基因组DNA的提取：第六章 基因组DNA的提取

第六章 基因组DNA的提取 第一节 概 述 　　基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。　　不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。　　本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 第二节 从植物组织提取基因组DNA 　　一、材料 　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 　　二、设备 　　移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 　　三、试剂 　　1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 　　2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。　　3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 　　4、 RnaseA母液：配方见第一章。 　　5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 　　四、操作步骤：　　（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 　　1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 　　2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 　　3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 　　4. 室温下5000rpm离心5分钟。 　　5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 　　6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。 　　7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 　　8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。 　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 　　10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 　　11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 　　12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。 　　13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。　　[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。　　（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA 　　1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。 　　2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 　　3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。 　　4. 同本节（一）中步骤3-13操作。?? 第三节 从动物组织提取基因组DNA 　　一、材料 　　哺乳动物新鲜组织。 　　二、设备 　　移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 　　三、试剂 　　1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 　　2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 　　四、操作步骤:　　1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 　　2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。 　　3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 　　4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。 　　5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。 　　6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。　　7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 　　8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 　　9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 　　10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。 　　11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。?? 第四节 细菌基因组DNA的制备 　　一、材料 　　细菌培养物。 　　二、设备 　　移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 　　三、试剂 　　1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 　　2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 　　四、操作步骤：　　1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 　　2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 　　3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 　　4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 　　5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 　　6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 　　7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 　　8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 　　9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节 基因组DNA的检测 　　上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。　　1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 　　2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。 　　3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 　　如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： 　　（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 　　（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 　　（3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 　　（4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。