏血酸和柠檬酸，或二氧化硫亚硫酸盐。葡萄酒的氧化变褐，也可用抗坏血酸或二氧化硫防止，即把葡萄糖和葡萄糖氧化酶-过氧化酶体系封装于高速透氧、低速透水的塑料袋中，作成氧清除剂加于罐头食品，使罐头顶空中氧被除去。这种体系也用于虾肉变色，除去啤酒中的氧。
第三章 固定化酶
第一节 概述
一、固定化酶的发展史
二、固定化酶的优缺点
优点：多次使用，稳定性高；纯化简单，底物与产物容易分开；反应条件易控制，可以装塔连续反应；较水溶性酶更适合于多酶反应；辅因子的再生和固定化，使固定化酶与能量再生体系，氧化还原体系偶联，扩大应用范围；增加产物的收得率，提高产物质量。
缺点：载体与试剂较贵，酶固定化回收率低；胞内酶固定化还要增加分离成本；适用于水溶性小分子底物，大分子由于载体阻拦，不易触及酶；固定单酶反应为多，多酶反应，尤其是辅因子固定化需进一步开发。
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一、影响固定化酶性质的因素
⒈ 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
⒉ 载体的影响：⑴ 分配效应；⑵ 空间障碍效应；⑶ 扩散限制效应。
二、固定化酶的性质
⒈ 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降
⒉ 固定化对酶稳定性的影响
⑴ 操作稳定性提高，在操作中可以长时间保留活力，半衰期在一个月以上。
转化酶最长，30℃，530天残余活力50%。葡萄糖异构酶最少，60℃，14天残余活力50%。
⑵ 贮存稳定性比游离酶大多数提高。
固定化的胰蛋白酶在2℃下，置于0.0025N Hcl中贮存数月活性不下降。
⑶ 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。研究50种，30种升高，12种不变，8
种下降。
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%；用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存活50%。用DEAE -纤维素通过离子结合的固定化转化酶在40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一条件下存在100%。
⑷ 对分解酶的稳定性提高。
⑸ 对有机溶剂的耐受力升高
固定化后酶稳定性提高的原因,
⑴ 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活性是靠其分子的三维结构来维持的，所以其分子伸展变形会破坏活性中心，是引起失活的原因之一。
⑵ 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。
⑶ 抑制自降解，提高了酶稳定性。可能固定化酶载体不允许酶蛋白自透过。
⒊ 最适pH的变化
华东理工大学,酶工程》讲义
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⑴ 载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。
⑵ 载体带正电荷，最适pH向酸性方向移动。
⒋ 最适温度变化，热稳定性升高，最适温度升高。因为最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。
⒌ 对底物专一变化-对大分子底物作用力下降。
⒍ 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化
由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境
对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程,
Km'=Km/ρ(表观米氏常数)
⑴ 载体与底物带相同电荷，[Si]<[S],则ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。
⑵ 载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，ρ>1,Km’<Km
三、评价固定化酶的指标
⒈ 酶活定义（游离）：在25℃,具有最适底物浓度，最适缓冲液离子强度和pH系统内一分钟转化一个微摩尔底物所需的酶量。
固定化的单位定义为：转化底物的量/固定化酶的单位重量（单位面积）/单位时间,单位是：μmol/mg(cm
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)/min。
⒉ 活力回收=固定化酶总活力/被固定化游离酶总活力*100%，或称偶联效率、活力保留百分数。
⒊ 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）
第三节 固定化酶的制备
一、一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。
⒈ 四大类方法：吸附法（包括电吸附法）；共价法（无机多孔材料）；交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）。
各类固定化方法的特点比较,
吸附法
比较项目
物理吸附 离子交换吸附共价法 包埋法 交联法
制备难易 易 易 难 较难 较难
固定化程度 弱 中等 强 强 强
活力回收率 较高 高 低 高 中等
载体再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能
费用 低 低 高 低 中等
底物专一性 不变 不变 可变 不变 可变
适用性 酶源多 广泛 较广 小分子底物、药用酶 较广
⒉ 选择方法依据：⑴ 酶的性质；⑵ 载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等；⑶ 制备方法简便易行。
⒊ 衡量依据：⑴ 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率；⑵ 研究它的最适反应条件（底物浓度、pH值、温度、离子强度等）；⑶ 稳定性和不稳定原因的探究；
⑷ 对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。
二、酶的固定化方法
（一） 吸附法
华东理工大学,酶工程》讲义
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⒈ 物理吸附
选择载体的原则：⑴ 要有巨大的比表面积；⑵ 要有活泼的表面；⑶ 表面自由能有自发降低的趋势；⑷ 要控制颗粒形状、大小，便于装柱进行连续反应。
常用载体,
无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、多孔玻璃、硅胶。
一般吸附量<1mg蛋白/克吸附剂。
有机载体：火棉胶膜、胶质膜、微孔玻璃载体。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂
举例：10ml 2%(W/V)的葡萄糖淀粉酶溶液，在pH4.8，30℃下，以活性碳为吸附剂，搅拌15min，过滤，得固定化酶。
⒉ 离子交换吸附法
多糖作骨架：离子交换剂结合蛋白质能力较高：50-150mg蛋白/克吸附剂。
吸附剂的选择原则：对酶有高亲和力，不会引起酶失活；吸附容量大，不吸附反应产物和酶抑制剂。
影响吸附操作因素,
pH：pH变化会引起酶、载体、电荷的变化，一般在等电点时的吸附量最大。
离子强度：一般盐阻止吸附。
温度：温度升高，蛋白质吸附降低。
第一个有工业应用价值的固定化酶：氨基酰化酶：DEAE-Sephdex A-25吸附。
举例：将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4含 0.5M NaCl,1mM CaCl2
和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc
pH4.5（1mMCaCl2和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS
中备用。
(二)共价法(载体偶联法)
⒈ 概念
所谓共价法就是使酶蛋白的非必需基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）
通过共价键和不溶性载体形成不可逆的联接。要使载体与酶形成共价键，必需首先使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反应。
⒉ 一般认为共价法的特点如下,
① 酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的半衰期较长。
② 制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构发生变化。
③ 制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。
④ 载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pH，浓度的改变。
⒊ 常用载体
⑴ 天然高分子。如纤维素，葡聚糖凝胶（Aephadex），琼脂糖（Agarose，Sepharose），
卡那胶，淀粉以及它们的衍生物。（利用-OH）
⑵ 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用
-NH2）
⑶ 无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。（要加上一个基团）
⒋ 技术要点
⑴ 将所选用的载体上的有关基团活化，然后和酶蛋白上有关基团发生偶联反应。（直接活化或另接一反应基团）
⑵ 在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。（接手臂）
⒌ 酶蛋白上可供联接的基团：⑴ 游离氨基；⑵ 游离羧基；⑶ 巯基；⑷ 咪唑基；⑸
酚基；⑹ 羟基；⑺ 甲硫基；⑻ 吲哚基；⑼ 二硫键。
华东理工大学,酶工程》讲义
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⒍ 分类：⑴重氮法；⑵ 叠氮法；⑶ 缩合法；⑷ 烷化反应法；⑸ 硅烷化反应法；⑹
溴化氰法。
⑴ 重氮法 反应示意式如下,
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，
用这些载体制备了不少固定化酶。
方法原理如下,
① 用双功能试剂β-硫酸酯乙砜基苯胺
（SESA），连接于被活化（-OH）的纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。
② 在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。
③ 把酶偶联于ABSE-纤维素上。
反应式及原理如右所示,
例：5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）。
方法如下：⑴纤维素- OH的活化，即用0.6%NaOH,加热至85℃，维持时间30min。 ⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在40℃时用1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣，以SESA：
纤维素=1：1（干重）在pH13（0.5N NaOH调），85℃，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。
⑶ 去除多余的苯胺基，依次用0.05N NaOH和水洗涤。 ⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及
1N HCl在10℃以下反应15min，然后用预先冷却的0.05N HCl及H2O洗涤抽干即成。 ⑸ 偶联，先在酶液中加入硫酸铵（1：0.007）,然后用1M Na2CO3调pH值6.5，加入经重氮化的
ABSE-纤维素，再调PH值7.0，在冰浴中反应两小时，过滤，洗涤抽干即为固定化酶，活力回收为25%，硫酸铵加入与否对活力回收影响很大，否则只有6%。
异氰酸衍生物（异硫氰酸法）：对含有苯胺基的载体除采用重氮法外，（还采用氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺衍生物和苯乙烯树脂等）还可采用异氰酸或异硫氰酸法制备固定化酶。
重氮法所用的载体除上述外，还采用氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺衍生物和苯乙烯树脂等。
下面再介绍我们最近的实验成果，固定化多核苷酸磷酸化酶。
方法：⑴ 琼脂糖OH得活化，即用1N NaOH调pH值13，室温放置片刻。⑵ 醚化，称取1.25倍于琼脂糖干重的SESA，加两倍水，用1.7M Na2CO3调PH值6.0去渣，然后将SESA
边搅拌边加入到琼脂糖凝胶中，当温度达60℃，即加入固定Na2CO3，维持PH=10，约45min
后，取出抽滤，用0.5N NaOH洗三次，再用水洗数次至无色，即得到ABSE琼脂糖（洗是去除多余苯胺基）。⑶ 重氮化制备。加入5%NaNO2及1N HCl在冰浴中反应20min，然后用预先冷却的0.05N HCl及冷蒸馏水洗，抽干即成ABSE琼脂糖重氮盐。⑷ 偶联。以1.5u/g的比例加入PNP液酶，立即用1M Na2CO3调pH值8.0，（大多数酶在中性偏碱的条件下反应）在冰浴中偶联1.5 小时后，抽滤，以少许1M NaCl溶液洗涤后，水洗数次，抽干即得。（游离氨基、咪唑基、酚基起反应）
⑵ 叠氮法
是在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。
主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。
肽键：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基失去一分子水相结合的键，又称酰华东理工大学,酶工程》讲义
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胺键。
例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⑴ 酯化：CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥。⑵ 肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，
再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，甲醇洗涤干燥。⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素
（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶，防止戊二醛的另一醛再与载体上另一个-NH2反应。(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）
⑶ 缩合法（对含-NH2,-COOH载体的另一种方法）主要利用具有羧基或氨基的载体，加入到酶液中，在缩合剂碳化二亚胺（双环己基碳酰胺）作用下，使载体的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或 COOH 形成肽链而被固定。
含羧基的载体有羧甲基纤维素，羧甲基交联葡聚糖等。
含氨基的载体有氨乙基纤维素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。
⑷ 烷基化反应法。将含有卤素官能团试剂与非水溶性的纤维素载体进行烷化反应，然后和酶进行偶联制得固定化酶。
一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。
⑸ 硅烷化法：多孔玻璃特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。
载体可以再生，寿命长等。
一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
这些多孔玻璃的孔径在250～1000埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1克所拥有的表面积达100平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热处理原子重组而成，是优良载体，但必须加以改造）。
本法进行酶的固定化可分三个步骤：① 将本体接上一个结合剂（也即硅烷化）；② 接上功能基团；③ 把酶共价结合于载体。
⑹ 溴化氰法-异脲键合法
本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。
华东理工大学,酶工程》讲义
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上述这些载体在高pH条件下（pH11左右），溴化氰和多糖一类物质形成一种环化的活泼的亚氨碳酸盐，该化合物对蛋白质上的NH2反应十分敏感，生成N-取代异脲，N-取代亚氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要产物为N-取代异脲，反应式如右,
例：胰蛋白酶的固定--均在4℃时进行。
⑴ 活化。称取琼脂糖凝胶100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl和H2O洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按1ml沉淀凝胶加入50～300mg CNBr。立即用2N NaOH调pH值10～11，
维持pH值11，pH值不再下降，直到反应终止。反应在25℃通风橱内进行，反应仅需10分钟，这样CNBr将载体全部活化，生成活泼的亚氨碳酸盐。反应完毕后，用冰水和冷0.1M
pH9.5 NaHCO3洗涤（注意：切忌用带有-NH2基的缓冲液来洗涤，因为亚氨碳酸盐对NH2
-
敏感，
在酶偶联时，活性部位被NH2占领，酶偶联不上），去除多余CNBr和杂蛋白。
⑵ 偶联。用偶联缓冲液（0.025M pH 10.2硼酸缓冲液-0.02M CaCl2或NaHCO3平衡洗涤，
抽干，加入5ml缓冲液（内含16mg酶）温度降至4℃，搅拌反应4小时，最后分别用0.1M pH
8.5硼酸缓冲液-1M NaCl洗涤即成10.2M pH 4.0醋酸缓冲也去除各种杂质。
(三) 交联法。
交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成席夫碱（基）
Shiff碱将酶固定化。含氨基的载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，还有乙撑二异氰酸酯OCN（CH2）6NCO。
交联剂的特点：①带有二个以上的功能基团。②反应比较剧烈条件比较严格。③操作方便，活力回收不高。
固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。
交联法有4种形式,
①酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺乏选择性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高。
②酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，
使酶与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，
经-30℃低温处理，再预热至4℃而得泡沫状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。
③吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。此法用于胞外酶的固定化较好，尤其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选择性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间的共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶装柱流动性能好，缺点是必须保证酶吸附在载体上。
④载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合物的单体反应，反应后再与酶一起共聚。
⑤交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
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（四）包埋法（entrapping method）：将酶物理包埋在高聚物内
包埋法分为格子型和微胶囊型两种。
将酶包裹在凝胶的微小格子中称为格子型；用半透性聚合物膜将酶包裹起来称为微胶囊型。包埋法有如下几个特点：① 不需要化学修饰氨基酸残基。② 反应条件温和，很少显著改变酶的结构。③ 包埋时只适用于小分子的底物和产物。④ 对酶、粗酶制剂和微生物都能进行固定。⑤ 无E-载体之间的化学反应只有载体凝固过程。
⒈格子型。格子型使将酶包埋在聚合物的凝胶格子中,格子的结构可以防止蛋白质渗出于周围培养体中，但是底物仍能渗入这格子内与酶相接触，使之处在不脱离状态下，达到固定化酶的目的。本法所用的聚合物有合成高分子物质聚丙烯酰胺、海藻酸、角叉菜胶等。
⒉ 微囊化法：其原理是用各种类型的膜将酶封装起来。这类膜能使低分子底物和产物通过膜，而酶和其他高分子不能通过。
微囊化法制备固定化酶有两种方法,
① 界面沉淀法：这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低面形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。
② 界面聚合法：是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界石上发生聚合反应产生聚合体将酶包裹起来。半透性微囊的膜可用尼龙610组成。
第四节 固定化细胞
一、细胞固定化种类：吸附法、不用载体法、包埋法。
二、包埋固定法
包埋法是在微生物细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
包埋法可以细分为凝胶包埋法、纤维包埋法、微胶囊包埋法三种。下面主要介绍凝胶包埋法。
按照形成凝胶方式的不同，形成凝胶的方法有：通过基材的聚合作用；离子网络的形成；
改变pH值、温度和溶剂等。
1．通过离子网络键包埋细胞
这是一种通过多价离子使高分子电解质形成凝胶的包埋法，其中尤以海藻酸钙包埋法最为常用。该法由于所用的试剂没有毒性，包埋的细胞易于增殖，故常被优先选用于生长细胞，
以及某些敏感细胞（如植物细胞）和原生质体的包埋，也常用于食品用酶的固定化。
其基本原理是：先将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na
+
，部分被Ca
2+
、或Al
3+
等所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。因此，这种方法又称离子交换凝胶法。可以通过下列参数的改变来调节。
⑴ 藻酸钙凝胶的机械性质与甘露糖醛酸和古罗糖醛嵌段的分布以及海藻酸本身的分子量和分散性有关。因此选用不同分子量及链段结构的海藻酸，可以配制出不同浓度的海藻酸钠溶液。当古罗糖醛酸嵌段含量较高时，凝胶的强度较高。
⑵ 固浴中的CaCl2浓度，可在0.05%-2%之间选用。
⑶ 操作温度可以0-80℃内选取。
⑷ 凝胶珠粒的直径可由滴加器口径的改变而控制在0.15mm,所得粒子直径分布均匀。
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⑸ 直接包埋法的细胞包埋密度，每毫升凝胶可高达1kg温细胞，不过太高的包埋量会对底物和产物的扩散带来不利。
⑹ 海藻酸钙凝胶粒子，还可通过部分干燥法使粒子的直径减小。
⒉ 通过改变载体溶液参数包埋细胞
除了上述聚合法和离子网络法外，改变载体溶液和温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。胶原蛋白、明胶、琼脂、角叉菜聚糖等，
均可用作此种包埋法的载体。
三、吸附法
它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。影响吸附法的主要因素有以下方面,
⑴ Z-电位,Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小，显然，细胞易于被吸引在具有相反Z-电位载体表面上。
⑵ 细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的荷电性质，直接影响着细胞与载体之间的相互吸引力。
⑶ 载体的性质：玻璃、陶瓷等无机材料，系由不同含量的铝、镁、钛等氧化物所组成，
在水介质中，它们会形成相应的氢氧化物（水合氧化物），存在于细胞表面的某些氨基或羧基，可以通过螯合金属离子吸附。
第五节 固定化辅酶
辅酶及偶联酶系的固定化,
⒈ 辅酶固定化的意义
辅酶类物质是一些“全酶”的组成成分，参与催化反应。同时当其与某些高分子物质结合时，可以大大提高催化效率。因此，将其固定化，一方面是固定化酶的必需，另一方面，
固定化酶可以提供亲和色谱的吸附剂。此外，还可能为研制“人工酶”提供实验模型，甚至可以将某些酶的催化性质加以改变，例如改变其底物特异性和热稳定性。辅酶物质固定化一般采用共价偶联法，或将其进行适当的化学修饰后进行包埋。酶常用的固定化载体，有琼脂糖、纤维素、合成高分子材料及微孔玻璃等不溶性物质；也有用葡聚糖、聚氨基酸或聚乙烯胺等不溶性材料的，还有用海藻酸的。固定化反应常用重氮化反应，卤代烷基化反应和BrCN
反应等。
⒉ 按作用机理可将辅酶分成二大类
⑴ 辅基型辅酶（酶内传递）：它与酶结合牢固，难以解离，是酶活性中心的组成部分，
在反应终止时再生成原形。
⑵ 底物型辅酶（酶间载体）：它与酶结合不牢固，容易解离，在酶反应中它由酶Ⅰ从底物AX接受还原单位或化学基团X，转移到酶Ⅱ，然后将X传递给底物B后再生成原形。
因此，可将它看作是一种特殊的共同底物。
⒊ 需辅酶的酶的亲和固定化
需辅酶的酶，其酶蛋白和辅酶之间，有较强的亲和力，因此这类酶的固定化，可以用溴化氰活化法或重氮化法或烷基化法，直接将酶蛋白共价结合于载体。为维持正常的催化作用，
必需不断向反应系统补充辅酶，另一种方法是将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附上去。
⒋ 保留辅因子方法：⑴ 在系统中不断加入辅因子；⑵ 固定化增殖细胞加入法；⑶ 微量辅因子一底物保留法；⑷ 固定化酶辅因子方法；⑸ 加入辅因子共价结合法。
例：李永丰包埋大肠杆菌生产谷氨酸脱羧酶，发现辅因子（PLP流失严重）。加入底物和PLP混合物成功。
因为PLP通过底物带入酶活性中心，后PLP与酶亲和力>PLP与底物亲和力。
所以S-PLP断开，PLP进入大大提高了酶的活力。
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用含铁的聚丙烯酰胺凝胶珠固定化腺苷酸激酶（E1）和乙酸激酶（E2），使ATP再生，
乙酰磷酸由乙烯酮和磷酸化学合成供给。美国麻省理工学院用这种再生系统，以其相应的酶系，完成了酶法合成短杆菌肽S（一种环状十肽）的研究。
第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用。
一、酶反应器
⒈ 分批搅拌反应器；⒉ 连续流搅拌桶反应器；⒊ 连续搅拌桶-超滤反应器；
⒋ 填充床反应器；⒌ 循环反应器；⒍ 流化床反应器。
二、固定化酶（细胞）的应用
⒈ 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
⒉ 固定化酶在医药治疗上的应用
例1：固定化L-天冬酰胺酶用于治疗白血病。L-天冬酰胺酶能分解L-Asn为L-Asp和
NH3。当注射该酶后，人体正常细胞由于有L-天冬酰胺合成酶，可以合成L-Asn，因而细胞的蛋白质合成不受影响。癌细胞本身缺少或没有L-天冬酰胺合成酶，因而L-Asn被注射的
L-天冬酰胺酶分解后，就缺少了合成蛋白质的一种原料，蛋白质合成的受影响，最终癌细胞会“饿死”。
例2：制造人工肾。以往治疗肾脏疾病，常用血液透析装置，由体外循环达到滤除尿素和尿酸等代谢废物的目的，装置笨重，价格昂贵，效率不高。利用固定化尿酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化尿酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。
⒊ 固定化酶在分析化学中应用
酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。
它的原理是：当把这种酶电极插入待测溶液时，酶膜中发生的酶催化反应产生某种离子或气体等电极活性物质，再由基础电极对之响应，转换成电信号，尔后经过放大、处理即可测出反应物量的变化。
⒋ 固定化酶和亲和色谱
⒌ 固定化酶在环境保护
一是环境监测，二是污染物处理。例如造纸厂废水中，含有大量淀粉和白土混悬和胶态物，用固定化a-淀粉酶，可以连续处理这种废水中的胶态悬浮淀粉，使纤维沉淀分离除去。
利用固定化热带假丝酵母的复合酶系，能够分解酚，可以用于处理含酚废水。
⒍ 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。
⒎ 固定化酶在基础理论研究中应用
第四章 有机介质中的酶促反应
第一节 有机介质中的酶促反应概述
一、有机相酶反应的优点
⒈ 有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化。）
⒉ 可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。
⒊ 能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中）
⒋ 可改变反应平衡移动方向（使许多热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酶合成，酯交换等）主要朝着合成而不是水解的方向进行。
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⒌ 可控制底物专一性（不同底物反应所选最适溶剂不一定相同）。
⒍ 可防止由水引起的副反应。
⒎ 可扩大反应pH值的适应性。
⒏ 酶易于实现固定化。
⒐ 酶和产物易于回收。（酶不溶于有机溶剂，有利于产物分离和酶的回收利用，且从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。）
⒑ 可避免微生物污染。
二、有机相酶反应具备条件
⒈ 保证必需水含量；
⒉ 选择合适的酶及酶形式；
⒊ 选择合适的溶剂及反应体系；
⒋ 选择最佳pH值。
三、有机相酶反应的研究进展
⒈ 超临界流体中的酶反应
所谓超临界流体是指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力。然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。另外该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性，而且萃取后分离也很容易。
有关性质,
⑴ 超临界流体的P-V-T性质
超临界流体萃取中最常用的萃取剂是CO2。
⑵ 所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力7.28Mpa）时的状态。
该流体的密度和液体相近，粘度和气体相近，自扩散系数比液体大100倍左右。完成传质达到平衡要快，分离效果要好。
⑶ SC流体的选择性
提高溶剂选择性的基本原则是：第一，操作温度和超临界流体的临界温度接近；第二，
超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近。若两条原则基本符合，效果就较理想，
若符合程度降低，效果就会递减。
⑷ SC流体的溶解能力
超临界流体的溶解能力与其密度有很大关系，而密度又受到体系温度或压力的明显影响，所以压力或温度的变化，就会直接改变其溶解能力。
⑸ 超临界流体的选定
作为萃取剂的超临界流体必须具备以下条件,
① 萃取剂需具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性；
② 临界温度不能太低或太高，最好在室温附近或操作温度附近；
③ 操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度；
④ 临界压力不能太高，可节约压缩动力费；
⑤ 选择性要好，容易得到高纯度制品；
⑥ 溶解度要高，可以减少溶剂的循环量；
⑦ 萃取剂要容易获取，价格要便宜；
⑧ 萃取剂必须对人体没有任何毒性。（在医药、食品上使用）
某些萃取剂超临界特性如下表,
流体名称 乙烷 丙烷 丁烷 戊烷 乙烯 NH3 CO2 SO2 H2O
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临界温度（℃） 32.3 96.9 150 296.7 9.9 132.4 31.1 157.6 374.3
临界压力（Mpa） 4.26 3.8 3.38 5.12 11.28 7.38 7.88 22.11 4.88
临界密度（g/cm
3
） 0.22 0.228 0.232 0.227 0.236 0.46 0.525 0.326 0.203
⑹ 超临界流体萃取过程
① 依靠压力变化萃取分离法（等温法，绝热法）：在一定温度下，使超临界流体和溶质减压，经膨胀，分离，溶质经分离槽下部取出，气体经压缩机返回萃取槽循环使用。
② 依靠温度变化的萃取分离法（等压法）：经加热，升温使气体和溶质分离，从分离槽下部取出萃取物，气体经冷却，压缩后返回萃取槽循环使用。
③ 用吸附剂进行萃取分离法（吸附法）：在分离槽中，经萃取出的溶质被吸附剂吸附，气体经压缩后返回萃取槽循环使用。
如图所示，在超临界CO2中加入N2，使咖啡因在CO2中的溶解度显著下降。根据这一原理建立起来的超临界流体萃取过程叫做惰性气体的分离法流程。此流程的操作都在等温等压下进行，故能耗低。但关键是必须有使超临界流体与惰性气体分离的简便方法。
⑺ 超临界流体萃取的应用
超临界流体萃取与液体溶剂萃取比较
超临界流体萃取法 液体溶剂萃取法
1 可选择萃取挥发性小的物质，生成超临界相 在要分离的原料中加入溶剂形成二相
2 萃取能力由T，P控制。夹带剂研究不多 萃取能力由温度及混合溶剂浓度控制，压力无影响
3
在常温，高压（5-30Mpa）下操作,
可处理对热稳定的物质
都在常温，常压下进行
4 溶质溶剂易于分离，改变压力温度即可 溶质与溶剂分离常用蒸馏法，存在对热稳定性问题
5 粘度小，扩散系数大，易达到相平衡 扩散系数小，有时粘度相当高
6 超临界相溶质浓度小 萃取相为液相，溶质浓度一般较高
超临界流体萃取的应用实例：（从咖啡中脱除咖啡因，从啤酒花中提取有效成分已工业化）
医药工业,
⑴ 原料药的浓缩，精制和脱溶剂（抗生素等）；
⑵ 酵母，菌体生成物的萃取（r-亚麻酸，酒精等）；
⑶ 酶，维生素等的精制、回收；
⑷ 从动植物中萃取有效药物成分（生物碱，维生素E，芳相油等）；
⑸ 脂质混合物的分离精制（甘油酯，脂肪酸，卵磷酯）。
食品工业,
⑴ 植物油的萃取（大豆，棕榈，花生，咖啡）；
⑵ 动物油的萃取（鱼油，肝油）；
⑶ 食品的脱脂（马铃薯片，无脂淀粉，油炸食品）；
⑷ 从茶，咖啡中脱除咖啡因，啤酒花的萃取；
⑸ 香料的萃取；
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⑹ 植物色素的萃取；
⑺ 油脂的脱色脱臭。
化妆品香料工业,
⑴ 天然香料的萃取，合成香料的分离、精制；
⑵ 烟草脱烟碱；
⑶ 化妆品原料的萃取、精制（界面活性剂，单甘酯等）。
⒉ 仿水溶剂和印迹技术
⑴ 仿水溶剂体系
原理：酶在有机相中主要依靠必需水与酶分子间的氢键维持活性构象，因此可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。
极性添加剂对体系的影响有以下三个方面,
① 对反应体系内水的分配影响；② 与蛋白质的直接作用；③ 对产物分配的影响。
应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。
⑵ 分子印迹技术（酶在冻干前可用配体为酶作印迹）
① 当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，
再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。
② 用正丁醇沉淀-胰凝乳蛋白酶和N-乙酰D-色氨酸间的酶抑制剂复合物，经干燥后再放入环己烷中，它可催化合成N-乙酰D-色氨酸乙酯，在水中酶还能“记住”它最后存在过的水溶液的PH值，因该PH值决定了酶分子上有关基团的电离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持，即失去对D型氨基酸的专一性，因为在有机溶剂沉淀时，
该酶分子接受D型氨基酸的构象被冻结，并且在有机溶剂中仍能保持，但在水中则酶又变回到它的天然构象，只能催化L型氨基酸酯化。
原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
四、有机相酶反应的应用现状
第二节 有机介质中酶促反应的条件
一、必需水
⒈ 概念：这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关。只要这层必需水不丢，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍能保持其催化活性。
⒉ 干燥的酶水合过程,
⑴ 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）；
⑵ 与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)；
⑶ 凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25-0.38g/g）；
⑷ 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。
⒊ 影响酶必需水含量的因素（酶和溶剂）
⑴ 不同酶需水量不同
例：溶菌酶在含水量38%以上，即每个酶分子周围有300个以上水分子，整个酶被一层单分子水层所包围，酶活性才能发挥。
在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附50个水分子，而脂肪酶仅需几个水分子就可显示出活性。
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⑵ 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。
溶剂疏水性越强，需水量越少。
例：胰凝乳蛋白酶，在二氯乙烷或氯仿中，1%含水量最高在更疏水的乙酸乙酯中则要求更高。
⒋ 表征必需水作用的参数---热力学水活度
即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。
含义：即为水在体系中的固相（酶，载体），液相（含低物的溶剂）和气相（液面上部的空间）之间进行分配，达到平衡时各相水活度相等。
二、酶的选择
⒈ 酶种类的选择：应具有对有机介质变性的潜在能力，在有机介质中能保持其催化活性构象。
在酶蛋白分子中与底物结合并起催化作用的区域，称为酶的活性部位。活性部位通常由酶分子中的残基侧链活性基团及辅基构成，一般位于酶分子的凹槽或两结构域（或两瓣）的结合处。
生物大分子结构的精确性称刚性，构成蛋白质的二级结构单位，如α螺旋、β-折叠和转角等相对刚性的，它们是稳定蛋白质空间结构的基础。蛋白质（酶）分子具有刚柔相间的空间结构。
蛋白质（酶）分子并非完全刚性的观点，认为局部区域具有一定的可运动性或称为柔性。
蛋白质中还含有一定量的环结构和无规则卷曲。由环和无规卷曲构成的局部区域相对比较柔性。
酶的柔性和刚性是局部的，也是相对的。对于局部柔性部位的维持必须有刚性部分来支持。酶分子既要保持相对稳定的整体结构，又必须要有相对柔性的微环境状态。正是这种刚柔相济的独特酶分子结构，是酶的催化作用保持高效性和可调性的结构基础。
在有机相中，酶在大多数有机溶剂中的不溶性也消除了酶构象的可变性，使酶变得更坚固，具有一定刚性，而有机相中微水也能破坏分子内氢键，使之有一定的柔性。
⒉ 酶形式的选择
⑴ 酶粉：例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。
⑵ 化学修饰酶：例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。
⑶ 固定化酶：把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，
其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。
载体对酶的影响,
① 载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。
例：在水浴液中，底物肉桂酸浓度在0.1mmol/L以上可强烈抑制马肝酸脱氢酶，但在乙酸丁酯中使用亲水载体固定化酶，底物浓度高达50mmol/L也不会发生抑制作用。
② 载体影响酶分子上的结合水
③ 通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。
例：α-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。
④ 影响酶动力学，影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度。
注意：载体不一定是固体或在有机溶剂中不溶的，如果酶加到含临界比的水表面活性剂系统中，酶会进入到凝胶束中，凝胶束是包埋在表面活性剂离子网格中的水微滴，凝胶束中华东理工大学,酶工程》讲义
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的酶活很高，但凝胶束结构易遭破坏，而且可溶酶的量也有限。
三、溶剂及反应体系的选择
水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等。
水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等。
⒈ 酶促反应有机介质体系,
⑴ 单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）
⑵ 两相体系（水/水不溶性有机溶剂）
⑶ 低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）
⑷ 反胶束体系,
① 概念：是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。
表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。
临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系的特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。
正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成“水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质与其它亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”，由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。
② 制备：将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），
便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。
反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。
反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。
③ 基本原理：“水壳”模型
反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水；自由水即为存在于水相中的那部分水。大分子的蛋白质被封闭在“水池”中，表面存在一层水化层与胶束内表面分隔开来，从而使蛋白质不与有机溶剂直接接触。水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多，如：从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层；α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象；反胶束中酶所显示的动力学特性接近于在主体水中的特性等，这些事实都有力地支持了水壳模型。
④ 影响的主要因素,
水相pH值的影响；离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定；
表面活性剂浓度的影响；离子种类对萃取的影响。
⑤ 反胶束的应用
分离蛋白质混合物；
浓缩酶（例：浓缩α-淀粉酶，用TOMAC/异辛烷反胶束系统再加入表面活性试剂，活力回收可达85%，浓缩倍数可增加17倍。）；
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从发酵液中提取胞外酶；
直接提取胞内酶；
蛋白质复性（有人用AOT/异辛烷反胶束溶液萃取变性的核糖核酸酶，将负载有机相连续与水接触除去变性剂盐酸胍，再用谷胱甘肽的混合物重新氧化二硫键，使酶的活性完全恢复，最后由反萃液回收复性的完全具有活性的核糖核酸酶，总收率达到了50%。）。
⒉ 有机溶剂影响酶催化的方式,
⑴ 有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活。
① 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度
② 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。
③ 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。
⑵ 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活
例如：氯仿显著减少过氧化物酶催化苯酚的氧化，原因在于氯仿是苯酚基的很好的猝灭剂。
⑶ 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。虽然这种相互作用可能不会直接影响酶，
但它对催化有重要影响。
① 强极性溶剂能溶解大量的水，倾向于夺取酶的必需水层而导制失活。
② 疏水性溶剂夺去水的能力较弱，引起酶失活可能性较小。
⒊ 选择有机溶剂必须考虑因素
⑴ 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。
例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）
又例：在己烷中聚苯酚氧化酶催化反应中，极性的苯醌产物不溶于己烷，导致在酶周围的水层发生不需要的聚合，该聚合物缠住酶，降低酶活，而在极性更强的氯仿中，苯醌分配到主体溶剂中不会使酶失活。
⑵ 溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。
例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。
⑶ 必须考虑溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）
最新报道溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。在加入等量水时：溶剂的lgP越高酶活性越大，所需最佳水量越少。
四、PH选择和离子强度的影响
⒈ pH选择：环境pH值决定酶表面的离子状态，而表面的离子状态又与酶的活性密切相关因酶分子活性中心的必需基团，需在特定的pH条件下，取得酶催化反应所需的最佳离子化状态。在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，从具有最适pH值的缓冲液中冻干出来。即使同一种酶不同来源，对pH
值敏感程度大不相同。
⒉ 离子强度影响：随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。
第三节 有机介质对酶性质的影响
一、稳定性
⑴ 热稳定性提高
例：丹麦Nove公司生产的脂肪酶Lipozyme TM，在水溶液中600C保温1小时后剩余的酶活只有10%，而在橄华东理工大学,酶工程》讲义
28
榄油中同样条件下脂肪酶的剩余酶活仍近100%。600C对乌桕脂和硬脂酸甲酯的转化反应24
小时后，酶活仍保持82%。
结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。
⑵ 储存稳定性提高
二、活性
⒈ 单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响
⑴ 有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象的氢键和疏水作用力，或破坏酶周围水化层，使酶失活或变性。
⑵ 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。
⒉ 低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化
例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化
⒊ 在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加
特点：酶活力依赖微团的水化程度，即取决于水与表面活性剂的摩尔比（R）
超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。
认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。
根据,
⑴ 微团水化程度（W）（W=[H2O]/[表面活性剂]）的最佳值和酶活性的最大值呈正相关；
⑵ W值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径。
三、专一性
某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。
例：醇脱氢酶催化烷醇氧化为醛，在水溶液中辛烷是最佳底物，再反向微团包裹后则丁醇更快被氧化。
有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。
四、反应平衡方向
有机介质能改变某些酶的反应平衡方向。
例：水解酶，水浓度高达55.5mol/L，水解酶在有机介质中，热力学平衡→催化合成反应。
有机溶剂在酶促合成多肽和蛋白质上的应用
酶 合成产物 有机溶剂 使用浓度（%）合成收率（%）
枯草杆菌蛋白酶核糖核酸酶 甘油 90 50
无色杆菌蛋白酶人胰岛素 DMF和乙醇30 80
羧肽酶 牛胰核糖核酸酶甘油 90 50
凝血酶 人生长激素 甘油 80 20
嗜热杆菌蛋白酶天冬甜味素 乙酸乙酯
胰凝乳蛋白酶 脑啡肽 乙醇或DMF
第四节 有机介质中酶促反应应用举例（外消旋体的拆分）
一、概念
⒈ 光学活性物质：能使平面偏振光旋转的化合物为光学活性物质。
⒉ 手性：一个具有光学活性的有机物不能与它的镜像重合
⒊ 对映异构体：两个互为镜像但不能重合的对映体称为对映异构体，它们旋光能力相华东理工大学,酶工程》讲义
29
同，但方向相反。
⒋ 外消旋体：等量对映异构体的混合物没有光学活性，成为外消旋体。
⒌ 外消旋体拆分：即利用拆分技术将外消旋体的两个对映体分开。通过外消旋体的拆分可得纯的光绪活性物质。
二、光学活性化合物的重要作用
⒈ 医药（Thalidomide;巴比妥药DMBB和MPPB；）；
⒉ 精细化学品（杀虫剂asana）；
⒊ 材料（100%光学活性的β-三氯甲基-β-丙内酯聚合物的熔点高达275度，而相应的外消旋体在相同条件下得到的聚合物在接近200度便分解。
三、光学活性物质的制备技术
⒈ 不对称合成法（以含有手性中心的天然化合物即手性源为原料，通过传统的化学合成方法，保留其活性中心，获得新的手性化合物；也可以用前手性底物与手性助剂或手性催化剂反应，生成光学活性产物。酶是一类具有催化活性的蛋白质，本身就是手性物质，因此可作为不对称合成的手性催化剂。脂肪酶、氧化还原酶、醛缩酶）
⒉ 外消旋体拆分（生物法，非生物法）即利用拆分技术将外消旋体的两个对映体分开。
可以不改变现有生产方法和工艺流程，减少投资同时获得一种消旋体的两种对映体，有可能申报对映体新药专利的机会。
非生物拆分法：⑴ 机械分离法；⑵ 形成和分离对映体异构法；⑶ 色谱分离法；⑷ 动力学拆分。
生物拆分法：利用一个酶或一系列酶。
⑴ 水相酶反应的应用研究热点是手性产品的合成和开发。脂肪酶和酯酶应用最多。
工业应用奥地利的Chemie-linz公司已从美国MIT购买了Klibanov教授的非水相酶催化法拆分a-卤代丙酸的专利许可，并建立了中试工厂，大批量生产光学活性除草剂中间体。
⑵ 生物拆分法原理：实质也为-动力学拆分过程即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。
快：E+A→E+P
慢：E+B→E+Q
C：表征参数
对映体选择率：底物中一对异构体（同一个酶的两种竞争性底物）的Vm/Km之比为酶的选择性。
E：反映某一拆分过程的效果，也表征酶选择性的大小，是酶反应的特征参数。
光学纯度o.p (%)=[a]/[a]纯品
对映体过量值，残余底物ees,
生成底物eep,
一般认为比旋光度与组成之间成直线关系，因此在实验无误差时，o.p与ee所表示的数值应是相同的。
第五章 核酶和抗体酶
第一节 Ribozyme
化学本质是RNA的生物催化剂一Ribozyme,
一、Ribozyme的发现
80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学的Sidnery
Altan各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。这个发现曾被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。为此，T.Cech和S.Altman共同华东理工大学,酶工程》讲义
30
获得了1989年度诺贝尔化学奖。
二、Ribozyme的种类
自然界存在催化分子内反应（incis）的Ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(in trans)的Ribozyme。
1．自我剪接Ribozyme可分为两类：Ⅰ型IVS和Ⅱ型IVS。Ⅰ型IVS均与四膜虫大核rRNA
前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。Ⅱ型IVS的结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟坩酸参与，但仍需Mg
2+
。
2．自我剪切Ribozyme,后者包含剪切与连接两个步骤。自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。
3．催化分子间反应的Ribozyme.如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。
三、Ribozyme研究进展与展望
对各种已知Ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的Ribozyme,
研究热点：从催化分子内反应的自我剪切Ribozyme设计出催化分子间反应的Ribozyme.
例如：锤头结构，它由两部分组成，一部分是设计的Ribozyme,另一部分是其底物。根据它们在锤头结构中的相对位置，可分为四种类型。其中以（d）类型应用最广，即一个线状RNA
分子可被一个具有催化中心，同时两侧与底物RNA分别互补的ribozyme特异降解。
Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。将Ribozyme基因构建于特定载体上。在爪蟾卵母细胞、Hela细胞等已表达成功。产生的 Ribozyme能阻断特定基因（如氯霉素酰基转移酶基因等）的表达。根据锤头结构或发夹结构原理设计的Ribozyme基因导入已获得美国FDA批准，很快将在临床上使用。一种高效并准确释放Ribozyme的质粒已构建，它将推动Ribozyme的研究。
对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA
为底物的Ribozyme。通过对它们的结构与作用机制的研究，可设计出更多的高效、稳定的
Ribozyme。这些Ribozyme可能成为研究RNA结构的有用工具，可能成为体内阻断有害基因表达和抗病毒感染、抗肿瘤的有效药物。导入抗病Ribozyme基因的转基因生物的出现将为期不远。
第二节 脱氧核酶
一、概念
具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶。
二、结构
Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca
2+
的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子。
三、脱氧核酶的催化特性
1．效率高 以Kcat/Km表示，脱氧核酶的催化效率在109mol/min
左右，超过任何其他的核酶。脱氧核酶的催化效率决定于底物结合速率。
2．酶的作用具有高度专一性 这种专一性是酶-底物以Watson-Crick碱基配对形成二联体或三联体的识别方式所决定。结合部位或催化部位的个别碱基突变导致碱基不配对，酶活将会丧失；碱基位置互换，仍是配对，则活性恢复。酶底物的结合亲和力决定于识别部位的序列长度短，最佳序列长度在14-20核苷酸范围内。
3．酶活性依赖金属离子：Mg
2+
,Zn
2+
,Cu
2+
,Pb
2+
,Ca
2+
、Mn
2+
、三价的镧族离子最高能提高酶活力105倍。
华东理工大学,酶工程》讲义
31
4．其它辅助因子：氨基酸（组氨酸）、精胺，该酶的螺旋结构与酶活性的关系也与锤头状核酶相似。脱氧核酶、核酶、蛋白酶在某种程度上有相似的切割催化机制。
四、酶促反应动力学特征
1．PH值和温度对酶反应速率的影响：pH4-8范围内呈钟形，在pH6.2左右达最大值。
最适温度在40℃左右，但有趣的是Vcat/Vuncat比值在15℃达最大值。
2．激活剂有：K
+
,Na
+
,Mg
2+
,Mn
2+
,Pb
2+
等；阴离子如组氨酸，还有H
+
等。表明酶的折叠活性形式中可能有G-四联体存在。
3．酶浓度对酶反应速率的影响：在底物过量和其他参数不变的条件下，催化速率与酶浓度成比例关系，符合米氏方程。V与[E]成直线关系。
五、生物学意义
三种脱氧核酶的活性：连接酶活性、金属螯合酶活性、磷酸酯酶活性。
第三节 抗体酶
一、概念
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
二、抗体酶研究简史
三、抗体酶的催化反应
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
4．金属螯和合反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
7．光诱导反应
a．光聚合反应（二聚作用）
四、制备方法
1．诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
半抗原设计原则就是酶的催化作用机制。常用过渡态类似物半抗原。
2．引入法：将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术
例：美国使用可裂解亲和标记物将含巯基的柄状亲核基团引入到抗2，4-二硝基苯酚
（DNP）的单抗的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有(DNP)与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇高6*104倍。不仅是这个含巯基的亲核基团能加速反应，而且是它作为一个诱导物可引入各种催化基团和辅助因子。还将荧光素联结在这个柄上，当抗原插入到抗体结合部位时，荧光迅速减弱，可检测荧光强度来研究抗体抗原的结合反应。
3．拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。
缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。
五、研究展望
1．研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律。
2．获得一类新型的蛋白酶。
3．催化天然酶不能催化的反应。
第六章 酶的化学修饰
华东理工大学,酶工程》讲义
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第一节 前言
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。
2．作用的最适条件不符。
3．酶的主要动力学性质的不适应。
4．临床应用的特殊要求。
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造或修饰，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合理的酶。
2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造，这包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象变得更为稳定。另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。
三、酶化学修饰的基本原理
1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂
3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
第二节 酶化学修饰的方法及修饰剂
一、修饰剂的要求
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性
2．修饰剂上反应基团的数目及位置
3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
二、酶性质的了解
1．酶活性部位情况
2．酶的稳定条件、酶反应最适条件
3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等
三、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例
2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件
3．反应温度及时间
四、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰
2．有机大分子对酶的化学修饰
3．蛋白质类及其他
第三节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1．酰化及其相关反应（乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和0-甲基异脲等）
2．烷基化反应（2，4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物和碘甲烷等）
3．氧化和还原反应，氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原剂（2-巯基乙醇、
巯基乙酸和二硫苏糖醇等）
4．芳香环取代反应
二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1．巯基的化学修饰（烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰华东理工大学,酶工程》讲义
33
胺；常用N－乙基马来酰亚胺、5,5′－二硫－2－硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ））。
2．氨基的化学修饰（常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６－三硝基苯酚、２，４
－二硝基氟苯、碘代乙酸、还原烷基、丹磺酰氯）。
非质子化的赖氨酸的ε－氨基是酶分子中亲核反应活性很高的基团。ε－氨基的pKa
值一般为10，由于微环境的影响，蛋白质分子中也可能存在低pKa值的赖氨酸残基，这些残基具有更强的可反应性，因而可以被选择性地修饰。
3,羧基的化学修饰；水溶性的碳化二亚胺、硼氟化三甲锌盐为修饰剂。
4．咪唑基的化学修饰：可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。
5．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修饰剂。
6．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行修饰。
第四节 有机大分子对酶的修饰
一、概念
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糠肽、Sephadex G-25）、聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、丙烯酸等的单聚或共聚物），具有生物活性的大分子物质（如肝素）蛋白质等。这些大分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合。修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
三、举例
利用水溶性大分子对酶进行修饰，是降低甚至消除酶的抗原性的有效方法之一。例如，
精氨酸酶经聚乙二醇（PEG）结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性；聚乙二醇结合修饰后的L-天门冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。
第五节 蛋白质类及其它
一、蛋白质类修饰
血浆蛋白质是血浆中的天然组分，它们和其它蛋白质（包括酶类）的复合物在血液中有可能被视为"自体蛋白"而被接受。同时由于血浆蛋白质具有较大的分子量，在改进酶性质上效果更明显，因此，已被认为是具有较大优越性和前途的一类修饰剂，其中人血清白蛋白是目前研究较多的一种酶修饰剂。常用有以下几种方法,
1．戊二醛法：此方法是利用戊二醛双功能基团的活泼性，使白蛋白和酶分子上氨基产生交联反应，生成修饰酶。
2．碳二亚胺法：白蛋白和酶以碳二亚胺作为交联剂的修饰反应
3．活性酯法
（1）原理：根据多肽合成原理发展起来
（2）特点：反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触所可能产生的酶失活，减少了副反应的产生。
（3）工艺：a.白蛋白琥珀酰化；b.活性酯形成反应；c.修饰反应。
二、金属离子置换修饰
1．概念：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。
2．常用离子
常用二价金属离子。例如：Ca
2+
,Mg
2+
,Mn
2+
,Zn
2+
,Co
2+
,Cu
2+
,Fe
2+
等。金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶
华东理工大学,酶工程》讲义
34
3．修饰方法
(1)加入一定量的乙二胺四乙酸（EDTA）等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。
(2)通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。
(3)用不同的金属离子加入到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。
(4)测活，选择适宜的金属离子作为修饰剂，去置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
例如：将锌型蛋白酶的Zn
2+
除去，然后用Ca
2+
置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。
若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。
第六节 修饰酶的性质及特点
一、热稳定性：增加
1．修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性。
2．增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。
二、抗原性：部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。
三、体内半衰期：延长
四、最适pH：有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化
五、酶学性质的改变：绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。
六、对组织的分布能力变化：对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。举例：辣根过氧化物酶。
第七节 酶化学修饰的应用
一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用
1,研究酶的空间结构
2,确定氨基酸残基的功能
3,测定酶分子中某种氨基酸的数量
二、化学修饰酶在医药和生物技术中的应用
三、蛋白质化学修饰的局限性
